Summary
이 문서에서는, 우리는 분리 하 고 마우스 긴 뼈에서 골 수 기질 세포와 조 혈 줄기 세포 분화 방법 제시. 두 개의 서로 다른 프로토콜에는 저조한 다른 세포 인구 확장 및 차별화 osteoblasts, adipocytes, osteoclasts에 적합 되 게 됩니다.
Abstract
중간 엽 줄기 세포의 표현으로 일상적으로 사용 되는 세포 인구를 구성 하는 골 수 기질 세포 (BMSCs) 생체 외에서. 그들은 캐비티 내에 골 수 조 혈 줄기 세포 (HSCs), 적혈구, 면역 창시자, 및 osteoclasts 증가 줄 수 있는 함께 상주 합니다. 따라서, 다양 한 세포 인구, 실험 설계 과제를 제시 하 고 데이터 해석을 혼동 수 있는 매우 다른 유형의 혼합에 골 결과에서 세포 인구의 기사. 여러 격리 및 문화 기술 BMSCs 및 HSCs invitro의 더 많거나 적은 균질 인구를 얻기 위하여 실험실에서 개발 되었습니다. 여기, 우리가 마우스 긴 뼈에서 BMSCs 및 HSCs의 격리에 대 한 두 가지 방법을 제시: 부착을 기반으로 BMSCs 및 HSCs의 혼합된 인구를 생성 한 방법 및 두 세포 인구를 분리 하는 한 방법. 두 방법 모두 제공 세포 적합 osteogenic 및 adipogenic 분화 실험 뿐만 아니라 기능적 분석 실험.
Introduction
기본 murine BMSCs1초기 1980 년대 있는 그들의 발견부터 중간 엽 줄기 세포의 생체 외에서 모델으로 일반적으로 사용 됩니다. 긴 뼈의 골 수 구멍에서 플러시 플라스틱 부착 한 세포의 문화 osteoblasts, osteoclasts, chondrocytes, 또는 많은 연구2,3, adipocytes에 분화 될 수 있는 능력을 유지 하는 사실, 4 , 그러나 5., 골 수는 독특한 조직 HSCs, 내 피, 그리고 면역 세포 포함 하 되이 국한 되지 않음, BMSCs, 하지만 많은 다른 세포 인구의 구성. 따라서, 고립과 문화 기술을 다른 동질성과 세포 인구를 얻을 수 있습니다. 이러한 기술을 사용 하 여 셀에서 잠재적인 차별화 테스트 전하실 수 있습니다. 예를 들어 다른 genotypes와 쥐에서 셀을 비교할 때 데이터의 해석을 제한 혼합된 세포 인구로 시작 합니다. 반대로, BMSCs 및 HSCs의 균질 성 인구 기술적으로 어려울 수 있습니다 고로 대표 되지 않을 수 있습니다 ex vivo 모델의.
우리의 실험실에서 우리는 주로 BMSCs osteoblasts, osteoclasts, adipocytes에 분화 될 그들의 잠재력 활용에 관심이. 여기, 우리가 osteoclasts에 차별화를 HSCs의 문화 뿐만 아니라 BMSCs와 HSCs 격리와 문화 osteoblastogenesis 또는 지질에서 생체 외에서평가 하는 데 사용의 기법 제시. 한 가지 방법은 BMSCs 및 HSCs 지질, osteoblastogenesis, 및 osteoclastogenesis (총 Bmc 라고 함)에 대 한 직접 적합 한 골 수 세포 (Bmc)의 혼합된 인구를 사용 합니다. 이 방법은 골 microenvironment의 세포 사이 발견이 성분의 가까이 비보 전 표현입니다. 또 다른 방법은 BMSCs (점착 BMSCs 라는) HSCs의 문화 "순수한" 인구 하려고 비 부착 한 세포에서 점착을 구분 합니다. 이후 방법은 세포 배양 실험의 BMSCs 또는 HSCs의 더 정확한 숫자와 함께 시작 하 고 문화에 남아 있는 다른 세포 인구의 복잡 한 간접 효과의 가능성을 줄일 수 있습니다. 두 방법 모두는 이전 출판 되었고 다른 연구 질문6,7,,89를 해결 하는 데 사용.
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Protocol
모든 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 메인 의료 센터 연구소에 의해 승인 되었다.
1. 컬렉션 튜브 준비
- 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린/스의 최소 필수 매체 α (MEM α)을 보완 하 여 BMSC 문화 미디어를 확인 합니다.
- 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 BMSC 문화 미디어의 100 µ L를 배치 합니다. 3 뼈 보통 단일 튜브 그래서 그에 따라 준비 하나에 적합할 것 이다.
- 그들은 원심 분리기 튜브에 들어가도록 충분히 200 µ L 피 펫 팁의 끝을 잘라. 튜브 내부 팁 넣고 뚜껑 얼음에 튜브를 배치 하기 전에 닫을 수 있도록 합니다.
참고: 또는, 0.75 mL microcentrifuge 튜브 끝 잘라 삽입할 수 있습니다 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에.
2입니다. 쥐에서 뼈의 수확
- CO2 뒤에 자 궁 경부 전위를 사용 하 여 동물을 안락사 하 고 70% 에탄올으로 그들을 살포.
주: 동물 같은 섹스 그리고 가급적 이면 같은 나이에서 사용 하는 확인 하십시오. 우리는 정기적으로 동물 세 7 ~ 8 주를 사용 합니다. 더 나은 대표 및 재현성 세포 인구를 실험 그룹 당 적어도 3 동물에서 세포를 풀링 하는 것이 좋습니다. -
해 보드에 그것의 뒤에 안락사 마우스를 놓습니다. 집게를 사용 하 여 복 부에 피부의 텐트를 만들. 살 균 해가 위를 사용 하 여 작은 절 개 (약 1cm)을 확인 합니다. 더 낮은 복 부와 다리를 노출 하려면 다시 사지와 컷에서 발 피부 껍질.
- 잘라 발목 아래 발 제거 공동. hipbone에서 대 퇴 골 머리를 분리 하는 엉덩이에 장 골의 크레스트 따라 자릅니다. 그것의 뒤에 아직도 마우스를 실행 하는 동안 2 개의 장 골 뼈 분리 hipbone 중간 절 개를 확인 합니다.
- 보풀이 물티슈를 사용 하 여 조심 스럽게 화관, tibias, 장 골 뼈에서 근육을 제거.
참고: 절단 힘 줄과 뼈에서 근육의 가능한 게로 보풀 잎사귀 (예, kimwipes)와 함께 쉽고 빠르게 청소. 그들은 쉽게 휴식 하는 경향이 하 고 그들의 취약성 특정 genotypes 증가 될 수 있습니다 뼈를 조작 하는 때 주의 사용 합니다. - 일단 모든 샘플 해 부 되는, 얼음에 PBS에 넣어 고 절연의 나머지 단계에 대 한 살 균 문화 후드로 이동.
참고: aseptically 가능한 작업 문화에 오염에 대 한 가능성을 줄일 것입니다. - 원심 분리기 튜브 내에서 sectioned 팁에 그들을 배치 하기 전에 뼈의 인접 하 고 원심 끝에 작은 상처 (약 1 ~ 2 m m)를 확인 합니다.
주: 골 수; centrifuged 수 있도록 충분 한 금액을 확인 그러나, 주의가 피하기 위해 골 수 공간에 근접에 따라 너무 많은 절단 세포 인구 변화 하는 경향이. - 15에 대 한 10000 x g에서 원심 분리기 실 온에서 s. 확인 한 모든 골 수는 플러시 1.5 mL 튜브의 하단에 삽입 (중 200 µ L 피펫으로 팁 또는 0.75 mL microcentrifuge 튜브) 안에 뼈는 일지도. 일단 모든 골 수 수집 컬렉션 튜브에서 뼈와 함께 삽입을 제거 합니다.
참고: 모든 골 수 플러시 뼈 나타납니다 흰색. 그러나, 골 수는 특정 뼈에 남아, 경우 절단 끝을 다시 시도 하 고 원심.
3. 세포 현 탁 액
- 25g 바늘, 풀을 사용 하 여 셀 쥐 똥를 위아래로 천천히 대단히 짧은 시간을 휴식과 단일 15 mL 원뿔 튜브로 모든 샘플을 결합. 샘플의 500 µ L 당 BMSC 문화 미디어의 10 mL를 추가 합니다.
- 70 µ m 필터 50 mL 원뿔 튜브 위에 놓고 가능한 뼈 조각을 제거 세포 현 탁 액이이 필터를 통해 전달 합니다.
4. 도금의 골 수 세포 (전체 Bmc)의 혼합된 인구와 문화
참고: 셀은 5% CO2배양 기에서 37 ° C에서으로 경작 된
- 셀의 수를 계산 하 고 x 106 셀/cm2 문화 미디어에서 1.0에서 접시. 연결할 셀에 대 한 혼합 문화의 72 h를 허용 합니다.
참고: 문화 미디어에 세포 현 탁 액 20 배 고 trypan 블루는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하기 전에에서 다시 diluting diluting 것이 좋습니다. 7 주 된 남성 C57Bl6/J 쥐에 대 한 우리 정기적으로6 셀 약 50 x 10의 셀 번호를 생성 하지만 나이, 성별, 및 스트레인 수 영향을 셀 수 크게.
참고: 셀의 혼합 인구 연결 해야 문화의 하단에 잘 합니다. - 72 h 후 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어와 함께 그것을 대체 합니다. 계속 변화 하는 미디어 모든 다른 하루 confluency 확인 합니다. 셀 confluency 80-100%에 도달, 그들은 차별화에 대 한 준비가 되었습니다.
참고:이 문화 BMSCs와 HSCs, 혼합 때문에 그것은 사용할 수 있습니다 직접 osteoblastogenesis, 지질으로 osteoclastogenesis.
5. 도금의 BMSCs (부착 BMSCs)의 분할 인구와 문화
참고: 셀은 5% CO2배양 기에서 37 ° C에서으로 경작 된
- 10 cm 문화 요리 (55 c m2 의 문화 영역)으로 화관, tibias, 그리고 한 마우스의 장 골 뼈에서 수집 하는 모든 셀 접시
참고: 2-3 C57BL/6J 마우스를 풀링할 때 우리가 일반적으로 접시 150 c m2 플라스 크에서이 '총' 골 인구. - 혼합 문화 48 h 후 (비-부착 HSCs 포함) 문화 미디어를 제거 합니다. Osteoclastogenesis 실험을 수행할 수 있다면, 비 부착 한 세포 제쳐두고 (섹션 7 참조), 하지 않을 경우, aspirate이이 인구를 설정 하 고 이러한 셀을 삭제.
- 연결 된 셀을 방해 하지로 신중 하 게 PBS 가진 접시/플라스 크를 씻으십시오.
- PBS를 제거 하 고 추가 0.25 %trypsin 및 세포 현 탁 액을 셀 미디어를 추가 하 여 1-3 분 끄다는 트립 신에 대 한 37 ° C에서 배양 하 여 세포를 리프트. 이 시점에서, BMSCs, 지금 해제, 될 수 있는 (로 이전에 완료 단계 4.1) 미래 실험을 위한 도금.
- 도금에 필요한 셀의 수를 계산 합니다. 필요한 양의 세포 현 탁 액 상 온에서 5 분 동안 1000 x g에서 원심
참고: 셀은 일반적으로 도금 끝점 실험에 따라. 예를 들어 단백질/RNA 격리 되어야 하는 경우 우리가 일반적으로 격판덮개 높은 밀도 (~1.0-2.0 x 106 셀/잘 6 잘 플레이트). - 미디어를 제거 하 고 도금에 필요한 문화 미디어의 볼륨에서 셀 펠 릿 resuspend. 실험에 따르면 문화 미디어에 셀 접시 하 고 몇 일 동안 연결할 수 있도록. BMSCs confluency에 도달, 수행 차별화를 진행 합니다.
6입니다. BMSCs의 차별화
-
Osteoblasts
- 게 osteoblast 차별화 미디어 1 M β-글리세롤의 800 µ L을 추가 하 여 인산 염 PBS에 PBS에 의약품 0.5 M의 200 µ L BMSC 문화 미디어의 99 mL (BMSC 문화 미디어의 구성에 대 한 단계 1.1 참조).
- BMSCs 문화 (총 Bmc 단계 4.3에서에서) 또는 BMSCs 단계 5.6에서에서 점착 confluent 일단 osteoblast 차별화 미디어 문화 미디어를 전환 하 여 그들을 osteoblasts로 차별화.
- 매일 차별화 미디어를 교체 합니다. 셀 강화 작용의 백색 혹 생산 시작. 우물의 바닥에 맨 눈으로 그들을 시각화합니다 이 과정은 3 주 몇 일 이내에 발생할 수 있습니다.
- Osteoblastogenesis 평가, 알칼리 성 인산 가수분해 효소 얼룩 또는 폰 Kossa 섹션 8에에서 설명 된 대로 우물에 얼룩을 수행 합니다.
참고: 셀 단층의 파괴를 피하기 위해 약간의 각도에 접시를 기울이기에 의해 신중 하 게 미디어를 변경 합니다.
- Osteoblastogenesis 평가, 알칼리 성 인산 가수분해 효소 얼룩 또는 폰 Kossa 섹션 8에에서 설명 된 대로 우물에 얼룩을 수행 합니다.
- 게 osteoblast 차별화 미디어 1 M β-글리세롤의 800 µ L을 추가 하 여 인산 염 PBS에 PBS에 의약품 0.5 M의 200 µ L BMSC 문화 미디어의 99 mL (BMSC 문화 미디어의 구성에 대 한 단계 1.1 참조).
-
Adipocytes
- Dulbecco 수정이 글 중간 (DMEM) 높은 포도 당, 소 태아 혈 청, 페니실린/스의 1 mL, 100 µ L 20 mM Rosiglitazone 2mm 인슐린의 100 µ L의 10ml의 90 mL을 함께 혼합 하 여 체형 기본 미디어를 확인 합니다. 필요한 경우 차별화 실험 기간 동안 주 4 ° C에이 미디어를 저장 합니다.
- 62.5 m m 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)의 200 µ L을 추가 하 여 체형 유도 미디어 만들기와 체형 베이스 미디어의 25 ml 1 m m Dexamethasone의 25 µ L.
- BMSCs 문화 (총 Bmc 단계 4.3에서에서) 또는 BMSCs 단계 5.6에서에서 점착 confluent 일단 체형 유도 미디어를 미디어를 변경 합니다. 차별화의이 오늘을 0를 고려 하십시오.
- 48 h 후 미디어를 제거 하 고 체형 유도 미디어 문화를 새로 고칩니다.
- 4 일에 체형 기본 미디어로 전환.
참고: 지질 방울 주 2 또는 4 일 일찍 나타나는 것을 시작할 수 있습니다. - 7 일 셀 최대 지질 방울 축적 및 성숙한 체형과 유사한 표현 형을 표시를 준수 합니다. 그것은 세포 죽음/분리를 발생할 수 있습니다이 시점 과거 문화 하지 마십시오.
7입니다. Osteoclasts에 HSCs의 차별화
- Osteoclast 차별화 미디어 25 ml BMSC 문화 미디어의 25 µ g/mL의 수용 체 활성의 NFKB Ligand (RANKL)와 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (mCSF)의 25 µ g/mL의 15 µ L의 50 µ L을 추가 하 여 확인 합니다.
- 일단 총 Bmc (4.3 단계)에서 나는 비 부착 한 세포 (5.2 단계)에서 우물에 연결 된, 문화 미디어 Osteoclast 차별화 미디어를 전환할 수 있습니다. 차별화 미디어 매일 보충.
- Osteoclast 문화에서 10 배 확대 현미경 매일 관찰 합니다. Osteoclasts 퓨즈와 차별화의 5-7 일의 주위에 일반적으로 multinucleated 세포 형성을 관찰 합니다.
8. 얼룩
-
Osteoblasts
참고: 사용 하는 우리는 종종 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 얼룩 얼룩 하는 AP 키트 ( 재료의 표참조) 지침에 따라.- AP 얼룩 키트 제조 업체의 지침에 따라 수행 합니다.
- 미디어를 발음 하 고 PBS로 세포를 씻어. 4% 셀 수정 Paraformaldehyde (PFA) 실 온에서 12 분에 대 한 PBS에.
- 한편, AP 500 µ L을 추가 하 여 키트를 얼룩이 지기에서 시 약을 사용 하 여 AP 솔루션을 만들어 500 µ L FRV 알카라인 솔루션을 부드럽게; 혼합 나트륨 아 질산염 하자 2 분 추가 22.5 mL dH2O와 500 µ L Naphthol AS BI 알칼리 성. 부드럽게 혼합.
주의: PFA 독성 이며 관리와 처리 해야 합니다. - 일단 셀 고정, PBS로 씻어 고 각 잘 (우물 당 1 ~ 2 mL)을 AP 솔루션을 추가 합니다. 커버 알루미늄 호 일 및 빛에서 보호 하는 실 온에서 30 분 동안 하자 얼룩. 솔루션을 발음 하 고, 증류수로 씻어 접시 건조를 허용.
- 알칼리 성 인산 가수분해 효소 긍정적인 세포를 관찰 하기 위해 카메라를 사용 하 여 스테인드 식민지의 이미지를 취득 합니다.
- 또는 알칼리 성 인산 가수분해 효소 얼룩 대신 폰 Kossa 수행 합니다. 이 위해, 모든 나머지 PBS로 증류수로 깨끗이 세척 웰 스 실버 질산염. 와 침전 것입니다.
- 4% 셀 수정 PFA 실 온에서 12 분에 대 한 PBS에. 그런 다음 충분 한 5% 실버 질산염 솔루션 잘 커버 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 강한 빛에 노출에 추가 합니다.
- 실버 질산염 솔루션을 제거 하 고 증류수로 각 잘 린스. 셀에 5% 나트륨 thiosulfate 솔루션을 추가 하 고 3 분 서 보자.
- 나트륨 thiosulfate 발음 하 고 증류수로 씻어. 접시 건조 미네랄 예금에서 맨 눈으로 어두운 갈색/검은색 얼룩이 관찰 하자.
- AP 얼룩 키트 제조 업체의 지침에 따라 수행 합니다.
-
Adipocytes
- 기름 빨간 O (오로) 얼룩이 지기에 대 한 10%를 사용 하 여 셀 수정 중립 버퍼링 말린 실 온에서 1 h.
- 한편, 0.035 g 소 프로 파 놀의 10 mL에 용 해 하 여 오로 재고 솔루션을 확인 합니다. 이것은 6 잘 플레이트에 대 한 충분 한입니다. 혼합 하 고 하나의 필터 종이 (기 공 크기 11 µ m)를 사용 하 여 솔루션을 전달 합니다.
- 6 mL 증류수의과 오로 재고 솔루션의 9 mL를 diluting 하 여 오로 작업 솔루션을 확인 합니다. 사용할 준비까지 로커에 솔루션을 둡니다.
- 증류수에 60% 소 프로 파 놀 준비 (각을 커버 하기에 충분 하 게 잘).
- 셀 고정, 증류수와 통 및 세척 한 번 제거. 1 분 60% 소 프로 파 놀 솔루션에 물을 바꿉니다.
참고: 추가 팁 접시; 하는 동안 액체도 천천히 adipocytes 매우 쉽게 분리 하십시오. - 소 프로 파 놀을 제거 하 고 모든 세포를 충당 하기 위해 충분 한 오로 작업 솔루션을 추가 합니다. 실 온에서 저속 로커에 15 분 동안 품 어. 오로 제거 하 고 증류수로 두 번 세척.
참고:이 시점에서 오로 얼룩진 지질 방울 수 구상 될 현미경. - 오로 계량, 각 음을 100% 소 프로 파 놀의 1 mL을 추가 하 고 10 분 동안 천천히 흔들어는 오로 destain.
- 한편, 오로 작업 솔루션을 사용 하 여 다음 8 표준에 따라 표준 곡선을 만드는 희석 시리즈를 준비 (2100 µ g/mL)와 소 프로 파 놀은 희석제로: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75, 및 0 µ g/mL.
- 표준과 접시에 triplicates에서 destained 샘플의 200 µ L을 로드 하 고 490에서 흡 광도 읽고 nm.
- 표준 곡선에 따라 각 샘플에 대 한 오로의 농도 결정 합니다.
참고: 셀 수 오로 농도 정상화 것이 좋습니다. 휴대폰 번호 크리스탈 바이올렛 얼룩 또는 DNA 양을 측정할 수 있습니다.
- 표준 곡선에 따라 각 샘플에 대 한 오로의 농도 결정 합니다.
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Osteoclasts
참고: 경우 준비, 좋습니다 osteoclasts 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소 (함정) 트랩 얼룩을 사용 하 여 키트 ( 재료의 표참조)에 대 한 얼룩.- 트랩 얼룩, PBS에 2.5%도 함께 실 온에서 30 분에 대 한 셀을 수정. 한편, 함께 빠른 가닛 기반 솔루션의 50 µ L, 나트륨 아 질산염, 증류수의 4.55 mL, Napthol AS Biphosphate 아세테이트 솔루션의 200 µ L, 100 µ L 주석산 솔루션의 50 µ L의 50 µ L를 혼합 하 여 트랩 솔루션을 확인 합니다.
- 정착 액에서 aspirate 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 트랩 솔루션을 추가 하기 전에 두 번 PBS 가진 세포를 씻어
- Osteoclasts 현미경 (10 배 확대) 아래를 계산 하기 전에 증류수로 세척. 트랩+ 셀 3 개 이상의 핵을 보라색 나타납니다.
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Representative Results
세포 배양의 개요
두 문화 기술 BMSCs 및 HSCs (총 Bmc, 그림 1A)로 구성 된 Bmc의 혼합된 인구 또는 BMSCs의 인구에 차별화의 평가 HSCs (부착 BMSCs, 그림 1B)에서 분리 수 있습니다. 48 시간 후에 골 수에서 세포 격리 및 도금 (그림 1C), 그들은 신속 하 게 플라스틱 문화 접시의 바닥에 연결 고는 단층을 형성 하는 경향이 있다. 셀 합류 (그림 1D)에 도달, 그들은 감 별 법 분석 실험을 위해 사용할 수 있습니다.
BMSCs Osteoblasts로 분화
BMSCs의 confluent 문화 osteoblasts 의약품 및 β-글리세롤 인산 염 (그림 2A, B)의 구성 osteogenic 미디어를 사용 하 여로 분화 될 수 있다. 차별화의 몇 일 후 osteoblasts 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (그림 2C) 표현 시작. 더 차별화 osteoid 매트릭스 생산 및 궁극적으로이 매트릭스 (그림 2D)의 강화 작용을 일으킬 것 이다. 흥미롭게도, 셀의 비율만 osteoblasts 시험관으로 차별화 됩니다. 실제로, 모든 셀 알칼리 성 인산 가수분해 효소를 표현 하거나 접시를 형성할 보여준다 크리스탈 바이올렛 (그림 2E)와 얼룩.
BMSCs Adipocytes에 분화
지질 혼합된 Bmc의 문화 뿐만 아니라 더 많은 동종 세포 인구에 테스트할 수 있습니다. 혼합된 인구 (그림 3A) 또는 분할 인구 (그림 3B) 사용 여부 osteoblast 차별화, 관찰, 셀의 비율만 adipogenic 있습니다. Adipocytes 빨간색 오로 (그림 3C)으로 얼룩이 질 수 있다 여러 지질 그들 라운드 나타납니다. 우리의 경험에서는, 생체 외에서 adipocytes 항상 vivo에서 흰색 adipocytes 달리 다 vacuolated 나타납니다. 유전자 형 또는 문화 조건에 차이 adipocytes 분리 하 고 문화 판에 떠 있는 지점에 지질을 증가할 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 지질 실험 이전 시간에서 중지 될 수 있습니다.
HSCs Osteoclasts에 분화
Osteoclastogenesis는 mCSF와 RANKL 미디어를 보완 하 여 문화에서 유도 될 수 있다. HSCs multinucleated 셀 트랩 (그림 4A)에 대 한 긍정적인 얼룩을 형성 하기 위하여 급속 하 게 융합 하기 시작 합니다. 그 osteoclasts 미네랄 매트릭스에 생체 외에서 resorbing의 수 및 따라서 osteoclastic 활동 (그림 4B). 를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.
그림 1: BMSCs 및 HSCs의 문화에 대 한 프로토콜의 도식 일정. 다른 문화 기술을 전체 Bmc를 셀 (A) 또는 부착 BMSCs (B)의 혼합된 인구로 이루어져 있습니다. BMSCs 문화 C57B6/J 쥐에서 고립 된 48 시간 후 그들의 도금 (C)와 그들은 HSCs (D)에서 분한 후의 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : BMSCs 문화의 우물의 이미지 차별화 osteoblasts에. (A) 하기 전에 BMSCs (B) osteogenic 미디어에 배치 되 고 후. 핑크 (C)에 알칼리 성 인산 가수분해 효소 식과 브라운 (D) 미네랄 예금을 위해 osteoblasts 얼룩이 될 수 있다. 크리스탈 바이올렛 차별화 (E) 후 휴대폰 번호를 나타내기 위해 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: BMSCs의 문화의 대표적인 이미지 adipocytes에 분화. 오로 얼룩진 adipocytes adipogenic 미디어에서 7 일 후 BMSCs (A)와 분할 문화 (B)의 혼합된 인구에 게 서 얻은 이미지는 체형의 오로 (C)와 스테인드. 정량화의 오로 (E) 정규화 크리스탈 바이올렛 흡 광도를 전후 (D) 전에 adipogenic 미디어에서 7 일 후. 데이터는 의미의 표준 오차를 나타내는 오차 막대 수단으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: HSCs 문화 분화 osteoclasts에. 트랩 osteoclasts 큰 자주색 분홍색 multinucleated 셀 (A)으로 나타나는의 얼룩. 광물 화 된 표면 osteoclasts HSCs에서 7 일 (B) 후 분화를 남긴 재흡수 구 덩이와 Von Kossa에 의해 검은 얼룩이 진다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 문서에서는, BMSCs의 문화의 두 가지 방법은 자신의 장점과 한계 표시 됩니다. 세포는 골 수에서 오는 격리 상대적으로 어려움 없이 과정 이다. 그러나, 중간 엽 줄기 세포 또는 osteoclastic 창시자의 대표적인 세포 인구를 얻기 때문에 골 수 구멍의 다양 한 세포 환경 전하실 수 있습니다.
골 수 내용의 전체를 경작 vivo에서 microenvironment의 가까운 표현을 제공 합니다. 그러나, 생체 외에서 실험의 처음에 BMSCs 또는 HSCs의 아주 다른 수 귀 착될 수 있다 쥐 (genotypes, 트리 트 먼 트, 나가, 등)의 다른 그룹에서 세포를 분리. 따라서, BMSCs 및 HSCs를 분리 하 고 다시 그들을 도금 차별화 실험의 시작에 휴대폰 번호를 통해 더 나은 제어를 허용 합니다. 그러나, 세포 배양의이 감소 수 있습니다 영향을 BMSCs 또는 HSCs의 결과 둘 다 분 엽 및 osteoclastic 분화에 영향을 미치는 요인으로. 그것은 고립과 BMSCs HSCs의 문화를 디자인할 때 그 한계를 고려 하는 것이 중요입니다.
골 수에 존재 하는 세포 인구의 수많은 데이터의 해석에 문제를 발생할 수 있습니다. HSCs와 BMSCs, 골 microenvironment 또한 포함 되어 차별화 된 면역 세포, 적혈구 세포, 내 피 세포등 그 인구 부착 또는 비 점착 분수에 남아 있을 수 있습니다 그리고 따라서 실험 결과 영향을 미칠 수 있습니다. BMSCs 정렬 옵션 "순수한" 세포 인구를 달성 하기 위해 될 수 있습니다. 실제로, BMSCs CD34 HSCs 하지10동안 표현 하 생각 된다. 그러나, 그것은 또한 BMSCs의 표면에서 CD34의 부족 문화의 결과 있을 수 있습니다, 연구는 CD34의 비 점착 하위 집합을 표시 하고있다 제안 했다+ BMSCs osteoblast, adipocytes chondrocytes11, 로 분화 수 12. 그러므로 때 BMSCs을 정렬, 잘 정의 된 마커의 배열 설계 되어야 한다 미리. 셀 정렬 다른 장애물이 타이밍 및 비용. 실제로, 고립의 시간에 증가 수 정렬 단계 추가 비용에 상당한 증가 뿐만 아니라 상당히 프로토콜. 요약 하자면, 정렬 셀 BMSCs의 품질과 수확량을 줄일 수 있는 기술 과제 제시.
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Disclosures
저자 들은 관심사의 재정적인 충돌 공개.
Acknowledgments
이 작품은 건강의 국가 학회 (R01 AR061164-01A1)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
| Dissection tools | |||
| 70 μm filters | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer inverter microscope | Zeiss |
References
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