Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

Published: January 6, 2018 doi: 10.3791/56750
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Maine Medical Center Research Institute

Summary

במאמר זה, נציג שיטות כדי לבודד, להבדיל תאי סטרומה מח עצם של תאי גזע hematopoietic עצמות ארוכות העכבר. שני פרוטוקולים שונים מוצגים מניב אוכלוסיות תאים שונים עבור הרחבת ובידול לתוך תאי העצם, adipocytes ו osteoclasts.

Abstract

מח עצם סטרומה תאים (BMSCs) מהווים אוכלוסיה תא בשימוש שגרתי כייצוג של גזע mesenchymal אין ויטרו. הם מתגוררים בתוך החלל מח העצם לצד hematopoietic תאי גזע (HSCs), אשר יכולים להצמיח תאי דם אדומים, מחוסן. אבות ו osteoclasts. לפיכך, עקירות של אוכלוסיות תאים מתוצאות מח עצם תערובת הטרוגנית מאוד של אוכלוסיות תאים שונים, אשר ניתן להציג את האתגרים בעיצוב ניסיוני, וחיסול פרשנות הנתונים. מספר בידוד וטכניקות תרבות פותחו במעבדות כדי לקבל אוכלוסיות פחות או יותר הומוגנית של BMSCs ו- HSCs invitro. כאן, אנו מציגים שתי שיטות בידוד של BMSCs ו- HSCs של עצמות ארוכות העכבר: שיטה אחת המניבה אוכלוסייה מעורבת של BMSCs ו- HSCs ובשיטת אחד שמנסה להפריד בין האוכלוסיות תא שני המבוסס על הדבקות. שתי השיטות מספקות תאים מתאים osteogenic ו- adipogenic בידול ניסויים מבחני גם פונקציונלית.

Introduction

BMSCs מאתר ראשי משמשות כמודל במבחנה של גזע mesenchymal מאז גילוין בתחילת שנות השמונים1. אכן, תרביות של תאים פלסטיק-חסיד מבניין את חלל מוח העצם של עצמות ארוכות לשמר את היכולת להיות מבודלים לתוך תאי העצם, osteoclasts, chondrocytes או adipocytes הרבה מחקרים2,3, 4 , 5. עם זאת, מח העצם היא רקמה ייחודית המורכבת רבים אוכלוסיות תאים שונים, לרבות אך לא מוגבל, BMSCs, HSCs, תאי אנדותל, ואת המערכת החיסונית. לפיכך, בידוד וטכניקות תרבות יכולות להניב תא אוכלוסיות בעלות הומוגניות שונות. שימוש בטכניקות כאלה כדי לבדוק את הבידול פוטנציאליים מתאי יכול להיות מאתגר. לדוגמה, בעת השוואה בין תאים של עכברים עם אחרים שונים, החל עם אוכלוסיה לתא מעורב מגביל את הפרשנות של הנתונים. לעומת זאת, קבלת אוכלוסיות הומוגנית של BMSCs ו- HSCs יכול להיות מבחינה טכנית קשה ולא ניתן גם נציג של דגם ex-vivo .

במעבדה שלנו, אנו מעוניינים בעיקר הניצול של BMSCs בשל הפוטנציאל שלהם כדי להיות מבודלים לתוך תאי העצם, osteoclasts ו- adipocytes. כאן, אנו מציגים שיטות בידוד BMSCs ו- HSCs והתרבות להערכת osteoblastogenesis או adipogenesis במבחנה, כמו גם תרבויות HSCs כדי להתמיין osteoclasts. שיטה אחת משתמשת אוכלוסייה מעורבת של תאים במח העצם (BMCs) המכילה BMSCs ו HSCs ישירות מתאים adipogenesis, osteoblastogenesis, osteoclastogenesis (נקרא BMCs סה כ). שיטה זו היא קרובה יותר ex-vivo ייצוג של הטרוגניות מצא בין התאים של microenvironment מח העצם. שיטה נוספת מפרידה מחסידי מתאי שאינו חסיד, בניסיון אוכלוסיות "מזוכך" תרבות של BMSCs ו- HSCs (נקרא חסיד BMSCs). שיטת מאוחר יותר מאפשרת התרבות התא ניסויים כדי להתחיל עם מספר מדויק יותר של BMSCs או HSCs ומפחית את הפוטנציאל של מורכבות השפעות עקיפות של אוכלוסיות אחרות-תא שנותרו בתרבות. שתי השיטות יש כבר בעבר לאור ולא להשתמש בו כדי לטפל מחקריות שונות שאלות6,7,8,9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים ניסיוני אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה-מכון המחקר מיין מרכז רפואי.

1. אוסף מנורות הכנה

  1. להפוך את המדיה תרבות BMSC על ידי שכשהם בינוני חיוני מינימום α (MEM α) עם 10% סרום שור בעובר ו 1% של פניצילין/סטרפטומיצין.
  2. מקום µL 100 BMSC תרבות המדיה 1.5 mL microcentrifuge צינורות. 3 עצמות יתאימו בדרך כלל באחד צינור בודד אז התכוננו בהתאם.
  3. חותכים את הקצוות של 200 µL פיפטה טיפים מספיק כדי שיתאימו את החצוצרות שלה צנטריפוגה. הוסף את הטיפים בתוך הצינורות ולהבטיח כי המכסים יכולים לסגור לפני הנחת הצינורות על קרח.
    הערה: לחלופין, 0.75 מ ל צינורות microcentrifuge עם קצוות החתך יכול להיות מוכנס לתוך הצינור microcentrifuge 1.5 mL.

2. הקציר של עצמות של עכברים

  1. המתת חסד החיות באמצעות CO2 ואחריו נקע בצוואר הרחם, לרסס אותם עם 70% אתנול.
    הערה: ודא כי משמשים בעלי חיים מאותו המין, רצוי באותו הגיל. אנו משתמשים באופן שגרתי חיות בגילאי 7-8 שבועות. אנו ממליצים באגירת תאים בעלי חיים לפחות 3 לכל קבוצות ניסיוני להניב אוכלוסיה תא נציג, לשחזור טוב יותר.
  2. הנח את העכבר לאללה על גבו על קרש החיתוך. נורא. להשתמש מלקחיים ליצירת אוהל של העור על הבטן. עושים חתך קטן (בערך 1 ס מ) בעזרת מספריים ויבתר סטרילי. לקלף העור לעבר הגפיים ואת כפות הרגליים של החתך כדי לחשוף את הבטן התחתונה ואת הרגליים.
    1. לחתוך מתחת לקרסול משותפת כדי להסיר את כף הרגל. חתך לאורך האגן-הירך. כדי להפריד את הראש של עצם הירך עצם הכסל. בעוד העכבר הוא עדיין על גבו, לעשות חתך באמצע עצם הכסל כדי להפריד בין שתי העצמות iliac.
  3. באמצעות מגבונים ללא מוך, הסר בזהירות את השריר מן עצמות הירך, tibias, ו- iliac עצמות.
    הערה: חיתוך באותה מידה של גידים, שרירים מן העצם כמו גורם אפשרי הניקוי למהירה וקלה עם המחיקות נטולת מוך (למשל, kimwipes). פעל בזהירות בעת הדחת את העצמות כפי שהם נוטים לשבור בקלות, ניתן להגדיל את השבריריות שלהם עם אחרים מסוימים.
  4. ברגע שיש כבר גזור כל הדגימות, למקם אותם ב- PBS בקרח ולהעביר אל ברדס תרבות סטרילי עבור השלבים הנותרים של בידוד.
    הערה: עובד גילוח ורחיצה כירורגית ככל האפשר יקטין את פוטנציאל זיהום בתרבויות.
  5. לבצע חתכים קטנים (כ 1-2 מ"מ) בשני קצותיו לקרע, העצמות לפני הכנסתם הטיפים משרטוטי בתוך הצינורות צנטריפוגה.
    הערה: ודא לחתוך מספיקה כך מח יכול להיות centrifuged עם זאת, יש לנקוט כדי למנוע חיתוך מדי כמו תא אוכלוסיות נוטים להשתנות בהתבסס על הקרבה בתוך החלל מח.
  6. צנטריפוגה ב 10,000 x g 15 s בטמפרטורת החדר. ודא כי כל לשד סמוקות, מגורען בחלק התחתון של צינור 1.5 mL אמנם העצמות בתוך השרוול (גם 200 µL pipet עצה או 0.75 מ ל microcentrifuge tube). לאחר כל לשד נאסף, הסר את הכיסויים עם העצמות הצינורות אוסף.
    הערה: אם כל לשד התרוקן, העצמות יופיעו לבן. עם זאת, אם מח נותר בעצמות מסוימות, חיתוך הקצוות שוב ולנסות צנטריפוגה.

3. תא השעיה

  1. באמצעות מחט 25 גרם, למשוך התא. גללים למעלה ולמטה לאט לשבור את הגושים, לשלב את כל הדגימות לתוך צינור חרוטי בודד 15 מ"ל. להוסיף 10 מ של BMSC תרבות המדיה לכל µL 500 דוגמאות.
  2. מקום מסנן מיקרומטר 70 על גבי צינור חרוטי 50 מ ל, עוברים התליה תא במסנן זה כדי להסיר את שברי העצם אפשרי.

4. ציפוי והתרבות של אוכלוסיות מעורבות של תאים במח העצם (כולל BMCs)

הערה: תאים מתורבתים ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור עם 5% CO2.

  1. לחשב את מספר התאים, צלחת אותם ב- 1.0 x 10 תאים/ס מ6 2 בתקשורת תרבות. לאפשר 72 h של מעורב תרבות עבור תאים לצרף.
    הערה: אנו ממליצים דילול תא ההשעיה x 20 תרבות בתקשורת ודילול שוב ב- trypan כחול לפני ספירת התאים באמצעות hemocytometer. עבור עכברים C57Bl6/J זכר בן שבוע 7, אנחנו באופן שגרתי תשואות מספר התא בסביבות 50 x 106 תאים אבל גיל, מין ו זן יכול להשפיע על מספר הטלפון הנייד באופן משמעותי.
    הערה: אוכלוסיה מיקס של תאים צריך לצרף בחלק התחתון של התרבות היטב.
  2. לאחר 72 h, מסיר את המדיה ולהחליף אותו עם מדיה טריים. להמשיך לשנות את המדיה כל יום, בדוק אם confluency אחרים. כאשר התאים מגיעים 80-100% confluency, הם מוכנים בידול.
    הערה: כי תרבות זו הוא מעורב עם BMSCs וגם HSCs, זה יכול ישירות לשמש osteoblastogenesis, adipogenesis, כמו גם osteoclastogenesis.

5. ציפוי והתרבות של האוכלוסייה פיצול של BMSCs (BMSCs חסיד)

הערה: תאים מתורבתים ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור עם 5% CO2.

  1. צלחת כל התאים שנאספו מן עצמות הירך, tibias, עצמות iliac עכבר אחד לתוך תבשיל תרבות 10 ס מ (55 ס מ2 של תרבות).
    הערה: בעת צירוף 2-3 C57BL/6J עכברים, אנחנו צלחת בדרך כלל אוכלוסייה זו 'סה כ' מח עצם בבקבוקון2 150 ס"מ.
  2. לאחר 48 שעות של תרבות מעורבת, מסיר את המדיה תרבות (המכיל את הלא-מחסידי HSCs). אם osteoclastogenesis ניסויים שיש לבצע, להגדיר את אוכלוסיית תאים שאינם מחסידי הצידה (ראו סעיף 7), אם לא, וביופסיה ולמחוק את התאים האלה.
  3. לשטוף את הבקבוק/הצלחת עם PBS בזהירות כדי לא להפריע את התאים המצורפת.
  4. הסר PBS והרם את התאים על ידי הוספת 0.25% טריפסין המקננת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-3 מינימלית כבאות טריפסין על-ידי הוספת מדיה תא התליה תא. בשלב זה, BMSCs, אשר מוסרות כעת, ניתן לספור (שלב קודם לכן בוצע ב 4.1) מצופה לניסויים עתידיים.
  5. לחשב את מספר התאים הדרושים עבור ציפוי. Centrifuge הנפח הנדרש של תא ההשעיה-1000 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: תאים הם בדרך כלל מצופה בהתבסס על ניסויים מובילים. לדוגמה, אם חלבון/רנ א היא להיות מבודד אנחנו בדרך כלל לוחית רישוי-צפיפות גבוהה יותר (~1.0-2.0 x 106 תאים/טוב בצלחת. ובכן 6).
  6. הסר את המדיה, resuspend בגדר תא בהיקף של תרבות התקשורת לצורך ציפוי. צלחת התאים בתקשורת תרבות על פי הניסויים ולאפשר להם לצרף לכמה ימים. כאשר BMSCs מגיעים confluency, להמשיך לבצע בידול.

6. הבידול של BMSCs

  1. תאי העצם
    1. לבצע אוסטאובלסט בידול מדיה על-ידי הוספת µL 800 של 1 מ' β-גליצרול פוספט PBS ו 200 µL של 0.5 M חומצה אסקורבית ב- PBS 99 מ של BMSC תרבות המדיה (ראה צעד 1.1 ההרכב של התקשורת התרבות BMSC).
      1. לאחר BMSCs תרבויות (סה כ BMCs מ שלב 4.3) או מחסידי BMSCs מהשלב 5.6 confluent, להבדיל אותם לתוך תאי העצם על ידי מיתוג התקשורת תרבות אוסטאובלסט בידול מדיה.
    2. החלף את המדיה בידול בכל יום אחר. התאים להתחיל בהפקת גושים לבנים של מינרליזציה. דמיינו אותם בעין בלתי מזוינת בתחתית הבאר; תהליך זה יכול להתרחש תוך מספר ימים עד שלושה שבועות.
      1. על מנת להעריך osteoblastogenesis, לבצע צביעת phosphatase אלקליין ו/או פון Kossa מכתים בכל הנוגע לבארות כמתואר בסעיף 8.
        הערה: לשנות את התקשורת בקפידה על-ידי הטיית הלוחות בזווית קלה על מנת למנוע שיבוש טפט תא.
  2. Adipocytes
    1. הפוך מדיה הבסיס adipocyte על ידי ערבוב יחד 90 מ"ל של גלוקוז גבוהה Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM), 10 מ של העובר סרום שור, 1 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין, 100 µL 20 מ מ רוזיגליטזון 100 µL של 2 מ מ אינסולין. אם יש צורך, לאחסן מדיה זו ב 4 מעלות צלזיוס במשך השבוע במהלך הניסוי בידול.
    2. להפוך את המדיה אינדוקציה adipocyte על-ידי הוספת µL 200 של 62.5 מ מ 3-איזובוטיל-1-methylxanthine (IBMX), µL 25 של 1 מ מ דקסמתזון 25 מ של Adipocyte בסיס מדיה.
    3. לאחר BMSCs תרבויות (סה כ BMCs מ שלב 4.3) או מחסידי BMSCs מהשלב 5.6 confluent, לשנות את המדיה מדיה אינדוקציה adipocyte. שקול את? היום הזה 0 של בידול.
    4. לאחר 48 שעות, מסיר את המדיה ולרענן את התרבות עם מדיה אינדוקציה adipocyte.
    5. ביום הרביעי, לעבור מדיה הבסיס adipocyte.
      הערה: טיפות השומנים יכול להתחיל להופיע מוקדם ככל יום 2 או 4 ביום.
    6. יום 7, להתבונן כי תאים הצטברו טיפות השומנים המרבי ולהציג את הפנוטיפ דומה adipocyte בוגר. לא תרבות מעבר לנקודה הזאת, זה עלול לגרום לתא המוות/ניתוק.

7. הבידול של HSCs לתוך Osteoclasts

  1. להפוך אוסטאוקלסט בידול מדיה על-ידי הוספת µL 50 µg 25/mL של קולטן Activator של NFKB ליגנד (רנקל) ו 15 µL של µg/mL 25 של מקרופאג גורם מגרה המושבה (mCSF) 25 מ של BMSC תרבות המדיה.
  2. ברגע של BMCs הכולל (מתוך שלב 4.3) או את התאים שאינם מחסידי (מתוך שלב 5.2) מחוברים היטב, ניתן להחזירו תרבות המדיה אוסטאוקלסט בידול מדיה. לחדש בידול מדיה בכל יום אחר.
  3. להתבונן התרבויות אוסטאוקלסט כל יום תחת מיקרוסקופ בהגדלה X 10. שים לב כי osteoclasts נתיך ויוצרים תאים multinucleated, בדרך כלל סביב יום 5-7 של בידול.

8. מכתים

  1. תאי העצם
    הערה: אלקליין פוספטאז (AP) ההכתמה, אנחנו לעתים קרובות להשתמש AP צביעת קיט (ראה טבלה של חומרים) על פי ההנחיות.
    1. לבצע AP צביעת על-ידי ביצוע ההנחיות של ערכת היצרן.
      1. האחות מדיה ולשטוף תאים עם PBS. לתקן את התאים עם 4% Paraformaldehyde (PFA) ב- PBS במשך 12 דקות בטמפרטורת החדר.
      2. בינתיים, להפוך את הפתרון AP באמצעות של ריאגנטים מנקודת הגישה מכתים הערכה על-ידי הוספת 500 µL נתרן חנקיתי כדי פתרון FRV-אלקליין 500 µL ולערבב בעדינות; משהים 2 דק להוסיף 22.5 מ ל dH2O ו- 500 µL Naphthol AS-BI אלקליין. מערבבים בעדינות.
        התראה: PFA הוא רעיל, יש לטפל בזהירות.
      3. ברגע התאים קבועים, לשטוף עם PBS ולהוסיף AP פתרון מכל קידוח (1-2 מ לכל טוב). מכסים בנייר כסף ומכניסים הכתם לתת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. וארוקן את הפתרון, לשטוף עם מים מזוקקים, ולאפשר את הצלחת לייבש.
    2. לרכוש תמונות של המושבות מוכתם בעזרת מצלמה על מנת לצפות תאים חיוביים phosphatase אלקליין.
    3. לחלופין, לבצע פון Kossa במקום phosphatase אלקליין מכתים. בשביל זה, בארות לשטוף ביסודיות עם מים מזוקקים כמו כל PBS הנותרים לזרז עם חנקת הכסף.
      1. לתקן את התאים עם 4% מחברים ב- PBS במשך 12 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף 5% מספיק כסף חנקתי לפתרון מכסה הבאר, לחשוף בפני אור חזק לשעה בטמפרטורת החדר.
    4. להסיר את חנקת ולשטוף כל טוב עם מים מזוקקים. להוסיף 5% נתרן תיוסולפט פתרון לתאים, משהים 3 דקות.
    5. האחות של נתרן תיוסולפט, לשטוף עם מים מזוקקים. תן את הצלחת לייבש ולבחון את הפיקדון מינרלים צבעונית בחום כהה/שחור בעין בלתי מזוינת.
  2. Adipocytes
    1. עבור צביעת שמן אדום O (אורו), לתקן את התאים באמצעות 10% נייטרלי Buffered פורמלין לשעה בטמפרטורת החדר.
    2. בינתיים, להפוך את הפתרון מניות אורו על ידי המסת 0.035 g ב- 10 מ"ל של אלכוהול איזופרופיל. . זה מספיק בשביל צלחת 6-. טוב. לערבב ולהעביר את הפתרון באמצעות נייר סינון אחד (נקבוביות בגודל 11 מיקרומטר).
    3. הפוך את הפתרון עובד אורו על ידי דילול 9 מ של פתרון מניות אורו, עם 6 מ של מים מזוקקים. לעזוב את הפתרון על כיסא נדנדה עד מוכן לשימוש.
    4. להכין 60% אלכוהול איזופרופיל במים מזוקקים (מרוויח מספיק כדי לכסות את כל טוב).
    5. לאחר התאים קבועים, להסיר את פעם אחת לשבועיים, תשטוף עם מים מזוקקים. להחליף את המים עם הפתרון אלכוהול איזופרופיל 60% 1 דקות.
      הערה: להוסיף נוזלים באיטיות תוך המפנה את הצלחת; adipocytes מכך בקלות רבה.
    6. להסיר את אלכוהול איזופרופיל ולהוסיף פתרון עובד מספיק אורו כדי לכסות את כל התאים. תקופת דגירה של 15 דקות על כיסא נדנדה במהירות נמוכה בטמפרטורת החדר. להסיר את אורו, לשטוף פעמיים עם מים מזוקקים.
      הערה: בשלב זה, השומנים שהוכתמו אורו טיפות ניתן לאבחן מתחת למיקרוסקופ.
    7. כדי לכמת את אורו, destain את אורו על-ידי הוספת 1 מ"ל של 100% אלכוהול איזופרופיל כל טוב ועל ידי מתנדנד באיטיות במשך 10 דקות.
    8. בינתיים, להכין סדרה דילול ליצירת עיקול רגיל המבוסס על תקני 8 הבאים באמצעות פתרון עובד אורו (2,100 µg/mL), אלכוהול איזופרופיל כמו diluent: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 ו 0 µg/mL.
    9. לטעון µL 200 של הסטנדרטים ודוגמאות destained ב triplicates בצלחת ולקרוא את ספיגת 490 nm.
      1. לקבוע ריכוז של אורו עבור כל דגימה בהתבסס על העקומה סטנדרטי.
        הערה: מומלץ נרמול הריכוז אורו אל מספר הטלפון הנייד. ניתן לכמת את המספר על ידי קריסטל ויולט להכתים או כמות ה-DNA.
  3. Osteoclasts
    הערה: כשאתה מוכן, אנו מציעים מכתים osteoclasts עבור שימוש ההכתמה מלכודת פוספטאז חומצה Tartrate עמידים (השמנה) קיט (ראה טבלה של חומרים).
    1. על מלכודת מכתים, לתקן תאים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם גלוטראלדהיד 2.5% ב- PBS. בינתיים, להפוך את הפתרון מלכודת על ידי ערבוב יחדיו. µL 50 בפתרון מהיר נופך בסיס, 50 µL של נתרן חנקיתי, 4.55 מ ל מים מזוקקים, µL 50 Napthol AS-Biphosphate, µL 200 של אצטט פתרון, פתרון Tartrate µL 100.
    2. האחות הנחה לשבועיים, ולשטוף את התאים עם PBS פעמיים לפני הוספת פתרון מלכודת 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
    3. לשטוף עם מים מזוקקים לפני שספר osteoclasts תחת מיקרוסקופ (הגדלה 10 X). התאים מלכודת+ מופיעים סגול עם 3 או יותר גרעינים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סקירה של התרבויות תא
טכניקות תרבות שני אפשר לפצל ההערכה של בידול על אוכלוסייה מעורבת של BMCs של BMSCs ו- HSCs (סה כ BMCs, איור 1A) או אוכלוסייה של BMSCs מ- HSCs (מחסידי BMSCs, איור 1B). hr 48 לאחר בתאים ממח מבודדים, מצופה (איור 1C), הם במהירות לצרף התחתית לצלחת פלסטיק תרבות, נוטים ליצור של טפט. ברגע התאים להגיע למפגש (איור 1D), הם יכולים לשמש עבור מבחני בידול.

BMSCs הבדיל לתוך תאי העצם
יכול להיות מובחן תרבויות confluent BMSCs תאי העצם באמצעות מדיה osteogenic המורכב של חומצה אסקורבית וβ-גליצרול פוספט (איור 2 א, ב'). לאחר כמה ימים של בידול, תאי העצם להתחיל לבטא phosphatase אלקליין (איור 2C). בידול נוסף יפעיל מטריקס דמוי עצם הייצור ובסופו של דבר את מינרליזציה של מטריצה זו (איור דו-ממדי). מעניין, רק שיעור של התאים להבדיל לתוך תאי העצם בתוך חוץ גופית. אכן, מכתים עם קריסטל ויולט (איור 2E) מגלה כי לא כל התאים אקספרס phosphatase אלקליין או mineralize את הצלחת.

BMSCs הבדיל לתוך Adipocytes
Adipogenesis יכול להיבדק על תרבויות של BMCs מעורבים, כמו גם על האוכלוסייה הסלולרי יותר הומוגני. כפי שנצפה עם אוסטאובלסט בידול, בין אם נעשה שימוש האוכלוסיות המעורבות (איור 3A) או האוכלוסיות פיצול (איור 3B), רק שיעור של התאים הם adipogenic. Adipocytes מופיעים עגול עם וקואלות השומנים מספר זה יכול להיות מוכתם באדום עם אורו (איור 3C). מניסיוננו, במבחנה adipocytes תמיד מופיעים רב vacuolated בניגוד adipocytes ויוו לבן. ההבדלים בין תנאי גנוטיפ או תרבות יכולים להעלות adipogenesis לנקודת לנתק ואיפה לצוף בצלחת תרבות adipocytes. כדי לפתור בעיה זו, ניתן לעצור את הניסוי adipogenesis בנקודת זמן קודמת.

HSCs הבדיל לתוך Osteoclasts
Osteoclastogenesis יכולה להיגרם בתרבויות על ידי שכשהם התקשורת עם mCSF ועם רנקל. HSCs להתחיל נתיך במהירות כדי ליצור תאים multinucleated כתם חיובי עבור השמנה (איור 4A). Osteoclasts האלה מסוגלים resorbing מטריקס מינרלים במבחנה , וכך ניתן להשתמש כדי להעריך את פעילות osteoclastic (איור 4B).

Figure 1
איור 1: ציר סכמטי של הפרוטוקולים של התרבות של BMSCs ו- HSCs. טכניקות תרבות אחרת להניב BMCs הכולל מורכב אוכלוסייה מעורבת של תאים (A) או מחסידי BMSCs (B). תמונת הנציגה של תרבות BMSCs מבודד C57B6/J עכברים 48 hr לאחר ציפוי שלהם (C), לאחר מכן הם מתפצלים מ- HSCs (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : תמונות של בארות של תרבויות BMSCs הבדיל לתוך תאי העצם. BMSCs (א) לפני ואחרי (B) שיוצבו בתקשורת osteogenic. יכול להיות מוכתם תאי העצם עבור הביטוי phosphatase אלקליין בוורוד (C), מינרליים הפקדה בראון (D). קריסטל ויולט יכול לשמש כדי לייצג מספר הטלפון הנייד לאחר בידול (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: להחליפן בתמונות של התרבויות של BMSCs הבדיל לתוך adipocytes. שהוכתמו אורו adipocytes המתקבל אוכלוסייה מעורבת של BMSCs (א) ותרבות פיצול (B) לאחר 7 ימים בתקשורת adipogenic. התמונה של adipocyte מוכתם אורו (C). כימות של אורו לאחר 7 ימים בתקשורת adipogenic לפני (D) ואחרי (E) נורמליזציה כדי ספיגת קריסטל ויולט. הנתונים מוצגים כאמצעי עם קווי שגיאה המייצג את שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: HSCs תרבויות הבדיל לתוך osteoclasts. השמנה מכתים של osteoclasts מופיעה תאים גדולים סגול-ורוד multinucleated (א). על בסיס מינרלים מן השטח צבעונית בשחור על ידי פון Kossa עם ספיגת החורים שהותירו osteoclasts תריז HSCs לאחר 7 ימים (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במאמר זה, שתי שיטות של התרבות של BMSCs מוצגים עם המגבלות והיתרונות שלהן. בידוד תאים מגיע ממח העצם הוא תהליך יחסית ללא מאמץ. עם זאת, קבלת אוכלוסיה תא נציג של גזע mesenchymal או אבות osteoclastic יכול להיות מאתגר בשל הסביבה התאית מגוונות של חלל מח.

Culturing מכלול של התכנים מח עצם מספק ייצוג קרוב של microenvironment ויוו . עדיין, לבודד תאים מקבוצות שונות של עכברים (אחרים, טיפולים, הגילאים, וכו ') עלולה להביא מספר שונה של BMSCs או HSCs על הקמתה של הניסוי במבחנה . לכן, הפרדת BMSCs ואת HSCs ואת מחדש ציפוי אותם לאפשר שליטה טובה יותר על המספר הסלולרי בתחילת הניסוי בידול. עם זאת, צמצום של הטרוגניות של התרבות תאים עשויים להשפיע על התוצאות של BMSCs או HSCs כפי מפרישים שניהם גורמים המשפיעים על בידול mesenchymal ו- osteoclastic. חשוב לקחת בחשבון מגבלות אלה בעת תכנון הבידוד של התרבות של BMSCs ושל HSCs.

ריבוי של אוכלוסיות תאים הנמצאים במח העצם יכול להציג את האתגרים של פרשנות של הנתונים. בנוסף HSCs BMSCs, microenvironment מח העצם מכיל גם תאים חיסוניים, תאי דם אדומים, תאי אנדותלוכו '. אוכלוסיות אלה עשויים להישאר בתוך השבר חסיד או שאינו חסיד, כך יכול להשפיע על התוצאות ניסיוני. מיון BMSCs יכול להיות אופציה על מנת להשיג אוכלוסיה תא "מזוכך". אכן, BMSCs נחשבים לבטא CD34 בזמן HSCs עושה לא10. עם זאת, גם הוצע כי העדר CD34 על פני השטח של BMSCs עשוי להיות התוצאה של תרבות, מחקר הראה כי קבוצת משנה שאינו חסיד של CD34+ BMSCs יכול להתמיין אוסטאובלסט, adipocytes ו- chondrocytes11, 12. לפיכך, כאשר בוחנים מיון כדי לבודד BMSCs, מערך של סמנים מוגדרים היטב צריך להיות מתוכנן מראש. מכשולים אחרים למיון תא תזמון הינם עלות. אכן, הוספת שלב המיון יכול להאריך את הזמן של הבידוד פרוטוקול במידה ניכרת כמו גם עלייה משמעותית עלות. לסיכום, מיון תאים מציגים אתגרים טכניים עלולה להפחית את התשואה ואיכות BMSCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לחשוף כי להם אין אינטרסים כספיים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R01 AR061164-01A1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200μL pipet tips  Rainin 17014401
1.5 mL centrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
15 mL conical tube  VWR 89039-668
50 mL conical tube VWR 89039-660
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Sigma-Aldrich 21-040-CM
Ethanol Fisher Science 04-355-451
Dissection tools
70 μm filters BD Falcon 352350
0.25% trypsin Gibco 25200
Kimwipe VWR 82003-820
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 15710
Alkaline Phosphatase kit Sigma-Aldrich 86R
Silver Nitrate Sigma-Aldrich S6506
Sodium Thiosulfate Sigma-Aldrich S7026
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
Isopropanol Sigma-Aldrich 190764
10% Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
Whatman filter Grade 1 Sigma-Aldrich Z274852
Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit Sigma-Aldrich 387A
Glutaraldehyde Electron 16220
MEMα Gibco 12571
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
β-glycerol phosphate Sigma-Aldrich G9891
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
DMEM High Glucose  Sigma-Aldrich D5796
Rosiglitazone Cayman Chemical 717410
Insulin Sigma-Aldrich I6634
IBMX Sigma-Aldrich I5879
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
RANKL Peprotech 310-01
mCSF Peprotech 315-02
Axio Observer inverter microscope Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
  2. Chen, T. L. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone. 35 (1), 83-95 (2004).
  3. Kokabu, S., et al. BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b. Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).
  4. Ghali, O., et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation. BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).
  5. Kretlow, J. D., et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells. BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).
  6. DeMambro, V. E., et al. Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss. Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).
  7. Maridas, D. E., et al. IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner. J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).
  8. Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).
  9. Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  10. Abdallah, B. M., et al. CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells. Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).
  11. Akiyama, K., et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension. Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).
  12. Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells? Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 131 Mesenchymal בידוד בידול אוסטאובלסט adipocytes osteoclasts
בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E.,… More

Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice. J. Vis. Exp. (131), e56750, doi:10.3791/56750 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter