Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي

Published: March 7, 2018 doi: 10.3791/56752
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3
1Institute for Diabetes and Obesity (IDO), German Center for Diabetes Research (DZD), Helmholtz Zentrum München, 2Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-Universität München, 3Roche Pharma Research and Early Development, Large Molecule Research, Roche Innovation Center Penzberg
* These authors contributed equally

Summary

ويصف هذا البروتوكول اندماجي استخدام رقاقة seq 4sU seq، وتسلسل الحمض النووي الريبي مجموع والريبوسوم التنميط لخطوط الخلايا والخلايا الأولية. فإنه يمكن تتبع التغييرات في النسخ-عامل ملزم، النسخ حيثياته وتجهيز الجيش الملكي النيبالي، ودوران والترجمة على مر الزمن، وعرض مسار الأحداث عموما في الخلايا المنشط و/أو المتغيرة بسرعة.

Abstract

عند التنشيط، تغيير الخلايا سريعاً على البرامج الفنية، ومن ثم صورتها التعبير الجيني. تحدث تغييرات هائلة في التعبير الجيني، على سبيل المثال، خلال التمايز الخلوي و morphogenesis والتحفيز الوظيفي (مثل تنشيط الخلايا المناعية)، أو بعد التعرض للمخدرات وعوامل أخرى من البيئة المحلية. اعتماداً على نوع التحفيز والخلية، هذه التغيرات تحدث بسرعة وعلى أي مستوى ممكن لتنظيم الجينات. عرض جميع العمليات الجزيئية للخلية المستجيبة لنوع معين من مدمني المخدرات التحفيز واحدة من أصعب المهام في البيولوجيا الجزيئية. هنا، يمكننا وصف بروتوكول يتيح التحليل المتزامن لطبقات متعددة من تنظيم الجينات. قارنا، على وجه الخصوص، عامل النسخ ملزمة (الكروماتين-إيمونوبريسيبيتيشن-تسلسل (الرقائق-seq)) والنسخ دي نوفو (4-ثيوريديني-تسلسل (4sU-seq))، وتجهيز مرناً، ودوران، فضلا عن الترجمة (الريبوسوم إنشاء تشكيل جانبي). وبالجمع بين هذه الأساليب، من الممكن لعرض مسار عمل مفصلة والجينوم على نطاق المنظومة.

تسلسل الحمض النووي الريبي يدون حديثا ينصح خاصة عند تحليل سرعة تكييف أو تغيير الأنظمة، حيث يصور هذا النشاط الترانسكربتي من جميع الجينات خلال وقت التعرض 4sU (بغض النظر عما إذا كانوا حتى-أو دوونريجولاتيد). بالإضافة إلى ذلك يسمح اندماجي استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي المجموع والتنميط الريبوسوم في حساب معدلات الدوران وترجمة الرنا. ويتيح تحليل Bioinformatic نتائج التسلسل الفائق للعديد من الوسائل لتحليل وتفسير البيانات. البيانات التي تم إنشاؤها يمكن أيضا تتبع الربط كوترانسكريبشونال والبديلة، اكتفى هنا بذكر عدد قليل من النتائج المحتملة.

يمكن تطبيق النهج الموحد المذكور هنا للكائنات نموذج مختلفة أو أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا الأولية. وعلاوة على ذلك، ونحن توفير بروتوكولات مفصلة لكل أسلوب استخدامها، بما في ذلك عمليات مراقبة الجودة، ومناقشة المشاكل والمخاطر المحتملة.

Introduction

في السنوات الأخيرة، أصبح الجيش الملكي النيبالي-تسلسل (الحمض النووي الريبي-seq) أداة قياسية لتحليل الكشف عن جميع داخل خلية أو الكائن حي1. ومع ذلك، فهم العملية برمتها من الخلايا تكييف استجابة لحافز/دواء معين، من الضروري تماما تحديد جميع العمليات الأساسية، بدءاً من النسخ مرناً للتجهيز، والدوران، والترجمة. لا يكاد يمكن أن تقاس التغيرات القصيرة الأجل في الجيش الملكي النيبالي النسخ بإجمالي رناسيق، نظراً للتغييرات في الجيش الملكي النيبالي إجمالي تعتمد على عوامل مثل الحمض النووي الريبي نصف حياة ونشاط النسخي، التي قالب فقيرة لتعكس تكيف الخلايا إلى الآثار البيئية2،3. وفي الواقع، تم وضع مجموعة متنوعة من التقنيات الجديدة للتسلسل التي تسمح بإجراء تحليل لمختلف خطوات عملية الجينات اللائحة4 عندما تقترن بالطريقة الصحيحة. ويصف هذا البروتوكول كيفية الجمع بين بعض تسلسل يسهل تطبيقها بدلاً من التقنيات التي تسمح لتتبع تنظيم الطبقات الأساسية مرناً بطريقة نسبية. لتحليل النشاط الترانسكربتي، وقد وصف مجموعة متنوعة من الأساليب، مثل كاب-تحليل الجينات التعبير (كيج)5، واستطالة الأصلية نسخة التسلسل (صافي-seq)6وعلى نطاق الجينوم النووي التحضير (غرو-seq)7 , 8، فضلا عن بروموريديني-تسلسل (Bru-seq) و 4-ثيوريديني-تسلسل (seq-4sU)، التي تستخدم نواتج الأيض التي أدرجت حديثا في نسخها من الجيش الملكي النيبالي9،10، فقط على سبيل المثال لا الحصر. القفص ويحدد موقع بدء النسخ الدقيقة، seq صافي وغرو seq تقديم معلومات أكثر دقة حول قراءة الاتجاهات ويكشف seq 4sU (وهي الطريقة الموضحة هنا) إلا حديثا نسخها الجيش الملكي النيبالي. مع ذلك، 4sU seq حساسة للغاية ويمكن أن تطبق في أطر زمنية مختلفة لقياس كمية النشاط النسخي في تغيير نشاط الخلايا، فضلا عن التغيرات الكمية في تجهيز مرناً (الذي يحدث في غضون دقائق)9، 11،12. وعلاوة على ذلك، 4sU seq مثالية للجمع بين تسلسل الحمض النووي الريبي لحساب معدلات دوران الحمض النووي الريبي للجينات9. يضطلع نسخ مرناً بالثاني بوليميريز الحمض النووي الريبي (رنابيي)، التي بدورها تتأثر بالعديد من العوامل، مثل عوامل النسخ والتعديلات هيستون وتفعيل/ريبريسورس العامة حتى يمكن أن تكون جزءا من النسخي المعقدة. لاختبار كيفية العديد من الجينات/المروج/محسن مناطق مرتبطة بعامل واحد، وضعت رقاقة seq، الذي هو الآن الطريقة القياسية لهذا الغرض، بسبب العديد من الأجسام المضادة المتاحة تجارياً13. ومع ذلك، على الرغم من أن تشيبسيق يعطي معلومات واضحة بشأن تنظيم العوامل حيث ربط، أنها لا تعكس إذا كان الفعل يؤدي إلى تغييرات في النسخ14. ولذلك، أداء رقاقة seq مع 4sU seq هو مزيج مثالي لمثل هذه المسائل البيولوجية. تنظيم التعبير الجيني يمكن أن يحدث أيضا في مرحلة لاحقة، نظراً لمستويات البروتين ومرناً لا ترتبط بالضرورة15،16، مشيراً إلى تنظيم كبير محتمل على متعدية أو بوستترانسلاشونال مستوى، تبعاً للسياق. في عام 2011، الريبوسوم التنميط أدمجت أولاً بتسلسل الحمض النووي الريبي، وهو الأسلوب المفضل لقياس التغيرات التي تحدث في سرعة في البروتين، حيث لا تزال هناك بعض حدود حساسية مع الطيف الكتلي17الآن. في الواقع، أظهرت أسعار الترجمة التي تم الحصول عليها من هذه الأساليب لتقديم تقدير جيد نسبيا للتغييرات في مستويات البروتين (على الأقل قياس التغيرات الطويلة الأجل) والسماح بطريقة عرض أكثر تفصيلاً في عملية الترجمة، مثلاً تحديد الترجمة الجانب ابدأ، والبديل إطارات17. استخدام جميع الأساليب الأربعة اندماجي يمكن استخدامها في حالة مستقرة، بين مختلف أنواع الخلايا، أو في وقت-مسلسل التجربة الخلايا المتغيرة بسرعة11. هذا الاستخدام لمحة عامة على نطاق الجينوم للتغييرات في ربط عامل النسخ التي تؤثر على الحمض النووي الريبي النسخ وتجهيزها، والترجمة.

Protocol

جميع الأساليب يتم وفقا والامتثال للمبادئ التوجيهية المؤسسية والدولة الاتحادية Zentrum München هلمهولتز.

1-إعداد

  1. تقديم خطة مفصلة للإعداد التجريبية بما في ذلك وضع جدول زمني، عند إضافة 4sU إلى مستنبت الخلية، وعندما الحصاد الخلايا لكل أسلوب. حسب المسألة البيولوجية، النظر بعناية النقاط الزمنية لنموذج الرسم والوسم 4sU الوقت وتركيز (الجدول 1).
    ملاحظة: التحقق من تأثير 4sU على بقاء الخلية، وأشدد على الاستجابة مقدما (انظر "التحقق من العلامات 4sU الظروف المثلى" في نتائج الممثل و الشكل 1). ينصح بإجراء اختبار أولى لكل أسلوب مع عينة واحدة على الأقل. تحقق من إذا كان نوعية وكمية من الحمض النووي الريبي/الحمض النووي كافية لتسلسل العميقة (انظر كرست أجزاء من البروتوكول)، والممارسة بسرعة لكن معالجة رقيقة من الخلايا أثناء التجربة.
  2. حساب عدد الخلايا بحاجة لكل نقطة الوقت لكل أسلوب (انظر الجدول 2 لإجراء تقدير تقريبي عند استخدام خلايا تي الأولية). أيضا، النظر في تسلسل العينات أقل من مجموع الجيش الملكي النيبالي من ذلك تماما من الجيش الملكي النيبالي 4sU (مثلاً، فقط لأسعار الترجمة نقطة الوقت أو دوران الجيش الملكي النيبالي أن تحسب معدلات). للتأكد والتحقق من أهمية النتائج (مستحسن)، إنشاء تكرار البيولوجية واحدة على الأقل.
    ملاحظة: الأهم من ذلك، لجميع الطرق ونقاط زمنية متتالية، العينات يجب أن تكون من نفس تجمع بدءاً من الخلايا. ويوصي الباحث مخصص واحد على الأقل لكل أسلوب.
  3. إعداد كل ما يلزم في وقت مبكر (مثلاً، 4sU الكوتيد، سيكلوهيكسيميدي، و "الثدييات تحلل العازلة"، وفورمالدهايد 1%). بعد إضافة 4sU، تجنب تعريض الخلايا للضوء الساطع، كما قد يؤدي هذا إلى كروسلينكينج من الجيش النيبالي الملكي المسمى 4sU للبروتينات الخلوية18.
  4. تجمع كافة الخلايا ذات الاهتمام في قارورة واحدة فقط قبل المعالجة (الشكل 2). عد الخلايا (مثلاً، مع هيموسيتوميتير) واستخدم المبلغ المطلوب لمراقبة كل أسلوب المعالجة (لا ننسى أيضا تسمية عنصر التحكم غير المعالجة ل seq 4sU مع 4sU). علاج الخلايا المتبقية ومباشرة تقسيم العدد المطلوب من الخلايا لكل نقطة الوقت والأسلوب. التعامل مع الخلايا، في أسرع وقت ممكن للتقليل من الإجهاد نتيجة للتغيرات في درجة الحرارة أو مستويات2 CO.
    ملاحظة: على سبيل المثال، يتم أخذ عينات ح 1، ح 2، ح 3 بعد العلاج، ثم يستخدم ربع الخلايا لعنصر التحكم غير المعالجة وثلاثة أرباع تستخدم لمراقبة المعالجة.

2-4sU--الوسم

ملاحظة: يتم تعديل هذا البروتوكول من Rädle، وآخرون. 19 راجع على بروتوكول للحصول على معلومات إضافية فيما يتعلق بوضع العلامات الاستقلابية مع 4sU. لجميع الطرق ونقاط زمنية متتالية، والعينات يجب أن تنبع من نفس تجمع بدءاً من الخلايا.

  1. بدء وضع العلامات
    1. ذوبان الجليد 4sU الكوتيد قبل الاستخدام. إضافة 4sU في كل وقت نقطة مباشرة إلى المتوسطة التي تحتوي على خلايا ذات الاهتمام (راجع الجدول 2 لأرقام الخلية T المستحسنة، أقل من الحمض النووي الريبي 60 ميكروغرام كل نقطة الوقت)، تخلط بلطف، ووضع مرة أخرى في الحاضنة. التخلص المتبقية 4sU (عدم تجميد).
    2. في نهاية الوسم، جمع الخلايا (مثلاً، مكشطة الخلية) وأجهزة الطرد المركزي في 330 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في أنابيب البولي بروبلين (التي تقاوم القوات ز عالية). نضح المتوسطة وإضافة كاشف لعزل الحمض النووي الريبي (إيه وان مل كل 3 × 106 خلايا، انظر المواد للتوصية التي لاستخدام) لكل أنبوبة. ريسوسبيند بيليه (إيه وان مل كل 3 × 106 خلايا) تماما، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT)، وتجميد عينات من-20 درجة مئوية. ويمكن تخزين العينات في-20 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل.
      تنبيه: الكواشف المستخدمة لعزل الحمض النووي الريبي خطرة للغاية عند الحصول على اتصال مع الجلد أو العينين. التعامل مع هذه الرعاية والنظر في تعليمات الأمان.
  2. الجيش الملكي النيبالي باستخدام إعداد تعديل للبروتوكول عزل الحمض النووي الريبي
    1. إضافة كلوروفورم 0.2 مل كل 1 مل كاشف لعزل الحمض النووي الريبي، ومزيج دقيق من الهز لمتابعة 15 س. كما ورد في بروتوكول وضع العلامات الأيضية (الخطوة 1-12، 2. الجيش الملكي النيبالي باستخدام إعداد تعديل لبروتوكول تريزول) من Rädle وآخرون. 19
    2. قياس تركيز الحمض النووي الريبي (انظر الجدول للمواد)، ووفقا لإرشادات الشركة المصنعة. استخدام هذا الحمض النووي الريبي لتسلسل الحمض النووي الريبي مجموع كذلك (راجع الخطوة رقم 3. مجموع تسلسل الحمض النووي الريبي) أو تخزينها في-80 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل.
  3. بيوتينيليشن ثيول محددة من الحمض النووي الريبي يدون حديثا
    1. بدء تشغيل مع 30-80 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي الخلوية. 60 ميكروغرام الحمض النووي الريبي ينبغي أن تسفر عن كميات كافية من الحمض النووي الريبي يدون حديثا.
    2. إعداد رد فعل وضع العلامات. ماصة بالترتيب التالي (لكل ميكروغرام الرنا): 1 ميليلتر 10 × بيوتينيليشن المخزن المؤقت، 7 ميليلتر الحمض النووي الريبي (تحتوي على 1 ميكروغرام الحمض النووي الريبي تضعف في خالية نوكلاس ح2س)، و 2 ميليلتر البيوتين-هبدب (1 ملغ/مل). إضافة البيوتين-هبدب آخر وخلط فورا قبل بيبيتينج. لف الأنابيب برقائق الألومنيوم لتجنب التعرض للضوء الساطع. انظر مناقشة لبديل البيوتين-هبدب. تبني على RT ل 1.5 ح بالتناوب.
    3. أنابيب مناسبة 2 مل الطرد المركزي (انظر الجدول للمواد) في 15,000 س ز 2 كحد أدنى "الماصة؛" كل من بيوتينيلاتيد الجيش الملكي النيبالي في أنبوب قبل نسج 2 مل وإضافة وحدة تخزين متساوية من كلوروفورم والمزيج بقوة. احتضان ل 2-3 دقيقة حتى تبدأ المراحل منفصلة وفقاعات ابدأ أن تختفي.
    4. أجهزة الطرد المركزي في 15,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل المرحلة المائية العليا بعناية في أنبوب جديد.
    5. كرر الخطوات من 2.3.3. و 2.3.4. مرة واحدة. إضافة 10% من حجم كلوريد الصوديوم (م 5) ووحدة تخزين متساوية من الايزوبروبانول إلى مرحلة مائي. أجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
    6. قم بإضافة وحدة تخزين تساوي طازج الإيثانول 75%. الطرد المركزي في 20,000 خ زاي تجاهل المادة طافية وتدور بإيجاز، وإزالة الإيثانول المتبقية. ريسوسبيند تماما في 30-100 ميليلتر ح2س (استخدام ميليلتر 1 ح2س الواحدة 1 ميكروغرام رنا الإدخال من الخطوة 2.3.1) عن طريق خلط ماصة.
    7. التحقق من تكامل الجيش الملكي النيبالي بتحليل الغرواني الكهربي، أو تأخذ قاسمة والتحقق في وقت لاحق.
  4. فصل حديثا نسخها (المسمى) و Preexisting الحمض النووي الريبي (غير مسمى)
    1. إزالة حبات باراماجنيتيك (انظر الجدول للمواد) من مخزن 4 درجات مئوية والسماح لها الوقوف لمدة 30 دقيقة على الأقل لتقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة. الحرارة 4sU الغسيل العازلة (3 مل كل عينة) إلى 65 درجة مئوية.
    2. إعداد حل ديثيوثريتول (DTT) 100 مم. وزن القيمة على نطاق جيد جداً وإضافة الكمية المطلوبة من المياه خالية من نوكلاس. دائماً إعداد جديدة. استخدام 200 ميليلتر كل عينة.
    3. الحرارة بيوتينيلاتيد عينات الحمض النووي الريبي (1 ميكروغرام/ميليلتر) إلى 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة تجريدها وفورا على الجليد. إضافة 100 ميليلتر streptavidin الخرز إلى بيوتينيلاتيد الجيش الملكي النيبالي واحتضان في RT لمدة 15 دقيقة بالتناوب.
    4. ضع عمود مناسبة (انظر الجدول للمواد للتوصيات) لكل عينة في موقف المغناطيسية، وحجته قبل كل عمود مع المخزن المؤقت للغسيل 4sU درجة حرارة الغرفة 1 مل.
      ملاحظة: هذا سوف يستغرق حوالي 5-10 دقيقة. إذا كان أي من الأعمدة لا تبدأ تجفيف بعد 5 دقائق، اضغط برفق على رأس العمود مع إصبع القفاز.
    5. تطبيق مزيج الحمض النووي الريبي/خرز في وسط كل عمود. تجاهل التدفق عبر، إلا إذا كان غير مسمى الجيش الملكي النيبالي بحاجة إلى استردادها. إذا كان الأمر كذلك، جمع في التدفق من خلال والغسيل الأولى على الأقل. إجراء استرداد الجيش الملكي النيبالي كما وصفها Rädle et al. (الخطوة 1-7، 7. الاسترداد من الحمض النووي الريبي غير مسمى، غير منضم)19.
    6. تغسل ثلاث مرات مع 0.9 مل 4sU الغسيل المخزن المؤقت (يسخن إلى 65 درجة مئوية من الخطوة 2.4.2.) و 0.9 مل الرايت 4sU الغسيل المخزن المؤقت، على التوالي.
    7. استخدم الخرز باراماجنيتيك لاسترداد رنا يدون حديثا. "الماصة؛" 400 ميليلتر من المشتتين جيدا RT الخرز باراماجنيتيك في أنبوب للعينة ومكان تحت كل عمود. الوت رنا يدون حديثا مع 100 ميليلتر 100 مم DTT. انتظر لمدة 3 دقائق والقيام شطف ثانية مع 100 ميليلتر 100 مم DTT. (اختياري: أداء شطف والانتعاش كما وصفها Rädle et al.) 19
    8. ميكس نسخها من الحمض النووي الريبي/الخرز جيدا قبل ماصة خلط 10 مرات والمضي قدما وفقا للمبدأ التوجيهي الخاص بالشركة المصنعة حديثا. الوت الجيش الملكي النيبالي في 11 ميليلتر خالية نوكلاس ح2فلوروميتير مناسبة باستخدام الحمض النووي الريبي O.Quantify (انظر الجدول للمواد). ويمكن تخزين الحمض النووي الريبي في-80 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل.
      حديثا تدوين ملاحظة: يمكن استخدام الحمض النووي الريبي لإعداد مكتبات كدنا لتسلسل الجيل القادم (انظر الجدول للمواد لاقتراح بشأن الذي لاستخدام طقم) أو مزيد من التحليلات المتلقين للمعلومات. 100-500 نانوغرام الحمض النووي الريبي كافية لمعظم مجموعات إعداد مكتبة (انظر المناقشة).

3-بلغ مجموع الجيش الملكي النيبالي-Seq

  1. مباشرة أن الجيش الملكي النيبالي من 4sU المسماة الجيش الملكي النيبالي بعد إعداد الجيش الملكي النيبالي باستخدام كاشف تعديل للبروتوكول عزل الحمض النووي الريبي لتسلسل الحمض النووي الريبي مجموع (راجع الخطوة 2.2.2).
  2. لإعداد مكتبة، تضعف قاسمة الحمض النووي الريبي لتركيز نهائي من 50-100 نانوغرام/ميليلتر. استخدم هذه المجموعة نفسها فيما يتعلق بإعداد المكتبة للجيش الملكي النيبالي يدون حديثا. 100-500 نانوغرام الحمض النووي الريبي كافية لمعظم مجموعات إعداد المكتبة.

4-الريبوسوم التنميط

ملاحظة: لجميع الطرق ونقاط زمنية متتالية، يجب أن تكون العينات من نفس تجمع بدءاً من الخلايا. تقديم توصيات بشأن أي طقم للاستخدام، أرجع إلى الجدول للمواد.

  1. إعداد وعزل الريبوسوم المحمية بشظايا (المفاضلة):
    1. استخدام الكميات المناسبة من الخلايا لكل نقطة الوقت (الرجوع إلى الجدول 2 لأرقام الخلية تي الموصى بها). علاج الخلايا ملتصقة مع سيكلوهيكسيميدي كما هو موضح في البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
      تنبيه: سيكلوهيكسيميدي عالية السمية، وقد تتسبب في حدوث طفرات. تجنب تماس الجلد والاستنشاق.
    2. أشر إلى أنبوب البولي بروبلين واحد جمع وتجمع غير-أو شبه-أدهيرينت الخلايا من كل الوقت وضبط تركيز النهائي إلى 1 × 106 خلايا كل مل المتوسطة خلية على حدة (مثلاً، ربمي المكملة للخلايا T). إضافة سيكلوهيكسيميدي بتركيز نهائي من 0.1 مغ/مل ومزج بعكس الأنبوب البولي بروبلين واحتضانها للحد الأدنى 1 خلايا جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 330 x ز في 4 درجات مئوية. نضح المتوسطة وغسل الخلايا مع مالا يقل عن 10 مل برنامج تلفزيوني وتستكمل مع سيكلوهيكسيميدي (تركيز النهائي من 0.1 مغ/مل).
    3. خلايا جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 330 x ز في 4 درجات مئوية. نضح المتوسطة وإضافة 100 المخزن المؤقت إلى تحلل خلايا الثدييات ميليلتر من كل 10 × 106 خلايا. مزيج من بيبيتينج وطرد من خلال إبرة 25-قياس 22 عقيمة الخلايا تماما.
    4. نقل الخلية ليستي إلى أنبوب بريكوليد 1.5 مل. احتضان لمدة 10 دقائق على الجليد بالعكس الدوري. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 20,000 ز x عند 4 درجة مئوية لتوضيح. نقل المادة طافية إلى أنبوب بريكوليد 1.5 مل.
    5. إعداد 01:10 إضعاف مع المياه خالية من نوكلاس وسجل A260قراءة باستخدام جهاز المطياف الضوئي. استخدام مياه خالية من نوكلاس كقرص فارغ و 01:10 إضعاف المخزن المؤقت لتحلل الخلية الثديية كالمعيار. حساب تركيز/mL260ألف من وفقا للمعادلة التالية:
      (260 خلية-260 الثدييات تحلل العازلة) × معامل التخفيف 10 =/mL260
    6. إنشاء 200 ميليلتر مختبرين لعلى الجليد، والمضي قدما في معالجة نوكلاس.
      ملاحظة: بشكل اختياري، إعداد 100 ميليلتر الكوة لمجموع الجيش الملكي النيبالي وإضافة 10 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 10% ومزيج. تخزين في 4 درجات مئوية، والمضي قدما في 4.3.2. من المستحسن استخدام مجموع الجيش الملكي النيبالي من الحمض النووي الريبي المسمى 4sU (راجع الخطوة رقم 3. الجيش الملكي النيبالي إجمالي-seq).
  2. Footprinting الريبوسوم
    1. تنفيذ المعاملة نوكلاس فورا دون تجميد. إضافة وحدات 7.5 من نوكلاس (المدرجة في هذه المجموعة الموصى بها) لكل ألف إلى260 من ليستي. فعلى سبيل المثال: 80 ألف260/mL × 0.2 مل × 7.5 يو/A260نوكلاس = 120 ش نوكلاس.
      ملاحظة: بشكل اختياري، تيتراتي نوكلاس الهضم كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
    2. تبني رد فعل نوكلاس لمدة 45 دقيقة في الرايت مع خلط لطيف. تجميد 200 ميليلتر مختبرين مع النتروجين السائل وتخزينها في-80 درجة مئوية، أو التوقف عن رد فعل نوكلاس بإضافة 15 ميليلتر رناسي مثبط لكل 200 ميليلتر الكوة، وتابع مع الخطوة 4.3.2.
  3. تنقية للمفاضلة
    1. إلغاء تجميد عينة واحدة للمفاضلة نوكلاس هضمها وإضافة 15 ميليلتر رناسي المانع. تبقى العينات على الجليد.
    2. تنقية المفاضلة وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (يوصي بتنقية العمود) وقياس تركيز الحمض النووي الريبي على جهاز المطياف الضوئي.
  4. الرنا الريباسي استنفاد
    1. استخدام 5 ميكروغرام للمفاضلة المنقي لاستنفاد الرنا الريباسي.
    2. اتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (الخطوة 1-2، ونضوب الرنا الريباسي الأولية) لاستنفاد الرنا الريباسي. قياس تركيز الحمض النووي الريبي الرنا الريباسي المنضب المفاضلة على جهاز المطياف الضوئي.
  5. تنقية صفحة للمفاضلة
    1. استخدام 500 نانوغرام من الرنا الريباسي المستنفد المفاضلة لتنقية صفحة.
    2. إعداد التحكم في الجيش الملكي النيبالي والعينات وسلم لتنقية صفحة. مزيج 5 ميليلتر مراقبة الجيش الملكي النيبالي، ويشوه 5 ميليلتر هلام تحميل صبغ في أنبوب ميكروسينتريفوجي 0.5 مل. ميكس 10 ميليلتر من الجبهة الوطنية الرواندية كل مع 10 ميليلتر من يشوه جل تحميل، على التوالي. إعداد سلم الكوة (ميكروليتر 4 20/100 سلم والمياه خالية من نوكلاس 1 ميليلتر، ويشوه 5 ميليلتر هلام صبغ التحميل). تحميل فإنه بين كل عينة والسيطرة لمنع كروسكونتامينيشن.
    3. تؤذي سلم والعينات التي تفرخ في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم ضع فورا على الجليد. تحميل 20 ميليلتر لكل عينة (اختيارياً، تحميل 10 ميليلتر وتجميد المتبقي العينات عند 20 درجة مئوية) مفصولة بواسطة 10 ميليلتر سلم مستعدة على جل يوريا-polyacrylamide 12% أو 15%. تحميل 10 ميليلتر لمراقبة الجيش الملكي النيبالي. تشغيل الهلام حتى يصل إلى الفرقة بروموفينول الأزرق أسفل الجل (180 الخامس، ~ 70 دقيقة) (الشكل 3).
    4. وصمة عار الجل وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة في 4 درجات مئوية. استخدام ترانسيلوميناتور الظلام--الميدانية التي تنبعث الضوء الأزرق لتصور الجيش الملكي النيبالي. المكوس جل شرائح لكل عينة تناظر ~ 28 و 30 nt في الطول. السيطرة على الجيش الملكي النيبالي كمرجع والمكوس عليه.
      ملاحظة: تكون المفاضلة لا يكاد مرئية. الرسوم على الشرائح بالحجم المبين بسيطرة الجيش الملكي النيبالي--التي تحتوي على أوليجوس اثنين من nt 28 و 30 في الطول--حتى إذا كانت العينات غير مرئية.
    5. ثقب ثقب في الجزء السفلي من أنابيب ميكروسينتريفوجي 0.5 مل بإبرة 20-قياس عقيمة. نقل كل شريحة جل في أنبوب منفصل وأنابيب مكان توج في أنبوب 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 12,000 س زاي تكرار الطرد المركزي إذا لم يتم اجاد شرائح جل تماما في أنبوب 1.5 مل.
    6. الوت الجيش الملكي النيبالي من شرائح جل تعطلت مع 400 ميليلتر المياه خالية من نوكلاس و 40 خلات الأمونيوم ميليلتر (م 5) 2 ميليلتر الحزب الديمقراطي الصربي (10%) كل ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية.
    7. نقل الملاط إلى 1.5 مل تصفية أنابيب (تقدم مع عدة الموصى بها) مع تلميح ماصة 1 مل (نصيحة تحمل على نطاق أو تلميح عصامي 1 مل مع نهاية قطع). أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقيقة في 2,000 س ز لفصل التيد الجيش الملكي النيبالي من جل الشرائح. بلطف "الماصة؛" محلول مائي في أنبوب 1.5 مل. إضافة 2 ميليلتر الجليكوجين (تقدم مع عدة الموصى بها) و 700 الايزوبروبانول 100% ميليلتر ومخزن في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.
    8. الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في غ. س 13,000 تجاهل المادة طافية. أغسل بيليه مع الإيثانول 80% طازجة مبردة مسبقاً عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 13,000 س زاي تجاهل المادة طافية وأيردري. ريسوسبيند كل عينة في 20 ميليلتر وسيطرة الجيش الملكي النيبالي في 8 المياه خالية من نوكلاس ميليلتر. تخزين في-20 درجة مئوية إذا لزم الأمر.
  6. تجزئة، الإصلاح نهاية، 3 ' ربط محول، النسخ العكسي
    1. تنفيذ الإجراء كما هو موضح بالبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (التجزؤ ونهاية إصلاح محول ربط 3 '، والنسخ العكسي).
  7. صفحة تنقية كدنا
    1. إعداد العينات ومراقبة الجيش الملكي النيبالي وسلم لتنقية الصفحة: مزيج 10 ميليلتر من كل عينة ومراقبة الجيش الملكي النيبالي مع 10 ميليلتر يشوه جل تحميل صبغ، على التوالي. إعداد سلم الكوة (4 سلم ميليلتر 20/100، 1 المياه خالية من نوكلاس ميليلتر، 5 ميليلتر يشوه جل تحميل صبغ). تحميل فإنه بين كل عينة والسيطرة لمنع كروسكونتامينيشن.
    2. تؤذي سلم والعينات التي تفرخ في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم ضع فورا على الجليد. تحميل 20 ميليلتر لكل عينة (اختيارياً، تحميل 10 ميليلتر وتجميد المتبقي العينات عند 20 درجة مئوية) مفصولة بواسطة 10 ميليلتر من سلم مستعدة على 10% بولياكريلاميدي/7-8 م اليوريا/TBE هلام. تحميل 10 ميليلتر لمراقبة الجيش الملكي النيبالي. تشغيل الهلام حتى بروموفينول الأزرق يهاجر تماما من الهلام (180 الخامس، ~ 60 دقيقة).
    3. وصمة عار الجل وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة في 4 درجات مئوية. استخدام ترانسيلوميناتور الظلام--الميدانية التي تنبعث الضوء الأزرق لتصور الجيش الملكي النيبالي والمكوس جل الشرائح من كل عينة تناظر nt ~ 70-80.
    4. تابع كما هو موضح في الخطوة 4.5.5-4.5.8 وريسوسبيند كل عينة في المياه خالية من نوكلاس 10 ميليلتر.
  8. كدنا على
    1. إعداد مزيج الرئيسي على ما يكفي لجميع ردود الفعل من خلال الجمع بين الكواشف التالية لكل عينة على الجليد: ميليلتر 4.0 على رد فعل مزيج و 2.0 ميليلتر ATP، 2.0 الحركة ميليلتر2، ميليلتر 2.0 ليجاسى.
    2. إضافة 10 ميليلتر من مزيج الرئيسي لكل عينة. المزيج بلطف والطرد المركزي بإيجاز. احتضان العينات عند 60 درجة مئوية ل 2 حاء على الفور مكان العينات على الجليد.
  9. [بكر] تضخيم
    1. اتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (الخطوة 1-3، [بكر] تضخيم) للتضخيم PCR. استخدام 4 ميليلتر من كدنا سيركولاريزيد للتضخيم مع 9 دورات PCR لخلايا تي أولية، لتحقيق أفضل النتائج.
    2. تنقية المكتبات والتدقيق على توزيع الحجم، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (الخطوة 4-8, [بكر] تضخيم). هو الحجم المتوقع للمكتبة تضخيم bp 140-160 (انظر الشكل 4).
    3. لترتيب المكتبات، الرجوع إلى مرفق التسلسل لمزيد من التوجيه والبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.

5-شرائح-Seq

ملاحظة: يتم تعديل هذا البروتوكول من Blecher-جونين، وآخرون. 14 الرجوع إلى بروتوكول بهم لمزيد من المعلومات فيما يتعلق بما يليها رقاقة لجميع الطرق ونقاط زمنية متتالية، يجب أن تكون العينات من نفس تجمع بدءاً من الخلايا.

  1. Crosslinking وحصاد الخلايا
    1. التشعب عدد مناسب من الخلايا (الرجوع إلى الجدول 2 لأرقام الخلية تي الموصى بها) لكل نقطة الوقت بتركيز نهائي من 1% فورمالدهايد في متوسط سيلسبيسيفيك (مثلاً، ربمي المكملة لخلايا تي) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف. التوقف عن رد فعل كروسلينكينج بإضافة جليكاين إلى نهائي تركز 0.125 M.
    2. خلايا أجهزة الطرد المركزي في 330 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني المثلج. كرر الخطوة 5.1.2 مرتين وتجميد الخلايا الكريات في-80 درجة مئوية. ويمكن تخزين الكريات مجمدة لمدة 6 أشهر على الأقل.
  2. تحلل الخلايا وسونيكاتيون
    ملاحظة: خلال كل خلية تفسخ و sonication الخطوات، العينات يجب أن تبقى على الجليد أو عند 4 درجة مئوية لتقليل تدهور البروتين وعكس التشعب.
    1. ريسوسبيند الكريات الخلية في المخزن المؤقت لتحلل الخلية المثلج 1 مل مع مثبطات البروتياز المضافة حديثا عزل الأنوية (إضافة مثبطات الفوسفاتيز اختيارياً). احتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد وأجهزة الطرد المركزي في 2,600 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    2. نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه الأنوية في المخزن المؤقت لتحلل أنوية المثلج 1 مل مع مثبطات البروتياز المضافة حديثا (اختياري: إضافة مثبطات الفوسفاتيز). احتضان لمدة 10 دقائق على الجليد. Sonicate الخلايا لتوليد حجم الحمض النووي يعني جزء بسيط من 0.2-1.0 كيلو بايت (انظر الشكل 5).
      ملاحظة: سونيكيشن ظروف الحاجة إلى الأمثل حسب نوع الخلية وكذلك الظروف (مثلاً، عدد الخلايا، وحجم، والمخزن المؤقت). لخلايا تي أولية، ينصح سونيكيشن لدورات 20-25 (انظر مواد للحصول على وصف مفصل).
    3. تأخذ من 20-50 ميليلتر الكوة الكروماتين المنفصمة والحرارة لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية و 1,000 في الدقيقة تهتز لأداء من التشعب عكس سريع والتحقق من حجم الكروماتين. إضافة 2-5 ميليلتر ك البروتيناز واحتضان لمدة 20 دقيقة في 56 درجة مئوية وتهز 1,000 لفة في الدقيقة. أداء المنظمة الحرارة لمدة 10 دقيقة في 95 درجة مئوية وتهز 1,000 لفة في الدقيقة. تنقية الكروماتين مع مجموعة مناسبة (انظر الجدول للمواد). تحقق من حجم الكروماتين على 1% [اغروس] هلام واستخدام 100 شركة بريتيش بتروليوم بالإضافة إلى علامة.
    4. الطرد المركزي الكروماتين المنفصمة بمتوسط جزء حجم الحمض النووي من 0.2-1.0 كيلو بايت لمدة 10 دقائق 000 20 شخص × ز و 4 درجات مئوية بيليه الكروماتين غير قابلة للذوبان والحطام. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد والحفاظ على الجليد.
    5. الحفاظ على نسبة 5-10% الكروماتين سونيكاتيد كإدخال. تجميد في-20 درجة مئوية (المستخدمة في الخطوة 5.5.2).
  3. جسم الزوجين الخرز
    1. جسم الزوجين 10 ميكروغرام (مثلاً، مكافحة-رنا بول الثاني؛ H3K36me3 Histon المضادة) في برنامج تلفزيوني ميليلتر 220 (مع جيش صرب البوسنة 0.5% و 0.5% 20 توين) إلى 80 الخرز ميليلتر سوبيرباراماجنيتيك بالإضافة إلى البروتين ز (انظر الجدول للمواد) على الأقل 1 ح في درجة حرارة الغرفة بالتناوب.
    2. ضع الأنابيب في مغناطيس. انتظر حتى جميع حبات ملزمون بالمغناطيس وإزالة المادة طافية. كتلة أخرى مع ميليلتر 6 سونيكاتيد الحيوانات المنوية السلمون الحمض النووي في برنامج تلفزيوني (مع جيش صرب البوسنة 0.5% و 0.5% 20 توين) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بالتناوب.
    3. ضع الأنابيب في مغناطيس. انتظر حتى جميع حبات ملزمون بالمغناطيس وإزالة المادة طافية واضحة. أغسل حبات مع المخزن المؤقت "الملكية الفكرية رقاقة" ثلاث مرات.
  4. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين
    1. تمييع الكروماتين إلى إجمالي حجم 1 مل في المخزن المؤقت لتحلل أنوية مع مثبطات البروتياز المضافة حديثا (يمكنك بشكل اختياري إضافة مثبطات الفوسفاتيز). إضافة IP الرقائق العازلة مع مثبطات البروتياز المضافة حديثا (يمكنك بشكل اختياري إضافة مثبطات الفوسفاتيز) لوحدة تخزين نهائي لمل 3. الحفاظ على الجليد أو عند 4 درجة مئوية بينما جسم يقترن بالخرز.
    2. إضافة إلى جانب الخرز من الخطوة 5.3.3 الكروماتين المخفف للجسم واحتضانها طوال الليل في 4 درجات مئوية مع تناوب لطيف.
    3. يغسل مع المخازن المؤقتة التالية (1 مل كل، انظر الجدول للمواد) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق مع التناوب، ووضع الأنابيب مرة أخرى على المغناطيس وإزالة المادة طافية: أغسل المخزن المؤقت أنا، وتغسل المخزن المؤقت الثاني والثالث المخزن المؤقت يغسل، و 2 × TE pH 8.0 على التوالي.
    4. تجاهل المادة طافية وأيردري لمدة دقيقة ~ 5.
  5. عكس كروسلينكينج
    1. إزالة عينات من المغناطيس. إضافة 50 ميليلتر شطف العازلة ومزيج من بيبيتينج إلى الوت مجمعات البروتين-الحمض النووي من الخرز.
    2. وتشمل sample(s) الإدخال من هذا خطوة إلى الأمام. إضافة شطف المخزن المؤقت الإدخال sample(s) لوحدة تخزين نهائي من 50 ميليلتر (للحفاظ على تكوين المخزن المؤقت مشابهة للعينات رقاقة) والعملية جنبا إلى جنب مع عينات الرقائق.
    3. 3 مزيج ميليلتر من المخزن المؤقت شطف و 2 ميليلتر من رناسي (الدناز الحرة). إضافة 5 ميليلتر من المزيج لكل عينة واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. 2.5 مزيج ميليلتر بروتيناز ك، 1 ميليلتر الجليكوجين، 1.5 ميليلتر شطف المخزن المؤقت لكل عينة. إضافة 5 ميليلتر من المزيج لكل عينة (1 يو بروتيناز ك و 20 الجليكوجين ميكروغرام كل عينة) واحتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية.
    5. احتضان هذه العينات عند 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها (على الأقل 4 ح) مع الهز القيام بعكس كروسلينكينج.
    6. ضع الأنابيب في المغناطيس لمالا يقل عن 30 ثانية ونقل المادة طافية على أنبوب جديد. يمكن تجميد عينات في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.
  6. تنقية الحمض النووي
    1. إضافة ميليلتر 140 من حبات باراماجنيتيك مشتتة جيدا إلى 60 ميليلتر من عينة (نسبة 2.3:1). بدقة "الماصة؛" صعودا وهبوطاً 25 مرة مزيج دقيق. تأكد من أن السائل في كل أنبوبة متجانسة. احتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 2 مكان الأنابيب في المغناطيس لدقيقة 4، أو حتى جميع حبات منضمة إلى المغناطيس، وتجاهل المادة طافية.
    2. اترك هذه الأنابيب على المغناطيس وإضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 70% الطازجة. احتضان هذه الأنابيب لمدة 30 ثانية دون الإخلال بالخرز. تجاهل المادة طافية وكرر هذه الخطوة مرة أخرى. نضح الإيثانول تماما، وأود باراماجنيتيك حبات أيردري لمدة 4 دقائق.
      ملاحظة: إزالة الإيثانول ناقصة قد جدية الحد من الانتعاش الحمض النووي والعائد. جاف بيليه فقط حتى تصبح جافة. الإفراط في تجفيف بيليه قد خفض الانتعاش الحمض النووي والعائد.
    3. إزالة الأنابيب من المغناطيس وإضافة 20 ميليلتر 10 ملم تريس-HCl (pH 8.0). بلطف "الماصة؛" وحدة التخزين بأكملها صعودا وهبوطاً 25 مرة مزيج دقيق. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنابيب مرة أخرى على المغناطيس لدقيقة 4 ونقل المادة طافية إلى أنبوب آخر.
    4. قياس كمية الحمض النووي مع فلوروميتير مناسبة (انظر الجدول للمواد).
    5. تحقق من نجاح من قبكر (ميكروليتر 1 تمييع في 100 ميليلتر ح2س واستخدام 2-5 ميليلتر ل qPCR) الرقاقة. استخدام كبسولة تفجير محددة للايجابية (موقع الربط المعروفة من البروتين للفائدة) والمراقبة السلبية (مثلاً، جين هو صامت و/أو ليس هدفا للبروتين للفائدة).
      ملاحظة: يمكن إجراء إعداد مكتبة مع 2 نانوغرام من "رقاقة الحمض النووي" اعتماداً على عدة (انظر الجدول للمواد لاقتراح بشأن الذي لاستخدام طقم).

Representative Results

4 سو العلامات: التحقق من الأمثل 4 شروط وضع العلامات سو (المبرمج، والإجهاد النووية، الإجهاد هيولى) والوقت وتركيز: يمكن أن تمنع إنتاج وتصنيع الرنا الريباسي مستويات عالية من 4sU والحث على الإجهاد هيولى فضلا عن النووية30. ولذلك، ينبغي اختبار خلايا فائدة للإجهاد الناجم عن 4sU فضلا عن المبرمج. يوصي بإجراء تحليل لطخة غربية لتصور تراكم p53، الذي يشير إلى التوتر النووي، زيادة مستويات والرمات-EIF2a الذي عرض هيولى الإجهاد والأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) تحليلاً للمبرمج. يمكن استخدام مستويات مرتفعة والتعرض المطول ل 4sU أو الأدوية مثل ثابسيجارجين أو زرنيخيت للحث على الإجهاد الخلوية. للحث على موت الخلايا المبرمج أو، تعامل الخلايا مع BH3I-1 (500 نانوغرام/ميليلتر) أو المحتضنة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية (صدمة الحرارة). أنيكسين V/7-عاد تلطيخ استخدمت لتحديد خلايا الميت (7-الإغراق) وأبوبتوتيك (أنيكسين V). وضع العلامات في المختبر تولد خلايا Th1 أولية ح 0.5 مع 500 ميكرون 4sU (تركيز نهائي) أو ح 1 مع 200 ميكرومتر 4sU لا يدفع علامات الإجهاد الخلوية لا المبرمج (الشكل 1) لكن يؤدي إلى إدماج 4sU كافية.

الجيش الملكي النيبالي وسم وقت يمكن اختصارها أيضا (دي فايف دقيقة) مما يؤدي إلى زيادة قصيرة الأجل إينترونيك تسلسل مرات وضع العلامات مقارنة بفترة أطول. تصور معدلات الربط كوترانسكريبشونال، ينبغي أن لا تتجاوز مرات وسم 4sU 30 دقيقة. لمزيد من التفاصيل بشأن 4sUlabeling، الرجاء الرجوع إلى Rädle وآخرون. 19

مراقبة الجودة: سلامة الحمض النووي الريبي ذات أهمية كبيرة عند تجهيز الجيش الملكي النيبالي. الأكثر ملاءمة للتحقق من جودة الجيش الملكي النيبالي من الحمض النووي الريبي المسمى 4sU بعد بيوتينيليشن بتحليل اليكتروفوريتيكال (انظر الجدول للمواد). النظر في التحقق من الحمض النووي الريبي المعزولة من الخطوة 2.2.2، خصوصا عند استخدامه لتسلسل مجموع الجيش الملكي النيبالي. يجب أن يكون رقم سلامة الحمض النووي الريبي (رين) إيه إيت لضمان سلامة الحمض النووي الريبي لمواصلة تجهيزها (الشكل 3).

يمكن أيضا استخدام تحليل اليكتروفوريتيكال للتحقق من الحمض النووي الريبي يدون حديثا. كن على علم أن يدون حديثا الجيش الملكي النيبالي يحتوي على ررناس أقل نضجاً كبيرا مقارنة بمجموع الجيش الملكي النيبالي مع العصابات الرنا الريباسي نموذجي يجري بارزة أقل بكثير.

الريبوسوم التنميط: [بكر] تضخيم مكتبة كدنا: كدنا التضخيم (الخطوة 4.9.1) خطوة حاسمة لضمان تحقيق نتائج جيدة التسلسل. تحليل مكتبات تضخيم بتحليل اليكتروفوريتيكال. يبين عينة جيدة من مكتبات تضخيم ذروته حول bp 140-160 (الشكل 4 أ). كميات مفرطة من محول dimers ينبغي تجنبها (الشكل 4 باء)، ويجب تنقية تلك العينات كذلك استخدام الإجراء تنقية صفحة طبقاً للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (تنقية صفحة منتجات PCR). يمكن أن ينتج الكثير القالب أو عدد كبير جداً من PCR دورات التضخيم المفرط وتتميز بظهور بقع PCR المنتجات، عصابات الوزن الجزيئي أعلى مما كان متوقعا ومحول ديمر المنتجات (الشكل 4). لمعظم العينات 1-5 ميليلتر من كدنا سيركولاريزيد و 9 دورات PCR للتضخيم سوف تسفر عادة عن كميات كافية من المنتج بكر الصحيح.

رقاقة: القص الكروماتين: شروط القص الأمثل تحتاج إلى تعديل لكل نوع من الخلايا. تحديد شروط القص (مثلاً، عدد الدورات، طاقة عالية أو منخفضة) مقدما. استخدام نفس العدد من الخلايا ونفس وحدة التخزين لأغراض، الاختبار منذ أقل كثافة خلية يزيد من كفاءة الإمالة. في محاولة لتجنب أكثر-أو تحت-القص الكروماتين. أجزاء كبيرة من الكروماتين هائلة يمكن أن تؤثر على نتائج رقاقة من انسداد، والقص المفرط يمكن أن تدمر [ابيتوبس] على البروتين للفائدة، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة ملزم بالجسم. في هذه التجربة، وتحققت أفضل النتائج عندما كان الكسر الرئيسي من الكروماتين المنفصمة حوالي 1,000 بي بي أو أقل قليلاً (الشكل 5A).

"رقاقة التحقق من" قبل قبكر: قبل البدء في الشريحة، فإنه من المستحسن اختبار إذا كان جسم المستخدمة مناسبة لشرائح (إذا كان ذلك ممكناً، استخدام رقاقة الصف الأجسام المضادة) برقاقة qPCR. تحقق من الرقائق للتسلسل ب qPCR قبل البدء في إعداد مكتبة (راجع الخطوة 5.6.5). كبسولة تفجير تصميم التي تربط إلى موقع هدف معروف من بروتين الفائدة. إذا كان الموقع الهدف المحدد ضمن جينات غير معروف، يمكن استخدام العديد من أزواج التمهيدي لفحص الجينات والعناصر التنظيمية المرتبطة بها. لرقاقة Th1 رنابي الخلايا إيفنج، الذي ترانسكريبتيونالي أوبريجولاتيد على التحفيز، والإشعال أكتين يمكن أن تستخدم كعنصر إيجابي. Sox9 و الأنسولين بمثابة عنصر تحكم سلبية، حيث لم يتم التعبير عن هذه الجينات في خلايا Th1 (الشكل 5 (ب)). تذكر أن لا تستخدم كبسولة تفجير إكسون الممتدة، التي عادة ما تستخدم ل qPCR مرناً. يمكن أيضا استخدام عنصر تحكم مفتش لإثبات خصوصية جسم المستخدمة. ويمكن قياس "الحمض النووي إيمونوبريسيبيتاتيد" مع فلوروميتير مناسبة (انظر الجدول للمواد). كميات من الحمض النووي نونسبيسيفيكالي ملزمة بمراقبة مفتش ينبغي إلى حد كبير أقل مقارنة بكمية الحمض النووي ملزمة بالضد المصلحة.

وإنشاء نسخ متماثلة: دليل على الأهمية البيولوجية: وينصح بشدة إجراء التجربة الحركية لجميع الأساليب بدءاً من نفس المجموعة من الخلايا التأكد من الخلايا لها نفس الهوية لجميع العينات غير المعالجة والمعالجة (الشكل 2). ومع ذلك، من المستحسن اتخاذ مختبرين صغيرة من النقاط الزمنية الرئيسية لكل طريقة لمقارنة العينات تكرار بيولوجية (مثلاً، من قبكر، تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية). هذا يسمح بإجراء تقدير تقريبي إذا كان العلاج لكلا replicates استنساخه ويمكن الشروع في التسلسل. ينبغي إجراء التحقق من الصحة replicates عن طريق تحليل بيوينفورماتيكال. إمكانية تكرار نتائج النتائج يمكن تقييمها من حيث العلاقة بين قيم فبكم بين replicates وتصور استخدام التبعثر مؤامرات (الشكل 6).

Figure 1
الشكل 1: تحقق ظروف المثلى وسم 4sU دون مقاومة فيزيولوجيا الخلية (الشكل من داوري et al. 11)
(أ) الكشف عن الخلايا المبرمج بنظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل: في المختبر ولدت Th0 الخلايا عولجوا بتركيزات مختلفة من 4sU (بين قوسين) ح 0.5 و 1 ح ح 2، على التوالي. واستخدمت العلاج BH3I-1 لحمل المبرمج يحدده V أنيكسين، بينما استخدمت صدمة الحرارة (5 دقائق عند 95 درجة مئوية) للحث على موت الخلايا التي تحددها 7-عاد. (ب) تحليل لطخة غربية ل p53 4sU معاملة وتنشيط خلايا T: كانت وصفت عينات مع 200 ميكرومتر 4sU لوقت التنشيط، فيما عدا الوقت ح 0.5 نقطة التي وصفت مع 500 ميكرون 4sU المشار إليها. (ج) تحليل لطخة غربية EIF2a والرمات ومجموع EIF2a في تنشيط خلايا Th1 بنفس الشروط التي وصفها كما هو الحال في (ب). ثابسيجارجين كعنصر إيجابي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: نظرة عامة التخطيطي لإعداد الحركية لتعقب التغييرات على نطاق الجينوم
يوضح هذا المخطط الإعداد للجمع بين 4sU seq مجموع تسلسل الحمض النووي الريبي والتنميط الريبوسوم، ورقاقة-seq لدراسة التغييرات على نطاق الجينوم عند معالجة الخلية. تجمع الخلايا وتوضع جانبا على العدد المطلوب من الخلايا لعنصر التحكم غير المعالجة. علاج الخلايا المتبقية وتقسيم لكل أسلوب ووقت نقطة. قم بتسمية الخلايا غير المعالجة أو المعالجة ل seq 4sU مع 4sU كما هو موضح. النقاط الزمنية وعينات لكل أسلوب يعتمد على مسألة بيولوجية محددة يجري بحثها. أخذ عينات لكل نقطة الوقت والأسلوب، واتبع الجزء المخصص من البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: مراقبة الجودة من الحمض النووي الريبي المسمى 4sU
تم تحليل مجموع الجيش الملكي النيبالي وبيوتينيلاتيد الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من خلايا Th1 المنشط في بيواناليزير. ترد الرنا الريباسي 18S والرنا الريباسي 28S وعدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) بالصك لتحديد وحدة من الجيش الملكي النيبالي. ينبغي أن يكون رين إيه إيت لضمان سلامة الحمض النووي الريبي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: بيواناليزير لمحات من الريبوسوم التنميط المكتبات
مكتبة جيدة (A) A: يظهر العينة ذروتها في نطاق الحجم المتوقع (140-160 bp) وهناك حاجة إلى لا تنقية إضافية. (ب) هذا النموذج يظهر محول المفرطة ديمر تضخيم المنتج (120 شركة بريتيش بتروليوم) بالنسبة إلى المنتج المطلوب (bp 140-160). هذه المكتبة يتطلب المزيد من تنقية. (ج) نموذج تضخيم الإفراط: الوزن الجزيئي قمم أعلى من المتوقع وبقع بكر أمبليكونس مرئية (المشار إليها بواسطة الأسهم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5: حجم الكروماتين الأمثل بعد القص والتحقق من شرائح من قبكر
(أ) [اغروس] هلام الصورة يظهر حجم جزء الأمثل الكروماتين المنفصمة من ثلاث عينات المنفصمة لدورات 25 في سونيكاتور وتنقيته كما هو موضح من قبل في البروتوكول. (ب) تمثل نتائج Q PCR "شريحة رنابي" مجموع (مكافحة-الجيش الملكي النيبالي بول الثاني، 8WG16، ab817) كنسبة مئوية من المدخلات. وتستخدم كبسولة تفجير إيفنج و أكتين إيجابية بينما Sox9 و الأنسولين هي عناصر سلبية (كلا الجينات لم يتم التعبير عن تنشيط خلايا Th1). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الشكل 6: مقارنة بين البيولوجية يتطابق (الشكل من داوري et al. 11)
مؤامرة مبعثر الممثل مقارنة قيم التعبير (فبكم) بين وإنشاء نسخ متماثلة من ح 4 الجيش الملكي النيبالي يدون حديثا (4sU) بعد التحفيز لتنشيط خلايا Th1. يشير الخط الأخضر إلى قيم فبكم متساوية وتتم الإشارة إلى ارتباط الرتب في كل الأرض.

المدة لوضع العلامات (دقيقة) تركيز 4sU الموصى بها (ميكرومتر)
120 100-200
60 200-500
15-30 500-1000
< 10 500-2000

الجدول 1: أوصى بتركيزات 4sU (من Rädle، وآخرون- 19)
تتم الإشارة إلى التركيزات الموصى بها 4sU لأوقات مختلفة لوضع العلامات.

الأسلوب عدد الخلايا كمية الحمض النووي الريبي
وسم 4sU إيه تو × 107 ≥60µg
الريبوسوم التنميط إيه تو x107
رقاقة-seq إيه تو × 107 -3 × 107

الجدول 2: المبلغ المطلوب من الخلايا الأولية
الحصول على الحد الأدنى من الخلايا الأولية المطلوبة لكل أسلوب. المبالغ يمكن أن يكون أقل عند استخدام أنواع الخلايا الأخرى.

Discussion

تحليل العملية برمتها من تنظيم الجينات من الضروري أن نفهم تماما التكيفات الخلوية في استجابة لحافز معين أو العلاج. الجمع بين تسلسل الحمض النووي الريبي المجموع، 4sU seq، الريبوسوم التنميط، ورقاقة-seq في نقاط زمنية مختلفة يؤدي إلى تحليل شامل للعمليات الرئيسية لتنظيم الجينات على مر الزمن. مطلوب فهم عميق للعمليات البيولوجية لتحديد الإعداد التجريبية، فضلا عن النقاط الزمنية المثلى.

منذ تحسين أساليب لدراسة تنظيم الجينات بسرعة، يمكن أن تكون هذه البروتوكولات تتكيف مع التغيرات السريعة. ومع ذلك فإنها توفر الأساليب الأكثر أهمية لدراسة آليات تنظيمية الجينات الأساسية في أي نوع من الخلايا. وهنا نحن نناقش بعض المزالق والوقائع التي يتعين على المرء أن ينظر عند استخدام هذه الأساليب.

الخلايا: يجب أن تكون الخلايا عالية قابلة للحياة، وإذا كان استخدام الخلايا الأولية المعزولة، يجب أن تضمن نقاء السكان خلية (مثلاً، تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لخلايا تي الأولية). الخلايا حتى قليلاً وأكد يمكن أن تؤثر على النتائج من هذه الأساليب تسلسل حساسة جداً وخفض كمية الحمض النووي الريبي يدون أو المترجمة حديثا، ويؤدي إلى قراءات غير المرغوب فيها لاستجابة الإجهاد في نتائج التسلسل. هو الأمثل سرعة الطرد المركزي المشار إليها في هذا البروتوكول بيليه الخلايا لخلايا تي الأولية. وهكذا، ضبط سرعة حسب نوع الخلية.

4 آثار سو على فيزيولوجيا الخلية: بالإضافة إلى الخيارات المذكورة أعلاه للتحقق من الحد الأدنى من اضطراب للفيزيولوجيا الخلوية عند إضافة 4sU، يمكن إجراء تحليل آخر و/أو إضافية، لا سيما عندما تقتصر أرقام الخلية. ويمكن اختبار آثار على تكاثر الخلايا بالتحقق من الوقت مضاعفة الخلايا ببساطة عد الخلايا المسماة وغير المسماة. يمكن أيضا اختبار الإجهاد النوية التعريفي من خلال تحليل مورفولوجيا الخلايا عن طريق تلطيخ الفلورة نوكليولين ونوى. كذلك التحقق من تأثير 4sU، ويمكن قياس التعبير الجيني العالمي تغير بربط قراءة التهم من الحمض النووي الريبي المجموع المسمى بالجيش الملكي النيبالي إجمالي غير مسمى.

الخلية الأرقام: في المختبر إنشاء خلايا T، نوصي بدءاً على الأقل كمية الخلايا المشار إليها في الجدول 2. اختر أعدادا كافية من كل أسلوب حسب نوع الخلايا. نظراً للخلايا T أقل من السيتوبلازم والجيش الملكي النيبالي بالمقارنة مع الخلايا الأخرى، ستكون كافية على الأرجح مبالغ أقل من الخلايا الأخرى. لرقاقة-seq، تعتمد أرقام الخلية عاليا على جسم المستخدمة ومستوى التعبير من بروتين الاهتمام داخل الخلايا. هيستون أو "رقاقة رنابي"، يمكن استخدام خلايا فو، بينما أرقام الخلية بحاجة إلى زيادة عند استخدام عوامل النسخ، خاصة إذا كان يتم التعبير عنها عند مستويات منخفضة.

4 سو-وضع العلامات، والجيش الملكي النيبالي بيوتينيليشن: عند استخدام الخلايا ملتصقة، وسم 4sU يمكن توجيهها كما وصفها Rädle وآخرون. 19 منذ 4sU جداً سرعة دمج الخلايا، يمكن إضافته إلى وسيلة لتعليق أو ملتصقة أو الخلايا شبه ملتصقة مباشرة.

من المستحسن أن تبدأ في بيوتينيليشن مع 60-80 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، يمكن استخدام كميات أقل من الجيش الملكي النيبالي، على الرغم من أننا لا اختبار لأقل من 30 ميكروغرام. إضافة كوبريسيبيتانت (مثلاً، جليكوبلوي) عندما عجل الجيش الملكي النيبالي إذا كان من الصعب رؤية بيليه. دافي وآخرون أظهرت أيضا أن البيوتين تنشيط ميثيلثيوسولفوناتي (النظام التجاري المتعدد الأطراف-البيوتين) أكثر كفاءة يتفاعل مع الحمض النووي الريبي المسمى 4sU هبدب-البيوتين31. ومن ثم، قد يكون من المفيد النظر في التحول إلى النظام التجاري المتعدد الأطراف-البيوتين، على وجه الخصوص، لاسترداد الكشف الصغيرة، التي تميل إلى أن تكون أقل من المخلفات أردين (الرجوع إلى بروتوكول بيوتينيليشن ذكرها دافي وآخرون؛ انظر تنقية الحمض النووي الريبي المسمى 4sU، الإجراءات التجريبية).

لاسترداد رنا يدون حديثا، فمن الممكن استخدام الخرز باراماجنيتيك أو الخرز تنظيف الجيش الملكي النيبالي من اختيارك. تأخذ دائماً في الاعتبار أن هذه المجموعات قد أو قد لا تنقية للكشف محددة. على سبيل المثال، إذا كنت ترغب في ميرناس، النظر في استخدام مجموعات محددة لالتقاط ميرنا وتسلسلها.

التحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي يدون حديثا: لدقة قياس الحمض النووي الريبي يدون حديثا، القياس ينبغي أن يؤديها إلى فلوروميتير مناسبة (انظر الجدول للمواد). ضمن ح 1 من التعرض 4sU، رنا يدون حديثا يمثل حوالي 1-4% من مجموع الجيش الملكي النيبالي. رنا يدون حديثا من ح 1 المسمى، وتنشيط خلايا تي تتألف من ~ 90-94% من الرنا الريباسي11.

الريبوسوم التنميط: عند إنشاء الطريقة، عقدنا العزم أن استخدام 1.5 x مبلغ نوكلاس مما اقترح في البروتوكول الأصلي يضمن الهضم السليم. أيضا، أبلغ أي آثار سلبية لكميات مرتفعة من نوكلاس. نظراً لأنه من الصعب جداً أوفيرديجيست المفاضلة في حين أنهم جزء من الجيش الملكي النيبالي ملزمة بالبروتينات ريبوسومال، يمكنك زيادة المبلغ الذي تيتراتي الهضم nuclease الأمثل لا يزال قليلاً.

إذا كان أقل من 500 نانوغرام من "الجبهة الوطنية الرواندية الجيش الملكي النيبالي" وعثر في خطوة 4.4.2، كرر استنزاف الرنا الريباسي وتجمع تنقية المفاضلة مع الحمض النووي الريبي نظيفة ومركزات-5 أعمدة. وبدلاً من ذلك، تحميل عينات مماثلة اثنين بجانب بعضهما البعض على الهلام (الخطوة 4.5.3) وتجمع جل الشرائح أثناء شطف الحمض النووي الريبي من الهلام (الخطوة 4.5.6).

ونحن نوصي بقطع المفاضلة على جل أحكام قدر الإمكان لعصابات nt 28 و 30. وهذا يساعد في إزالة الأجزاء غير المرغوب فيها من ررناس وترنس، التي سوف تصبح جزءا من المكتبة الخاصة بك وتقليل ما يلي تسلسل للمفاضلة الخاصة بك في وقت لاحق.

كما يوصي بتجنب ضوء أثناء تنقية هلام الأشعة فوق البنفسجية. هذا يمكنك إنشاء نيكس في الأجزاء رنا، فضلا عن dimers بيريميدين، التي يمكن أن تؤثر تأثيراً شديدا على إعداد مكتبة وتسلسل النتائج في نهاية المطاف.

إعداد مكتبة وتسلسل البيانات: تمكن الريبوسوم التنميط بروتوكول لإنشاء مكتبة كدنا مناسبة للتسلسل. يمكن استخدام العينات التي تم إنشاؤها بواسطة العلامات 4sU مباشرة لإعداد مكتبة مع أي مجموعة تسلسل الحمض النووي الريبي المناسبة. منذ يدون حديثا الجيش الملكي النيبالي، خاصة عند استخدام قصيرة وسم تايمز، قد لا تكون بوليادينيلاتيد، ينبغي إجراء لا بولي--مجموعة مختارة. بدلاً من ذلك، نوصي بشدة باستنفاد الرنا الريباسي للحيلولة دون تخفيض عمق التسلسل للعينة الفعلية. استخدام خلايا تي، بدأنا مع 400 نانوغرام من الحمض النووي الريبي يدون حديثا ومجموع (تبعاً لهذه المجموعة، انظر مواد)، يقوم الرنا الريباسي نضوب وانخفاض دورات للتضخيم PCR للتقليل من التحيز PCR. إعداد مكتبة يمكن أن يؤديها بأقل المواد البداية. ينبغي أن يكون الأمثل لحساب المكتبة تعقد أرقام دورات PCR.

لرقاقة seq هناك أيضا العديد من مجموعات المتاحة لإعداد المكتبة. في مكتبتنا أيدي عملت إعداد جيدا بدءاً من 2 نانوغرام من "رقاقة الحمض النووي" (انظر المواد لاقتراح بشأن الذي لاستخدام طقم). يجب التأكد من مراجعة الأرقام القياسية لتوازن اللون أثناء تسلسل. ونحن نوصي بعمق تسلسل إيه فور زيرو × 106 يقرأ كل 4sU seq ومجموع الجيش الملكي النيبالي-seq، وعينات seq رقاقة، وإيه إيت زيرو × 106 ما يلي: الريبوسوم التنميط عينات. عمق التسلسل يعتمد على العينة وتحليل المتلقين للمعلومات المعلوماتية الحيوية وينبغي النظر بعناية. لتحليل ما يلي إينترونيك للربط كوترانسكريبشونال، 100 يحتاج bp إقران نهاية تسلسل يتم اختياره.

تسلسل التحيز: التسلسل أصبح معيار الذهب عند تحديد التغيرات العالمية في النسخ أو الترجمة أو النسخ عامل ملزم. في السنوات الأخيرة، تم دفعها من الأساليب القائمة على حدودها أو تم تطوير تقنيات جديدة لتسلسل مبالغ بداية صغيرة متزايدة من الجيش الملكي النيبالي. ويتطلب هذا تضخيم كدنا، الذي يدخل الضوضاء أو التحيز. في الآونة الأخيرة، وضعت معرفات فريدة الجزيئية (أميس) تجريبيا تحديد التكرارات عرضته PCR. في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن أميس أقل ما يقال مجرد تحسين تسلسل السلطة، ومعدل اكتشاف كاذبة ل التعبير الجيني التفاضلي32. ومع ذلك، النظر في استخدام معرفات فريدة الجزيئية (أميس) لجميع المكتبات التسلسل لعنصر التحكم للمكتبة تعقد، خاصة عند البدء بكميات قليلة من الجيش الملكي النيبالي، وعندما تكون هناك حاجة العديد من دورات PCR.

المخزن المؤقت وحلول الأسهم: ويجب إعداد كافة المخازن المؤقتة ل 4sU seq والتنميط الريبوسوم تحت شروط صارمة خالية من رناسي استخدام مياه خالية من نوكلاس. من المستحسن لشراء مسبقة الصنع خالية نوكلاس كلوريد الصوديوم وتريس-HCl، يدتا، وسترات الصوديوم والماء. ولضمان ظروف خالية من نوكلاس، يمكن استخدام حلاً ديكونتاميناتينج رناسي لتنظيف الممصات أو الأسطح. كافة المخازن المؤقتة لرقاقة seq بحاجة إلى أن تكون على الأقل خالية من الدناز ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة. دائماً إضافة مثبطات البروتياز، واختيارياً، مثبطات الفوسفاتيز الحق قبل الاستخدام والحفاظ على الجليد.

المعلوماتية الحيوية: تحليل جميع البيانات التسلسل (أي، seq رقاقة وتسلسل الحمض النووي الريبي والتنميط ريبسوسومي) ينطوي على مراقبة الجودة (مثلاً، استخدام فاستقك، http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)، التشذيب المحول (مثلاً، مع كوتادابت20) متبوعاً برسم خرائط الجينوم مرجع الخلايا قيد الدراسة. لبيانات تسلسل الحمض النووي الريبي (المجموع و 4sU seq)، فضلا عن الريبوسوم التنميط البيانات، مطلوب مخطط تسلسل الحمض النووي الريبي المقسمة، مثل 2 كونتيكستماب21. للتحالفات seq رقاقة البيانات أونسبليسيد، استخدام MEM التحالف22 كافية. يمكن حساب التعبير الجيني باستخدام نموذج (قراءة كل "كيلوبس إكسون" الواحدة ملايين الأجزاء المعينة) ربكم1، بعد تحديد قراءة التهم كل الجينات استخدام البرنامج، مثل فيتوريكونتس23. تتوفر لاستدعاء الذروة من البيانات seq رقاقة، عددا من البرامج، مثلاً، أجهزة ماكينتوش24 أو25من الأحجار الكريمة. كذلك يمكن إجراء تحليلات المصب في ص26، لا سيما باستخدام الأدوات التي توفرها المشاريع بيوكوندوكتور27.

هنا، تحديا كبيرا في دمج 4sU-ومجموع مستويات الحمض النووي الريبي والنشاط متعدية الجنسيات من الريبوسوم التنميط هو التطبيع. نهج التقليدي لمعالجة هذه المشكلة تطبيع لمستويات من البيت-حفظ الجينات. للحد من الضوضاء بسبب التقلبات العشوائية لحفظ البيت الجينات الفردية، من المستحسن أن ليس فقط استخدام قليلة البيت حفظ الجينات ولكن المستويات الوسطية لمجموعة أكبر، مثل > 3,000 البيت حفظ الجينات التي جمعتها أيزنبرغ وليفانون28 . لحساب معدلات دوران الجيش الملكي النيبالي من نسب 4sU-إلى مجموع الجيش الملكي النيبالي، التطبيع هو استناداً إلى معدل دوران متوسط معدلات (مثلاً، على افتراض نصف الجيش الملكي النيبالي من ح 5)29. بيد أن هذا يفترض لا التغييرات الشاملة لحفظ البيت الجينات، نوصي باستخدام نهج تحليل مستقل للتطبيع، مثلاً، تجميع لسلسلة زمنية من أنواع بيانات مختلفة لتحديد مجموعات من الجينات على أساس الارتباط مع السلوك متميزة في النسخ والترجمة أثناء التنشيط. للحصول على وصف مفصل في التكامل بيوينفورماتيكال لأنواع البيانات المختلفة، نشير إلى أن المنشور الأصلي11.

تحليل لتكامل البيانات ومعدلات الدوران: يمكن أن تظهر ورقة نشرت مؤخرا33 مقارنة نصف حياة مصممة بعنصر تحكم متعدد جينات (MGC) إلى الأساليب العالمية أن نصف العمر ارتباطاً أفضل مع تلك التي تم الحصول عليها بطرق وضع العلامات الاستقلابية مقارنة بالأساليب الأخرى (مثلاً، العامة تثبيط النسخ بالمخدرات). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الاختلافات بين حسابات نصف العمر يمكن أن تنشأ، وقد تم وصف 15،34. يمكننا حساب لمعظم المشاكل والخلافات التي يتم تقديمها بواسطة استجابة الإجهاد بسبب التعرض لفترات طويلة 4sU. ولذلك من الضروري استبعاد إجهاد استجابة عرض العلامات 4sU. للتحقق من صحة زيادة معدلات الدوران، نوصي باستخدام مجكس.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا استخدام مجموعة من البيانات كما تم إنشاؤه هنا لبيانات تحليل (مثلاً، تنظيم الكشف منذ فترة طويلة غير الترميز)35،أكثر تكاملية36.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

ونحن نشكر لارس Dölken لتقديم المشورة وضع العلامات 4sU لخلايا تي الأولية؛ إليزابيث غراف، وتوماس شوارزماير لمساعدة حاسمة في مكتبة الأجيال وتسلسل؛ ديرك إيك وأندرو Flatley لتوفير الأجسام المضادة رنابي و T الخلية؛ أ. هنرييت أوهلينهاوت وال [فرنزيسكا Greulich للحصول على مساعدة في إعداد المكتبة لرقاقة-seq؛ وأيده كارولين جيم فريدل المنح FR2938/7-1 و CRC 1123 (Z2) من الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG)؛ وأيد جلاسماتشير الكه المنحة GL 870/1-1 من الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG) والمركز الألماني لأبحاث مرض السكري (DZD)، ميونيخ Zentrum هلمهولتز.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4sU-labeling
4-thiouridine (100 mg) Carbosynth 13957-31-8 Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at –20°C in aliquots of 50-500 µl; do not refreeze.
1.5 ml safe-lock tubes Eppendorf 30121589 Optional
1.5 ml screw-top polypropylene tubes Sarstedt 72692005 Compatible with Dimethylformamide
15 ml tubes BD Falcon 352096 Compatible with Dimethylformamide
2.0 ml screw-top polypropylene tubes Sarstedt 72694005 Compatible with Dimethylformamide
50 ml tubes BD Falcon 352070 Compatible with Dimethylformamide
Agencourt RNAClean XP Beckman Coulter A63987 We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C
Chloroform Sigma Aldirch 372978 WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH
Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
Dithiothreitol (DTT) Roth 6908.1 Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh
Ethanol Merck 1.00983.1000
EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg) Pierce 21341 Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4°C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes.
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626
Isopropanol Merck 1.09634.1011
NaCl (5M) Sigma Aldrich 71386 Stock solution
nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0 Invitrogen 15575-020 Stock solution
Nuclease-free H2O Sigma Aldrich W4502 Stock solution
nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4 Lonza 51237 Stock solution
Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml) 5Prime 2302830 Use in step 1.3.4.
Polypropylene 15 ml centrifuge tubes Greiner Bio-One 188271 Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 × g
QIAzol Lysis Reagent (200 ml) Qiagen 79306 Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol)
Qubit RNA HS assay kit Life Technologies Q32852 Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11
RNeasy MinElute Kit Qiagen 74204 Optional; includes Buffer RLT
Sodium citrat Sigma Aldrich C8532 Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water
Tween 20 Sigma Aldrich P1379
µMacs Streptavidin Kit Miltenyi 130-074-101 Store at 4°C, includes µMacs columns used in step 1.4.6. (store at RT)
Cell viability and stress assay
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD Biosciences 559763 Optional
Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 Optional
p53 abcam ab26 Optional
p-EIF2a (Ser51) Cell Signaling 9721 Optional
BH3I-1 Sigma-Aldrich B 8809 Optional
Buffers
4sU Washing Buffer store at RT 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O
Biotinylation Buffer (10x) store at 4 °C 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4°C
RNA precipitation buffer store at RT 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.
Equipment
2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939BA
RNA 6000 Nano Kit Agilent 5067-1511 Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10
RNA 6000 Pico Kit Agilent 5067-1513 Optional
UV/VIS spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 1000 Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3
High-speed centrifuge Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3R Or equivalent equipment capable of reaching 13,000 × g
High-speed rotor Thermo Scientific Fiberlite F15-6 x 100y
Adaptors for 15 ml tubes
Refrigerated table-top centrifuge Eppendorf 5430 R Or equivalent.
Thermomixer Eppendorf Thermomixer C Or equivalent.
Magnetic stand Miltenyi Biotec 130-042-109 One stand holds 8 µMacs columns.
Ultra-fine scale Mettler Toledo ML204T Or equivalent.
E-Gel iBase Power System Invitrogen G6400UK For RNA gels; or equivalent.
E-Gel EX 1% agarose precast gels Invitrogen G4020-01 For RNA gels; or equivalent.
DynaMag-2 Magnet-1 each Life Technologies 12321D
RNaseZap Sigma R2020 Optional
TruSeq stranded total RNA library prep kit Illumina RS-122-2201 Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit
Nanodrop Thermo Scientific use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration
Ribosome Profiling
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) Illumina RPYSC12116 (Yeast)
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) Illumina RPHMR12126 (Mammalian)
Illustra MicroSpin S-400 HR Columns GE Healthcare 27-5140-01
RNA Clean & Concentrator-25 kit Zymo Research R1017
RNA Clean & Concentrator-5 kit Zymo Research R1015
Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) Illumina MRZG126 or MRZG12324
(High Sensitivity DNA Kit) Agilent Technologies 5067-4626 Already needed for 4sU-seq
All other consumables and equipment are listed in the User guide !!! Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels)
ChIP
10 mM Tris-HCl (pH 8.0) gereral lab supplier
100 bp Plus Marker Thermo Fisher SM0323
16 % Formaldehyde Thermo Fisher 28908 Add to a final concentration of 1 %
70% EtOH gereral lab supplier Always prepare fresh
Agarose gereral lab supplier
Agencourt RNAClean XP beads Beckman Coulter A63987 We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C
ChIP library preparation kit KapaBiosystems KK8504 Or use the kit of your choice
DNA low bind microcentrifuge tubes Eppendorf Z666548-250EA or equivalent
Dynabeads Protein G Invitrogen 10004D Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use
Glycine gereral lab supplier Prepare a 2M stock solution
Glycogen Roche 10-901-393-001
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4.
Phosphatase Inhibitor (PhosStop) Roche 4906837001 Add freshly to the buffer and keep on ice
Power SYBRgreen Master mix Thermo Fisher 4367659
Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free) Roche 11873580001 Add freshly to the buffer and keep on ice
Proteinase K Invitrogen 25530049
Qubit dsDNA HS Assay kit Invitrogen Q32851 Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer
Rnase, DNase free Roche 11-119915001
Salmon sperm (sonicated to around 100bp) Sigma D1626
TE pH 8.0 gereral lab supplier
Antibodies (ChIP grade if possible)
anti-RNA Pol II [8WG16] abcam ab817
anti-Histon H3K36me3 abcam ab9050
or antibody of interest
Buffers
Binding/Blocking buffer Store at RT PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20
Cell-Lysis buffer Store at RT 5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40
ChIP IP buffer Store at RT 0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7 mM NaCl
Elution buffer Store at RT up to 6 months 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS
Nuclei-Lysis buffer Store at RT 50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS
Wash buffer I Store at RT 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl
Wash buffer II Store at RT 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 500 mM NaCl
Wash buffer III Store at RT 0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 8.1
Equipment
2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939BA use this instrument for electrophoretical analysis
Nanodrop Thermo Scientific
Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml Diagenode C30010010
or tubes special for your sonication device
Bioruptor sonication device or sonication device of your choice Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 µl each tube)
Magnetic stand for tubes
Thermomixer
Agarose gel electrophoresis
Qubit Fluorometer Thermo Scientific Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
  2. Chavez, S., Garcia-Martinez, J., Delgado-Ramos, L., Perez-Ortin, J. E. The importance of controlling mRNA turnover during cell proliferation. Curr Genet. 62 (4), 701-710 (2016).
  3. Rutkowski, A. J., et al. Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection. Nat Commun. 6, 7126 (2015).
  4. Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).
  5. Carninci, P., et al. Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution. Nat Genet. 38 (6), 626-635 (2006).
  6. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  7. Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
  8. Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145 (4), 622-634 (2011).
  9. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
  10. Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67 (1), 45-54 (2014).
  11. Davari, K., et al. Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses. Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).
  12. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. 22 (10), 2031-2042 (2012).
  13. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
  14. Blecher-Gonen, R., Barnett-Itzhaki, Z., Jaitin, D., Amann-Zalcenstein, D., Lara-Astiaso, D., Amit, I. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
  15. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  16. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302 (2013).
  17. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
  18. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
  19. Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. J Vis Exp. (78), (2013).
  20. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  21. Bonfert, T., Kirner, E., Csaba, G., Zimmer, R., Friedel, C. C. ContextMap 2: fast and accurate context-based RNA-seq mapping. BMC Bioinformatics. 16, 122 (2015).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  23. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  24. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  25. Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS Comput Biol. 8 (8), e1002638 (2012).
  26. Team, R. D. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , the R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).
  27. Huber, W., et al. Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor. Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).
  28. Eisenberg, E., Levanon, E. Y. Human housekeeping genes, revisited. Trends Genet. 29 (10), 569-574 (2013).
  29. Friedel, C. C., Dolken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol Biosyst. 5 (11), 1271-1278 (2009).
  30. Burger, K., et al. 4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response. RNA Biol. 10 (10), 1623-1630 (2013).
  31. Duffy, E. E., Rutenberg-Schoenberg, M., Stark, C. D., Kitchen, R. R., Gerstein, M. B., Simon, M. D. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Mol Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
  32. Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq. Sci Rep. 6, 25533 (2016).
  33. Baudrimont, A., et al. Multiplexed gene control reveals rapid mRNA turnover. Sci Adv. 3 (7), e1700006 (2017).
  34. Rabani, M., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
  35. Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs. Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).
  36. Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles. Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).

Tags

علم الوراثة، العدد 133، 4-ثيوريديني، الريبوسوم التنميط، رقاقة-seq، الجيش الملكي النيبالي-seq، نسخها حديثا من الجيش الملكي النيبالي، على نطاق الجينوم، تجهيز الجيش الملكي النيبالي، الربط، والربط كوترانسكريبشونال، ومعدل الترجمة، معدل دوران، ربط عامل النسخ
تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davari, K., Lichti, J., Friedel, C.… More

Davari, K., Lichti, J., Friedel, C. C., Glasmacher, E. Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation. J. Vis. Exp. (133), e56752, doi:10.3791/56752 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter