Summary
Neste artigo, apresentamos métodos para isolar e diferenciar as células do estroma da medula óssea e células-tronco hematopoiéticas de ossos longos de rato. Dois protocolos diferentes apresentam-se populações de células diferentes rendimento adequadas para a expansão e diferenciação em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos.
Abstract
Células do estroma da medula óssea (BMSCs) constituem uma população de células rotineiramente utilizada como uma representação de células-tronco mesenquimais in vitro. Eles residem dentro da cavidade da medula óssea, ao lado de células-tronco hematopoiéticas (linfócitos), que pode dar origem a células vermelhas do sangue, progenitores imunes e osteoclastos. Assim, extrações de populações de células resultados da medula óssea em uma mistura muito heterogénea de diferentes populações de células, que pode apresentar desafios em delineamento experimental e confundir a interpretação dos dados. Várias técnicas de cultura e isolamento foram desenvolvidas em laboratórios a fim de obter mais ou menos homogêneas populações de BMSCs e linfócitos in vitro. Aqui, apresentamos dois métodos para isolamento de BMSCs e linfócitos de ossos longos de rato: um método que produz uma população mista de BMSCs e linfócitos e um método que tenta separar as populações de duas células com base em aderência. Ambos os métodos fornecem células apropriadas para osteogênico e adipogenic diferenciação dos experimentos de ensaios, bem como funcionais.
Introduction
BMSCs murino primárias são comumente usados como um modelo in vitro de células-tronco mesenquimais, desde a sua descoberta no início dos anos 19801. Na verdade, culturas de células de plástico aderente liberadas da cavidade da medula óssea dos ossos longos mantêm a capacidade de ser diferenciadas em osteoblastos, osteoclastos, condrócitos ou adipócitos em muitos estudos2,3, 4 , 5. no entanto, a medula óssea é um tecido exclusivo composto de muitas populações de células diferentes, incluindo, mas não limitado a, BMSCs, linfócitos, células endoteliais e imunes. Assim, o isolamento e as técnicas de cultura podem render populações de células com diferente homogeneidade. Usando essas técnicas para testar a potencial de diferenciação de células pode ser um desafio. Por exemplo, ao comparar células de ratos com diferentes genótipos, começando com uma população de célula mista limita a interpretação dos dados. Inversamente, a obtenção de populações homogêneas de BMSCs e linfócitos pode ser tecnicamente difícil e pode não ser tão representativa de um modelo ex vivo .
Em nosso laboratório, nós estamos principalmente interessados na utilização de BMSCs devido ao seu potencial a ser diferenciadas em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos. Aqui, apresentamos técnicas de isolamento BMSCs e linfócitos e cultura usada para avaliar osteoblastogenesis ou adipogenesis em vitro, assim como culturas de linfócitos de se diferenciarem em osteoclastos. Um método utiliza uma população mista de células da medula óssea (BMCs) contendo BMSCs e linfócitos diretamente apropriados para adipogenesis, osteoblastogenesis e osteoclastogenesis (chamado BMCs Total). Este método é uma representação de ex vivo perto da heterogeneidade encontrada entre as células do microambiente da medula óssea. Outro método separa aderente de células não-aderentes na tentativa de populações "puras" de cultura de BMSCs e linfócitos (chamados BMSCs aderente). O método posterior permite a cultura de pilha experimentos para iniciar com um número mais exato de BMSCs ou linfócitos e reduz o potencial de complexos efeitos indiretos de outras populações de células que permanecem na cultura. Ambos os métodos foram previamente publicados e usados para tratar diferentes pesquisas perguntas6,7,8,9.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de uso para o Maine Medical Center Research Institute e institucional Cuidado Animal.
1. coleção tubos de preparação
- Fazer os meios de cultura BMSC, completando meio essencial mínimo α (α MEM) com 10% de soro Fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina.
- Coloque 100 µ l de BMSC de meios de cultura em tubos de 1,5 mL microcentrifuge. 3 ossos geralmente vão caber em um único tubo então preparar conformemente.
- Corte as extremidades das pontas de pipetas da 200 µ l de suficiente para que eles se encaixam em tubos de centrífuga. Insira as pontas dentro dos tubos e certifique-se de que as tampas podem fechar antes de colocar os tubos no gelo.
Nota: Como alternativa, tubos de microcentrifuga 0,75 mL com o corte de pontas podem ser inseridos no tubo microcentrifuga de 1,5 mL.
2. colheita de ossos de ratos
- Eutanásia em animais usando CO2 , seguido por deslocamento cervical e pulverizá-los com etanol a 70%.
Nota: Certifique-se que são utilizados animais de mesmo sexo e, de preferência, da mesma idade. Rotineiramente usamos animais com idades entre 7 a 8 semanas. Recomendamos que o pool de células pelo menos 3 animais por grupos experimentais para produzir uma população de células representativas e reprodutíveis a melhor. -
Coloque o mouse euthanized em suas costas num tabuleiro de dissecação. Use fórceps para criar uma tenda de pele no abdômen. Faça uma pequena incisão (cerca de 1 cm) com uma tesoura estéril de dissecação. Descasca a pele para os membros e os pés do corte para expor a parte inferior do abdome e as pernas.
- Corte abaixo do tornozelo conjunta para remover o pé. Corte ao longo da crista ilíaca no quadril para separar a cabeça do fêmur do osso ilíaco. Enquanto o mouse está ainda em suas costas, fazer uma incisão no meio do osso ilíaco para separar os dois ossos ilíacos.
- Usando lenços fiapos, cuidadosamente remova o músculo os fêmures, tíbias e ossos ilíacos.
Nota: Corte o máximo dos tendões e músculos do osso como torna possível a limpeza mais rápida e mais fácil com as toalhitas de fiapos (por exemplo, kimwipes). Tenha cuidado ao manipular os ossos como eles tendem a quebrar facilmente e sua fragilidade pode ser aumentada com determinados genótipos. - Uma vez que todas as amostras têm sido dissecadas, colocá-los em PBS no gelo e mover-se para uma capa de cultura estéril para as etapas restantes de isolamento.
Nota: Trabalhar assepticamente possível reduzirá o potencial de contaminação nas culturas. - Faça pequenos cortes (cerca de 1 a 2 mm) em ambas as extremidades proximais e distais dos ossos antes de colocá-los em dicas seccionadas dentro dos tubos de centrífuga.
Nota: Certifique-se para cortar uma quantidade suficiente para que a medula pode ser centrifugada para fora; no entanto, deve ter cuidado para evitar cortar demais como populações de células tendem a variar com base na proximidade dentro do espaço de medula. - Centrifugação a 10.000 x g por 15 s à temperatura ambiente. Certifique-se que todo o tutano é liberado e peletizado na parte inferior do tubo de 1,5 mL, enquanto que os ossos estão dentro as inserções (ou 200 µ l pipeta ponta ou 0,75 mL microcentrifuga tubo). Depois de toda a medula é recolhida, remova as inserções com os ossos dos tubos de coleta.
Nota: Se é liberada toda a medula, os ossos aparecerá brancos. No entanto, se a medula permanece em certos ossos, tente extremidades de corte novamente e centrifugar.
3. suspensão
- Usando uma agulha 25g, puxe a célula pelotas acima e para baixo lentamente para separar grupos e combinar todas as amostras em um tubo cônico único 15 mL. Adicione 10 mL de meio de cultura BMSC por 500 µ l de amostras.
- Coloque um filtro de 70 µm em cima de um tubo cónico de 50 mL e a suspensão de células atravessam este filtro para retirar fragmentos de osso possível.
4. chapeamento e cultura das populações mistas de células da medula óssea (BMCs Total)
Nota: As células são cultivadas a 37 ° C numa incubadora com 5% de CO2.
- Calcular o número de células e placa-los em 1.0 x 106 células/cm2 em meios de cultura. Permita a 72 h de cultura mista de células anexar.
Nota: Recomendamos diluir a suspensão de célula 20 x em meios de cultura e diluir novamente em trypan azul antes de contar as células usando um hemocytometer. Para camundongos C57Bl6/J machos de 7 semanas de idade, nós rotineiramente ceder um número de celular de cerca de 50 x 106 células mas idade, sexo e tensão podem afetar o número de celular grandemente.
Nota: Uma população de mistura das pilhas deve anexar na parte inferior da cultura bem. - Depois de 72 h, remova a mídia e substituí-lo com a nova mídia. Continue mudando os meios de comunicação cada outro dia e verificar se há confluência. Quando as células atingem 80-100% confluência, eles estão prontos para a diferenciação.
Nota: Porque esta cultura é misturada com BMSCs e linfócitos, isso pode ser usado diretamente para osteoblastogenesis, adipogenesis, bem como osteoclastogenesis.
5. chapeamento e cultura da população de Split de BMSCs (BMSCs aderentes)
Nota: As células são cultivadas a 37 ° C numa incubadora com 5% de CO2.
- Placa de todas as células coletadas dos fêmures, tíbias e ilíacos ossos de um rato em um prato de cultura de 10 cm (55 cm2 de área de cultura).
Nota: Quando o pool de camundongos C57BL/6J de 2-3, nós tipicamente placa esta população 'total' da medula óssea em um balão de2 a 150 cm. - Após 48 h de cultura mista, remova a mídia de cultura (que contém o linfócitos não-aderente). Se osteoclastogenesis experiências devem ser executadas, definir esta população de células não-aderente à parte (veja seção 7), se não, aspirado e descartar essas células.
- Lave o placa/frasco com PBS como cuidadosamente para não perturbar as células anexadas.
- Remover o PBS e levantar as células adicionando tripsina 0,25% e incubar a 37 ° C, durante 1-3 min Quench a tripsina adicionando mídia celular à suspensão de células. Neste ponto, o BMSCs, que agora é levantado, que podem ser contado (como feito anteriormente no passo 4.1) e chapeado para experiências futuras.
- Calcule o número de células necessárias para o chapeamento. Centrifugue o volume necessário de suspensão de células a 1.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
Nota: As células normalmente são banhadas com base em experiências de ponto de extremidade. Por exemplo, se deve ser isolado da proteína/RNA nós tipicamente chapear em uma densidade mais elevada (~1.0-2.0 x 106 células/poço em placa de 6). - Remova a mídia e ressuspender as células no volume de meios de cultura necessário para o chapeamento. As células em meios de cultura, de acordo com as experiências da placa e lhes permitem anexar por alguns dias. Quando os BMSCs chegarem a confluência, dirijam-se para realizar a diferenciação.
6. diferenciação de BMSCs
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Osteoblastos
- Faça mídia de diferenciação osteoblástica adicionando 800 µ l de 1m β-glicerol fosfato em PBS e 200 µ l de ácido ascórbico de 0,5 M em PBS a 99 mL de meios de cultura BMSC (consulte a etapa 1.1 para a composição dos meios de cultura a BMSC).
- Uma vez que as culturas de BMSCs (BMCs totais da etapa 4.3) ou aderente BMSCs da etapa 5.6 são confluentes, diferenciá-los em osteoblastos alternando-se os meios de cultura para mídia de diferenciação osteoblástica.
- Substitua a mídia diferenciação todos os dias. Células começam a produzir nódulos brancos de mineralização. Visualizá-las a olho nu no fundo do poço; Este processo pode ocorrer dentro de alguns dias a 3 semanas.
- Para avaliar osteoblastogenesis, realize a coloração da fosfatase alcalina e/ou Von Kossa coloração sobre os poços, conforme descrito na seção 8.
Nota: Altere a mídia cuidadosamente pela inclinação das placas em um ângulo ligeiro para evitar perturbações da monocamada a célula.
- Para avaliar osteoblastogenesis, realize a coloração da fosfatase alcalina e/ou Von Kossa coloração sobre os poços, conforme descrito na seção 8.
- Faça mídia de diferenciação osteoblástica adicionando 800 µ l de 1m β-glicerol fosfato em PBS e 200 µ l de ácido ascórbico de 0,5 M em PBS a 99 mL de meios de cultura BMSC (consulte a etapa 1.1 para a composição dos meios de cultura a BMSC).
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Adipócitos
- Faça mídia base adipócito pela mistura de 90 mL de meio de Eagle modificado Dulbecco (DMEM) glicose alta, 10ml de soro Fetal bovino, 1 mL de penicilina/estreptomicina, 100 µ l 20mm Rosiglitazona e 100 µ l de 2 mM de insulina. Se necessário, armazene essa mídia a 4 ° C para a semana durante o experimento de diferenciação.
- Faça mídia de indução dos adipócitos adicionando-se 200 µ l de 62,5 mM 3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX) e 25 µ l de 1mm dexametasona a 25 mL de mídia de Base dos adipócitos.
- Uma vez que as culturas de BMSCs (BMCs totais da etapa 4.3) ou aderente BMSCs da etapa 5.6 são confluentes, altere os meios de comunicação para mídia de indução dos adipócitos. Considere este dia 0 de diferenciação.
- Após 48 h, remova a mídia e atualizar a cultura com mídia de indução dos adipócitos.
- No dia 4, alterne para a mídia de base dos adipócitos.
Nota: Gotículas lipídicas podem começam a aparecer tão cedo quanto dia 2 ou 4 dias. - No dia 7, observe que as células acumularam gotículas lipídicas máxima e exibir um fenótipo semelhante a dos adipócitos maduros. Não cultura por esse ponto, como pode resultar morte/destacamento de célula.
7. diferenciação dos linfócitos em osteoclastos
- Faça Osteoclast diferenciação mídias pela adição de 50 µ l de 25 µ g/mL de Receptor ativador de VHC ligante (RANKL) e 15 µ l de 25 µ g/mL de macrófagos (mCSF) fator estimulante da colônia para 25 mL de meio de cultura BMSC.
- Depois os BMCs totais (da etapa 4.3) ou as células não-aderente (da etapa 5.2) são anexadas ao poço, meios de cultura pode ser alternado para mídia de diferenciação do Osteoclast. Repor os meios de diferenciação todos os dias.
- Observe as culturas osteoclast cada dia sob um microscópio com ampliação de 10x. Observe que osteoclastos se fundem e formam células multinucleadas, tipicamente em torno de 5-7º dia de diferenciação.
8. coloração
-
Osteoblastos
Nota: Para a coloração da fosfatase alcalina (AP), que muitas vezes usam uma coloração AP kit (veja a Tabela de materiais) de acordo com as orientações.- Execute AP coloração, seguindo as orientações do fabricante do kit.
- Aspirar a mídia e enxágue células com PBS. Consertar as células com 4% paraformaldeído (PFA) em PBS por 12 min à temperatura ambiente.
- Entretanto, fazer a solução de AP usando os reagentes do kit de coloração adicionando 500 µ l do AP nitrito de sódio, solução alcalina-FRV 500 µ l e misturando delicadamente; deixe descansar por 2 min. Adicione 22.5 mL dH2O e 500 µ l naftol AS-BI alcalina. Misture suavemente.
Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado. - Uma vez que as células são fixos, enxaguar com PBS e adicionar solução de AP a cada poço (1 a 2 mL por bem). Cubra com papel alumínio e deixe a mancha por 30 min em temperatura ambiente protegida da luz. Aspirar a solução, lavar com água destilada e deixar a placa secar.
- Adquira imagens de colônias manchadas usando uma câmera para observar células positivas de fosfatase alcalina.
- Como alternativa, execute Von Kossa em vez de coloração da fosfatase alcalina. Por isso, poços de lavagem com água destilada como qualquer restantes PBS precipitará com nitrato de prata.
- Consertar as células com 4% PFA em PBS por 12 min à temperatura ambiente. Em seguida, adicione o suficiente solução de nitrato de prata 5% para cobrir o poço e expor à luz forte por 1h à temperatura ambiente.
- Remova a solução de nitrato de prata e lave cada poço com água destilada. Adicionar a solução de tiossulfato de sódio a 5% para as células e deixar repousar durante 3 min.
- Aspirar o tiossulfato de sódio e lave com água destilada. Deixe a placa secar e observar o depósito mineral corado em marrom escuro/preto com olho nu.
- Execute AP coloração, seguindo as orientações do fabricante do kit.
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Adipócitos
- Para a mancha de óleo vermelho O (ORO), consertar as células usando a 10% neutro tamponado formol por 1h à temperatura ambiente.
- Entretanto, fazer a solução de estoque ORO pela dissolução de 0,035 g em 10 mL de isopropanol. Isto é suficiente para uma placa de 6. Misturar e transferir a solução usando um filtro de papel (poros tamanho 11 µm).
- Fazer a solução de trabalho de ORO diluindo 9 mL de solução-mãe de ORO com 6 mL de água destilada. Deixe a solução em um roqueiro até que esteja pronto para uso.
- Preparar o isopropanol 60% em água destilada (suficiente para cobrir cada um fazer bem).
- Uma vez que as células são fixos, remova o fixador e lave uma vez com água destilada. Substitua a água com a solução de isopropanol 60% por 1 min.
Nota: Adicione o líquido lentamente enquanto derrubando a placa; adipócitos desalojar muito facilmente. - Remover o isopropanol e adicionar solução de trabalhar bastante ORO para cobrir todas as células. Incube durante 15 min em um balancim de baixa velocidade à temperatura ambiente. Remover ORO e lavar duas vezes com água destilada.
Nota: neste ponto, gotículas lipídicas ORO-manchadas podem ser visualizadas sob o microscópio. - Para quantificar o ORO, destain o ORO, adicionando 1 mL de isopropanol 100% a cada poço e agite-o lentamente por 10 min.
- Entretanto, preparar uma série de diluição para criar uma curva padrão baseada nos seguintes 8 padrões usando solução de trabalho de ORO (2.100 µ g/mL) e isopropanol como diluente: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 e 0 µ g/mL.
- Carregar a 200 µ l das normas e as amostras destained em triplica em um prato e ler a absorvância a 490 nm.
- Determine a concentração de ORO para cada amostra com base na curva padrão.
Nota: Recomendamos que normalizar a concentração ORO para o celular. Número do celular pode ser quantificado pela coloração violeta cristal ou a quantidade de DNA.
- Determine a concentração de ORO para cada amostra com base na curva padrão.
-
Osteoclastos
Nota: Quando estiver pronto, nós sugerimos coloração osteoclastos para kit de resistente ao tartarato ácido fosfatase (armadilha) usando a coloração de armadilha (ver Tabela de materiais).- Armadilha de coloração, corrigi células por 30 min à temperatura ambiente com glutaraldeído 2,5% em PBS. Entretanto, fazer a solução de armadilha pela mistura de 50 µ l da solução de Base rápido granadas, 50 µ l de nitrito de sódio, 4,55 mL de água destilada, 50 µ l de Napthol AS-Biphosphate, 200 µ l de solução de acetato e solução de tartarato de 100 µ l.
- Aspire o fixador e lave as células com PBS duas vezes antes de adicionar a solução de armadilha para 1 h a 37 ° C.
- Lavar com água destilada antes da contagem de osteoclastos sob um microscópio (ampliação 10x). As células de armadilha+ aparecem roxas com 3 ou mais núcleos.
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Representative Results
Visão geral das culturas de células
As técnicas de duas cultura permitem a avaliação da diferenciação em uma população mista de BMCs composto de BMSCs e linfócitos (BMCs Total, figura 1A) ou de uma população de BMSCs separou-se linfócitos (BMSCs aderente, figura 1B). 48 horas depois que as células da medula são isoladas e chapeado (Figura 1), eles rapidamente anexar a parte inferior da placa de cultura de plástico e tendem a formar uma monocamada. Uma vez que as células alcançar confluência (Figura 1), pode ser usados para ensaios de diferenciação.
BMSCs diferenciadas em osteoblastos
Confluentes culturas de BMSCs podem ser diferenciadas em osteoblastos, usando uma mídia osteogênica, composta de ácido ascórbico e β-glicerol fosfato (Figura 2A, B). Depois de alguns dias de diferenciação, osteoblastos começam expressando a fosfatase alcalina (Figura 2). Diferenciação mais provocará a produção de matriz osteoide e, finalmente, a mineralização dessa matriz (Figura 2D). Curiosamente, apenas uma proporção das células irá diferenciar em osteoblastos em vitro. Com efeito, a coloração com violeta de cristal (Figura 2E) revela que não todas as células expressam fosfatase alcalina ou mineralização da placa.
BMSCs diferenciadas em adipócitos
Adipogenesis pode ser testado em culturas de BMCs mistos, bem como sobre a população de células mais homogênea. Como observado com diferenciação osteoblástica, se as populações mistas (Figura 3A) ou as populações de split (Figura 3B) são usadas, apenas uma proporção das células são adipogenic. Adipócitos aparecem redondos com múltiplos vacúolos de lipídios que podem ser manchados de vermelho com ORO (Figura 3). Em nossa experiência, sempre aparecem em vitro adipócitos multi vacuolated ao contrário dos adipócitos na vivo branco. Diferenças nas condições de genótipo ou cultura podem aumentar adipogenesis a um ponto onde os adipócitos desanexar e flutuam na placa de cultura. Para resolver esse problema, o experimento adipogenesis pode parar em um ponto do tempo anterior.
Linfócitos diferenciados em osteoclastos
Osteoclastogenesis podem ser induzidas nas culturas, completando os meios de comunicação com mCSF e RANKL. Linfócitos começam a fundir-se rapidamente para formar as células multinucleadas que mancham positivas para a armadilha (Figura 4A). Os osteoclastos são capazes de resorbing matriz mineral em vitro e, portanto, podem ser usados para avaliar a atividade osteoclástica (Figura 4B).
Figura 1: Cronograma esquemática dos protocolos para a cultura de linfócitos e de BMSCs. Técnicas de cultura diferente para produzir BMCs Total é composto por uma população mista de células (A) ou aderente BMSCs (B). Imagem representativa da cultura BMSCs isolada de ratos C57B6/J 48hr após sua chapeamento (C) e depois eles dividem-se de linfócitos (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Imagens de poços de BMSCs culturas diferenciadas em osteoblastos. BMSCs antes (A) e depois (B) sendo colocada na mídia osteogênica. Os osteoblastos podem ser manchados para expressão de fosfatase alcalina em rosa (C) e para o depósito mineral em marrom (D). Cristal violeta pode ser usada para representar o número de células após diferenciação (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens representativas das culturas de BMSCs diferenciados em adipócitos. ORO-manchado adipócitos obtidos de uma população mista de BMSCs (A) e uma cultura de divisão (B) após 7 dias em adipogenic mídia. Imagem de um adipócito manchada de ORO (C). Quantificação de ORO após 7 dias em mídia adipogenic antes (D) e (E) normalização a absorvância de violeta cristal. Dados são apresentados como meio com barras de erro, que representam o erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Culturas de linfócitos diferenciados em osteoclastos. ARMADILHA de coloração dos osteoclastos, aparecendo como grandes células multinucleadas de roxo-rosa (A). Mineralizado superfície manchada de preto por Von Kossa com reabsorção poços deixados pelos osteoclastos diferenciados de linfócitos após 7 dias (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste artigo, apresentam-se dois métodos de cultura de BMSCs com suas vantagens e limitações. Isolar as células provenientes da medula óssea é um processo relativamente fácil. No entanto, a obtenção de uma população de células representativa dos progenitores osteoclástica ou células-tronco mesenquimais pode ser um desafio devido ao ambiente celular diverso da cavidade da medula.
Cultivo a totalidade do conteúdo da medula óssea fornece uma representação perto do microambiente no vivo . No entanto, isolar células de diferentes grupos de ratos (genótipos, tratamentos, idades, etc.) pode resultar em um número muito diferente de BMSCs ou linfócitos no início do experimento em vitro . Portanto, separar BMSCs e linfócitos e re-chapeamento-lhes permitam um melhor controle sobre o número de células no início do experimento diferenciação. No entanto, reduzindo a heterogeneidade da cultura de pilha pode afetar os resultados do BMSCs ou linfócitos como ambos secretam fatores que influenciam a diferenciação osteoclástica e mesenquimal. É importante considerar essas limitações ao projetar o isolamento e a cultura da BMSCs e linfócitos.
A multidão de populações de células presentes na medula óssea pode apresentar desafios na interpretação dos dados. Além de linfócitos e BMSCs, o microambiente da medula óssea também contém células imunes diferenciadas, glóbulos vermelhos, células endoteliaisetc. Essas populações podem permanecer na fração aderente ou não aderente e, portanto, podem afetar os resultados experimentais. BMSCs de triagem pode ser uma opção para atingir uma população de células "mais pura". Com efeito, BMSCs são pensados para expressar CD34 enquanto linfócitos fazer não10. No entanto, foi também sugerido que a falta de CD34 na superfície do BMSCs pode ser o resultado da cultura e um estudo mostrou que um subconjunto não-aderente de CD34+ BMSCs poderia se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condrócitos11, 12. portanto, quando se considera a classificação para isolar BMSCs, uma matriz de marcadores bem definidos deve ser concebida previamente. Outros obstáculos à célula classificação são tempo e custo. Na verdade, adicionar um passo classificação poderia aumentar o tempo do isolamento protocolo consideravelmente bem como um aumento significativo no custo. Em resumo, classificação células apresentam desafios técnicos que podem reduzir o rendimento e a qualidade de BMSCs.
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Disclosures
Os autores divulgar que eles têm não financeiro conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (AR061164-01A1 R01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
| Dissection tools | |||
| 70 μm filters | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer inverter microscope | Zeiss |
References
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