Summary
في هذه المقالة، نقدم طرق لعزل والتفريق بين الخلايا اللحمية في النخاع العظمى والخلايا الجذعية المكونة للدم من العظام الطويلة الماوس. وترد اثنين من البروتوكولات المختلفة الغلة السكان خلية مختلفة مناسبة للتوسع والتمايز في خلايا الاوستيوبلاستس و adipocytes والأكلة.
Abstract
نخاع العظم stromal خلايا (بمسكس) يشكل عدد سكانها خلية تستخدم بشكل روتيني كتمثيل الخلايا الجذعية الوسيطة في المختبر. يقيمون داخل تجويف نخاع العظم جنبا إلى جنب مع الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)، التي يمكن أن تؤدي إلى خلايا الدم الحمراء وفروعه محصنة والأكلة. وهكذا، عمليات استخراج سكان خلية من نتائج نخاع العظام في خليط غير متجانس جداً سكان الخلية المختلفة، التي يمكن أن تشكل تحديات في التصميم التجريبي وارباك تفسير البيانات. وضعت عدة العزلة وتقنيات الثقافة في المختبرات من أجل الحصول على السكان متجانسة أكثر أو أقل من بمسكس وهسكس invitro. هنا، نحن نقدم طريقتين لعزل بمسكس وهسكس من العظام الطويلة الماوس: أسلوب واحد التي تسفر عن عدد سكان مختلطة من بمسكس وهسكس وأسلوب واحد أن المحاولات الرامية إلى فصل السكان الخلية اثنين استناداً إلى الالتزام. توفر كلا أساليب مناسبة للخلايا أوستيوجينيك، والتمايز أديبوجينيك تجارب معبراً كذلك وظيفية.
Introduction
بمسكس مورين الأولية تستخدم عادة كنموذج في المختبر للخلايا الجذعية الوسيطة منذ اكتشافهم في مطلع الثمانينات1. وفي الواقع، صون ثقافات خلايا البلاستيكية-تمسكا مسح من تجويف نخاع العظام الطويلة القدرة على تكون متباينة في adipocytes في العديد من الدراسات2،3، ، تشوندروسيتيس، خلايا الاوستيوبلاستس أو الآكلة 4 , 5-بيد أن نخاع العظم نسيج فريد يتألف من العديد من السكان خلية مختلفة بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، بمسكس، الخلايا البطانية، ومحصنة ضد هسكس،. وهكذا، العزلة وتقنيات الثقافة يمكن أن تسفر عن السكان خلية مع التجانس مختلفة. باستخدام هذه التقنيات لاختبار المفاضلة المحتملة من الخلايا يمكن أن يكون تحديا. على سبيل المثال، عند مقارنة الخلايا من الفئران مع الأنماط الجينية المختلفة، بدءاً خلايا مختلطة سكان حدود تفسير البيانات. على العكس من ذلك، الحصول على السكان متجانسة بمسكس وهسكس يمكن أن يكون صعباً من الناحية التقنية ولا يجوز كممثل من طراز السابقين فيفو .
في المختبر، نحن مهتمون أساسا في الاستفادة بمسكس بسبب قدرتها على أن تكون متمايزة إلى خلايا الاوستيوبلاستس والأكلة adipocytes. نقدم هنا، تقنيات العزل بمسكس وهسكس والثقافة المستخدمة لتقييم أوستيوبلاستوجينيسيس أو أديبوجينيسيس في المختبر، وكذلك الثقافات هسكس تفرق في الآكلة. يستخدم أسلوب واحد سكان مختلطة من "خلايا نخاع العظام" (بمكس) التي تحتوي على بمسكس وهسكس مباشرة مناسبة أديبوجينيسيس وأوستيوبلاستوجينيسيس وأوستيوكلاستوجينيسيس (تسمى بمكس المجموع). هذا الأسلوب توثيق السابقين فيفو تمثيل لعدم تجانس وجدت بين خلايا المكروية نخاع العظام. أسلوب آخر يفصل ملتصقة من الخلايا غير ملتصقة في محاولة لثقافة السكان "أنقى" بمسكس وهسكس (تسمى بمسكس ملتصقة). يسمح أسلوب لاحق ثقافة الخلية والتجارب للبدء بعدد أكثر دقة من بمسكس أو هسكس ويقلل من إمكانات مجمع الآثار غير المباشرة للسكان الخلية الأخرى التي ما زالت في الثقافة. نشرت كلا الأسلوبين سابقا وتستخدم لمعالجة مختلف البحوث الأسئلة6،7،،من89.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافق جميع الإجراءات التجريبية برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في معهد البحوث الطبية مين مركز.
1-جمع أنابيب إعداد
- جعل وسائل الإعلام الثقافة بمسك باستكمال "الحد الأدنى الأساسية المتوسطة" α (MEM α) مع 10% "مصل بقرى الجنين" و 1% من البنسلين/ستربتوميسين.
- ضع 100 ميليلتر من وسائط الثقافة بمسك في أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. 3 عظام تناسب عادة في أحد أنبوب واحد لذا تعد تبعاً لذلك.
- قص نهايات 200 ميليلتر ماصة نصائح كافية حيث أن ما يصلح في أنابيب أجهزة الطرد المركزي. إدراج النصائح داخل الأنابيب والتأكد من أنه يمكن إغلاق الأغطية قبل وضع الأنابيب في الجليد.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، أنابيب 0.75 مل ميكروسينتريفوجي مع قطع ينتهي يمكن إدراجها في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
2. الحصاد للعظام من الفئران
- Euthanize الحيوانات استخدام CO2 متبوعاً بخلع عنق الرحم ورذاذ لهم مع الإيثانول 70%.
ملاحظة: تأكد من أن يتم استخدام الحيوانات من نفس الجنس، ويفضل أن يكون ذلك في نفس الفئة العمرية. ونحن نستخدم بشكل روتيني الحيوانات الذين تتراوح أعمارهم بين 7 إلى 8 أسابيع. ونحن نوصي تجميع الخلايا من الحيوانات على الأقل 3 كل المجموعات التجريبية تسفر عن عدد سكان تمثيلاً واستنساخه من خلية أفضل. -
ضع الماوس يوثانيزيد على ظهرها على لوح تشريح. استخدام الملقط لإنشاء خيمة للجلد في البطن. إجراء شق صغير (حوالي 1 سم) باستخدام مقص تشريح العقيمة. قشر الجلد نحو أطرافه والقدمين من القطع من أجل فضح أسفل البطن والساقين.
- قص أسفل الكاحل مشتركة لإزالة القدم. قص على طول الحرقفي في الورك لفصل رأس عظم الفخذ من هيببوني. أن الماوس لا يزال على ظهرها، فجعل شق في وسط هيببوني فصل اثنين من العظام الحرقفي.
- استخدام مناديل خالية من الوبر، بعناية إزالة العضلات من قصبة، وتيبياس، وعظام حرقفي.
ملاحظة: قطع جزء كبير من الأوتار والعضلات من العظام كما يجعل من الممكن تنظيف أسرع وأسهل مع المسحات خالية من الوبر (مثلاً، كيمويبيس). توخ الحذر عند التعامل مع العظام كما أنها تميل إلى كسر بسهولة، ويمكن زيادة هشاشتها مع بعض الأنماط الجينية. - مرة واحدة وقد تم تشريح جميع العينات، وضعها في برنامج تلفزيوني على الجليد والانتقال إلى غطاء ثقافة عقيمة للخطوات المتبقية من العزلة.
ملاحظة: يعمل أسيبتيكالي بقدر الإمكان سوف يقلل احتمال التلوث في الثقافات. - إجراء تخفيضات صغيرة (حوالي 1-2 مم) في كلا نهايات العظام الدانية والبعيدة قبل وضعها في نصائح مقطعة داخل أنابيب الطرد المركزي.
ملاحظة: تأكد من لخفض كمية كافية حتى أنه يمكن فصل نخاع؛ ومع ذلك، يجب الحرص على تجنب قطع الكثير كما يميل السكان خلية تختلف استناداً إلى قرب داخل الفضاء نخاع. - أجهزة الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 15 ثانية في درجة حرارة الغرفة. ضمان أن جميع النخاع مسح والقريبون في الجزء السفلي من الأنبوب 1.5 مل بينما العظام داخل إدراج (أما 200 ميليلتر بيبيت تلميح أو 0.75 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة). حالما يتم تجميع كافة النخاع، إزالة إدراج مع العظام من أنابيب جمع.
ملاحظة: إذا كان يتم مسح كافة النخاع، سوف تظهر العظام بيضاء. ومع ذلك، إذا بقيت نخاع العظام معينة، حاول قطع ينتهي مرة أخرى والطرد المركزي.
3. تعليق الخلية
- استخدام إبرة ز 25، سحب الخلية الكريات صعودا وهبوطاً ببطء تفتيت كتل وضم جميع العينات في أنبوب مخروطي واحد 15 مل. أضف 10 مل من "بمسك الثقافة الإعلامية" الواحدة 500 ميليلتر من العينات.
- وضع عامل تصفية 70 ميكرومتر على رأس أنبوب مخروطي 50 مل ويمر بتعليق خلية عامل التصفية هذا لإزالة شظايا العظام ممكن.
4-طلاء وثقافة السكان مختلطة من خلايا نخاع العظام (مجموع بمكس)
ملاحظة: الخلايا تستزرع في 37 درجة مئوية في حاضنة مع شركة 5%2.
- حساب عدد الخلايا ولوحة لهم في 1.0 × 106 خلايا/سم2 في ثقافة وسائل الإعلام. تسمح ح 72 الثقافة المختلطة للخلايا لإرفاق.
ملاحظة: نوصي بتمييع x 20 تعليق خلية في ثقافة وسائل الإعلام، وتمييع مرة أخرى في تريبان الأزرق قبل عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير. لذكور الفئران C57Bl6/ي عمرها 7 الأسبوع، نحن بشكل روتيني تسفر عن عدد خلايا من حوالي 50 × 106 خلايا لكن العمر والجنس، والإجهاد يمكن أن يؤثر على عدد الخلايا إلى حد كبير.
ملاحظة: عدد سكانها مزيج من الخلايا ينبغي إرفاق في الجزء السفلي من الثقافة جيدا. - بعد 72 ساعة، قم بإزالة الوسائط والاستعاضة عنه بوسائط جديدة. متابعة تغيير وسائل الإعلام كل يوم والتحقق من كونفلوينسي الأخرى. عندما تصل الخلايا إلى 80-100% كونفلوينسي، أنهم مستعدون للتمايز.
ملاحظة: نظراً لأن هذه الثقافة هي مختلطة مع كل من بمسكس وهسكس، مباشرة استخدامها أوستيوبلاستوجينيسيس، أديبوجينيسيس، فضلا عن أوستيوكلاستوجينيسيس.
5-طلاء وثقافة انقسام السكان من بمسكس (بمسكس ملتصقة)
ملاحظة: الخلايا تستزرع في 37 درجة مئوية في حاضنة مع شركة 5%2.
- لوحة كافة الخلايا التي جمعت من قصبة، وتيبياس، وعظام حرقفي واحدة بالماوس إلى طبق ثقافة 10 سم (55 سم2 من مجال الثقافة).
ملاحظة: عند تجميع الفئران C57BL/6J 2-3، ونحن عادة لوحة هذا السكان 'مجموع' نخاع العظام في قارورة2 سم 150. - بعد 48 ساعة ثقافة المختلطة، قم بإزالة وسائط الثقافة (التي تحتوي على هسكس غير ملتصقة). إذا كان إجراء التجارب أوستيوكلاستوجينيسيس، تعيين هذه الفئة من السكان من الخلايا غير ملتصقة جانبا (راجع القسم 7)، أن لم يكن، أسبيراتي وتجاهل هذه الخلايا.
- تغسل في اللوحة/قارورة مع برنامج تلفزيوني بعناية فيما يتعلق بعدم الإزعاج الخلايا المرفقة.
- إزالة برنامج تلفزيوني ورفع الخلايا عن طريق إضافة 0.25% التربسين وتفرخ في 37 درجة مئوية للطفايات التربسين كحد أدنى 1-3 عن طريق إضافة الوسائط المحمولة إلى تعليق خلية. عند هذه النقطة، بمسكس، الذي رفع الآن، يمكن عد (كما فعلت سابقا في الخطوة 4، 1) ومطلي للتجارب المقبلة.
- حساب عدد الخلايا بحاجة للطلاء. الطرد المركزي وحدة التخزين المطلوب من تعليق خلية في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يتم مطلي عادة الخلايا استناداً إلى تجارب نقطة النهاية. على سبيل المثال، إذا كان البروتين/الجيش الملكي النيبالي أن تكون معزولة ونحن عادة لوحة في كثافة أعلى (~1.0-2.0 x 106 خلايا/بئر في لوحة 6-جيدا). - قم بإزالة الوسائط وريسوسبيند بيليه الخلية في الحجم للثقافة الإعلامية اللازمة للطلاء. لوحة الخلايا في ثقافة وسائل الإعلام وفقا للتجارب والسماح لهم بإرفاق لبضعة أيام. عندما تصل بمسكس إلى كونفلوينسي، المضي قدما لإجراء المفاضلة.
6-التفريق بين بمسكس
-
خلايا الاوستيوبلاستس
- جعل osteoblast التمايز وسائط الإعلام عن طريق إضافة 800 ميليلتر من م 1 β-والغليسيرول الفوسفات في برنامج تلفزيوني و 200 ميليلتر من حمض الأسكوربيك 0.5 م في برنامج تلفزيوني إلى 99 مل وسائط الثقافة بمسك (راجع الخطوة 1.1 لتشكيل وسائل الإعلام ثقافة بمسك).
- بمجرد المتلاقية الثقافات بمسكس (بمكس مجموع من الخطوة 4، 3) أو ملتصقة بمسكس من الخطوة 5، 6، التفريق بينهم في خلايا الاوستيوبلاستس بتبديل وسائط الثقافة إلى osteoblast التمييز بين وسائل الإعلام.
- استبدال وسائط الإعلام تمايز كل يوم. تبدأ الخلايا المنتجة للعقيدات البيضاء التمعدن. تصور لهم بالعين المجردة في الجزء السفلي من البئر؛ يمكن أن تحدث هذه العملية في غضون بضعة أيام إلى 3 أسابيع.
- وبغية تقييم أوستيوبلاستوجينيسيس، أداء تلطيخ الفوسفاتيز القلوية و/أو فون كوسي تلطيخ في الآبار كما هو موضح في القسم 8.
ملاحظة: تغيير وسائط الإعلام بعناية عن إمالة لوحات بزاوية طفيفة لتجنب اضطراب أحادي الطبقة الخلية.
- وبغية تقييم أوستيوبلاستوجينيسيس، أداء تلطيخ الفوسفاتيز القلوية و/أو فون كوسي تلطيخ في الآبار كما هو موضح في القسم 8.
- جعل osteoblast التمايز وسائط الإعلام عن طريق إضافة 800 ميليلتر من م 1 β-والغليسيرول الفوسفات في برنامج تلفزيوني و 200 ميليلتر من حمض الأسكوربيك 0.5 م في برنامج تلفزيوني إلى 99 مل وسائط الثقافة بمسك (راجع الخطوة 1.1 لتشكيل وسائل الإعلام ثقافة بمسك).
-
Adipocytes
- جعل adipocyte قاعدة وسائط الإعلام بخلط معا 90 مل دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دميم) ارتفاع الجلوكوز، 10 مل من "المصل البقري الجنين"، 1 مل من البنسلين/ستربتوميسين، 100 ميليلتر 20 مم روزيقليتازون وميليلتر 100 مم 2 الأنسولين. إذا لزم الأمر، قم بتخزين الوسائط هذا عند 4 درجة مئوية في الأسبوع خلال التجربة بالتمايز.
- جعل الإعلام التعريفي adipocyte بإضافة 200 ميليلتر من 62.5 مم 3-إيسوبوتيل-1-زانتين (إيبمكس) و 25 ميليلتر من 1 مم الديكساميتازون إلى 25 مل من Adipocyte قاعدة الوسائط.
- بمجرد المتلاقية الثقافات بمسكس (بمكس مجموع من الخطوة 4، 3) أو ملتصقة بمسكس من الخطوة 5، 6، تغيير وسائط الإعلام إلى adipocyte تحريض وسائل الإعلام. النظر في هذا اليوم 0 من التفريق.
- بعد 48 ساعة، قم بإزالة الوسائط وتحديث الثقافة مع adipocyte تحريض وسائل الإعلام.
- في يوم 4، قم بالتبديل إلى adipocyte قاعدة الوسائط.
ملاحظة: قطرات الدهن يمكن أن تبدأ في الظهور في أقرب وقت يوم 2 أو 4 يوم. - في يوم 7، ويلاحظ أن الخلايا تراكمت قطرات الدهن الأقصى وعرض النمط الظاهري شبيه adipocyte ناضجة. الثقافة لا في الماضي هذه النقطة، كما قد تؤدي إلى موت الخلايا/مفرزة.
7-التفريق بين هسكس في الآكلة
- جعل "اوستيوكلاست التمايز وسائط الإعلام" عن طريق إضافة 50 ميليلتر من 25 ميكروغرام/ملليلتر من مستقبلات المنشط من NFKB يجند (رانكل) و 15 ميليلتر من 25 ميكروغرام/مل من بلعم "عامل تحفيز مستعمرة" (مكسف) إلى 25 مل من "بمسك الثقافة الإعلامية".
- بمجرد بمكس مجموع (من الخطوة 4، 3) أو الخلايا غير ملتصقة (من الخطوة 5، 2) موصولة شكل جيد، يمكن أن تحول ثقافة وسائل الإعلام اوستيوكلاست التمييز بين وسائل الإعلام. تجديد التمايز وسائل الإعلام كل يوم.
- احترام الثقافات اوستيوكلاست كل يوم تحت مجهر بتكبير X 10. ويلاحظ أن الآكلة الصمامات وشكل الخلايا مولتينوكليتيد، عادة حوالي اليوم 5-7 من التفريق.
8-تلطيخ
-
خلايا الاوستيوبلاستس
ملاحظة: لتلطيخ الفوسفاتيز القلوي (AP)، ونحن غالباً ما تستخدم تلطيخ AP كيت (انظر الجدول للمواد) وفقا للمبادئ التوجيهية.- أداء تلطيخ AP باتباع إرشادات الشركة المصنعة كيت.
- نضح وسائط الإعلام وشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا مع 4% بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني لمدة 12 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- وفي الوقت نفسه، جعل الحل AP باستخدام الكواشف من وكالة اسوشييتد برس تلطيخ كيت بإضافة 500 ميليلتر "نتريت الصوديوم" 500 ميليلتر الحل FRV القلوية والاختلاط بلطف؛ اسمحوا الوقوف لدقيقة 2 إضافة 22.5 مل dH2س و 500 ميليلتر نافثول AS-بي "القلوية". المزيج بلطف.
تنبيه: منهاج عمل بيجين هو السامة ويجب التعامل معها بحذر. - حالما يتم إصلاح الخلايا، شطف مع برنامج تلفزيوني وإضافة حل وكالة اسوشييتد برس لكل بئر (1 إلى 2 مل في البئر). وتغطي برقائق الألومنيوم ووصمة عار واسمحوا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. نضح الحل ويغسل بماء مقطر وتسمح اللوحة لتجف.
- الحصول على صور مستعمرات ملطخة باستخدام كاميرا من أجل مراقبة الخلايا إيجابية الفوسفاتيز القلوية.
- وبدلاً من ذلك إجراء كوسي فون بدلاً من تلطيخ الفوسفاتيز القلوية. ولهذا الغرض، سوف يعجل بالآبار يغسل جيدا بالماء المقطر كأي برنامج تلفزيوني المتبقية مع نترات الفضة.
- إصلاح الخلايا مع 4% منهاج العمل في برنامج تلفزيوني لمدة 12 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، إضافة كافية محلول نترات الفضة 5% لتغطية البئر وفضح إلى ضوء قوي ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة محلول نترات الفضة وشطف كل بئر بماء مقطر. إضافة 5% من محلول ثيوكبريتات الصوديوم إلى الخلايا واسمحوا الوقوف لمدة 3 دقائق.
- نضح ثيوكبريتات الصوديوم وتغسل بالماء المقطر. تسمح لوحة جاف ومراقبة الرواسب المعدنية الملون في الظلام براون/أسود بالعين المجردة.
- أداء تلطيخ AP باتباع إرشادات الشركة المصنعة كيت.
-
Adipocytes
- لتلطيخ س الأحمر النفط (أورو)، إصلاح الخلايا باستخدام 10% "فورمالين مخزنة المحايدة" ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- وفي الوقت نفسه، جعل "الحل الأسهم أورو" بتذويب ز 0.035 في 10 مل الكحول. وهذا يكفي للوحة 6-جيدا. خلط وتمرير الحل باستخدام ورق الترشيح واحدة (الحجم 11 المسام ميكرومتر).
- جعل "الحل يعمل أورو" بتمييع مل 9 أورو الأسهم الحل مع 6 مل ماء المقطر. اترك الحل على الروك حتى جاهزة للاستخدام.
- إعداد الايزوبروبانول 60% في الماء المقطر (جعل ما يكفي لتغطية كل جيدا).
- حالما يتم إصلاح الخلايا، قم بإزالة مثبت ويغسل مرة واحدة بماء مقطر. استبدال الماء بالحل الايزوبروبانول 60% لمدة 1 دقيقة.
ملاحظة: إضافة السائل ببطء بينما البقشيش اللوحة؛ adipocytes إزاحة بسهولة جداً. - إزالة الكحول وإضافة "حل العامل أورو" ما يكفي لتغطية كافة الخلايا. احتضان لمدة 15 دقيقة على السرعة المنخفضة الروك في درجة حرارة الغرفة. إزالة أورو ويغسل مرتين بماء مقطر.
ملاحظة: عند هذه النقطة، قطرات الدهن الملون أورو يمكن تصور تحت المجهر. - لتحديد مقدار أورو، ديستاين أورو بإضافة 1 مل الكحول 100% لكل بئر وتعصف ببطء لمدة 10 دقائق.
- وفي الوقت نفسه، تعد سلسلة تمييع لإنشاء منحنى قياسي استناداً إلى معايير 8 التالية استخدام "الحل يعمل أورو" (2,100 ميكروغرام/مل) والكحول كمخفف: 500 و 350، 300، 250، 150، 100، 75 و 0 ميكروغرام/مل.
- تحميل 200 ميليلتر من المعايير وعينات دستايند في تريبليكاتيس على لوحة وقراءة امتصاص في 490 نانومتر.
- تحديد تركيز لاورو لكل عينة استناداً إلى المنحنى القياسي.
ملاحظة: نوصي بتطبيع تركيز أورو لعدد الخلايا. يمكن قياس عدد الخلايا بصبغة الكريستال البنفسجي أو كمية الحمض النووي.
- تحديد تركيز لاورو لكل عينة استناداً إلى المنحنى القياسي.
-
الآكلة
ملاحظة: عندما تكون جاهزاً، فإننا نقترح تلطيخ الآكلة الفوسفاتيز حمض طرطرات المقاوم (TRAP) استخدام تلطيخ فخ كيت (انظر الجدول للمواد).- لفخ تلطيخ، إصلاح الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع 2.5 ٪ glutaraldehyde في برنامج تلفزيوني. وفي الوقت نفسه، جعل الحل فخ بخلط معا 50 ميليلتر من "تقليد قاعدة الحل السريع", 50 ميليلتر من "نتريت الصوديوم"، 4.55 مل من الماء المقطر، 50 ميليلتر AS نابثول-بيفوسفاتي، 200 ميليلتر من خلات الحل و 100 ميليلتر طرطرات الحل.
- نضح قبالة مثبت، وشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرتين قبل إضافة الحل مصيدة ح 1 في 37 درجة مئوية.
- تغسل بالماء المقطر قبل عد الآكلة تحت مجهر (التكبير 10 X). تظهر الخلايا فخ+ الأرجواني مع نويات 3 أو أكثر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نظرة عامة حول الثقافات الخلية
تسمح تقنيات الثقافة هما تقييم التمايز في عدد سكان مختلطة من بمكس تتألف من بمسكس وهسكس (مجموع بمكس، الشكل 1A) أو عدد سكانها بمسكس تقسيم من هسكس (بمسكس ملتصقة، الشكل 1B). 48 ساعة بعد أن يتم عزل الخلايا من النخاع ومطلي (الشكل 1)، أنها سرعة نعلق على الجزء السفلي من لوحة الثقافة البلاستيكية وتميل بشكل أحادي الطبقة. حالما تصل الخلايا إلى التقاء (الشكل 1)، يمكن استخدامها للتمييز بين فحوصات.
بمسكس متمايزة إلى خلايا الاوستيوبلاستس
يمكن أن تكون متباينة الثقافات المتلاقية من بمسكس إلى خلايا الاوستيوبلاستس استخدام وسائط osteogenic تتألف من حمض الأسكوربيك والفوسفات β-الجلسرين (الشكل 2 أ، ب). بعد أيام قليلة من التمايز، تبدأ خلايا الاوستيوبلاستس الإعراب عن الفوسفاتيز القلوية (الشكل 2). سوف يؤدي التمايز زيادة إنتاج مصفوفة عظماني والتمعدن من هذه المصفوفة (الشكل 2D) في نهاية المطاف. من المثير للاهتمام، وسوف تفرق إلا نسبة من الخلايا في خلايا الاوستيوبلاستس في المختبر. تلطيخ مع الكريستال البنفسجي (الشكل 2E) يكشف في الواقع، أنه ليست كافة الخلايا إكسبريس الفوسفاتيز القلوية أو طاغية اللوحة.
بمسكس متباينة في Adipocytes
ويمكن اختبار أديبوجينيسيس على ثقافات مختلطة بمكس فضلا عن السكان خلية أكثر تجانساً. كما لاحظ مع التمايز osteoblast، ما إذا كان يتم استخدام السكان مختلطة (الشكل 3A) أو تقسيم السكان (الشكل 3B)، فقط نسبة من الخلايا أديبوجينيك. Adipocytes تظهر جولة مع vacuoles الدهنية المتعددة التي يمكن الملون باللون الأحمر مع أورو (الشكل 3). في تجربتنا، تظهر في المختبر adipocytes دائماً الرغوة متعددة خلافا في فيفو الأبيض adipocytes. الاختلافات في الظروف الوراثي أو الثقافة قد يؤدي إلى زيادة أديبوجينيسيس إلى نقطة حيث فصل adipocytes وتطفو في لوحة الثقافة. لحل هذه المشكلة، يمكن إيقاف التجربة أديبوجينيسيس في نقطة سابقة من الزمن.
هسكس المتباينة في الآكلة
أوستيوكلاستوجينيسيس يمكن أن يكون الناجمة في الثقافات المكمل لوسائل الإعلام مع مكسف ورانكل. بدء هسكس فتيل سريعاً لتشكيل خلايا مولتينوكليتيد إيجابية وصمة عار لفخ (الشكل 4 أ). تلك الآكلة قادرون على ريسوربينج المصفوفة المعدنية في المختبر ، وهكذا يمكن استخدامها لتقييم النشاط أوستيوكلاستيك (الشكل 4).
رقم 1: الجدول الزمني التخطيطي للبروتوكولات لثقافة بمسكس وهسكس. تقنيات ثقافة مختلفة العائد "الإجمالي بمكس" تتألف من عدد السكان مختلطة من الخلايا (A) أو "ملتصقة بمسكس" (ب). صورة الممثل لثقافة بمسكس المعزولة من الفئران C57B6/ي 48 ساعة بعد الطلاء (ج) وبعد أنها تقسم من هسكس (د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : صور آبار بمسكس الثقافات المتباينة في خلايا الاوستيوبلاستس. بمسكس قبل (A) وبعد (ب) يتم وضعها في وسائل الإعلام أوستيوجينيك. يمكن الملون خلايا الاوستيوبلاستس للتعبير الفوسفاتيز القلوية باللون الوردي (ج) والرواسب المعدنية في براون (د). يمكن استخدام الكريستال البنفسجي لتمثيل عدد الخلايا بعد المفاضلة (E). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الصور التمثيلية لثقافات بمسكس متباينة في adipocytes. ملون أورو adipocytes التي تم الحصول عليها من مجموعة سكانية مختلطة من بمسكس (A) وثقافة انقسام (ب) بعد 7 أيام في وسائل الإعلام أديبوجينيك. صورة adipocyte ملطخة أورو (ج). التحديد الكمي لاورو بعد 7 أيام في وسائل الإعلام أديبوجينيك قبل (د) وبعد التطبيع (ه) لامتصاص الأشعة فوق البنفسجية كريستال. يتم عرض البيانات كوسيلة مع أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4 الرقم: هسكس الثقافات المتباينة في الآكلة. تلوين مصيدة للأكلة الظهور كخلايا مولتينوكليتيد الوردي الأرجواني كبيرة (A). سطح غضاريف الملون باللون الأسود من فون كوسي مع ارتشاف الحفر التي خلفتها الآكلة متباينة من هسكس بعد 7 أيام (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المقالة، يتم عرض طريقتين لثقافة بمسكس مع مزايا وقيود. عزل الخلايا من نخاع العظام وعملية سهل نسبيا. ومع ذلك، الحصول على عدد سكان خلية ممثل للخلايا الجذعية الوسيطة أو فروعه أوستيوكلاستيك يمكن أن تكون صعبة بسبب تنوع البيئة الخلوية تجويف نخاع.
استزراع مجمل محتويات نخاع العظام يوفر تمثيل قريبة من المكروية في فيفو . حتى الآن، وعزل الخلايا من مجموعات مختلفة من الفئران (الأنماط الجينية، والعلاجات، والإعمار، إلخ) يمكن أن يؤدي إلى عدد مختلفة جداً من بمسكس أو هسكس في بداية التجربة في المختبر . ولذلك، فصل بمسكس وهسكس وإعادة الطلاء لهم السماح سيطرة أفضل على عدد الخلايا في بداية التجربة التمايز. ومع ذلك، الحد من عدم تجانس ثقافة الخلية قد تؤثر على نتائج بمسكس أو هسكس كما تفرز كل العوامل التي تؤثر على التمايز الوسيطة وأوستيوكلاستيك. من المهم النظر في تلك القيود عند تصميم العزلة وثقافة بمسكس وهسكس.
يمكن إدخال العديد السكان الخلايا الموجودة في نخاع العظام التحديات في تفسير البيانات. بالإضافة إلى هسكس وبمسكس، يتضمن المكروية نخاع العظام أيضا متباينة من الخلايا المناعية، وخلايا الدم الحمراء، خلايا بطانية، إلخ هؤلاء السكان قد تبقى في الكسر ملتصقة أو غير ملتصقة، ومما يمكن أن يؤثر على نتائج تجريبية. ويمكن فرز بمسكس خيار بغية تحقيق عدد سكان خلية "أنقى". وفي الواقع، يعتقد بمسكس للتعبير عن CD34 حين هسكس لا لا10. ومع ذلك، اقترح أيضا أن عدم CD34 على سطح بمسكس قد يكون نتيجة للثقافة وقد أثبتت دراسة أن مجموعة فرعية غير ملتصقة من CD34 يمكن أن تفرق+ بمسكس في أوستيوبلاست و adipocytes و chondrocytes11، 12-وبالتالي، عند النظر في الفرز لعزل بمسكس، مجموعة علامات محددة تحديداً جيدا ينبغي أن تصمم مسبقاً. عقبات أخرى لفرز الخلايا هي التوقيت والتكلفة. في الواقع، إضافة خطوة فرز يمكن أن تزيد من وقت العزلة البروتوكول إلى حد كبير فضلا عن زيادة كبيرة في التكاليف. وباختصار، يقدم فرز الخلايا التحديات التقنية التي قد تقلل من العائد ونوعية بمسكس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يكشف عن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل "المعاهد الوطنية للصحة" (R01 AR061164-01A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
| Dissection tools | |||
| 70 μm filters | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer inverter microscope | Zeiss |
References
- Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
- Chen, T. L. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone. 35 (1), 83-95 (2004).
- Kokabu, S., et al. BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b. Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).
- Ghali, O., et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation. BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).
- Kretlow, J. D., et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells. BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).
- DeMambro, V. E., et al. Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss. Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).
- Maridas, D. E., et al. IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner. J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).
- Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
- Abdallah, B. M., et al. CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells. Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).
- Akiyama, K., et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension. Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).
- Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells? Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).
