Summary
In diesem Artikel präsentieren wir Methoden zum isolieren und Stromazellen Knochenmarkzellen und Blutstammzellen von Röhrenknochen Maus unterscheiden. Zwei verschiedene Protokolle sind nachgiebig unterschiedliche Zellpopulationen geeignet für Erweiterung und Differenzierung in Adipozyten, Osteoblasten und Osteoklasten vorgestellt.
Abstract
Knochenmark-Stromazellen Zellen (BMSCs) bilden eine Zellpopulation, die routinemäßig als eine Darstellung von mesenchymalen Stammzellen verwendet in-vitro-. Sie befinden sich in dem Knochenmark Hohlraum neben hämatopoetischen Stammzellen (HSCs), die roten Blutkörperchen, immun Stammväter und Osteoklasten hervorrufen können. So, Extraktionen der Zell-Populationen von der Knochenmark resultiert eine sehr heterogene Mischung aus verschiedenen Zell-Populationen, die Herausforderungen im experimentellen Design und Interpretation der Daten zu verwirren können. Mehrere Isolation und Kulturtechniken wurden im Labor entwickelt, um mehr oder weniger homogenen Bevölkerungen von BMSCs und HSCs Invitrozu erhalten. Hier stellen wir zwei Methoden zur Isolierung von BMSCs und HSCs aus Maus Röhrenknochen: eine Methode, die eine gemischte Bevölkerung von BMSCs und HSCs ergibt und eine Methode, die versucht, die zwei Zellpopulationen zu trennen Abkommen beruht auf. Beide Methoden liefern Zellen geeignet für osteogene und adipogenen Differenzierung Experimente sowie Funktions-Tests.
Introduction
Primären murinen BMSCs werden häufig als in-vitro- Modell von mesenchymalen Stammzellen seit ihrer Entdeckung in den frühen 1980er Jahren1verwendet. Kulturen der Kunststoff-anhaftende Zellen aus dem Knochenmark Hohlraum der langen Knochen gespült pflegen in der Tat, die Fähigkeit, differenziert in Osteoblasten, Osteoklasten, Chondrozyten oder Adipozyten in vielen Studien2,3, 4 , 5. ist eine einzigartige Gewebe bestehend aus vielen unterschiedlichen Zellpopulationen einschließlich, aber nicht beschränkt auf, BMSCs, HSCs, Endothelzellen und Immun-Zellen jedoch das Knochenmark. So können Isolation und Kulturtechniken Zell-Populationen mit unterschiedlichen Homogenität nachgeben. Mit solchen Techniken, um die mögliche Differenzierung von Zellen zu testen, kann schwierig sein. Z. B. Grenzen, wenn Zellen von Mäusen mit verschiedenen Genotypen zu vergleichen, beginnend mit einer gemischten Zellpopulation der Interpretation der Daten. Umgekehrt erhalten homogene Bevölkerung von BMSCs und HSCs technisch schwierig sein kann und möglicherweise nicht als Vertreter eines ex-Vivo -Modells.
In unserem Labor sind wir in erster Linie interessiert die Nutzung der BMSCs durch ihr Potenzial in Osteoblasten und Osteoklasten Adipozyten unterschieden werden. Hier präsentieren wir Ihnen Techniken der BMSCs und HSCs Isolation und Kultur verwendet, um Osteoblastogenesis oder angereizte in Vitrozu bewerten, sowie Kulturen von HSZ in Osteoklasten zu unterscheiden. Eine Methode verwendet eine gemischte Bevölkerung von Knochenmarkzellen (BMCs) mit BMSCs und HSCs direkt geeignet für angereizte, Osteoblastogenesis und Osteoclastogenesis (Total BMCs genannt). Diese Methode ist eine engere ex Vivo -Darstellung der Heterogenität zwischen den Zellen des Knochenmarks Mikroumgebung gefunden. Eine andere Methode trennt Anhänger von nicht-anhaftende Zellen in einem Versuch, Kultur "reiner" Populationen von BMSCs und HSCs (Anhänger BMSCs genannt). Die späteren Methode ermöglicht die Zellkultur um zu beginnen mit einer genauer Anzahl von BMSCs oder HSCs experimentiert und verringert das Potenzial von komplexen indirekten Auswirkungen der anderen Zell-Populationen, die in der Kultur bleiben. Beide Methoden haben zuvor veröffentlicht und verwendet, um verschiedene Forschung Fragen6,7,8,9anzugehen.
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Protocol
Alle experimentelle Verfahren wurden von der institutionellen Animal Care und Use Committee am Maine Medical Center Research Institute zugelassen.
1. Sammlung Röhren Vorbereitung
- Machen Sie BMSC Kulturmedien durch die Ergänzung von Minimum wesentliche Medium α (MEM α) mit 10 % fötalen Rinderserum und 1 % von Penicillin/Streptomycin.
- Platz 100 µL BMSC Kulturmedien in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. 3 Knochen passen in der Regel in einer einzigen Röhre also entsprechend vorbereiten.
- Kürzen Sie die Enden von 200 µL Pipettenspitzen genug, so dass sie in die Zentrifuge Rohre passen. Setzen Sie die Tipps in den Rohren und sicherzustellen Sie, dass die Deckel schließen können, bevor Sie die Rohre auf Eis legen.
Hinweis: Alternativ können 0,75 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Schnitt enden in 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch eingefügt werden.
(2) die Ernte der Knochen von Mäusen
- Einschläfern Sie die Tiere mit CO2 gefolgt von zervikale Dislokation und sprühen sie mit 70 % Ethanol.
Hinweis: Sicherstellen Sie, dass Tiere aus der gleichen Geschlechts und vorzugsweise im gleichen Alter verwendet werden. Wir verwenden routinemäßig Tiere im Alter von 7 bis 8 Wochen. Es wird empfohlen, Bündelung von Zellen aus mindestens 3 Tiere pro Versuchsgruppen zu eine bessere Vertreter und reproduzierbare Zellpopulation führen. -
Platzieren Sie die euthanasierten Maus auf dem Rücken auf einem sezierenden Brett. Verwenden Sie Zange, um ein Zelt der Haut auf dem Bauch zu schaffen. Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 1 cm) mit sterilen sezierenden Schere. Ziehen Sie die Haut in Richtung der Gliedmaßen und die Füße aus dem Schnitt um den Unterleib und die Beine offen zu legen.
- Schneiden Sie unterhalb des Knöchels zu Fuße zu entfernen. Schneiden Sie entlang der Beckenkamm an der Hüfte, den Femur-Kopf von den Hüftknochen zu trennen. Während die Maus noch auf den Rücken, machen Sie einen Einschnitt in der Mitte der Hüftknochen, trennen die beiden Beckenkamm Knochen.
- Mit fusselfreien Wischtücher, vorsichtig aus dem Oberschenkelknochen, Schienbeine und Beckenkamm Knochen des Muskels.
Hinweis: Schneiden so viel von den Sehnen und Muskeln vom Knochen wie möglich macht die Reinigung schneller und einfacher mit den fusselfreien Tüchern (z.B. Kimwipes). Vorsicht wenn die Knochen zu manipulieren, wie sie neigen dazu, leicht zu brechen und ihre Zerbrechlichkeit mit bestimmte Genotypen erhöht werden kann. - Sobald die Proben seziert haben, legen Sie sie in PBS auf Eis und verschieben in einen sterilen Kultur-Haube für die übrigen Schritte der Isolation.
Hinweis: Arbeiten aseptisch so weit wie möglich verringert das Potenzial für Verschmutzung in den Kulturen. - Machen Sie kleine Einschnitte (ca. 1 bis 2 mm) an den proximalen und distalen Enden der Knochen vor der Einlagerung in die geschnittenen Spitzen innerhalb der Zentrifuge Rohre.
Hinweis: Stellen Sie sicher um eine ausreichende Menge zu schneiden, so dass Knochenmark heraus geschleudert werden kann; Allerdings muss darauf geachtet werden, zu vermeiden schneiden zu viel wie Zell-Populationen sind in der Regel variieren basierend auf Nähe innerhalb Knochenmark. - Zentrifuge bei 10.000 x g für 15 s bei Raumtemperatur. Sicherzustellen Sie, dass das Knochenmark gespült und oelletiert am unteren Rand der 1,5 mL Tube, während die Knochen im Inneren der Einsätze (entweder 200 µL Pipettieren Tipp oder 0,75 mL Microcentrifuge Schlauch) sind. Sobald das Knochenmark gesammelt werden, entfernen Sie die Einsätze mit den Knochen aus dem Röhrchen.
Hinweis: Wenn das Knochenmark geleert ist, werden die Knochen weiß erscheinen. Jedoch wenn Knochenmark in bestimmten Knochen bleibt, versuchen Sie es erneut schneiden enden und Zentrifugieren.
3. die Zellsuspension
- Mit einer 25 G Nadel, ziehen, Holzpellets die Zelle oben und unten langsam Klumpen aufzubrechen und die Proben in ein einzelnes 15 mL konische Röhrchen zu kombinieren. Fügen Sie 10 mL BMSC Nährmedien pro 500 µL der Proben.
- Legen Sie einen 70 µm-Filter auf eine 50 mL konische Rohr und dieser Filter durchlaufen Sie die Zellsuspension, um mögliche Knochensplitter zu entfernen.
(4) Beschichtung und Kultur der gemischten Populationen von Knochenmarkzellen (Total BMCs)
Hinweis: Zellen sind bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5 % CO2kultiviert.
- Berechnen Sie die Anzahl der Zellen und Platte sie bei 1,0 x 106 Zellen/cm2 in Kulturmedien. Lassen Sie 72 h der Mischkultur für Zellen befestigen.
Hinweis: Wir empfehlen Verdünnen der Zelle Aufhängung 20 X in Kulturmedien und Verdünnung wieder in Trypan blau vor zählen die Zellen mit einem Hemocytometer. Für 7 Wochen alten männlichen C57Bl6/J Mäusen wir routinemäßig ergeben eine Handynummer von rund 50 x 106 Zellen jedoch Alter, Geschlecht und Belastung Zellzahl stark beeinflussen können.
Hinweis: Eine Mischung Population von Zellen sollte am unteren Rand der Kultur gut befestigen. - Entfernen Sie nach 72 h das Medium und ersetzen Sie sie durch neue Medien. Weiter verändern die Medien jeden anderen Tag und suchen Sie nach Konfluenz. Wenn die Zellen 80-100 % Konfluenz erreicht haben, sind sie bereit für eine Differenzierung.
Hinweis: Da diese Kultur mit BMSCs und HSCs gemischt wird, kann es direkt für Osteoblastogenesis, angereizte sowie Osteoclastogenesis verwendet werden.
5. Beschichtung und Kultur der Split Bevölkerung von BMSCs (anhaftende BMSCs)
Hinweis: Zellen sind bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5 % CO2kultiviert.
- Teller alle Zellen in der Kulturschale 10 cm (55 cm2 Kulturkreis) vom Oberschenkelknochen, Schienbeine und Beckenkamm Knochen von einem Mausklick gesammelt.
Hinweis: Bei der Bündelung von 2-3 C57BL/6J Mäuse Platte wir in der Regel diese "Gesamt" Knochenmark-Population in einem 150 cm2 Kolben. - Entfernen Sie nach 48 h der Mischkultur die Nährmedien (mit der nicht-Anhänger HSCs). Wenn Osteoclastogenesis Experimente durchgeführt werden, setzen Sie diese Population von nicht-anhaftende Zellen beiseite (siehe Abschnitt 7), wenn nicht, Absaugen und entsorgen Sie diese Zellen.
- Waschen Sie die Platte/Flasche mit PBS sorgfältig hinsichtlich der angeschlossenen Zellen nicht zu stören.
- Entfernen Sie PBS und heben Sie die Zellen durch Hinzufügen von 0,25 % Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für ca. 1-3 min. Quench die Trypsin, indem Sie die Zellsuspension Zelle Medien hinzufügen. An dieser Stelle BMSCs, die nun aufgehoben, können (als zuvor getan in Schritt 4.1) gezählt und verchromt für zukünftige Experimente.
- Berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die für die Beschichtung benötigt. Zentrifugieren Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension bei 1.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
Hinweis: Zellen sind in der Regel vernickelt basierend auf Endpunkt-Experimente. Zum Beispiel wenn Protein/RNA isoliert sein Platte wir in der Regel auf eine höhere Dichte (~1.0-2.0 X 106 Zellen/Brunnen in 6-Well-Platte). - Entfernen Sie das Medium und Aufschwemmen der Zelle Pellet im Volumen von Nährmedien für die Beschichtung benötigt. Die Zellen in Kultur Medien nach den Experimenten Platte und es ihnen ermöglichen, für ein paar Tage anhängen. Wenn die BMSCs Konfluenz erreicht haben, fahren Sie mit Differenzierung durchführen.
6. Differenzierung der BMSCs
-
Osteoblasten
- Machen, Osteoblasten Differenzierung Medien indem 800 µL 1 M β-Glycerin Phosphat in PBS und 200 µL 0,5 M Ascorbinsäure in PBS zu 99 mL BMSC Nährmedien (siehe Schritt 1.1 für die Zusammensetzung der BMSC Kultur Medien).
- Nachdem BMSCs Kulturen (total BMCs aus Schritt 4.3) oder anhaftende BMSCs aus Schritt 5.6 konfluierende sind, unterscheiden sie in Osteoblasten durch den Wechsel der Nährmedien zu Osteoblasten Differenzierung Medien.
- Ersetzen Sie die Differenzierung Medien jeden zweiten Tag. Zellen beginnen, weiße Knötchen Mineralisierung. Visualisieren sie mit bloßem Auge auf der Unterseite des Brunnens; Dieser Prozess kann innerhalb von wenigen Tagen bis 3 Wochen stattfinden.
- Führen Sie bei der Beurteilung Osteoblastogenesis alkalische Phosphatase Färbung und/oder Von Kossa Färbung auf den Brunnen wie in Kapitel 8 beschrieben.
Hinweis: Ändern Sie die Medien sorgfältig durch die Platten in einem leichten Winkel zur Vermeidung von Störungen der Zelle Monolage kippen.
- Führen Sie bei der Beurteilung Osteoblastogenesis alkalische Phosphatase Färbung und/oder Von Kossa Färbung auf den Brunnen wie in Kapitel 8 beschrieben.
- Machen, Osteoblasten Differenzierung Medien indem 800 µL 1 M β-Glycerin Phosphat in PBS und 200 µL 0,5 M Ascorbinsäure in PBS zu 99 mL BMSC Nährmedien (siehe Schritt 1.1 für die Zusammensetzung der BMSC Kultur Medien).
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Adipozyten
- Machen Sie Adipocyte base Medien durch mischen zusammen 90 mL Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) hohe Glucose, 10 mL von fetalen Rinderserum, 1 mL Penicillin/Streptomycin, 100 µL 20 mM Rosiglitazon und 100 µL 2 mM Insulin. Bei Bedarf speichern Sie dieses Medium bei 4 ° C für die Woche während des Experiments Differenzierung.
- Machen Adipocyte Induktion Medien durch Zugabe von 200 µL 62,5 mM 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) und 25 µL 1 mM Dexamethason bis 25 mL Adipocyte Base Medien.
- Nachdem BMSCs Kulturen (total BMCs aus Schritt 4.3) oder anhaftende BMSCs aus Schritt 5.6 konfluierende sind, wechseln Sie das Medium Adipocyte Induktion Medien. Betrachten Sie diesen Tag 0 der Differenzierung.
- Entfernen Sie nach 48 h das Medium und aktualisieren Sie die Kultur mit Adipocyte Induktion Medien zu.
- Am 4. Tag wechseln Sie zur Adipocyte base Medien.
Hinweis: Lipid Tröpfchen können beginnen so früh wie Tag2 oder Tag 4 erscheinen. - Am 7. Tag beobachten Sie, dass Zellen maximale Lipid Tröpfchen angesammelt haben und einen Phänotyp ähnlich wie eine Reife Adipocyte zeigen. Nicht über diesen Punkt Kultur, da es Zelle Tod/Ablösung führen kann.
(7) die Differenzierung von HSZ in Osteoklasten
- Osteoklasten Differenzierung Medien durch Zugabe von 50 µL 25 µg/mL der Rezeptor Aktivator von NFKB Liganden (RANKL) und 15 µL von Makrophagen Kolonie stimulierende Faktor (mCSF) 25 µg/mL bis 25 mL BMSC Nährmedien zu machen.
- Sobald die gesamte BMCs (aus Schritt 4.3) oder nicht-anhaftende Zellen (aus Schritt 5.2) Brunnen verbunden sind, können Nährmedien Osteoklasten Differenzierung Medien geschaltet werden. Wieder füllen Sie Differenzierung Medien jeden zweiten Tag auf.
- Beobachten Sie die Osteoklasten Kulturen täglich unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung. Beachten Sie, dass Osteoklasten verschmelzen und mehrkernigen Zellen, in der Regel um Tag 5 bis 7 der Differenzierung bilden.
(8) Färbung
-
Osteoblasten
Hinweis: Für die alkalische Phosphatase (AP) Färbung, wir oft benutzen ein AP Färbung kit (siehe Tabelle der Materialien) nach den Richtlinien.- Führen Sie AP Färbung, indem Sie die folgenden Richtlinien des Herstellers Kit.
- Aspirieren Sie Medien und spülen Sie Zellen mit PBS. Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit PBS-Puffer für 12 min bei Raumtemperatur.
- In der Zwischenzeit machen die AP-Lösung unter Verwendung der Reagenzien von der AP Färbung Kit durch Zugabe von 500 µL Natriumnitrit, 500 µL FRV-Lauge und mischen sanft; lassen Sie stehen für 2 min. hinzufügen 22,5 mL dH2O und 500 µL Naphthol AS-BI alkalisch. Mischen Sie vorsichtig.
Achtung: PFA ist giftig und muss mit Vorsicht behandelt werden. - Sobald die Zellen fixiert sind, Spülen mit PBS und AP-Lösung in jede Vertiefung (1 bis 2 mL pro Well) hinzufügen. Deckel mit Alu-Folie und lassen Sie Fleck für 30 min bei Raumtemperatur vor Licht geschützt werden. Aspirieren Sie die Lösung, waschen mit destilliertem Wasser und lassen die Platte zum trocknen.
- Abrufen von Bildern der gefärbten Kolonien mit Hilfe einer Kamera um alkalische Phosphatase positive Zellen zu beobachten.
- Alternativ führen Von Kossa statt alkalische Phosphatase Färbung. Hierzu werden Brunnen waschen gründlich mit destilliertem Wasser als alle übrigen PBS mit Silbernitrat. auszufällen.
- Befestigen Sie die Zellen mit 4 % PFA mit PBS-Puffer für 12 min bei Raumtemperatur. Fügen Sie dann genug 5 % Silbernitratlösung um den Brunnen zu decken und setzen auf starkes Licht für 1 h bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die Silbernitrat-Lösung und spülen Sie jedes gut mit destilliertem Wasser. Die Zellen 5 % Natriumthiosulfat-Lösung hinzufügen und 3 Minuten lang stehen lassen.
- Die Natriumthiosulfat abzusaugen und mit destilliertem Wasser zu waschen. Lassen Sie die Platte trocken und die Lagerstätte gebeizt in dunkelbraun/schwarz mit bloßem Auge zu beobachten.
- Führen Sie AP Färbung, indem Sie die folgenden Richtlinien des Herstellers Kit.
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Adipozyten
- Fix für Öl rot O (ORO) Färbung, die Zellen mit 10 % Neutral gepufferte Formalin für 1 h bei Raumtemperatur.
- In der Zwischenzeit machen Sie die ORO-Lager-Lösung durch Auflösen von 0,035 g in 10 mL Isopropanol. Dies ist ausreichend für eine 6-Well-Platte. Mischen und die Lösung mit einem Filterpapier (Pore Größe 11 µm) übergeben.
- Machen Sie die ORO arbeiten Lösung durch 9 mL der Stammlösung ORO mit 6 mL destilliertem Wasser verdünnen. Lassen Sie die Lösung auf einer Wippe bis einsatzbereit.
- 60 % Isopropanol in destilliertem Wasser vorbereiten (machen genug, um jede decken gut).
- Sobald die Zellen fixiert sind, entfernen Sie das Fixativ und Waschen einmal mit destilliertem Wasser. Ersetzen Sie das Wasser mit der 60 % Isopropanol-Lösung für 1 min.
Hinweis: Fügen Sie Flüssigkeit langsam beim Kippen der Plattenrandes; Adipozyten verdrängen sehr leicht. - Entfernen Sie das Isopropanol, und fügen Sie genug ORO arbeiten Lösung um alle Zellen zu decken. 15 min auf ein Lowspeed Rocker bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie ORO und waschen Sie zweimal mit destilliertem Wasser.
Hinweis: an dieser Stelle können ORO-gefärbten Lipid Tropfen unter dem Mikroskop visualisiert werden. - Zur Quantifizierung von ORO destain das ORO durch Zugabe von 1 mL 100 % Isopropanol in jede Vertiefung und Schaukeln langsam für 10 Minuten.
- In der Zwischenzeit bereiten eine Verdünnungsreihe erstelle ich eine Standardkurve auf Basis der folgenden 8 Standards mit ORO-arbeiten-Lösung (2.100 µg/mL) und Isopropanol als ein Verdünnungsmittel: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 und 0 µg/mL.
- 200 µL des Standards und die destained Muster in Triplicates auf einem Teller laden und Lesen der Extinktion bei 490 nm.
- Bestimmen Sie Konzentration von ORO für jede Probe anhand der Standardkurve.
Hinweis: Wir empfehlen normalisieren die Konzentration ORO, Anzahl von Zellen. Anzahl von Zellen kann mit Kristallviolett beflecken oder DNA-Menge quantifiziert werden.
- Bestimmen Sie Konzentration von ORO für jede Probe anhand der Standardkurve.
-
Osteoklasten
Hinweis: Wenn Sie bereit sind, empfehlen wir die Färbung Osteoklasten für Tartrat-resistente Acid Phosphatase (TRAP) mit der Falle Färbung kit (siehe Tabelle der Materialien).- Befestigen Sie für TRAP Färbung Zellen für 30 min bei Raumtemperatur mit 2,5 % Glutaraldehyd in PBS. In der Zwischenzeit machen Sie die TRAP-Lösung von 50 µL schnell Granate Basis Lösung, 50 µL Natriumnitrit, 4,55 mL destilliertes Wasser, 50 µL Napthol AS-Biphosphate, 200 µL der Acetat-Lösung und 100 µL Tartrat Lösung vermischen.
- Aspirieren Sie Fixiermittel, und spülen Sie die Zellen mit PBS zweimal vor dem Hinzufügen von TRAP-Lösung für 1 h bei 37 ° C.
- Waschen Sie mit destilliertem Wasser vor dem zählen Osteoklasten unter dem Mikroskop (10 X Vergrößerung). Die Falle+ -Zellen erscheinen violett mit 3 oder mehr Kernen.
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Representative Results
Überblick über die Zellkulturen
Die beiden Kulturtechniken ermöglichen die Beurteilung der Differenzierung auf eine Mischpopulation BMCs bestehend aus BMSCs und HSCs (Total BMCs, Abb. 1A) oder eine Bevölkerung von BMSCs von HSZ (Anhänger BMSCs, Abbildung 1 b) aufgeteilt. 48 Stunden, nachdem die Zellen aus dem Knochenmark isoliert werden und (Abbildung 1 beschichtet), sie schnell befestigen an der Unterseite der Platte Kunststoff Kultur und neigen zu einem monomolekularen Film bilden. Sobald die Zellen Zusammenfluss (Abbildung 1) erreicht haben, können sie für Differenzierung Assays verwendet werden.
BMSCs in Osteoblasten differenzieren
Konfluierende Kulturen der BMSCs können in Osteoblasten eine osteogene Medien bestehend aus Ascorbinsäure und β-Glycerin-Phosphat (Abb. 2A, B) unterschieden werden. Nach ein paar Tagen der Differenzierung Osteoblasten starten mit dem Ausdruck alkalischen Phosphatase (Abbildung 2). Weitere Differenzierung wird osteoid Matrix Produktion und letztlich die Mineralisierung dieser Matrix (Abb. 2D) auslösen. Interessanterweise wird nur ein Teil der Zellen in Osteoblasten in Vitrozu differenzieren. In der Tat mit Kristallviolett (Abb. 2E) Färbung zeigt, dass nicht alle Zellen alkalischen Phosphatase Express oder die Platte mineralisieren.
BMSCs in Adipozyten differenzieren
Angereizte kann auf Kulturen des gemischten BMCs sowie homogener Zellpopulation getestet werden. Wie mit Osteoblasten Differenzierung, beobachtet, ob die gemischte Bevölkerung (Abb. 3A) oder Split-Populationen (Abb. 3 b) verwendet werden, sind nur ein Teil der Zellen adipogenen. Adipozyten erscheinen Runde mit mehreren Lipid-Vakuolen, die in rot mit ORO (Abbildung 3) gebeizt werden können. Nach unserer Erfahrung werden in Vitro Adipozyten immer Multi-im Gegensatz zu in Vivo weiß Adipozyten vakuolisierten angezeigt. Unterschiede bei Genotyp oder Kultur erhöht möglicherweise angereizte bis zu einem Punkt, wo Fettzellen lösen und schweben in der Kultur-Platte. Um dieses Problem zu beheben, kann das angereizte Experiment zu einem früheren Zeitpunkt beendet werden.
HSZ differenziert in Osteoklasten
Osteoclastogenesis können in den Kulturen durch die Ergänzung der Medien mit mCSF und RANKL induziert werden. HSZ starten schnell verschmelzen zu mehrkernigen Zellen bilden, die positiv für TRAP (Abb. 4A) notwendig. Die Osteoklasten sind in der Lage, mineralischen Matrix in-vitro- resorbierbarem und können somit verwendet werden, um osteoclastic Aktivität (Abbildung 4 b). bewerten
Abbildung 1: Schematische Timeline der Protokolle für die Kultur der BMSCs und HSCs. Verschiedene Techniken insgesamt BMCs Ausbeute bestehend aus eine gemischte Population von Zellen (A) oder anhaftende BMSCs (B). Repräsentatives Bild der BMSCs Kultur von C57B6/J Mäusen isoliert 48 Stunden nach ihrer Beschichtung (C) und nachdem sie von HSZ (D) aufgeteilt sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Bilder von Brunnen von BMSCs Kulturen in Osteoblasten differenzieren. BMSCs vor (A) und nach (B) in osteogene Medien gelegt. Osteoblasten können für alkalische Phosphatase Ausdruck in Rosa (C) und für die Lagerstätte in Braun (D) gefärbt werden. Kristallviolett kann verwendet werden, um die Anzahl von Zellen nach Differenzierung (E) darzustellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Repräsentative Bilder der Kulturen der BMSCs in Adipozyten differenzieren. ORO-gefärbten Adipozyten eine gemischte Bevölkerung von BMSCs (A) und einer geteilten Kultur (B) nach 7 Tagen in adipogenen Medien entnommen. Bild von einem Adipocyte befleckt mit ORO (C). Quantifizierung von ORO nach 7 Tagen in adipogenen Medien vor (D) und (E) Normierung auf Kristallviolett Extinktion. Daten werden als Mittel mit Fehlerbalken Vertretung Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: HSZ Kulturen unterschieden in Osteoklasten. TRAP Färbung von Osteoklasten erscheinen als große lila-rosa mehrkernigen Zellen (A). Mineralisierte Oberfläche gebeizt in schwarz von Von Kossa mit Resorption Gruben links durch Osteoklasten von HSZ nach 7 Tagen (B) unterschieden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In diesem Artikel werden zwei Methoden der Kultur des BMSCs mit ihren Vorteilen und Einschränkungen vorgestellt. Zellen aus dem Knochenmark zu isolieren, ist ein relativ müheloses Prozess. Erlangung einer Zellpopulation, die repräsentativ für die mesenchymalen Stammzellen oder osteoclastic Vorfahren kann jedoch aufgrund der vielfältigen zellulären Umgebung des Hohlraums Knochenmark eine Herausforderung sein.
Kultivierung der Gesamtheit der Knochenmark-Inhalte bietet einen engen Darstellung von in Vivo Mikroumgebung. Noch, isolieren von Zellen aus verschiedenen Gruppen von Mäusen (Genotypen, Behandlungen, Alter, etc.) kann eine sehr unterschiedliche Anzahl von BMSCs oder HSCs zu Beginn der in-vitro- Experiment führen. Lassen Sie deshalb BMSCs und HSCs zu trennen und neu Plattieren sie eine bessere Kontrolle über die Anzahl von Zellen zu Beginn des Experiments Differenzierung. Reduzierung der Heterogenität der Zellkultur kann jedoch die Ergebnisse des BMSCs oder der HSCs auswirken, wie beide Faktoren absondern, die Differenzierung von mesenchymalen und osteoclastic beeinflussen. Es ist wichtig, diese Einschränkungen zu berücksichtigen, bei der Gestaltung der Isolation und der Kultur der BMSCs und HSCs.
Die Vielzahl der Zell-Populationen, die im Knochenmark kann Herausforderungen bei der Interpretation der Daten führen. HSCs und BMSCs enthält neben dem Knochenmark Mikroumgebung auch differenzierte Immunzellen, rote Blutkörperchen, Endothelzellenetc. Diese Populationen in den Anhänger oder nicht-anhaftende Bruchteil bleibt und somit die experimentellen Ergebnisse beeinflussen können. Sortieren von BMSCs kann eine Option um ein "reiner" Zell-Population zu erreichen sein. In der Tat sind BMSCs vermutlich CD34 express während HSCs nicht10tun. Aber es wurde auch vorgeschlagen, dass das Fehlen von CD34 auf der Oberfläche des BMSCs möglicherweise das Ergebnis von Kultur und eine Studie, dass eine nicht-anhaftende Teilmenge der CD34 gezeigt hat Adipozyten, Osteoblasten und Chondrozyten11, + BMSCs differenzieren könnte 12. daher, wenn man bedenkt, Sortierung, um BMSCs zu isolieren, eine Reihe von klar definierten Marker sollte so gestaltet werden im Voraus. Andere Hindernisse für Zellsortierung sind Zeitpunkt und Kosten. In der Tat ein Sortierschritt könnte erhöhen die Zeit der Isolation deutlich Protokoll sowie eine signifikante Zunahme der Kosten. Zusammenfassend lässt sich sagen präsentieren Sortierung Zellen technische Herausforderungen, die den Ertrag und die Qualität der BMSCs reduzieren können.
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Disclosures
Die Autoren offen zu legen, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikt haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
| Dissection tools | |||
| 70 μm filters | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer inverter microscope | Zeiss |
References
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