Summary
I denna artikel presenterar vi metoder för att isolera och differentiera benmärgens stromaceller och hematopoetiska stamceller från mus långa ben. Två olika protokoll presenteras högproducerande olika cellpopulationer lämplig för expansion och differentiering till osteoblaster, adipocyter och osteoklaster.
Abstract
Benmärgens stromaceller (BMSCs) utgör en cell befolkningen rutinmässigt används som en representation av mesenkymala stamceller in vitro-. De bor i benmärgen hålrummet tillsammans med hematopoetiska stamceller (Förenta), som kan ge upphov till röda blodkroppar, immun stamfäder och osteoklaster. Således, extraktioner av cellpopulationer från benmärgen resulterar i en mycket heterogen blandning av olika cellpopulationer, som kan presentera utmaningar i experimentell design och blanda ihop tolkning av data. Flera isolering och kultur tekniker har utvecklats i laboratorier för att få mer eller mindre homogena populationer av BMSCs och Förenta invitro. Här presenterar vi två metoder för isolering av BMSCs och Förenta från mus långa ben: en metod som ger en blandad befolkning av BMSCs och Förenta och en metod som försöker separera de två cellpopulationer baserat på följsamhet. Båda metoderna ger celler passar osteogent och adipogena differentiering experiment samt som funktionella analyser.
Introduction
Primära murina BMSCs används ofta som en in vitro- modell av mesenkymala stamceller sedan sin upptäckt i början av 1980-talet1. Faktiskt, kulturer av plast-anhängare celler spolas från benmärgen hålighet i långa ben upprätthålla kapacitet att differentieras till osteoblaster, osteoklaster, kondrocyter eller adipocyter i många studier2,3, 4 , 5. benmärgen är dock en unik vävnad består av många olika cellpopulationer inklusive, men inte begränsat till, BMSCs, Förenta, endotel och immuna celler. Således, isolering och kultur tekniker kan ge cellpopulationer med olika homogenitet. Använda sådana tekniker för att testa differentieringen som potentiella från celler kan vara utmanande. Till exempel när man jämför celler från möss med olika genotyper, börjar med en blandad cell befolkningen begränsar tolkningen av data. Omvänt, att erhålla homogen populationer av BMSCs och Förenta kan vara tekniskt svårt och kanske inte så representativa av en ex vivo -modell.
I vårt laboratorium är vi främst intresserade av utilizationen av BMSCs på grund av deras potential att differentieras till osteoblaster, osteoklaster och adipocyter. Här presenterar vi tekniker för BMSCs och Förenta isolering och kultur som används för att bedöma osteoblastogenesis eller adipogenesis i vitro, såväl kulturer av Förenta differentieras till osteoklaster. En metod använder en blandad befolkning av benmärgsceller (BMC) som innehåller BMSCs och Förenta direkt lämplig för adipogenesis, osteoblastogenesis och osteoclastogenesis (kallas totala BMC). Denna metod är en närmare ex vivo representation av heterogenitet finns bland cellerna i benmärgens mikromiljö. En annan metod separerar anhängare från icke-anhängare celler i ett försök att kultur ”renare” populationer av BMSCs och Förenta (kallas anhängare BMSCs). Den sena metoden tillåter cellkulturen experiment för att starta med en mer exakt antal BMSCs eller Förenta och minskar potentialen för komplexa indirekta effekter av andra cellpopulationer som finns kvar i kulturen. Båda metoderna har tidigare publicerat och används för att behandla olika frågor6,7,8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella rutiner godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén vid Maine Medical Center Research Institute.
1. insamling rör förberedelse
- Göra BMSC kulturmassmedia genom att komplettera minst viktigt Medium α (MEM α) med 10% fetalt bovint Serum och 1% av Penicillin/Streptomycin.
- Placera 100 µL av BMSC kultur media i 1,5 mL mikrocentrifugrör. 3 ben passar vanligtvis i en enda röret så förbereda därefter.
- Klipp ändarna av 200 µL pipettspetsar nog så att de passar i centrifugrör. Infoga tips inuti rören och se till att locken kan stänga innan placera rören på is.
Obs: Alternativt 0,75 mL mikrocentrifugrör med ändarna snittet kan infogas i 1,5 mL mikrocentrifug röret.
2. skörden av ben från möss
- Euthanize djuren använder CO2 följt av cervikal dislokation och spraya dem med 70% etanol.
Obs: Se till att djur från samma kön och helst samma ålder används. Vi använder rutinmässigt djur åldern 7 till 8 veckor. Vi rekommenderar att slå samman celler från minst 3 djur per experimentella grupper att ge en bättre representant och reproducerbara cell befolkningen. -
Placera euthanized musen på ryggen på en dissekera ombord. Använd tången för att skapa ett tält av hud på buken. Göra ett litet snitt (cirka 1 cm) med sterila dissekera sax. Dra av huden mot benen och fötterna från snittet för att exponera nedre delen av buken och benen.
- Skära nedanför fotleden gemensamma ta bort foten. Skär längs höftbenskammen på höften för att separera lårbenet huvudet från tarmbenet. Även musen är fortfarande på ryggen, gör ett snitt i mitten av tarmbenet att separera de två iliaca ben.
- Använd luddfria servetter och ta försiktigt bort muskeln från lårbenet, skenbenet och iliaca ben.
Obs: Skära så mycket av senor och muskler från benet som möjligt gör rengöring snabbare och enklare med de luddfria servetterna (t.ex., kimwipes). Var försiktig när du manipulera benen eftersom de tenderar att bryta lätt och deras bräcklighet kan ökas med vissa genotyper. - När alla prover har varit dissekerade, placera dem i PBS på is och flytta till en steril kultur huva för de återstående stegen av isolering.
Obs: Arbeta aseptiskt så mycket som möjligt minskar risken för kontaminering i kulturer. - Göra små nedskärningar (cirka 1 till 2 mm) i både proximala och distala ändarna på benen innan du placerar dem i sektionerad tips inom centrifugrör.
Anmärkning: Se till att skära en tillräcklig mängd så att benmärgen kan vara centrifugeras ut; men försiktighet måste iakttas för att undvika skärning för mycket eftersom cellpopulationer tenderar att variera baserat på närhet inom märg. - Centrifugera vid 10 000 x g under 15 s i rumstemperatur. Säkerställa att alla märgen är spolas och pelleterat längst ned på 1,5 mL röret medan benen är inuti skären (antingen 200 µL Pipettera spets eller 0,75 mL mikrocentrifug rör). När alla märgen samlas in, ta bort skären med ben från samling rören.
Obs: Om alla märgen spolas, ben visas vit. Dock om benmärg förblir i vissa ben, försöka klippa ändarna igen och centrifugera.
3. cellsuspension
- Använda en 25 G nål, dra pellets cellen upp och ner långsamt att bryta upp klumpar och kombinera alla prover till ett enda 15 mL koniska rör. Tillsätt 10 mL av BMSC kultur Media per 500 µL av prover.
- Placera en 70 µm filter ovanpå en 50 mL konisk tub och passera cellsuspensionen genom detta filter för att ta bort eventuella benfragment.
4. plätering och kultur av blandade populationer av benmärgsceller (totala BMC)
Obs: Celler odlas vid 37 ° C i en inkubator med 5% CO2.
- Beräkna antalet celler och platta dem på 1,0 x 106 celler/cm2 i kultur media. Tillåta 72 h av blandad kultur för celler att fästa.
Obs: Vi rekommenderar att späda på cell suspension 20 x kultur media och späda igen i trypan blått innan räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. För 7 veckor gamla C57Bl6/J hanmöss, vi ge rutinmässigt en cellantal runt 50 x 106 celler men ålder, kön och stam kan påverka antalet celler kraftigt.
Obs: En mix population av celler bör bifoga längst ned på kulturen väl. - Efter 72 h, ta bort materialet och ersätta det med frisk media. Fortsätta byta media varannan dag och kontrollera för konfluens. När cellerna når 80-100% konfluens, är de redo för differentiering.
Obs: Eftersom denna kultur blandas med både BMSCs och Förenta, det kan användas direkt för osteoblastogenesis, adipogenesis samt osteoclastogenesis.
5. plätering och kultur av Split befolkningen av BMSCs (vidhäftande BMSCs)
Obs: Celler odlas vid 37 ° C i en inkubator med 5% CO2.
- Tallrik alla celler samlas från lårbenet, skenbenet och iliaca ben av en mus i en 10 cm kultur maträtt (55 cm2 av kulturområdet).
Obs: Vid poolning 2-3 C57BL/6J möss, vi vanligtvis tallrik denna 'total' benmärg population i en 150 cm2 kolv. - Efter 48 h av blandad kultur, ta bort kultur media (som innehåller den icke-anhängare Förenta). Om osteoclastogenesis experiment ska utföras, ange denna population av icke-anhängare celler åt sidan (se avsnitt 7), om inte, aspirera och kasta dessa celler.
- Tvätta plattan/kolven med PBS noga för att inte störa de bifoga cellerna.
- Ta bort PBS och lyfta cellerna genom att lägga till 0,25% trypsin och inkubation vid 37 ° C i 1-3 min. dämpningen av trypsin genom att lägga till cell media cellsuspension. Vid denna punkt, BMSCs, som lyfts nu, kan räknas (som tidigare gjort i steg 4.1) och klädd för framtida experiment.
- Beräkna antalet celler behövs för plätering. Centrifugera volymen som krävs av cellsuspension vid 1 000 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
Obs: Celler är vanligtvis pläterade baserat på slutpunkten experiment. Exempelvis om proteinet/RNA isoleras tallrik vi vanligtvis på en högre densitet (~1.0-2.0 x 106 celler per brunn i 6-well plate). - Ta bort media och återsuspendera cellpelleten i volymen av kultur media behövs för plätering. Platta celler i kultur media enligt experimenten och tillåta dem att fästa ett par dagar. När BMSCs når konfluens, Fortsätt att utföra differentiering.
6. differentiering av BMSCs
-
Osteoblaster
- Gör osteoblast differentiering media genom att lägga till 800 µL 1 M β-glycerol fosfat i PBS och 200 µL 0,5 M askorbinsyra i PBS till 99 mL BMSC kultur media (se punkt 1.1 för sammansättningen av BMSC kultur media).
- När BMSCs kulturer antingen (totala BMC från steg 4,3) eller anhängare BMSCs från steg 5,6 är konfluenta, skilja dem i osteoblaster genom att byta kultur media till osteoblast differentiering media.
- Ersätta differentiering media varannan dag. Cellerna börjar producera vita knölar av mineralisering. Visualisera dem med blotta ögat på botten av brunnen; denna process kan uppstå inom några dagar till 3 veckor.
- För att bedöma osteoblastogenesis, utföra alkaliskt fosfatas färgning eller Von Kossa färgning på brunnarna som beskrivs i avsnitt 8.
Obs: Ändra media noggrant genom att luta plattorna i en liten vinkel för att undvika störningar av den cell enskiktslager.
- För att bedöma osteoblastogenesis, utföra alkaliskt fosfatas färgning eller Von Kossa färgning på brunnarna som beskrivs i avsnitt 8.
- Gör osteoblast differentiering media genom att lägga till 800 µL 1 M β-glycerol fosfat i PBS och 200 µL 0,5 M askorbinsyra i PBS till 99 mL BMSC kultur media (se punkt 1.1 för sammansättningen av BMSC kultur media).
-
Adipocyter
- Gör fettceller base media genom att blanda ihop 90 mL Dulbecco modifierade Eagle Medium (DMEM) hög glukos, 10 mL av fetalt bovint Serum, 1 mL Penicillin/Streptomycin, 100 µL 20 mM rosiglitazon och 100 µL av 2 mM Insulin. Om det behövs, lagra denna media vid 4 ° C för veckan under differentiering experimentet.
- Göra fettceller induktion media genom att lägga 200 µL 62,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) och 25 µL av 1 mM dexametason till 25 mL av fettceller Base Media.
- När BMSCs kulturer antingen (totala BMC från steg 4,3) eller anhängare BMSCs från steg 5,6 är konfluenta, ändra media till fettceller induktion media. Överväga denna dag 0 av differentiering.
- Efter 48 h, ta bort materialet och uppdatera kulturen med fettceller induktion media.
- Dag 4, växla till fettceller base media.
Obs: Lipid droppar kan börja visas så tidigt som dag 2 eller dag 4. - Dag 7, konstatera att celler har samlat maximala lipid droppar och visa en fenotyp som liknar en mogna fettceller. Kultur inte förbi denna punkt, eftersom det kan leda cell death/avlossning.
7. differentiering av Förenta till osteoklaster
- Göra hos osteoklasterna differentiering Media genom att lägga 50 µL av 25 µg/mL av Receptor Activator av NFKB Ligand (RANKL) och 15 µL av 25 µg/mL makrofag koloni stimulerande faktor (mCSF) till 25 mL av BMSC kultur Media.
- När de totala BMC (från steg 4,3) eller icke-anhängare celler (från steg 5.2) är kopplade till brunnen, kan kultur media växlas till Osteoclast differentiering Media. Fylla på differentiering media varannan dag.
- Iaktta de osteoclast kulturerna varje dag under ett Mikroskop vid 10 X förstoring. Observera att osteoklaster säkring och bildar Multinucleära celler, vanligtvis runt dag 5-7 av differentiering.
8. färgning
-
Osteoblaster
Obs: För alkaliskt fosfatas (AP) färgningen, vi ofta använder en AP färgning kit (se Tabell för material) enligt riktlinjerna.- Utföra AP färgning av kit tillverkarens riktlinjer.
- Aspirera media och skölj celler med PBS. Fixa cellerna med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS för 12 min i rumstemperatur.
- Under tiden gör AP lösningen med reagens från AP färgning kit genom att lägga till 500 µL natriumnitrit 500 µL FRV-alkalisk lösning och blanda försiktigt; Låt stå i 2 min. Tillsätt 22,5 mL dH2O och 500 µL naftol AS-BI alkaliska. Blanda försiktigt.
Försiktighet: PFA är giftigt och måste hanteras med försiktighet. - När cellerna är fasta, skölj med PBS och lägga till AP lösning till varje brunn (1 till 2 mL per brunn). Täck med aluminiumfolie och låt fläcken för 30 min i rumstemperatur skyddas från ljus. Aspirera lösningen, tvätta med destillerat vatten, och låt plattan torka.
- Skaffa bilder av färgade kolonier med en kamera för att observera alkaliskt fosfatas positiva celler.
- Alternativt utföra Von Kossa istället för alkaliskt fosfatas färgning. För detta, Tvätta brunnarna noggrant med destillerat vatten som eventuella återstående PBS kommer fällningen med silvernitrat.
- Fixa cellerna med 4% PFA i PBS för 12 min i rumstemperatur. Lägg sedan till tillräckligt 5% silvernitratlösning för att täcka brunnen och utsätta för starkt ljus för 1 h i rumstemperatur.
- Ta bort silvernitratlösningen och skölj varje brunn med destillerat vatten. Lägga till 5% natrium tiosulfat lösning till cellerna och låt stå i 3 min.
- Aspirera på natriumtiosulfat och tvätta med destillerat vatten. Låt plattan torka och observera den mineraliska insättning betsad i mörk brun/svart med blotta ögat.
- Utföra AP färgning av kit tillverkarens riktlinjer.
-
Adipocyter
- För olja Red O (ORO) färgning, fixa cellerna använder 10% Neutral buffrad Formalin för 1 h i rumstemperatur.
- Under tiden göra ORO lager lösning genom att lösa 0,035 g i 10 mL isopropanol. Detta är tillräckligt för en 6-bra platta. Mixa och passera lösningen med ett filterpapper (por storlek 11 µm).
- Gör ORO arbetar lösningen genom att späda ut 9 mL stamlösning av ORO med 6 mL destillerat vatten. Låt lösningen verka en rocker förrän du är klar för användning.
- Förbereda 60% isopropanol i destillerat vatten (göra tillräckligt för att täcka varje väl).
- När cellerna är fasta, ta bort fixativ och tvätta en gång med destillerat vatten. Ersätta vattnet med en 60% isopropanol lösning för 1 min.
Obs: Tillsätt vätskan långsamt medan tipping plåten; adipocyter lossnar mycket lätt. - Ta bort isopropanol och tillsätt tillräckligt ORO arbetar lösning för att täcka alla celler. Inkubera i 15 min på en låg hastighet rocker i rumstemperatur. Ta bort ORO och tvätta två gånger med destillerat vatten.
Obs: vid denna punkt, ORO-färgade lipid droppar kan visualiseras under mikroskopet. - För att kvantifiera ORO, Avfärga ORO genom att tillsätta 1 mL 100% isopropanol i varje brunn och gunga sakta i ca 10 min.
- Under tiden förbereder en utspädning serie att skapa en standardkurva baserat på följande 8 standarder med ORO arbetar lösning (2 100 µg/mL) och isopropanol som en spädningsvätska: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 och 0 µg/mL.
- Lasta 200 µL av standarderna och destained tar prov i exemplar på en tallrik och Läs av absorbansen vid 490 nm.
- Bestämma koncentrationen av ORO för varje prov baserat på standardkurvan.
Obs: Vi rekommenderar att normalisera koncentrationen ORO att antalet celler. Antalet celler kan kvantifieras av kristallviolett färgning eller DNA kvantitet.
- Bestämma koncentrationen av ORO för varje prov baserat på standardkurvan.
-
Osteoklasterna
Obs: När du är redo, vi föreslår färgning osteoklaster för tartrat-resistenta syra fosfatas (TRAP) använda FÄLLAN färgningen kit (se Tabell för material).- För fälla färgning, fixa celler i 30 min i rumstemperatur med 2,5% glutaraldehyd i PBS. Under tiden gör den TRAP-lösningen genom att blanda ihop 50 µL snabbt granater Base lösning, 50 µL av natriumnitrit, 4,55 mL destillerat vatten, 50 µL av Napthol AS-Biphosphate, 200 µL Acetat lösning och 100 µL tartratlösning.
- Aspirera off fixativ och skölj cellerna med PBS två gånger innan du lägger till FÄLLAN lösning för 1 h vid 37 ° C.
- Tvätta med destillerat vatten innan räknar osteoklaster under ett mikroskop (10 X förstoring). FÄLLAN+ cellerna visas lila med 3 eller fler kärnor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Översikt av cellkulturer
De två kultur teknikerna tillåter bedömning av differentiering på en blandad befolkning av BMC består av BMSCs och Förenta (totala BMC, figur 1A) eller en befolkning på BMSCs split från Förenta (anhängare BMSCs, figur 1B). 48 hr efter cellerna från märgen är isolerade och förkromad (figur 1 c), de snabbt fäster till botten av plast kultur plattan och tenderar att bilda en enskiktslager. När cellerna når sammanflödet (figur 1 d), kan de användas för differentiering analyser.
BMSCs differentieras efter osteoblaster
Konfluenta kulturer av BMSCs kan göras åtskillnad mellan in i osteoblaster använder ett osteogent media består av askorbinsyra och β-glycerol fosfat (figur 2A, B). Efter några dagar av differentiering börjar osteoblaster uttrycka alkaliskt fosfatas (figur 2 c). Ytterligare differentiering utlöser osteoid matrix produktion och slutligen mineraliseringen av denna matris (figur 2D). Intressant, kommer endast en del av cellerna differentieras till osteoblaster in vitro. Faktiskt, färgning med kristallviolett (figur 2E) avslöjar att inte alla celler express alkaliskt fosfatas eller mineralize plattan.
BMSCs differentieras efter adipocyter
Adipogenesis kan testas på kulturer av blandade BMC samt mer homogen cell befolkningen. Som observerats med osteoblast differentiering, huruvida den blanda befolkningen (figur 3A) eller split befolkningen (figur 3B) används, endast en del av cellerna är adipogena. Adipocyter visas runda med flera lipid vakuoler som kan färgas i rött med ORO (figur 3 c). Vår erfarenhet visas i vitro adipocyter alltid flera vakuoliserade till skillnad från i vivo vit adipocyter. Skillnaderna i villkoren för genotyp eller kultur kan öka adipogenesis till en punkt där adipocyter loss och flyter i kultur plattan. Lös detta genom kan adipogenesis experimentet stoppas vid en tidigare tidpunkt.
Förenta differentieras efter osteoklasterna
Osteoclastogenesis kan induceras i kulturer genom att komplettera media med mCSF och RANKL. Förenta börja säkring snabbt för att bilda Multinucleära celler som fläckar positiva för fälla (figur 4A). Dessa osteoklaster klarar resorbing mineral matris in vitro- och därmed kan användas för att bedöma osteoklastisk aktivitet (figur 4B),.
Figur 1: Schematisk tidslinje av protokollen för kultur BMSCs och Förenta. Annan kultur tekniker för att ge totalt BMC består av en blandad befolkning av celler (A) eller anhängare BMSCs (B). Representativ bild av BMSCs kultur isolerade från C57B6/J möss 48 hr efter deras plating (C) och efter de är uppdelade från Förenta (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Bilder av brunnar i BMSCs kulturer differentieras efter osteoblaster. BMSCs innan (A) och efter (B) placeras i osteogent media. Osteoblaster kan färgas alkaliskt fosfatas uttryck i rosa (C) och för mineraliska insättning i brunt (D). Kristallviolett kan användas för att representera antalet celler efter differentiering (E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa bilder av kulturerna av BMSCs differentieras efter adipocyter. ORO-färgade adipocyter erhålls från en blandad befolkning på BMSCs (A) och en delad kultur (B) efter 7 dagar i adipogena media. Bilden av en fettceller färgas med ORO (C). Kvantifiering av ORO efter 7 dagar i adipogena media innan (D) och (E) normalisering till kristallviolett absorbans. Data presenteras som medel med felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Förenta kulturer differentieras efter osteoklaster. FÄLLAN färgning av osteoklaster visas som stora lila-rosa Multinucleära celler (A). Mineraliserade ytan färgas svart av Von Kossa med resorption gropar kvar av osteoklaster åtskilt från Förenta efter 7 dagar (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här artikeln presenteras två metoder för kultur av BMSCs med sina fördelar och begränsningar. Isolera cellerna kommer från benmärgen är en relativt enkel process. Att erhålla en cell befolkningen representativt av mesenkymala stamceller eller osteoklastisk föräldraparets kan dock vara utmanande på grund av den olika cellulära miljön av benmärg hålrummet.
Odling av helheten av benmärgen innehållet ger en nära representation av den i vivo mikromiljö. Ännu, isolera cellerna från olika grupper av möss (genotyper, behandlingar, åldrar, etc.) kan resultera i mycket olika antal BMSCs eller Förenta vid starten av in vitro- experimentet. Alltså möjliggöra skiljer BMSCs och Förenta och åter plätering dem en bättre kontroll över cellen numrera början av differentiering experimentet. Minska heterogena cellkulturen kan emellertid påverka resultatet av den BMSCs eller Förenta som både utsöndrar faktorer som påverkar mesenkymala och osteoklastisk differentiering. Det är viktigt att beakta dessa begränsningar när du utformar isolering och kulturen av BMSCs och Förenta.
Mängden cellpopulationer närvarande i benmärgen kan införa utmaningar i tolkningen av data. Förutom Förenta och BMSCs innehåller benmärgens mikromiljö också differentierade immunceller, röda blodkroppar, endotelcellerosv Dessa populationer kan finnas kvar i den vidhäftande eller icke-anhängare fraktionen och därmed kan påverka de experimentella resultaten. Sortering BMSCs kan vara ett alternativ för att uppnå en ”renare” cell befolkningen. Faktiskt tros BMSCs uttrycka CD34 medan Förenta gör inte10. Dock det föreslogs också att bristen på CD34 på ytan av BMSCs kan vara resultatet av kultur och en studie har visat att en icke-anhängare delmängd av CD34+ BMSCs kunde skilja in osteoblast, adipocyter och kondrocyter11, 12. därför, när man överväger sortering för att isolera BMSCs, en rad väldefinierade markörer bör utformas i förväg. Andra hinder för cell sortering är timing och kostnad. Faktiskt lägga en sortering steg kunde öka tid av isolering protokoll avsevärt samt en betydande ökning av kostnaderna. I sammanfattning presentera sortering celler tekniska utmaningar kan försämra avkastningen och kvaliteten på BMSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna avslöja att de har inga finansiella intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
| Dissection tools | |||
| 70 μm filters | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer inverter microscope | Zeiss |
References
- Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
- Chen, T. L. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone. 35 (1), 83-95 (2004).
- Kokabu, S., et al. BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b. Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).
- Ghali, O., et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation. BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).
- Kretlow, J. D., et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells. BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).
- DeMambro, V. E., et al. Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss. Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).
- Maridas, D. E., et al. IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner. J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).
- Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
- Abdallah, B. M., et al. CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells. Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).
- Akiyama, K., et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension. Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).
- Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells? Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).
