Summary
In dit artikel presenteren we methoden om te isoleren en te onderscheiden van het beenmerg stromale cellen en hematopoietische stamcellen van lange beenderen van de muis. Twee verschillende protocollen worden gepresenteerd opbrengst andere cel populaties geschikt voor uitbreiding en differentiatie in botcellen, adipocytes en osteoclasten.
Abstract
Het beenmerg stromale cellen (BMSCs) vormen een celpopulatie routinematig gebruikt als een vertegenwoordiging van mesenchymale stamcellen in vitro. Ze bevinden zich in de holte van het beenmerg naast hematopoietische stamcellen (HSCs), die aanleiding tot rode bloedcellen, immuun progenitoren en osteoclasten geven kunnen. Dus, extracties van cel populaties uit de resultaten van de beenmerg in een zeer heterogene mix van diverse cel populaties, die kan uitdagingen aanwezig in experimenteel design en data interpretatie beschamen. Diverse isolatie en cultuur technieken zijn ontwikkeld in laboratoria met het oog op een min of meer homogene bevolking van BMSCs en HSCs invitro. Hier presenteren we twee methoden voor het isoleren van BMSCs en HSCs van lange beenderen van de muis: een methode die resulteert in een gemengde bevolking van BMSCs en HSCs en één methode die probeert te scheiden van de twee cel populaties gebaseerd op naleving. Beide methoden worden verkregen cellen geschikt voor osteogenic en adipogenic differentiatie experimenten zo goed als functionele testen.
Introduction
Primaire lymfkliertest BMSCs worden vaak gebruikt als een in vitro model van mesenchymale stamcellen sinds hun ontdekking in de vroege jaren 19801. Inderdaad, culturen van kunststof-aanhanger cellen uit het beenmerg holte van lange beenderen gespoeld handhaven de capaciteit te differentiëren in botcellen, osteoclasten, chondrocyten of adipocytes in vele studies2,3, 4 , 5. het beenmerg is echter een unieke weefsel bestaat uit veel verschillende cel populaties, inclusief, maar niet beperkt tot, BMSCs, HSCs, endotheel en immuun cellen. Dus, isolatie en cultuur technieken kunnen opleveren cel populaties met verschillende homogeniteit. Met behulp van deze technieken voor het testen van de mogelijke differentiatie van cellen kan worden uitdagende. Bijvoorbeeld, bij het vergelijken van cellen uit muizen met verschillende genotypen, beginnend met een gemengde celpopulatie beperkt de interpretatie van de gegevens. Omgekeerd, verkrijgen van homogene bevolking van BMSCs en HSCs kan technisch moeilijk en mogelijk niet als vertegenwoordiger van een ex vivo -model.
In ons laboratorium zijn we voornamelijk geïnteresseerd in het gebruik van BMSCs als gevolg van hun potentieel te differentiëren in botcellen, osteoclasten en adipocytes. Hier presenteren we technieken van BMSCs en HSCs isolement en cultuur gebruikt om te beoordelen osteoblastogenesis of adipogenesis in vitro, evenals de culturen van HSCs te onderscheiden in de osteoclasten. Één methode gebruikt een gemengde bevolking van beenmergcellen (BMCs) met BMSCs en HSCs direct geschikt voor adipogenesis, osteoblastogenesis, en osteoclastogenesis (totale BMCs genoemd). Deze methode is een nauwere ex vivo representatie van de heterogeniteit gevonden onder de cellen van het beenmerg-communicatie. Een andere methode scheidt aanhanger uit niet-aanhanger cellen in een poging aan cultuur "zuiverder" bevolking van BMSCs en HSCs (aanhanger BMSCs genoemd). De latere methode kan de celcultuur experimenten om te starten met een meer nauwkeurige aantal BMSCs of HSCs en vermindert het potentieel van complexe indirecte effecten van andere cel populaties die in de cultuur blijven. Beide methoden zijn eerder gepubliceerd en gebruikt om verschillende onderzoek vragen6,7,8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de Maine Medical Center Research Institute.
1. verzameling buizen voorbereiding
- Maken de BMSC cultuurmedia door Minimum essentiële Medium α (MEM α) aan te vullen met 10% foetale runderserum en 1% van penicilline/streptomycine.
- Plaats 100 µL van de voedingsbodems BMSC in 1,5 mL microcentrifuge buizen. 3 beenderen past meestal in een enkele buis dus bereiden dienovereenkomstig.
- Snij de uiteinden van 200 µL Pipetteer tips genoeg zodat ze in de centrifuge buizen passen. Invoegen van de tips binnen de buizen en ervoor te zorgen dat de deksels sluiten kunnen alvorens de buizen te plaatsen op het ijs.
Opmerking: Als alternatief, 0,75 mL microcentrifuge buizen met de uiteinden cut kunnen worden ingevoegd in de 1,5 mL microcentrifuge buis.
2. de oogst van botten van muizen
- Euthanaseren van de dieren met behulp van CO2 , gevolgd door cervicale dislocatie en spuiten ze met 70% ethanol.
Opmerking: Zorg ervoor dat de dieren van hetzelfde geslacht en bij voorkeur dezelfde leeftijd worden gebruikt. Regelmatig gebruiken we dieren die ouder zijn 7 tot 8 weken. Het is raadzaam om bundeling van cellen van ten minste 3 dieren per experimentele groepen een betere vertegenwoordiger en reproduceerbare celpopulatie opleveren. -
Plaats de euthanized muis op zijn rug op een ontleden bord. Pincet gebruiken voor het maken van een tent van huid op de buik. Maken een kleine snede (ongeveer 1 cm) met behulp van steriele ontleden schaar. Schil terug de huid naar de ledematen en de voeten van de snede om de onderbuik en de benen bloot.
- Snijden onder de enkel gezamenlijk te verwijderen van de voet. U snijdt langs de iliacale kuif op de heup te scheiden van de dijbeen-hoofd van de heupen. Terwijl de muis nog steeds op zijn rug is, maak een snede in het midden van de heupen te scheiden van de twee iliac botten.
- Met behulp van pluisvrije doekjes, verwijder voorzichtig de spier van het dijbeen, zijn verbeend en iliacale botten.
Opmerking: Snijden zo veel van de pezen en spieren van het been als mogelijk maakt het reinigen sneller en makkelijker met de pluisvrije doekjes (bijvoorbeeld, kimwipes). Wees voorzichtig bij het bewerken van de botten, omdat ze de neiging om gemakkelijk te breken en hun kwetsbaarheid kan worden verhoogd met bepaalde genotypes. - Zodra alle monsters hebben zijn ontleed, plaats ze in PBS op ijs en verplaatsen naar een steriele cultuur kap voor de resterende stappen van isolatie.
Opmerking: Werken aseptisch zoveel mogelijk zal verminderen de kans op besmetting in de culturen. - Maken kleine bezuinigingen (ongeveer 1 tot 2 mm) aan beide de proximale en distale uiteinden van de botten alvorens hen te plaatsen in de verdeelde tips binnen de centrifuge buizen.
Opmerking: Zorg ervoor om een voldoende hoeveelheid zodat beenmerg kan worden gecentrifugeerd echter, moet worden gezorgd om te voorkomen dat snijden teveel als cel populaties de neiging te variëren op basis van nabijheid binnen de ruimte van het beenmerg. - Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 15 s bij kamertemperatuur. Ervoor zorgen dat alle beenmerg is gespoeld en Ingehuld aan de onderkant van de buis 1,5 mL terwijl de beenderen binnen de inserts (ofwel 200 µL Pipetteer tip of 0,75 mL microcentrifuge buis zijn). Zodra alle beenmerg wordt verzameld, verwijdert u de inzetstukken met de botten uit de collectie buizen.
Opmerking: Als alle beenmerg wordt geleegd, de botten zal verschijnen witte. Echter als beenmerg in bepaalde botten blijft, probeer het snijden uiteinden opnieuw en centrifugeren.
3. de celsuspensie
- Met behulp van een 25 G naald, trek pellets de cel op en neer langzaam te breken klontjes en alle monsters te combineren in een conische buis van één 15 mL. Voeg 10 mL van de Media van de cultuur van het BMSC per 500 µL van monsters.
- Een 70 µm filter plaatsen op de top van een conische tube van 50 mL en de celsuspensie passeren in dit filter te verwijderen mogelijk botfragmenten.
4. plating en cultuur van gemengde bevolkingsgroepen van beenmergcellen (totale BMCs)
Opmerking: De cellen worden gekweekt bij 37 ° C in een broedstoof met 5% CO2.
- Bereken het aantal cellen en hen op 1.0 x 106 cellen/cm2 in kweekmedia plaat. Het toestaan van 72 h van gemengde cultuur voor cellen te koppelen.
Opmerking: We raden verdunning van de cel schorsing 20 x in cultuurmedia en verdunnen opnieuw in trypan blauwe vóór het tellen van de cellen met behulp van een hemocytometer. Voor 7-week-oude mannelijke C57Bl6/J muizen, we opleveren routinematig een aantal cellen van ongeveer 50 x 106 cellen maar leeftijd, geslacht en soort celaantal sterk kunnen beïnvloeden.
Opmerking: De bevolking van een mix van cellen moet koppelen aan de onderkant van de cultuur. - Na 72 uur, verwijderen van de media en nieuwe media te vervangen. Gaan met het wijzigen van de media elke andere dag en controleren op confluentie. Wanneer de cellen 80-100% confluentie bereikt, zijn ze klaar voor differentiatie.
Opmerking: Omdat deze cultuur wordt vermengd met zowel BMSCs als HSCs, het kan direct gebruikt worden voor osteoblastogenesis, adipogenesis, evenals osteoclastogenesis.
5. plating en cultuur van de bevolking van de Split van BMSCs (aanhangend BMSCs)
Opmerking: De cellen worden gekweekt bij 37 ° C in een broedstoof met 5% CO2.
- Plaat alle cellen verzameld uit het dijbeen, zijn verbeend en iliacale botten van een muis in een 10 cm cultuur schotel (55 cm,2 van cultuur gebied).
Opmerking: Wanneer de bundeling van 2-3 C57BL/6J muizen, plaat we meestal deze 'totaal' beenmerg bevolking in een maatkolf van 150 cm2 . - Na 48u van gemengde cultuur, de media van de cultuur (met de niet-aanhanger HSCs) te verwijderen. Als osteoclastogenesis experimenten worden uitgevoerd moeten, stelt u deze bevolking van cellen van de niet-aanhanger opzij (zie punt 7), zoniet, aspirate en negeren van deze cellen.
- Wassen van de plaat/kolf met PBS zorgvuldig over de gekoppelde cellen niet te storen.
- PBS verwijderen en de cellen op te heffen door toevoeging van 0,25% trypsine en incuberen bij 37 ° C gedurende 1-3 min. Quench de trypsine door cel media toe te voegen aan de celsuspensie. Op dit punt, BMSCs, die nu worden opgeheven, kunnen worden gerekend (eerder gedaan in stap 4.1) en vergulde voor toekomstige experimenten.
- Bereken het aantal cellen die nodig zijn voor de beplating. Centrifugeer het vereiste volume van celsuspensie bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: Cellen zijn meestal verzinkt gebaseerd op eindpunt experimenten. Bijvoorbeeld, als eiwit/RNA te isoleren plaat wij meestal op een hogere dichtheid (~1.0-2.0 x 106 cellen per putje in 6-well plaat). - Verwijder het medium en resuspendeer de pellet cel in het volume van de voedingsbodems die nodig zijn voor de beplating. Plaat van de cellen in kweekmedia volgens de experimenten en laten hechten voor een paar dagen. Wanneer de BMSCs confluentie bereikt, gaat u verder met het uitvoeren van differentiatie.
6. differentiatie van BMSCs
-
Botcellen
- Osteoblast differentiatie media door toevoeging van 800 µL 1 M β-glycerol fosfaat in aanbrengt PBS en 200 µL van 0.5 M ascorbinezuur in PBS 99 mL BMSC voedingsbodems (zie stap 1.1 voor de samenstelling van de BMSC-cultuur-media).
- Zodra BMSCs culturen (totale BMCs uit stap 4.3) of aanhanger BMSCs uit stap 5.6 confluente, ze verschillen in botcellen door over te schakelen van de voedingsbodems osteoblast differentiatie media.
- Vervang de differentiatie media om de andere dag. Cellen beginnen met de productie van witte knobbeltjes van mineralisatie. Ze visualiseren met het blote oog op de bodem van de put; Dit proces kan optreden binnen een paar dagen tot 3 weken.
- Uitvoeren om te beoordelen osteoblastogenesis, alkalische fosfatase kleuring en/of Von Kossa kleuring op de putten zoals beschreven in sectie 8.
Opmerking: Wijzig de media zorgvuldig door het kantelen van de platen lichtjes schuin teneinde verstoring van de cel enkelgelaagde.
- Uitvoeren om te beoordelen osteoblastogenesis, alkalische fosfatase kleuring en/of Von Kossa kleuring op de putten zoals beschreven in sectie 8.
- Osteoblast differentiatie media door toevoeging van 800 µL 1 M β-glycerol fosfaat in aanbrengt PBS en 200 µL van 0.5 M ascorbinezuur in PBS 99 mL BMSC voedingsbodems (zie stap 1.1 voor de samenstelling van de BMSC-cultuur-media).
-
Adipocytes
- Adipocyte base media maken door het te mengen samen 90 mL Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) hoge Glucose, 10 mL foetale runderserum, 1 mL penicilline/streptomycine, 100 µL 20 mM Rosiglitazon en 100 µL van 2 mM insuline. Indien nodig slaan deze media bij 4 ° C voor de week tijdens het experiment van de differentiatie.
- Adipocyte inductie media maken door toevoeging van 200 µL van 62,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) en 25 µL van 1 mM dexamethason aan 25 mL Adipocyte Base Media.
- Zodra BMSCs culturen (totale BMCs uit stap 4.3) of aanhanger BMSCs uit stap 5.6 confluente, omzetten in de media adipocyte inductie media. Beschouw deze dag 0 van differentiatie.
- Na 48u, verwijder het medium en vernieuwen van de cultuur met adipocyte inductie media.
- Op dag 4, overschakelen naar adipocyte base media.
Opmerking: Lipide druppels kunnen beginnen zo vroeg als dag 2 en dag 4 te verschijnen. - Op dag 7, observeren dat cellen maximale lipide druppels hebben opgebouwd en een fenotype vergelijkbaar met een volwassen adipocyte weer te geven. Cultuur niet voorbij dit punt, omdat het leiden cel dood/detachement tot kan.
7. differentiatie van HSCs in de osteoclasten
- Osteoclast differentiatie Media maken door toevoeging van 50 µL van 25 µg/mL van Receptor Activator van NFKB Ligand (RANKL) en 15 µL van 25 µg/mL macrofaag kolonie stimulerende Factor (mCSF) tot 25 mL van de Media van de cultuur van het BMSC.
- Zodra de totale BMCs (uit stap 4.3) of de niet-aanhanger cellen (uit stap 5.2) zijn aangesloten op de put, cultuurmedia omschakelbaar Osteoclast differentiatie Media. Aanvullen differentiatie media om de andere dag.
- Observeer de osteoclast culturen dagelijks onder een microscoop op 10 X vergroting. Vaststellen dat de osteoclasten zekering en vormen van multinucleaire cellen, meestal rond dag 5-7 van differentiatie.
8. vlekken
-
Botcellen
Opmerking: Voor gebruik door de alkalische fosfatase (AP) kleuring, we vaak een AP kleuring kit (Zie Tabel van materialen) volgens de richtlijnen.- AP kleuring door de richtlijnen van de fabrikant van de kit uitvoeren
- Gecombineerd media en spoel cellen met PBS. Herstellen van de cellen met de 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur.
- In de tussentijd, maken de oplossing van de AP met behulp van de reagentia van de AP kleuring kit door toevoeging van 500 µL natriumnitriet 500 µL FRV-Alkaline oplossing en mengen zachtjes; laat staan voor 2 min. toevoegen 22,5 mL dH2O en 500 µL naftol AS-BI Alkaline. Meng voorzichtig.
Let op: PFA is giftig en moet met zorg worden behandeld. - Zodra de cellen worden opgelost, spoelen met PBS en AP-oplossing toevoegen aan elk putje (1 tot 2 mL per putje). Dek af met aluminiumfolie en laat vlek gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. De oplossing gecombineerd, wassen met gedestilleerd water en laat de plaat om te drogen.
- Beelden van gebeitst kolonies met behulp van een camera om observeren van alkalische fosfatase positieve cellen verwerven.
- U kunt ook uitvoeren Von Kossa in plaats van alkalische fosfatase kleuring. Hiervoor was putjes grondig met gedestilleerd water als eventuele resterende PBS met zilvernitraat. neerslaat
- Herstellen van de cellen met de 4% PFA in PBS gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens voegt u genoeg 5% zilvernitraat, oplossing om te dekken van de put en blootstellen aan fel licht gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder de zilvernitraatoplossing en elk putje met gedestilleerd water spoelen. 5% natrium thiosulfate oplossing aan de cellen toevoegen en laat het staan voor 3 min.
- De natrium-thiosulfate gecombineerd en wassen met gedestilleerd water. Laat de plaat droog en observeren van de minerale storting gekleurd in de donker bruin/zwart met blote oog.
- AP kleuring door de richtlijnen van de fabrikant van de kit uitvoeren
-
Adipocytes
- Voor olie Red O (ORO) kleuring, vast de cellen met behulp van 10% neutraal gebufferd formaline gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- In de tussentijd, maken de ORO Stock oplossing door ontbinding 0,035 g in 10 mL isopropanol. Dit is voldoende voor een 6-well-plate. Meng en laat de oplossing met behulp van een filtreerpapier (porie maat 11 µm).
- Maak de ORO werken oplossing door 9 mL van de stockoplossing ORO met 6 mL gedestilleerd water verdunnen. Laat de oplossing op een rocker tot klaar voor gebruik.
- Bereiden van 60% isopropanol in gedistilleerd water (maken genoeg om te behandelen elk goed).
- Zodra de cellen worden opgelost, verwijdert u de kleefpoeders en wassen eenmaal met gedestilleerd water. Vervang het water door de 60% isopropanol oplossing voor 1 min.
Opmerking: Voeg vloeistof langzaam terwijl het kantelen van de plaat; adipocytes verjagen zeer gemakkelijk. - Verwijder van het isopropanol en voeg voldoende ORO werken oplossing ter dekking van alle cellen. Incubeer gedurende 15 minuten op een lage snelheid rocker bij kamertemperatuur. Verwijderen van ORO en spoel tweemaal met gedestilleerd water.
Opmerking: op dit punt, ORO gebeitste lipide druppels kunnen worden gevisualiseerd onder de Microscoop. - Om te kwantificeren ORO, destain de ORO door toevoeging van 1 mL 100% isopropanol en aan elk putje en schommelen langzaam gedurende 10 minuten.
- In de tussentijd bereidt een verdunningsreeks aan het maken van een standaard curve op basis van de volgende 8 normen met behulp van ORO werken oplossing (2.100 µg/mL) en isopropanol als een oplosmiddel: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 en 0 µg Mo/mL.
- Laden van 200 µL van de normen en de destained monsters in triplicates op een bord en lees de absorptie bij 490 nm.
- Bepaal de concentratie van ORO voor elk monster gebaseerd op de standaard curve.
Opmerking: Wij raden de concentratie ORO aan celaantal normaliseren. Aantal cellen kan worden gekwantificeerd door kristalviolet kleuring of de hoeveelheid van DNA.
- Bepaal de concentratie van ORO voor elk monster gebaseerd op de standaard curve.
-
Osteoclasten
Opmerking: Als u klaar bent, wij stellen voor osteoclasten kleuring voor tartraat-resistente zuur fosfatase (TRAP) met behulp van de TRAP kleuring kit (Zie Tabel van materialen).- Voor OVERVULLING kleuring, herstellen van cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met 2,5% Glutaaraldehyde in PBS. In de tussentijd, maken de TRAP-oplossing door het mengen samen 50 µL van snel granaten Base oplossing, 50 µL van natriumnitriet, 4.55 mL gedestilleerd water, 50 µL van Napthol AS-Biphosphate, 200 µL van acetaat oplossing en 100 µL tartraatoplossing.
- Gecombineerd uit fixeer, en spoel de cellen met PBS tweemaal alvorens toe te voegen TRAP oplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Wassen met gedestilleerd water voor het tellen van de osteoclasten onder een microscoop (vergroting 10 X). De TRAP+ cellen verschijnen paars met 3 of meer kernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overzicht van de celculturen
De twee cultuur technieken laten de beoordelingvan differentiatie op een gemengde populatie van BMCs bestaat uit BMSCs en HSCs (totale BMCs, figuur 1A) of een bevolking van BMSCs afgesplitst van HSCs (aanhanger BMSCs, figuur 1B). 48 hr na de cellen uit het beenmerg geïsoleerd worden en verguld (Figuur 1 c), ze snel hechten aan de onderkant van de plastic cultuur plaat en de neiging om een enkelgelaagde vormen. Zodra de cellen bereiken samenvloeiing (Figuur 1 d), kunnen ze worden gebruikt voor differentiatie testen.
BMSCs onderscheiden in botcellen
Confluente culturen van BMSCs kunnen worden gedifferentieerd naar botcellen met behulp van een osteogenic media samengesteld uit ascorbinezuur en β-glycerol fosfaat (figuur 2A, B). Na een paar dagen van differentiatie, botcellen beginnen uiting van alkalische fosfatase (figuur 2C). Verdere differentiatie zal leiden tot osteoid matrix productie, en uiteindelijk de mineralisatie van deze matrix (figuur 2D). Interessant is dat zal slechts een deel van de cellen onderscheiden in botcellen in vitro. Inderdaad, kleuring met crystal violet (figuur 2E) blijkt dat niet alle cellen express alkalisch fosfatase of mineralize van de plaat.
BMSCs onderscheiden in Adipocytes
Adipogenesis kan worden getest op de culturen van gemengde BMCs evenals op de meer homogene celpopulatie. Zoals opgemerkt met osteoblast differentiatie, of de gemengde bevolking (figuur 3A) of de split populaties (figuur 3B) worden gebruikt, zijn slechts een deel van de cellen adipogenic. Adipocytes verschijnen ronde met meerdere lipide vacuolen die kunnen worden gekleurd in rood met ORO (Figuur 3 c). In onze ervaring weergegeven in vitro adipocytes altijd meerdere vacuolated in tegenstelling tot in vivo witte adipocytes. Verschillen in omstandigheden van het genotype of cultuur kunnen adipogenesis tot een punt waar adipocytes loskoppelen en zweven in de cultuur-plaat toenemen. U kunt oplossen door dit, kan het adipogenesis experiment op een eerder tijdstip worden gestopt.
HSCs onderscheiden in osteoclasten
Osteoclastogenesis kan in de culturen worden opgewekt door de media met mCSF en RANKL aan te vullen. HSCs beginnen te smelten snel om te vormen van multinucleaire cellen die vlek positief voor de TRAP (figuur 4A). De osteoclasten resorbeerbare minerale matrix in vitro staat zijn en dus kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de osteoclastic activiteit (figuur 4B).
Figuur 1: Schematische tijdlijn van de protocollen voor de cultuur van de BMSCs en HSCs. Andere cultuur technieken om de opbrengst van de totale BMCs samengesteld uit een gemengde bevolking van cellen (A) of aanhanger BMSCs (B). Representatief beeld van de cultuur van de BMSCs van C57B6/J muizen geïsoleerd 48 hr na hun beplating (C) en nadat ze zijn afgesplitst van HSCs (D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Beelden van putjes van BMSCs culturen onderscheid gemaakt tussen botcellen. BMSCs voor (A) en na (B) in osteogenic media wordt geplaatst. Botcellen kunnen worden gekleurd voor alkalische fosfatase expressie in roze (C) en minerale storting in bruin (D). Kristalviolet kan worden gebruikt ter vertegenwoordiging van celaantal na differentiatie (E). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Afbeeldingen van de vertegenwoordiger van de culturen van BMSCs onderscheiden in adipocytes. ORO-gekleurd adipocytes verkregen uit een gemengde populatie van BMSCs (A) en een split-cultuur (B) na 7 dagen in adipogenic media. Afbeelding van een adipocyte gekleurd met ORO (C). Kwantificering van ORO na 7 dagen in adipogenic media voor (D) en (E) normalisatie te kristalviolet absorptie. Gegevens worden gepresenteerd als middel met foutbalken die vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: HSCs culturen onderscheid gemaakt tussen osteoclasten. TRAP kleuring van osteoclasten verschijnen als grote paars-roze multinucleaire cellen (A). Gemineraliseerde oppervlak gekleurd in black van Von Kossa met resorptie kuilen achtergelaten door osteoclasten onderscheiden van HSCs na 7 dagen (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel worden twee methoden van cultuur van de BMSCs gepresenteerd met hun voordelen en beperkingen. Isoleren van cellen uit het beenmerg is een relatief eenvoudig proces. Verkrijgen van een vertegenwoordiger van de mesenchymale stamcellen of osteoclastic progenitoren celpopulatie kan echter uitdagende als gevolg van de verschillende cellulaire omgeving van de holte van het beenmerg.
Kweken van het geheel van de inhoud van het beenmerg biedt een nauwe weergave van de communicatie in vivo . Nog, isoleren van cellen uit verschillende groepen van muizen (genotypen, behandelingen, leeftijden, etc.) kan resulteren in een zeer verschillend aantal BMSCs of HSCs bij de aanvang van het experiment in vitro . Daarom scheiden van BMSCs en HSCs en opnieuw plating hen een betere controle mogelijk maken over het nummer van de cel aan het begin van de differentiatie-experiment. Echter, vermindering van de heterogeniteit van de celcultuur invloed kan zijn op de resultaten van de BMSCs of HSCs als beide factoren die van invloed zijn mesenchymale en osteoclastic differentiatie afscheiden. Het is belangrijk dat deze beperkingen bij het ontwerpen van de isolatie en de cultuur van de BMSCs en de HSCs.
De veelheid van cel populaties aanwezig zijn in het beenmerg kan leiden tot problemen bij de interpretatie van de gegevens. Naast HSCs en BMSCs bevat het beenmerg communicatie ook gedifferentieerde immune cellen, rode bloedcellen, endotheliale cellenenz. Die populaties in de Fractie aanhangend of niet-aanhanger kunnen blijven en dus invloed op de experimentele resultaten. Sorteren van BMSCs kunnen een optie met het oog op een "zuiverder"-celpopulatie. Inderdaad, zijn BMSCs dacht dat wil CD34, terwijl HSCs niet10 doen. Echter werd ook gesuggereerd dat het gebrek aan CD34 op het oppervlak van BMSCs kan het resultaat van de cultuur en een studie is gebleken dat een subset van de niet-aanhanger van CD34+ BMSCs kon onderscheiden in osteoblast, adipocytes en chondrocyten11, 12. daarom bij het overwegen van sorteren te isoleren van de BMSCs, een matrix van welomschreven markeringen moet erop gericht zijn vooraf. Andere belemmeringen voor het sorteren van de cel, zijn timing en kosten. Inderdaad, het toevoegen van een sorteer stap zou kunnen vergroten het tijdstip van het isolement protocol aanzienlijk evenals een aanzienlijke toename van de kosten. Kortom presenteren sorteren cellen technische uitdagingen die de opbrengst en kwaliteit van BMSCs verminderen kunnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs vermelden dat zij geen financiële belangenverstrengeling hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
| Dissection tools | |||
| 70 μm filters | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer inverter microscope | Zeiss |
References
- Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
- Chen, T. L. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone. 35 (1), 83-95 (2004).
- Kokabu, S., et al. BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b. Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).
- Ghali, O., et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation. BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).
- Kretlow, J. D., et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells. BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).
- DeMambro, V. E., et al. Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss. Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).
- Maridas, D. E., et al. IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner. J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).
- Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
- Abdallah, B. M., et al. CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells. Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).
- Akiyama, K., et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension. Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).
- Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells? Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).
