Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Real-time analyse af transskription faktor bindende, transskription, Translation og omsætning skal vises Global begivenheder under aktivering af cellulære

Published: March 7, 2018 doi: 10.3791/56752
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver kombinatorisk brugen af ChIP-FF., 4sU-FF., total RNA-FF. og ribosomet profilering for cellelinjer og primærelementer. Det giver mulighed for sporing af ændringer i transkriptionsfaktor bindende, de novo transskription, RNA forarbejdning, omsætning og oversættelse over tid, og viser den samlede forløb i aktiveret og/eller hurtigt skiftende celler.

Abstract

Ved aktivering, celler hurtigt ændre deres funktionelle programmer og dermed deres gen expression profil. Massive ændringer i genekspression forekomme, for eksempel under Celledifferentiering, morfogenese og funktionelle stimulation (f.eks. aktivering af immunceller), eller efter eksponering for stoffer og andre faktorer i det lokale miljø. Afhængigt af hvilken stimulus og celle sker disse ændringer hurtigt og på alle mulige niveauer af genregulering. Vise alle molekylære processer af en besvarende celle til en bestemt type af stimulus/narkotika er en af de sværeste opgaver i Molekylærbiologi. Her, beskriver vi en protokol, der giver mulighed for simultan analyse af flere lag af genregulering. Vi sammenligner især transskription faktor bindende (kromatin-immunoprecipitation-sekventering (ChIP-seq)), de novo transskription (4-thiouridine-sekventering (4sU-seq)), mRNA behandling, og omsætningen samt oversættelse (ribosomet profilering). Ved at kombinere disse metoder, er det muligt at vise en detaljeret og genome-wide handlingsforløb.

Sekventering nyligt transskriberede RNA anbefales især, når du analyserer hurtigt tilpasse eller ændre systemer, da det skildrer den transcriptional aktivitet af alle gener i løbet af 4sU eksponering (uanset om de er op- eller downregulated). Kombinatorisk brugen af total RNA-FF. og ribosomet profilering giver desuden beregningen af RNA omsætning og oversættelse priser. Bioinformatic analyse af høj overførselshastighed sekventering resultater giver mulighed for mange midler til analyse og fortolkning af data. Den genererede data giver også mulighed for sporing af co-transcriptional og alternativ splicing, bare for at nævne et par mulige udfald.

Den kombinerede metode beskrives her kan anvendes til forskellige modelorganismer eller celletyper, herunder primærelementer. Desuden, vi leverer detaljerede protokoller for hver metode, herunder kvalitetskontrol, og diskutere potentielle problemer og faldgruber.

Introduction

I de seneste år blevet RNA-sekventering (RNA-seq) den norm værktøj til at analysere alle udtrykt RNA'er inden for en celle eller en organisme1. For at forstå hele processen med celler tilpasning som svar på en bestemt stimulus/stof, er det imidlertid nødvendigt at finde fuldt ud alle underliggende processer, spænder fra mRNA transskription til forarbejdning, omsætning og oversættelse. Kortsigtede ændringer i RNA transskription kan næppe måles ved total RNAseq, da ændringer af total RNA afhængige faktorer fx RNA halv-liv og transcriptional aktivitet, som er en dårlig skabelon for afspejler tilpasning af celler til miljømæssige virkninger2,3. Faktisk, en række nye sekventering teknikker blevet udviklet, der giver mulighed for en analyse af de forskellige skridt i gen forordning4 når de kombineres på den rigtige måde. Denne protokol beskriver hvordan man kan kombinere nogle temmelig let anvendelig sekventering teknikker, der giver mulighed for sporing regulering af de essentielle lag af mRNA i en sammenlignende måde. Til at analysere transcriptional aktivitet, en række forskellige metoder er blevet beskrevet, såsom Cap-analyse af genet udtryk (bur)5, native brudforlængelse udskrift sekventering (NET-seq)6og genome-wide nukleare køre (GRO-seq)7 , 8, og bromouridine-sekventering (Bru-seq) samt 4-thiouridine-sekventering (4sU-FF.), som bruger metabolitter, er indarbejdet i nyligt transskriberet RNA9,10, bare for at nævne nogle få. Mens bur identificerer eksakt transskription startsted, NET-FF. og GRO-seq levere mere præcise oplysninger om læsning retninger og 4sU-seq (som er metoden beskrevet her) registrerer kun nyligt transskriberet RNA. Dog 4sU-seq er yderst følsom og kan anvendes i forskellige tidsrammer til at måle kvantitativt transcriptional aktivitet i aktivt skiftende celler samt kvantitative ændringer i mRNA behandling (hvilket sker inden for minutter)9, 11,12. Desuden er 4sU-seq ideel til at kombinere med RNA-seq at beregne RNA omsætning satser for gener9. Transskription af mRNA er udført af RNA Polymerase II (RNAPII), som igen er påvirket af en lang række faktorer, såsom transkriptionsfaktorer, Histon ændringer og generelle aktivatorer/repressors, der kan endda være en del af det transkriptionel komplekse. For at teste hvor mange promotor-gen-forstærker regioner er bundet af en faktor, er ChIP-seq blevet udviklet, som er nu standard metode til dette formål, på grund af mange kommercielt tilgængelige antistoffer13. Men selv om ChIPseq giver klare oplysninger om hvor regulering faktorer binde, det afspejler ikke hvis det faktisk fører til ændringer i transskription14. Derfor er udfører ChIP-seq med 4sU-seq den ideelle kombination for sådanne biologiske spørgsmål. Regulering af genekspression kan også forekomme på et senere tidspunkt, da mRNA og protein niveauer ikke nødvendigvis korrelerer15,16, der angiver potentielt betydningsfulde forordning på translationel eller posttranslationelle niveau, afhængigt af sammenhængen. I år 2011, ribosomet profilering havde været først kombineret med RNA-FF. og er nu den foretrukne at kvantificere ændringer, der sker hurtigt i protein, da der er stadig nogle følsomhed grænser med massespektrometri17metode. Faktisk, oversættelse satser opnås fra sådanne metoder har vist sig at levere en relativt god skøn over ændringer i protein niveauer (i hvert fald målt for langsigtede ændringer) og giver mulighed for en endnu mere detaljeret visning på oversættelsesprocessen, fx den bestemmelse af start-side og alternativ oversættelse rammer17. Kombinatorisk brugen af alle fire metoder kan bruges i steady state, mellem forskellige celletyper, eller i en tid-serie eksperiment i en hurtigt skiftende celle11. Denne brug giver en genome-wide oversigt over ændringer i transskription faktor bindende påvirke RNA transskription, forarbejdning og oversættelse.

Protocol

Alle metoder er i overensstemmelse og overensstemmelse med Helmholtz Zentrum München institutionelle, statslige og føderale retningslinjer.

1. forberedelse

  1. Lave en detaljeret plan for den eksperimentelle setup, herunder en tidsplan, når at tilføje 4sU til cellekulturmedium, og hvornår man skal høste celler for hver metode. Afhængigt af de biologiske spørgsmål, nøje overveje tidspunkter for eksempel tegning, mærkning af 4sU tid og koncentration (tabel 1).
    Bemærk: Kontrollere virkningen af 4sU på cellernes levedygtighed og stress respons på forhånd (Se "Bekræft optimale 4sU-mærkning betingelser" i repræsentative resultater og figur 1). Det anbefales at udføre en indledende test af hver metode med mindst én prøve. Kontrollere hvis kvaliteten og mængden af RNA/DNA er tilstrækkelig for dyb sekventering (Se dedikeret dele af protokollen), og praksis hurtigt men skånsom håndtering af cellerne under eksperimentet.
  2. Beregne antallet af celler, der er nødvendige for ethvert tidspunkt af hver metode (Se tabel 2 for et groft skøn, når du bruger primær T-celler). Også overveje at sekventering færre prøver af total RNA end bare 4sU RNA (fx, lige for tiden punkt oversættelse satser eller RNA omsætning skal beregnes). For at bekræfte og kontrollere betydningen af resultaterne (anbefales), skal du oprette mindst én biologiske replikat.
    Bemærk: Vigtigere, for alle metoder og på hinanden følgende tidspunkter, prøver skal være fra det samme udgangspunkt pulje af celler. Mindst en dedikeret forsker for hver metode anbefales.
  3. Forberede alt det nødvendige på forhånd (f.eks.aliquoted 4sU, cycloheximide, pattedyr lysisbuffer og 1% formaldehyd). Efter tilsætning af 4sU, undgå at udsætte celler til lys, da dette kan føre til crosslinking af 4sU-mærket RNA til cellulære proteiner18.
  4. Samle alle celler af interesse i en kolbe lige før behandling (figur 2). Tælle cellerne (f.eks.med en hemocytometer) og bruge den nødvendige mængde til ubehandlet kontrol af hver metode (glem ikke at også mærke den ubehandlet kontrol for 4sU-seq med 4sU). Behandle resterende celler og øjeblikkeligt delt det krævede antal celler for hver gang punkt og metode. Håndtere celler så hurtigt som muligt for at minimere stress på grund af ændringer i temperatur eller CO2 niveauer.
    Bemærk: For eksempel, udtages 1 h, 2 h, 3 h efter behandling, derefter en fjerdedel af cellerne, der bruges til ubehandlet kontrol og tre fjerdedele er brugt for behandlede kontrol.

2. 4sU-mærkning

Bemærk: Denne protokol er ændret fra Rädle, mfl. 19 henviser til deres protokol for yderligere infomation om metabolisk mærkning med 4sU. For alle metoder og på hinanden følgende tidspunkter, skal prøver stamme fra det samme udgangspunkt pulje af celler.

  1. Start af mærkning
    1. Optø aliquoted 4sU lige før brug. Tilføj 4sU på hvert tidspunkt direkte til det medium, der indeholder celler af interesse (Se tabel 2 for anbefalede T celle numre, mindst 60 µg RNA pr. tidspunkt), blandes forsigtigt, og placere tilbage i inkubatoren. Disponere resterende 4sU (ikke genfryses).
    2. I slutningen af mærkning, indsamle celler (fx, celle skraber) og centrifugeres ved 330 x g i 5 min. ved 4 ° C i polypropylen rør, (som kan modstå høje g kræfter). Aspirér medium og tilføje reagens for RNA isolering (≥ 1 mL pr 3 x 106 celler, se materialer til anbefaling til at bruge) til hver tube. Fuldt resuspenderes (≥ 1 mL pr 3 x 106 celler), inkuberes i 5 min. ved stuetemperatur (RT), og fryse prøver ved-20 ° C. Prøver kan opbevares ved-20 ° C i mindst 1 måned.
      Forsigtighed: Reagenser til RNA isolering er ekstremt farligt, når at komme i kontakt med hud eller øjne. Håndtere disse med forsigtighed og overveje sikkerhedsinstruktioner.
  2. RNA forberedelse brug ændret RNA isolering protokol
    1. Tilføje 0,2 mL chloroform per 1 mL reagens for RNA isolering, og blandes omhyggeligt ved omrystning for 15 s. Fortsæt som nævnt i den metaboliske mærkning protokol (trin 1-12, 2. RNA forberedelse ved hjælp af ændrede trizol-protokol) fra Rädle mfl. 19
    2. Måle RNA koncentration (Se Tabel af materialer), ifølge producentens anvisninger. Brug denne RNA for total RNA-seq samt (Se trin 3. Total RNA-seq) eller opbevares ved-80 ° C i mindst 1 måned.
  3. Thiol-specifikke Biotinylation for nyligt transskriberede RNA
    1. Start med 30-80 µg samlede cellulære RNA. 60 µg RNA bør give tilstrækkelige mængder af nyligt transskriberede RNA.
    2. Forberede mærkning reaktion. Pipette i følgende rækkefølge (pr. µg RNA): 1 µL 10 x Biotinylation Buffer, 7 µL RNA (som indeholder 1 µg RNA fortyndet i nukleasen-fri H2O), og 2 µL biotin-HPDP (1 mg/mL). Tilføj biotin-HPDP sidst og bland straks af pipettering. Wrap rør med aluminiumsfolie at undgå udsættelse for lys. Se diskussion for et alternativ til biotin-HPDP. Der inkuberes ved RT i 1,5 time med rotation.
    3. Passende 2 mL centrifugeglas (Se Tabel af materialer) på 15.000 x g i 2 min. afpipetteres alle biotinylated RNA i pre spundet 2 mL tube, tilføje et lige saa stort volumen af chloroform og bland kraftigt. Der inkuberes i 2-3 min. indtil faserne begynder at adskille og boblerne begynder at forsvinde.
    4. Der centrifugeres ved 15.000 x g i 15 min. ved 4 ° C. Omhyggeligt overføre den øverste vandige fase i en ny tube.
    5. Gentag trin 2.3.3. og 2.3.4. én gang. Tilføje 10% af mængden af NaCl (5 M) og en tilsvarende mængde isopropanol til vandfasen. Der centrifugeres ved 20.000 x g i 20 min. ved 4 ° C. Kassér supernatanten.
    6. Tilføje et lige saa stort volumen frisklavet 75% ethanol. Der centrifugeres ved 20.000 x g. udsmid supernatanten, spin kort og fjerne de resterende ethanol. Fuldt resuspend i 30-100 µL H2O (brug 1 µL H2O per 1 µg input RNA fra trin 2.3.1) af pipette blanding.
    7. Kontrollere RNA integritet af elektroforese analyse, eller tage en alikvot og kontrollere senere.
  4. Adskillelse af nyligt transskriberet (mærket) og allerede eksisterende (umærkede) RNA
    1. Fjern Paramagnetiske perler (Se Tabel af materialer) fra 4 ° C opbevaring og lad det stå i mindst 30 min til at bringe dem til stuetemperatur. Varme 4sU vask buffer (3 mL pr. sample) til 65 ° C.
    2. Forberede 100 mM dithiothreitol (DTT) løsning. DTT ultra-fine skala og der tilsættes den nødvendige mængde af nukleasen-gratis vand. Altid forberede friske. Bruge 200 µL pr. prøve.
    3. Varme biotinylated RNA prøver (1 µg/µL) til 65 ° C i 10 min at denaturere og umiddelbart sted på is. Tilsæt 100 µL streptavidin perler til biotinylated RNA og inkuberes ved RT i 15 min med rotation.
    4. Placer en passende kolonne (Se Tabel af materialer til anbefalinger) for hver prøve til den magnetiske stand og pre reagensglasset hver kolonne med 1 mL stuetemperatur 4sU vask buffer.
      Bemærk: Dette vil tage ca 5-10 min. Hvis nogen af kolonnerne ikke indlede dræning efter 5 min, tryk forsigtigt på toppen af kolonnen med en behandsket finger.
    5. Anvende en RNA/perler mix på midten af hver kolonne. Kassér flow-through, medmindre umærkede RNA skal inddrives. Hvis ja, indsamle gennemstrømnings- og i det mindste den første vask. Udfør en gendannelse af RNA som beskrevet af Rädle et al. (trin 1-7, 7. Inddrivelse af umærkede, ubundne RNA)19.
    6. Vaskes tre gange med 0,9 mL 4sU vask buffer (forvarmet til 65 ° C fra trin 2.4.2.) og 0.9 mL RT 4sU vask buffer, henholdsvis.
    7. Brug Paramagnetiske perler til at inddrive nyligt transskriberet RNA. Tilsæt 400 µL af godt spredte RT Paramagnetiske perler i et reagensglas pr. prøve og sted under hver kolonne. Elueres nyligt transskriberede RNA med 100 µL 100 mM DTT. Venter på 3 min og udføre en anden eluering med 100 µL 100 mM DTT. (Valgfri: udføre eluering og opsving, som beskrevet af Rädle et al.) 19
    8. Mix nyligt transskriberet RNA/perler grundigt med pipette blande 10 gange og ske i henhold til fabrikantens vejledning. Elueres RNA i 11 µL nukleasen-fri H2O.Quantify RNA ved hjælp af en egnet fluorometer (Se Tabel af materialer). RNA kan opbevares ved-80 ° C i mindst 1 måned.
      Bemærk: Nyligt transskriberet RNA kan bruges til at forberede næste generation sequencing cDNA-biblioteker (Se Tabel af materialer til et forslag om hvilke kit til at bruge) eller videre downstream analyse. 100 - 500 ng RNA er tilstrækkelig for de fleste bibliotek forberedelse kits (Se diskussion).

3. total RNA-Seq

  1. Direkte tage RNA fra 4sU mærket RNA efter RNA forberedelse ved hjælp af den modificerede reagens for RNA isolering protokol for total RNA-seq (Se trin 2.2.2).
  2. For biblioteket forberedelse, fortynde en RNA alikvot til en slutkoncentration på 50-100 ng / µL. Brug den samme kit som for biblioteket forberedelse af nyligt transskriberede RNA. 100 - 500 ng RNA er tilstrækkelig for de fleste bibliotek forberedelse kits.

4. ribosomet profilering

Bemærk: For alle metoder og gang i træk punkter skal prøver fra det samme udgangspunkt pulje af celler. For anbefalinger om, hvilke kit til brug, henvises til Tabel af materialer.

  1. Forberedelse og Isolation af ribosomet beskyttet fragmenter (RPFs):
    1. Bruge relevante mængder af celler for hvert tidspunkt (Se tabel 2 for anbefalede T celle numre). Behandle vedhængende celler med cycloheximide, som beskrevet i producentens protokol.
      Forsigtig: Cycloheximide er yderst giftigt og kan forårsage mutationer. Undgå hudkontakt og indånding.
    2. Indsamle og pool ikke - eller semi - adherent celler fra hver gang pege i én polypropylen tube og justere den endelige koncentration til 1 x 106 celler pr. mL af celle-specifikke medium (f.eks.suppleres med RPMI til T-celler). Tilføj cycloheximide med en endelig koncentration på 0,1 mg/mL, blandes ved at vende polypropylen røret og inkuberes i 1 min. Centrifuge celler i 5 min på 330 x g ved 4 ° C. Opsug medium og vaske cellerne med mindst 10 mL PBS suppleret med cycloheximide (endelig koncentration 0,1 mg/ml).
    3. Centrifuge celler i 5 min på 330 x g ved 4 ° C. Opsug medium og tilsæt 100 µL pattedyr celle lysisbuffer pr. 10 x 106 celler. Mix af pipettering og udvise gennem en steril 22 25-gauge kanyle til lyse celler helt.
    4. Overføre cellen lysate til en forkølede 1,5 mL tube. Der inkuberes i 10 min på isen med periodiske inversioner. Der centrifugeres i 10 min på 20.000 x g ved 4 ° C til at klarlægge de lysate. Overføre supernatanten til en forkølede 1,5 mL tube.
    5. Forberede en 1:10 fortynding af lysate med nukleasen-gratis vand og post et260læsning ved hjælp af et spektrofotometer. Bruge nukleasen-gratis vand som en tom og en 1:10 fortynding af pattedyr celle lysisbuffer som standard. Beregn A260/mL koncentration af lysate efter følgende ligning:
      (En260 celle lysate - en260 pattedyr lysisbuffer) x 10 fortyndingsfaktoren = en260/mL
    6. Oprette 200 µL delprøver af den lysate på is og gå videre med nukleasen behandling.
      Bemærk: Eventuelt forberede total RNA en 100 µL alikvot, tilsæt 10 µL af 10% SDS og bland. Opbevares ved 4 ° C og Fortsæt med 4.3.2. Ved hjælp af total RNA fra 4sU-mærket RNA anbefales (Se trin 3. Total RNA-seq).
  2. Ribosomet fodspor
    1. Udføre nukleasen behandling straks uden at fryse den lysate. Tilføje 7,5 enheder af nukleasen (inkluderet i de anbefalede kit) for hver A260 af lysate. For eksempel: 80 A260/mL lysate x 0,2 mL lysate x 7.5 U/A260nukleasen = 120 U nukleasen.
      Bemærk: Du kan eventuelt titreres nukleasen for fordøjelsen som beskrevet af fabrikanten.
    2. Inkuber nukleasen reaktion for 45 min på RT med blide blanding. Fryse 200 µL delprøver af en lysate med flydende nitrogen og opbevares ved-80 ° C, eller stoppe nukleasen reaktion ved at tilføje 15 µL RNase inhibitor til hvert 200 µL alikvot, og fortsætte med trin 4.3.2.
  3. Rensning af RPFs
    1. Frigør en stikprøve af nukleasen fordøjet RPFs og tilføje 15 µL RNase inhibitor. Holde prøver på is.
    2. Rense RPFs efter producentens protokol (kolonne rensning anbefales) og måle RNA koncentration på et spektrofotometer.
  4. rRNA udtynding
    1. Brug 5 µg af renset RPFs for rRNA udtømning.
    2. Følg producentens protokol (trin 1-2, primære rRNA udtynding) for rRNA udtømning. Foranstaltning RNA koncentration af rRNA forarmet RPFs på et spektrofotometer.
  5. SIDE rensning af RPFs
    1. Brug 500 ng af rRNA forarmet RPFs side rensning.
    2. Forbered RNA kontrol, prøver og stigen til side rensning. Mix 5 µL RNA kontrol og 5 µL denatureringen gel ladning farvestof i 0,5 mL microcentrifuge rør. Mix 10 µL af hver RPF med 10 µL af denatureringen gel ladning, henholdsvis. Forberede en alikvot stige (4 µL 20/100 stigen, 1 µL nukleasen-gratis vand og 5 µL denatureringen gel ladning farvestof). Indlæse det mellem hver prøve og kontrol til at forhindre crosscontamination.
    3. Denaturere prøver og stigen ved at inkubere ved 95 ° C i 5 min og umiddelbart sted på is. Indlæse 20 µL af hver prøve (valgfrit, belastning 10 µL og fryse resterende prøver ved 20 ° C) adskilt af 10 µL af rede stige på en 12% eller 15% urea-polyacrylamid gel. Indlæse 10 µL af RNA kontrol. Kør gelen indtil bromophenol blå band når bunden af gel (180 V, ~ 70 min) (figur 3).
    4. Pletten gel efter producentens protokol ved 4 ° C. Brug en mørk-felt transilluminator, der udsender blåt lys til at visualisere RNA. Punktafgifter gel skiver til hver prøve, svarende til ~ 28 og 30 nt i længden. Tage RNA kontrol som reference og punktafgifter det.
      Bemærk: RPFs er næppe synlige. Punktafgifter skiver på størrelsen angivet af kontrolelementet RNA - indeholdende to oligos af 28 og 30 nt i længde - selvom prøverne ikke synlige.
    5. Punkteres et hul i bunden af 0,5 mL microcentrifuge rør med en steril 20-gauge kanyle. Overføre hver gel skive i en separat tube og sted udjævnede rør i en 1,5 mL tube. Der centrifugeres i 2 min på 12.000 x g. Gentag centrifugering hvis gel skiver ikke er helt makulere ind i 1,5 mL rør.
    6. Elueres RNA fra forstyrret gel skiver med 400 µL nukleasen-gratis vand, 40 µL ammoniumacetat (5 M) og 2 µL SDS (10%) hver natten over ved 4 ° C.
    7. Overføre gylle til 1,5 mL filter rør (forsynet med de anbefalede kit) med 1 mL pipette spids (wide-bore spidsen eller Self-Made 1 mL tip med afskårne ende). Der centrifugeres i 3 min på 2.000 x g at adskille elueret RNA fra gel skiver. Forsigtigt afpipetteres vandig opløsning i en 1,5 mL tube. Tilføje 2 µL glykogen (forsynet med de anbefalede kit) og 700 µL 100% isopropanol og opbevares ved-20 ° C i mindst 1 time.
    8. Der centrifugeres ved 4 ° C i 20 min. på 13.000 x g. udsmid supernatanten. Vaske pellet med pre kølet frisklavede 80% ethanol ved 4 ° C i 10 min på 13.000 x g. udsmid supernatanten og lufttørre. Resuspend hver prøve i 20 µL og kontrolelementet RNA i 8 µL nukleasen-gratis vand. Opbevares ved-20 ° C hvis nødvendigt.
  6. Fragmentering, ende reparation, 3' adapter ligatur, Reverse transkription
    1. Udføre proceduren som beskrevet af producentens protokol (fragmentering og slutningen reparation, 3' adapter ligatur og reverse transkription).
  7. SIDE rensning af cDNA
    1. Forberede prøverne, RNA kontrol og stigen til side rensning: Mix 10 µL af hver prøve og RNA kontrol med 10 µL denatureringen gel ladning farvestof, henholdsvis. Forberede en alikvot stige (4 µL 20/100 stigen, 1 µL nukleasen-gratis vand, 5 µL denatureringen gel ladning farvestof). Indlæse det mellem hver prøve og kontrol til at forhindre crosscontamination.
    2. Denaturere prøver og stigen ved at inkubere ved 95 ° C i 5 min og umiddelbart sted på is. Indlæse 20 µL af hver prøve (valgfrit, belastning 10 µL og fryse resterende prøver ved 20 ° C) adskilt af 10 µL af rede stige op på en 10% polyacrylamid/7 - 8 M urea/TBE gel. Indlæse 10 µL af RNA kontrol. Kør gelen, indtil den blå bromophenol trækker helt ud af gel (180 V, ~ 60 min).
    3. Pletten gel efter producentens protokol ved 4 ° C. Brug en mørk-felt transilluminator, der udsender blåt lys for at visualisere RNA og punktafgifter gel skiver til hver prøve, svarende til ~ 70-80 nt.
    4. Fortsæt som beskrevet i trin 4.5.5 - 4.5.8 og resuspend hver prøve i 10 µL nukleasen-gratis vand.
  8. cDNA Circularization
    1. Forberede alle reaktioner nok circularization master mix ved at kombinere de følgende reagenser til hver prøve på ice: 4.0 µL Circularization mastermix, 2.0 µL ATP, 2.0 µL frihedsbevægelse2og 2,0 µL Ligase.
    2. Tilføje 10 µL af den master mix til hver prøve. Bland forsigtigt og centrifugeres kort. Inkuber prøver ved 60 ° C i 2 h. straks sted prøver på is.
  9. PCR-amplifikation
    1. Følg producentens protokol (trin 1-3, PCR-amplifikation) til PCR-amplifikation. Brug 4 µL af circularized cDNA for forstærkning med 9 PCR cyklusser for primære T-celler til at opnå de bedste resultater.
    2. Rense biblioteker og kontrollere deres størrelse fordeling, producentens protokol (trin 4-8, PCR-amplifikation). Den forventede størrelse af den forstærkede bibliotek er 140-160 bp (Se figur 4).
    3. For sekventering biblioteker, henvises til fabrikantens protokol og sekventering facilitet for yderligere vejledning.

5. chIP-Seq

Bemærk: Denne protokol er ændret fra Blecher-Gonen, mfl. 14 vedrører deres protokol for yderligere infomation om ChIP-FF. For alle metoder og gang i træk punkter skal prøver fra det samme udgangspunkt pulje af celler.

  1. Crosslinking og høst cellerne
    1. Bitmapgenkendelse passende antal celler (Se tabel 2 for anbefalede T celle numre) for hvert tidspunkt med en endelig koncentration på 1% formaldehyd i et cellspecific medie (f.eks.suppleres med RPMI til T-celler) i 10 min ved stuetemperatur med blide vuggende. Stop crosslinking reaktionen ved tilsætning af glycin til en endelig koncentration på 0,125 M.
    2. Centrifuge celler på 330 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten og vaske cellerne i iskold PBS. Gentag trin 5.1.2 to gange og fryse celle pellets ved-80 ° C. Frosne pellets kan opbevares i mindst 6 måneder.
  2. Celle Lysis og ultralydbehandling
    Bemærk: Under alle celle lysis og ultralydbehandling trin, prøver skal holdes på is eller ved 4 ° C at minimere bitmapgenkendelse tilbageførsel og protein nedbrydning.
    1. Resuspend celle pellets i 1 mL iskold celle lysisbuffer med frisk tilføjet proteasehæmmere at isolere kerner (tilføje fosfatase hæmmere valgfrit). Der inkuberes i 10 min på is og centrifugeres ved 2.600 x g i 5 min. ved 4 ° C.
    2. Opsug supernatanten og resuspend kerner pellet i 1 mL iskold kerner lysisbuffer med frisk tilføjet proteasehæmmere (Valgfrit: tilføje fosfatase hæmmere). Der inkuberes i 10 min. på køl. Der sonikeres celler for at generere en gennemsnitlig DNA størrelse brøkdel af 0,2 - 1,0 kb (Se figur 5).
      Bemærk: Sonikering betingelser skal optimeres ifølge celletype og yderligere betingelser (f.eks.celle nummer, diskenheden og buffer). Sonikering for 20-25 cykler anbefales for primære T-celler (Se materialer til detaljeret beskrivelse).
    3. Tag en 20-50 µL alikvot af afrevne kromatin og varme i 10 min. ved 95 ° C og 1000 rpm ryste for at udføre en hurtig baglæns bitmapgenkendelse og kontrollere kromatin størrelse. Tilsættes 2-5 µL Proteinase K og der inkuberes i 20 min. ved 56 ° C og 1000 rpm ryster. Udføre varme inaktivering for 10 min. ved 95 ° C og 1000 rpm ryster. Rense kromatin med en passende kit (Se Tabel af materialer). Kontroller kromatin størrelsen på en 1%-agarosegel og bruge 100 bp Plus markør.
    4. Der centrifugeres afrevne kromatin med en gennemsnitlig DNA størrelse brøkdel af 0,2 - 1,0 kb i 10 min på 20.000 x g og 4 ° C for at pellet uopløselige kromatin og debris. Overføre supernatanten til en ny tube og holde på is.
    5. Holde 5-10% af sonicated kromatin som input. Fryse ved-20 ° C (bruges i trin 5.5.2).
  3. Par antistof til perler
    1. Par 10 µg antistof (f.eks.anti-RNA Pol II anti-Histon H3K36me3) i 220 µL PBS (med 0,5% BSA og 0,5% Tween 20) til 80 µL superparamagnetisk perler koblet til G-protein (Se Tabel af materialer) i mindst 1 time ved stuetemperatur med rotation.
    2. Sted rør på en magnet. Vent, indtil alle perler er bundet til magneten og Fjern supernatanten. Yderligere blok med 6 µL sonicated laks sæd DNA i PBS (med 0,5% BSA og 0,5% Tween 20) i 30 min. ved stuetemperatur med rotation.
    3. Sted rør på en magnet. Vent, indtil alle perler er bundet til magneten og fjern den klare supernatanten. Vask perler med ChIP IP buffer tre gange.
  4. Kromatin Immunoprecipitation
    1. Fortynd kromatin til 1 mL samlede volumen i kerner lysisbuffer med frisk tilføjet proteasehæmmere (valgfrit, tilføje fosfatase hæmmere). Tilføje ChIP IP buffer med frisk tilføjet proteasehæmmere (valgfrit, tilføje fosfatase hæmmere) til en endelige mængden af 3 mL. Holde på is eller ved 4 ° C, mens antistof er koblet til perlerne.
    2. Tilsæt fortyndede kromatin til antistoffet kombineret perler fra trin 5.3.3 og Ruger over nat ved 4 ° C med blide rotation.
    3. Vask med følgende buffere (1 mL hver, se Tabel af materialer) ved stuetemperatur i 5 min. med rotation, placere rør tilbage på magneten og Fjern supernatanten: Wash Buffer I, vaske Buffer II, vaske Buffer III og 2 x TE pH 8,0 henholdsvis.
    4. Kassér supernatanten og lufttørre for ~ 5 min.
  5. Omvendt crosslinking
    1. Fjerne prøver fra magneten. Tilsæt 50 µL eluering buffer og bland af pipettering for at eluere protein-DNA komplekser fra glasperler.
    2. Omfatte input stikprøveudvælgelsen fra dette skridt fremad. Tilføje eluering buffer for at input stikprøveudvælgelsen for en endelige mængden af 50 µL (for at holde buffer sammensætningen svarer til ChIP prøver) og processen sammen med ChIP prøver.
    3. Mix 3 µL af eluering buffer og 2 µL af RNase (DNase gratis). Tilsæt 5 µL af blandingen til hver prøve og Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.
    4. Mix 2.5 µL proteinase K, 1 µL glykogen og 1,5 µL eluering buffer pr. prøve. Tilsæt 5 µL af blandingen til hver prøve (1 U proteinase K og 20 µg glykogen pr. prøve) og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C.
    5. Inkuber prøver på 65 ° C natten over (mindst 4 h) med ryste for at udføre reverse crosslinking.
    6. Sted rør på magnet for mindst 30 s og overførsel supernatanten til en ny tube. Prøver kan fryses ved-20 ° C i op til 12 måneder.
  6. DNA oprensning
    1. Tilføje 140 µL af godt spredte Paramagnetiske perler til 60 µL af prøven (2.3:1 ratio). Omhyggeligt pipetteres op og ned 25 gange blandes grundigt. Sikre, at væsken i hver tube er homogen. Inkuber ved stuetemperatur i 2 min. rør på magnet for 4 min, eller indtil alle perlerne er bundet til magneten, og supernatanten.
    2. Forlade rørene på magneten og tilføje 200 µL af frisklavede 70% ethanol. Inkuber rør til 30 s uden at forstyrre perlerne. Supernatanten og Gentag dette trin en gang mere. Opsug ethanol helt og lad den Paramagnetiske perler lufttørre i 4 min.
      Bemærk: Ufuldstændige ethanol fjernelse kan seriøst reducere DNA opsving og udbytte. Tørre pellet, kun indtil det er tørt. Over tørring pellet kan reducere DNA opsving og udbytte.
    3. Fjerne rør fra magneten og tilføje 20 µL 10 mM Tris-HCl (pH 8.0). Forsigtigt afpipetteres i hele volumen op og ned 25 gange blandes grundigt. Der inkuberes i 2 min. ved stuetemperatur. Sted rør tilbage på magnet for 4 min og overføre supernatanten til et andet rør.
    4. Måle mængden af DNA med en egnet fluorometer (Se Tabel af materialer).
    5. Kontrollere chippen lykkedes af qPCR (fortyndet 1 µL i 100 µl H2O og brug 2-5 µL til qPCR). Brug specifikke primere for en positiv (kendte bindingssted protein af interesse) og negativ kontrol (f.eks., et gen, der er tavs og/eller ikke et mål af protein af interesse).
      Bemærk: Bibliotek forberedelse kan udføres med 2 ng af ChIP DNA afhængigt af sættet (Se Tabel af materialer til et forslag om hvilke kit til brug).

Representative Results

4 sU mærkning: kontrollere optimal 4 sU-mærkning betingelser (apoptose, nukleare stress, cytoplasmatisk stress), tid og koncentration: Høje niveauer af 4sU kan hæmme produktion og forarbejdning af rRNA og fremkalde cytoplasmatisk samt nukleare stress30. Celler af interesse bør derfor testes for 4sU-induceret stress samt apoptose. Western blot analyse anbefales til at visualisere p53 ophobning, som angiver nukleare stress, phospho-EIF2a stigende, som vise cytoplasmatisk stress og fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) analyse for apoptose. Høje niveauer og langvarig udsættelse for 4sU eller stoffer som thapsigargin eller arsenite kan bruges til at fremkalde cellulært stress. For at inducere apoptose eller celle død, celler blev behandlet med BH3I-1 (500 ng/µL) eller rugede i 5 min. ved 95 ° C (heat shock). Annexin V/7-ald farvning blev brugt til at bestemme apoptotiske (Annexin V) og døde (7-AAD) celler. Mærkning af in vitro- genereret primære Th1 celler til 0,5 h med 500 µM 4sU (endelig koncentration) eller 1 h med 200 µM 4sU heller ikke fremkalder tegn på cellulært stress eller apoptose (figur 1) men medføre tilstrækkelig 4sU vedtægter.

RNA mærkning tid kan også afkortes (≤5 min) der fører til en stigning i kortlivede intronic sekvenser i forhold til længere mærkning gange. For at visualisere co-transcriptional splejsning satser, bør mærkning af 4sU gange ikke overstige 30 min. For yderligere oplysninger om 4sUlabeling, henvises til Rädle mfl. 19

Kvalitetskontrol: RNA integritet er af stor betydning, når behandling RNA. Det er mest praktisk at tjekke 4sU-mærket RNA RNA kvalitet efter biotinylation af electrophoretical analyse (Se Tabel af materialer). Overveje at kontrollere isolerede RNA fra trin 2.2.2, især når du bruger det til sekvensering af total RNA. RNA integritet nummer (RIN) bør være ≥8 at sikre RNA integritet til yderligere forarbejdning (figur 3).

Electrophoretical analyse kan også bruges til at kontrollere nyligt transskriberede RNA. Vær opmærksom på at nyligt transskriberede RNA indeholder betydeligt mindre modne rRNAs sammenlignet med total RNA med de typiske rRNA bands er langt mindre fremtrædende.

Ribosomet profilering: PCR-amplifikation af cDNA bibliotek: cDNA forstærkning (trin 4.9.1) er et afgørende skridt til at sikre god sekventering resultater. Analysere forstærket biblioteker af electrophoretical analyse. En god prøve af forstærkede biblioteker viser et peak omkring 140-160 bp (figur 4A). Store mængder af adapter dimerer bør undgås (figur 4B), og disse prøver bør være renset yderligere ved hjælp af proceduren side rensning efter producentens protokol (side oprensning af PCR produkter). For meget skabelon eller for mange PCR cyklusser kan medføre overdreven forstærkning karakteriseret ved fremkomsten af højere end forventet molekylvægt bands, smurt PCR produkter og adapter dimer produkter (figur 4 c). For de fleste prøver vil 1-5 µL af circularized cDNA og 9 PCR cyklusser for forstærkning typisk give tilstrækkelige mængder af den korrekte PCR produkt.

ChIP: kromatin klipning: Optimal klipning betingelser skal være justeret for hver type celle. Bestemme klipning betingelser (fx, antal cyklusser, høj eller lav power) på forhånd. Brug det samme antal celler og den samme lydstyrke til testformål, eftersom en lavere celle tæthed øger klipning effektiviteten. Prøv at undgå over - eller under-klipning af kromatin. Store kromatin fragmenter kan drastisk påvirke ChIP resultater ved tilstopning, og over klipning kan ødelægge epitoper på protein af interesse, fører til en lavere bindende effektivitet af antistoffet. I dette eksperiment, de bedste resultater blev opnået, når den vigtigste fraktion af den afrevne kromatin var omkring 1.000 bp eller lidt lavere (figur 5A).

Kontrol af ChIP af qPCR: Før du starter chippen, det er tilrådeligt at teste, hvis de anvendte antistoffer er velegnet til ChIP (brug om muligt ChIP grade antistoffer) af ChIP-qPCR. Kontrollere ChIP til sekvensering af qPCR før du starter bibliotek forberedelse (Se trin 5.6.5). Design primere, som binder til et kendt målwebsted protein af interesse. Hvis målwebstedet nøjagtige inden for et gen er ukendt, kan flere primer par bruges til at scanne genet og tilhørende regulerende elementer. For RNAPII ChIP af Th1 celler, Ifng, som er transcriptionally upregulated ved stimulation, og aktin primere kan bruges som en positiv kontrol. Sox9 og insulin tjene som en negativ kontrol, da disse gener ikke er udtrykt i Th1 celler (figur 5B). Husk ikke at bruge exon-spænder primere, som normalt anvendes til qPCR af mRNA. En IgG kontrol kan også bruges til at bevise specificitet af de anvendte antistof. Immunoprecipitated DNA kan måles med en egnet fluorometer (Se Tabel af materialer). Mængder af nonspecifically bundne DNA af kontrolelementet IgG bør være markant lavere i forhold til DNA beløb bundet af antistof af interesse.

Replikater: bevis for biologisk betydning: Det anbefales kraftigt at udføre den kinetiske eksperiment for alle metoder med udgangspunkt i den samme pulje af celler til at sikre celler har det samme identitet for alle ubehandlede og behandlede prøver (figur 2). Dog anbefales det at tage små prøver af vigtigste tidspunkter for hver metode til at sammenligne prøver til en biologisk replikat (f.eks.af qPCR, FACS analyse). Dette giver mulighed for et groft skøn, hvis behandlingen for begge replikater var reproducerbare og du kunne gå videre med sekvensering. Validering af replikater bør udføres ved hjælp af bioinformatical analyse. Reproducerbarhed af resultaterne kan vurderes med hensyn til korrelation mellem FPKM værdier mellem replikater og visualiseres ved hjælp af scatter parceller (figur 6).

Figure 1
Figur 1: Kontrol af optimale 4sU-mærkning betingelser uden forstyrrende celle fysiologi (figur fra Davari mfl. 11)
(A) påvisning af celle apoptose af FACS analyse: In vitro genereret Th0 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af 4sU (anført i parentes) til 0,5 h, 1 h og 2 h, henholdsvis. BH3I-1 behandling blev brugt til at inducere apoptose bestemmes af Annexin V, mens varme chok (5 min. ved 95 ° C) blev brugt til at fremkalde celledød bestemmes af 7-ald. (B) Western blot analyse for p53 af 4sU behandlet og aktiverede T-celler: prøver var mærket med 200 µM 4sU for den angivne tid i aktivisering, undtagen det 0,5 h tid der var mærket med 500 µM 4sU. (C) Western blot analyse af phospho-EIF2a og samlede EIF2a i aktiverede Th1 celler med samme mærkning betingelser som i (B). Thapsigargin blev anvendt som positiv kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skematisk oversigt over en kinetisk setup til at spore ændringer, genome-wide
Denne ordning illustrerer setup til at kombinere 4sU-FF., total RNA-FF., ribosomet profilering og ChIP-seq at studere genome-wide ændringer på celle behandling. Pool celler og afsætte de nødvendige antal celler for ubehandlet kontrol. Behandle resterende celler og opdele for hver metode og tid. Label ubehandlet/behandlede celler til 4sU-seq med 4sU som beskrevet. Tidspunkter og prøver for hver metode afhænge af den specifikke biologiske spørgsmål undersøges. Udtage prøver til hvert tidspunkt og metode, og følg den dedikerede del af protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kvalitetskontrol af 4sU-mærket RNA
Total RNA og biotinylated RNA fremstillet af aktiverede Th1 celler blev analyseret på en Bioanalyzer. 18s rRNA og 28S rRNA er vist og RNA integritet nummer (RIN) er givet ved instrumentet til at bestemme integritet af RNA. RIN bør ≥8 at sikre RNA integritet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Bioanalyzer profiler af ribosomet profilering biblioteker
(A) A god bibliotek: prøven viser et højdepunkt på den forventede størrelsesområde (140-160 bp) og ingen yderligere rensning er nødvendig. (B) dette eksempel viser overdreven adapter dimer forstærket produkt (120 bp) i forhold til den ønskede vare (140-160 bp). Dette bibliotek kræver yderligere rensning. (C) en over forstærket prøve: højere end forventet molekylvægt toppe og smurt PCR-amplikoner er synlige (angivet med pile). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Optimal kromatin størrelse efter klipning og verifikation af ChIP af qPCR
(A) Agarosen gel billede viser den optimale fragment størrelse af den afrevne kromatin fra tre prøver, der blev klippet til 25 cykler på en sonikator og renset som beskrevet før i protokollen. (B) Q-PCR resultaterne af en total RNAPII ChIP (anti-RNA Pol II, 8WG16, ab817) er repræsenteret som en procentdel af input. Ifng og aktin primere blev brugt som en positiv, mens Sox9 og Insulin er negative kontroller (begge gener ikke er udtrykt i aktiverede Th1 celler). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Sammenligning af biologiske replikater (figur fra Davari et al. 11)
Repræsentative scatter plot sammenligne udtryk værdier (FPKM) mellem replikater af nyligt transskriberede (4sU) RNA 4 h efter stimulation af aktiverede Th1 celler. Den grønne linje angiver lig FPKM værdier og rang korrelation er angivet i hvert enkelt observationsområde.

Varighed af mærkning (min) Anbefalede 4sU koncentration (µM)
120 100 - 200
60 200 - 500
15 - 30 500 - 1000
< 10 500 - 2000

Tabel 1: Anbefalede 4sU koncentrationer (fra Rädle, mfl. 19)
Rækken af anbefalede 4sU koncentrationer er indiceret til forskellige tidspunkter af mærkning.

Metode Cell antal RNA beløb
4sU-mærkning ≥2 x 107 ≥60µg
Ribosomet profilering ≥2 x107
ChIP-seq ≥2 x 107 - 3 x 107

Tabel 2: Ønskede mængde af primære T celler
Minimum af nødvendige primære T celler for hver metode. Beløbene kan være mindre, når du bruger andre celletyper.

Discussion

Analysere hele processen med genregulering er nødvendige for fuldt ud at forstå cellulære tilpasninger som reaktion på et specifikt stimulus eller behandling. Kombinere total RNA-FF., fører 4sU-FF., ribosomet profilering og ChIP-seq på forskellige tidspunkter til en omfattende analyse af de vigtigste processer af genregulering over tid. En dyb forståelse af biologiske processer er forpligtet til at definere den eksperimentelle opsætning samt optimale tidspunkter.

Da metoder til at studere genregulering forbedre hurtigt, kan disse protokoller tilpasses til hurtige ændringer. Ikke desto mindre, de giver de vigtigste metoder til at studere grundlæggende gen reguleringsmekanismer i nogen form for celle. Her diskuterer vi nogle af de faldgruber og fakta må man overveje, når du bruger disse metoder.

Celler: Cellerne skal være stærkt levedygtige, og hvis du bruger primær isolerede celler, renheden af cellepopulationer skal sikres (fxFACS analyse for primære T-celler). Selv lidt stressede celler kan påvirke resultaterne af disse meget følsomme sekventering metoder og sænke mængden af nyligt transskriberede eller oversat RNA og føre til uønskede udlæsninger af stressrespons i sekventering resultater. Centrifugering hastighed nævnt i denne protokol at sammenpresse cellerne er optimeret til primære T celler. Således, justere hastigheden efter celletype.

4 sU effekter på celle fysiologi: Ud over de førnævnte muligheder for kontrol minimal undertrykkelse af netbårne til cellulær fysiologi ved 4sU tilsætning, kan yderligere og/eller yderligere analyse udføres, især når celle numre er begrænset. Effekter på celle spredning kan testes ved at kontrollere den fordobling tid af celler ved blot at tælle mærket og umærket celler. Nucleolar stress induktion kan også blive testet ved at analysere celle morfologi via immunofluorescens farvning af nucleolin og kerner. For at yderligere kontrollere virkningen af 4sU, kunne ændrede globale genekspression måles ved at sammenholde læse tæller fra mærket total RNA til umærkede total RNA.

Celle numre: For in vitro- genereret T celler anbefaler vi at starte med mindst mængden af celler, der er angivet i tabel 2. Vælg passende tal pr. metode i henhold til typen celler. Da T-celler har mindre cytoplasma og RNA i forhold til andre celler, vil sandsynligvis lavere mængder af andre celler være tilstrækkeligt. For ChIP-FF. afhænger celle tal meget af antistof bruges og udtryk niveau af protein af interesse i cellerne. Histon eller RNAPII ChIP, kan færre celler bruges, celle tal skal øges når transkriptionsfaktorer bruges, især hvis de kommer til udtryk på et lavt niveau.

4 sU-mærkning og RNA biotinylation: Når du bruger vedhængende celler, kan 4sU mærkning rettes som beskrevet af Rädle al.. 19 da celler meget hurtigt at indarbejde 4sU, det kan føjes direkte til medium affjedring, tilhænger eller semi-vedhængende celler.

Det anbefales at starte i biotinylation med 60-80 µg af RNA. Ikke desto mindre, lavere mængder af RNA kan bruges, selv om vi ikke teste for mindre end 30 µg. Tilføj en coprecipitant (f.eks.GlycoBlue) Hvornår fældningen RNA hvis pellet er svært at se. Duffy et al. har også vist, at methylthiosulfonate-aktiveret biotin (MTS-biotin) mere effektivt reagerer med 4sU-mærket RNA end HPDP-biotin31. Derfor kan det være værd overvejer at skifte til MTS-biotin, navnlig for inddrivelse af små RNA'er, som har en tendens til at have færre uridine restprodukter (der henvises til den biotinylation protokollen som nævnt ved Duffy fl.; Se rensning af 4sU-mærket RNA, Eksperimentelle procedurer).

Inddrivelse af nyligt transskriberede RNA er det muligt at bruge Paramagnetiske perler eller RNA oprydning perler af dit valg. Altid tage i betragtning, at disse kits kan eller kan ikke rense for specifikke RNA'er. For eksempel, hvis du er interesseret i miRNAs, overveje at bruge specifikke kits til miRNA opsamling og sekventering.

Kvantificering af nyligt transskriberede RNA: For at nøjagtigt kvantificere nyligt transskriberede RNA, måling skal udføres af et egnet fluorometer (Se Tabel af materialer). Inden for 1 h af 4sU eksponering repræsenterer nyligt transskriberede RNA ca. 1-4% af total RNA. Nyligt transskriberede RNA 1 h mærket, aktiverede T celler består af ~ 90-94% af rRNA11.

Ribosomet profilering: Ved fastlæggelsen af metoden, vi har besluttet at bruge 1,5 x mængden af nukleasen end foreslog i den oprindelige protokol garanterer ordentlig fordøjelse. Også, ingen bivirkninger er blevet rapporteret til forhøjede mængder af nukleasen. Da det er ganske vanskeligt at overdigest RPFs, mens de er en del af RNA bundet af ribosomale proteiner, kan du stadig lidt forhøje beløbet for at titrere optimal nukleasen fordøjelsen.

Hvis mindre end 500 ng af RPF RNA blev inddrevet i trin 4.4.2, Gentag rRNA udtynding og pool renset RPFs med RNA Clean & koncentrator-5 kolonner. Alternativt kan du indlæse to identiske prøver ved siden af hinanden på gel (trin 4.5.3) og pool gel skiver under RNA eluering fra gel (trin 4.5.6).

Vi anbefaler, at skære i RPFs på en gel så stramt som muligt til de 28 og 30 nt bands. Dette hjælper med at fjerne uønskede fragmenter fra rRNAs og tRNAer, som senere vil blive en del af dit bibliotek og reducere sekventering læser for din RPFs.

Det anbefales også at undgå UV-lys under gel rensningen. Dette kan skabe rifter i RNA fragmenter, samt pyrimidin dimerer, der i sidste ende kan alvorligt påvirke bibliotek forberedelse og sekventering resultater.

Bibliotek forberedelse og sekventering af data: Ribosomet profilering protokollen gør det muligt for at generere en cDNA bibliotek egnet til sekvensering. Prøver genereret ved 4sU-mærkning kan bruges direkte til biblioteket forberedelse med enhver passende RNA sekventering kit. Siden nyligt transskriberede RNA, især når du bruger kort mærkning gange, måske endnu ikke polyadenylated, skal ingen poly-et udvalg udføres. I stedet anbefaler vi kraftigt rRNA udtynding at forhindre at reducere sekventering dybde for selve prøven. Ved hjælp af T-celler, vi startede med 400 ng af nyligt transskriberede og total RNA (afhængigt af kit, se materialer), udføres rRNA udtynding og reduceret cykler til PCR-amplifikation at minimere PCR bias. Biblioteket forberedelse kan udføres med mindre råvare. For at tage hensyn til biblioteket kompleksitet numre af PCR cykler skal optimeres.

For ChIP-seq findes der også mange kits til biblioteket forberedelse. I vores hænder bibliotek forberedelse arbejdede nå startende med 2 ng af ChIP DNA (Se materialer til et forslag om hvilke kit til brug). Sørg for at kontrollere indeks for color balance under sekvensering. Vi anbefaler en sekventering dybde af ≥40 x 106 læser hver for 4sU-FF., total RNA-FF., og ChIP-seq prøver og ≥80 x 106 læser til ribosomet profilering prøver. Sekventering dybden afhænger af prøven og downstream Bioinformatik analyse og bør overvejes nøje. For at analysere intronic læser til cotranscriptional splicing, 100 skal bp parret ende sekventering vælges.

Sekventering bias: Sekvensering er blevet guld standard ved fastsættelsen af de globale forandringer i transskription, translation eller transskription faktor bindende. Inden for de seneste år, eksisterende metoder blev skubbet til grænserne eller nye teknikker blev udviklet til sekvensering stadig mindre startbeløb af RNA. Dette kræver forstærkning af cDNA, der introducerer støj eller bias. For nylig, var unikke molekylære identifikatorer ((UMIS) velkommen) udviklet eksperimentelt identificere dubletter indført ved PCR. For nylig, blev det vist at (UMIS) velkommen bare mildt forbedre sekventering magt og falsk opdagelse sats for differential gen expression32. Ikke desto mindre, overveje at bruge unikke molekylære identifikatorer ((UMIS) velkommen) for alle sekventering biblioteker til kontrol for bibliotek kompleksitet, især når du starter med små mængder af RNA, og når mange PCR cyklusser er nødvendige.

Buffer og stamopløsninger: Alle buffere for 4sU-FF. og ribosomet profilering skal udarbejdes under streng RNase-fri betingelser ved hjælp af nukleasen-gratis vand. Det anbefales at købe pre-made nukleasen-fri NaCl, Tris-HCl, EDTA, natriumcitrat og vand. For at sikre nukleasen-fri betingelser, kan en RNase dekontaminering løsning bruges til at rense pipetter eller overflader. Alle buffere for ChIP-seq skal være mindst DNase-frit og kan opbevares ved stuetemperatur. Altid tilføje proteasehæmmere og eventuelt fosfatase hæmmere lige før brug og holde på is.

Bioinformatik: Analyse af alle sequencing data (dvs., ChIP-FF., RNA-FF. og ribsosome profilering) indebærer kvalitetskontrol (f.eks.ved hjælp af FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), adapter trimning (f.eks.med cutadapt20) efterfulgt af tilknytning til reference genom for celler under undersøgelsen. For RNA-seq data (både samlet og 4sU-FF.), såvel som ribosomet profilering data, er en splejset RNA-seq mapper påkrævet, såsom ContextMap 221. For ChIP-seq data unspliced tilpasninger er det tilstrækkeligt at bruge BWA-MEM22 . Genekspression kan beregnes ved hjælp af RPKM model (læser per Kilobase af Exon pr. Million fragmenter kortlagt)1, efter bestemmelse af læse tæller pr. gen ved hjælp af et program, f.eks. featureCounts23. For peak kald fra ChIP-seq data, en række programmer er tilgængelige, f.eks., MACS24 eller perle25. Yderligere kan downstream analyser udføres i R26, navnlig ved hjælp af værktøjer, som Bioconductor projekt27.

Her er en stor udfordring for integration af 4sU- og total RNA niveauer og translationel aktivitet fra ribosomet profilering normalisering. En klassisk tilgang til at løse dette problem er at normalisere til niveauer af hus-holder gener. For at reducere støj på grund af tilfældige udsving for individuelle hus-holder gener, anbefales det at ikke bare bruge et par hus-holder gener men median niveauer for et større sæt, fx den > 3.000 hus-holder gener udarbejdet af Eisenberg og Levanon28 . For beregning af RNA omsætning satser fra nøgletal af 4sU-til total RNA, normalisering er baseret på median omsætning satser (f.eks.under forudsætning af en RNA halveringstid på 5 h)29. Men da dette forudsætter ingen overordnede ændringer for hus-holder gener, vi anbefaler at bruge analyse tilgange uafhængigt af normalisering, fxkorrelation-baserede klynger af en tidsserie af forskellige datatyper til at identificere grupper af gener med forskellige adfærd i transskription og translation under aktiveringen. For en detaljeret beskrivelse af bioinformatical integrering af de forskellige datatyper henviser vi til den oprindelige publikation11.

Analyse af omsætning satser og data integration: En nyligt offentliggjort papir33 sammenligne halveringstider bestemmes af en multiplex gen kontrol (MGC) til globale metoder kunne vise at halveringstider korreleret bedst med dem, der opnås ved hjælp af metaboliske mærkning metoder i forhold til andre metoder (f.eks., generelle hæmning af transkription af narkotika). Men det bør nævnes, at forskellene mellem half-life beregninger kan opstå og har været beskrevet 15,34. Vi tegner sig for de fleste af de problemer og forskelle, der er indført ved stressrespons på grund af langvarig 4sU eksponering. Derfor er det nødvendigt at udelukke stressrespons indført ved 4sU-mærkning. Du kan yderligere validere omsætning satser, anbefaler vi brug af MGCs.

Derudover kunne et datasæt som genereret her også bruges til en mere Integrativ data analyse (f.eks., regulering af længe ikke-kodende RNA'er)35,36.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Lars Dölken for rådgivning til at etablere 4sU mærkning for primære T celler; Elisabeth Graf og Thomas Schwarzmayr for kritiske hjælp i biblioteket generationer og sekventering; Dirk Eick og Andrew Flatley for at give RNAPII og T-celle antistoffer; N. Henriette Uhlenhaut og Franziska Greulich for hjælp bibliotek forberedelse til ChIP-seq; Caroline C. Friedel blev støttet af tilskud FR2938/7-1 og CRC 1123 (Z2) fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG); Elke Glasmacher blev støttet af tilskud GL 870/1-1 fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) og den tyske Center for Diabetes forskning (DZD), Helmholtz Zentrum München.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4sU-labeling
4-thiouridine (100 mg) Carbosynth 13957-31-8 Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at –20°C in aliquots of 50-500 µl; do not refreeze.
1.5 ml safe-lock tubes Eppendorf 30121589 Optional
1.5 ml screw-top polypropylene tubes Sarstedt 72692005 Compatible with Dimethylformamide
15 ml tubes BD Falcon 352096 Compatible with Dimethylformamide
2.0 ml screw-top polypropylene tubes Sarstedt 72694005 Compatible with Dimethylformamide
50 ml tubes BD Falcon 352070 Compatible with Dimethylformamide
Agencourt RNAClean XP Beckman Coulter A63987 We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C
Chloroform Sigma Aldirch 372978 WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH
Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
Dithiothreitol (DTT) Roth 6908.1 Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh
Ethanol Merck 1.00983.1000
EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg) Pierce 21341 Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4°C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes.
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626
Isopropanol Merck 1.09634.1011
NaCl (5M) Sigma Aldrich 71386 Stock solution
nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0 Invitrogen 15575-020 Stock solution
Nuclease-free H2O Sigma Aldrich W4502 Stock solution
nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4 Lonza 51237 Stock solution
Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml) 5Prime 2302830 Use in step 1.3.4.
Polypropylene 15 ml centrifuge tubes Greiner Bio-One 188271 Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 × g
QIAzol Lysis Reagent (200 ml) Qiagen 79306 Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol)
Qubit RNA HS assay kit Life Technologies Q32852 Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11
RNeasy MinElute Kit Qiagen 74204 Optional; includes Buffer RLT
Sodium citrat Sigma Aldrich C8532 Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water
Tween 20 Sigma Aldrich P1379
µMacs Streptavidin Kit Miltenyi 130-074-101 Store at 4°C, includes µMacs columns used in step 1.4.6. (store at RT)
Cell viability and stress assay
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD Biosciences 559763 Optional
Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 Optional
p53 abcam ab26 Optional
p-EIF2a (Ser51) Cell Signaling 9721 Optional
BH3I-1 Sigma-Aldrich B 8809 Optional
Buffers
4sU Washing Buffer store at RT 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O
Biotinylation Buffer (10x) store at 4 °C 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4°C
RNA precipitation buffer store at RT 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.
Equipment
2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939BA
RNA 6000 Nano Kit Agilent 5067-1511 Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10
RNA 6000 Pico Kit Agilent 5067-1513 Optional
UV/VIS spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 1000 Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3
High-speed centrifuge Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3R Or equivalent equipment capable of reaching 13,000 × g
High-speed rotor Thermo Scientific Fiberlite F15-6 x 100y
Adaptors for 15 ml tubes
Refrigerated table-top centrifuge Eppendorf 5430 R Or equivalent.
Thermomixer Eppendorf Thermomixer C Or equivalent.
Magnetic stand Miltenyi Biotec 130-042-109 One stand holds 8 µMacs columns.
Ultra-fine scale Mettler Toledo ML204T Or equivalent.
E-Gel iBase Power System Invitrogen G6400UK For RNA gels; or equivalent.
E-Gel EX 1% agarose precast gels Invitrogen G4020-01 For RNA gels; or equivalent.
DynaMag-2 Magnet-1 each Life Technologies 12321D
RNaseZap Sigma R2020 Optional
TruSeq stranded total RNA library prep kit Illumina RS-122-2201 Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit
Nanodrop Thermo Scientific use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration
Ribosome Profiling
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) Illumina RPYSC12116 (Yeast)
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) Illumina RPHMR12126 (Mammalian)
Illustra MicroSpin S-400 HR Columns GE Healthcare 27-5140-01
RNA Clean & Concentrator-25 kit Zymo Research R1017
RNA Clean & Concentrator-5 kit Zymo Research R1015
Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) Illumina MRZG126 or MRZG12324
(High Sensitivity DNA Kit) Agilent Technologies 5067-4626 Already needed for 4sU-seq
All other consumables and equipment are listed in the User guide !!! Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels)
ChIP
10 mM Tris-HCl (pH 8.0) gereral lab supplier
100 bp Plus Marker Thermo Fisher SM0323
16 % Formaldehyde Thermo Fisher 28908 Add to a final concentration of 1 %
70% EtOH gereral lab supplier Always prepare fresh
Agarose gereral lab supplier
Agencourt RNAClean XP beads Beckman Coulter A63987 We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C
ChIP library preparation kit KapaBiosystems KK8504 Or use the kit of your choice
DNA low bind microcentrifuge tubes Eppendorf Z666548-250EA or equivalent
Dynabeads Protein G Invitrogen 10004D Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use
Glycine gereral lab supplier Prepare a 2M stock solution
Glycogen Roche 10-901-393-001
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4.
Phosphatase Inhibitor (PhosStop) Roche 4906837001 Add freshly to the buffer and keep on ice
Power SYBRgreen Master mix Thermo Fisher 4367659
Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free) Roche 11873580001 Add freshly to the buffer and keep on ice
Proteinase K Invitrogen 25530049
Qubit dsDNA HS Assay kit Invitrogen Q32851 Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer
Rnase, DNase free Roche 11-119915001
Salmon sperm (sonicated to around 100bp) Sigma D1626
TE pH 8.0 gereral lab supplier
Antibodies (ChIP grade if possible)
anti-RNA Pol II [8WG16] abcam ab817
anti-Histon H3K36me3 abcam ab9050
or antibody of interest
Buffers
Binding/Blocking buffer Store at RT PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20
Cell-Lysis buffer Store at RT 5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40
ChIP IP buffer Store at RT 0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7 mM NaCl
Elution buffer Store at RT up to 6 months 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS
Nuclei-Lysis buffer Store at RT 50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS
Wash buffer I Store at RT 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl
Wash buffer II Store at RT 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 500 mM NaCl
Wash buffer III Store at RT 0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 8.1
Equipment
2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939BA use this instrument for electrophoretical analysis
Nanodrop Thermo Scientific
Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml Diagenode C30010010
or tubes special for your sonication device
Bioruptor sonication device or sonication device of your choice Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 µl each tube)
Magnetic stand for tubes
Thermomixer
Agarose gel electrophoresis
Qubit Fluorometer Thermo Scientific Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
  2. Chavez, S., Garcia-Martinez, J., Delgado-Ramos, L., Perez-Ortin, J. E. The importance of controlling mRNA turnover during cell proliferation. Curr Genet. 62 (4), 701-710 (2016).
  3. Rutkowski, A. J., et al. Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection. Nat Commun. 6, 7126 (2015).
  4. Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).
  5. Carninci, P., et al. Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution. Nat Genet. 38 (6), 626-635 (2006).
  6. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  7. Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
  8. Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145 (4), 622-634 (2011).
  9. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
  10. Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67 (1), 45-54 (2014).
  11. Davari, K., et al. Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses. Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).
  12. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. 22 (10), 2031-2042 (2012).
  13. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
  14. Blecher-Gonen, R., Barnett-Itzhaki, Z., Jaitin, D., Amann-Zalcenstein, D., Lara-Astiaso, D., Amit, I. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
  15. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  16. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302 (2013).
  17. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
  18. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
  19. Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. J Vis Exp. (78), (2013).
  20. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  21. Bonfert, T., Kirner, E., Csaba, G., Zimmer, R., Friedel, C. C. ContextMap 2: fast and accurate context-based RNA-seq mapping. BMC Bioinformatics. 16, 122 (2015).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  23. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  24. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
  25. Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS Comput Biol. 8 (8), e1002638 (2012).
  26. Team, R. D. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , the R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).
  27. Huber, W., et al. Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor. Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).
  28. Eisenberg, E., Levanon, E. Y. Human housekeeping genes, revisited. Trends Genet. 29 (10), 569-574 (2013).
  29. Friedel, C. C., Dolken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol Biosyst. 5 (11), 1271-1278 (2009).
  30. Burger, K., et al. 4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response. RNA Biol. 10 (10), 1623-1630 (2013).
  31. Duffy, E. E., Rutenberg-Schoenberg, M., Stark, C. D., Kitchen, R. R., Gerstein, M. B., Simon, M. D. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Mol Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
  32. Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq. Sci Rep. 6, 25533 (2016).
  33. Baudrimont, A., et al. Multiplexed gene control reveals rapid mRNA turnover. Sci Adv. 3 (7), e1700006 (2017).
  34. Rabani, M., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
  35. Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs. Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).
  36. Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles. Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).

Tags

Genetik sag 133 4-thiouridine ribosomet profilering ChIP-FF. RNA-FF. nyligt transskriberet RNA genome-wide RNA forarbejdning splejsning cotranscriptional splicing oversættelse sats omsætningshastighed transskription faktor bindende
Real-time analyse af transskription faktor bindende, transskription, Translation og omsætning skal vises Global begivenheder under aktivering af cellulære
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davari, K., Lichti, J., Friedel, C.More

Davari, K., Lichti, J., Friedel, C. C., Glasmacher, E. Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation. J. Vis. Exp. (133), e56752, doi:10.3791/56752 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter