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Genetics

Analyse en temps réel du facteur de Transcription Binding, Transcription, traduction et chiffre d’affaires pour afficher des événements mondiaux au cours de l’Activation cellulaire

Published: March 7, 2018 doi: 10.3791/56752
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3
1Institute for Diabetes and Obesity (IDO), German Center for Diabetes Research (DZD), Helmholtz Zentrum München, 2Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-Universität München, 3Roche Pharma Research and Early Development, Large Molecule Research, Roche Innovation Center Penzberg
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole décrit l’utilisation de combinatoire de ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq et ribosomes profilage de lignées cellulaires et les cellules primaires. Il permet aux changements suivi de transcription-facteur contraignant, novo de transcription, l’ARN traitement, chiffre d’affaires et traduction au fil du temps et d’afficher le cours général des événements dans les cellules activées ou évolues rapidement.

Abstract

Lors de leur activation, les cellules changent rapidement leurs programmes fonctionnels et, partant, leur profil d’expression génique. Des changements massifs dans l’expression des gènes se produisent, par exemple, au cours de la différenciation cellulaire, morphogenèse et stimulation fonctionnelle (par exemple, l’activation des cellules immunitaires), ou après exposition à des médicaments et d’autres facteurs de l’environnement local. Selon le type de stimulus et de la cellule, ces changements se produisent rapidement et à tous les niveaux possible de la régulation génique. Afficher tous les processus moléculaires d’une cellule ayant répondre à un certain type de stimulation/drogue est une des tâches plus difficiles en biologie moléculaire. Nous décrivons ici un protocole qui permet l’analyse simultanée de plusieurs couches de régulation génique. Nous comparons, en particulier, facteur de transcription contraignant (chromatine-immunoprécipitation-séquençage (ChIP-seq)), transcription de novo (4-thiouridine-séquençage (4sU-seq)), traitement de l’ARNm et chiffre d’affaires ainsi que traduction (ribosome profilage). En combinant ces méthodes, il est possible d’afficher un plan détaillé et Génome-large d’action.

Séquençage RNA nouvellement transcrit est particulièrement recommandé lors de l’analyse rapidement adapter ou changer de système, car cela représente l’activité transcriptionnelle des gènes au cours de la durée d’exposition 4sU (qu’ils soient haut - ou diminuée). L’utilisation combinatoire de total RNA-seq et ribosomes profilage permet en outre le calcul des taux de rotation et de translation RNA. L’analyse bioinformatique des résultats de séquençage haut-débit permet de nombreux moyens pour analyse et interprétation des données. Les données générées permettent également de suivre co-transcriptional et alternative splicing, pour ne citer que quelques résultats possibles.

L’approche combinée décrite ici peut être appliqué pour les organismes différents modèles ou types de cellules, y compris les cellules primaires. En outre, nous fournir des protocoles détaillés pour chaque méthode utilisée, y compris des contrôles de qualité et discuter des problèmes et les pièges potentiels.

Introduction

Ces dernières années, RNA-sequencing (RNA-seq) est devenu l’outil standard pour analyser RNAs tous exprimés dans une cellule ou un organisme1. Toutefois, pour comprendre tout le processus d’adaptation en réponse à un stimulus/médicament spécifique des cellules, il est nécessaire de bien déterminer tous les processus sous-jacents, allant de la transcription de l’ARNm à transformation, rotation et translation. Des changements à court terme dans la transcription de l’ARN peine peuvent être mesurées par RNAseq total, étant donné que les changements de l’ARN total dépendent de facteurs p. ex. RNA demi-vies et activité transcriptionnelle, qui sont un mauvais modèle pour reflétant l’adaptation des cellules à effets environnementaux2,3. En effet, une variété de nouvelles techniques de séquençage ont été développés qui permettent une analyse des différentes étapes dans le processus de règlement de gène4 lorsqu’il est combiné à de la bonne manière. Ce protocole décrit comment combiner certaines techniques de séquençage plutôt facile à appliquer qui permettent le suivi de la réglementation des couches essentielles de l’ARNm de façon comparative. Pour analyser l’activité transcriptionnelle, diverses méthodes ont été décrites, comme Cap-analyse de gene expression (CAGE)5, élongation natif de séquençage (NET-seq) la transcription6et génome nucléaire exécuter-sur (GRO-seq)7 , 8, ainsi que bromouridine-séquençage (Bru-seq) et 4-thiouridine-séquençage (4sU-seq), qui utilisent des métabolites qui sont incorporées dans nouvellement transcrites RNA9,10, pour ne citer que quelques uns. Tandis que CAGE identifie le site d’initiation de la transcription exacte, NET-seq et GRO-seq fournissent des informations plus précises sur le sens de lecture et 4sU-seq (qui est la méthode décrite ici) détecte seulement nouvellement transcrites RNA. Cependant, 4sU-seq est très sensible et peut être appliqué à différentes périodes de temps de mesurer l’activité transcriptionnelle quantitative à changer activement les cellules, ainsi que des changements quantitatifs dans le traitement de l’ARNm (ce qui arrive dans les minutes)9, 11,12. En outre, 4sU-seq est idéal pour combiner avec RNA-seq pour calculer le taux de roulement du RNA pour gènes9. La transcription de l’ARNm est effectuée par l’ARN polymérase II (RNAPII), qui est à son tour influencé par une multitude de facteurs, tels que les facteurs de transcription, modifications d’histone et activateurs/répresseurs générales qui peuvent même faire partie de la transcription complexe. Pour tester comment de nombreuses régions de gène/promoteur/enhancer sont liées par un facteur, ChIP-seq a été développé, qui est maintenant la méthode standard à cet effet, en raison de nombreux anticorps disponibles dans le commerce13. Cependant, bien que ChIPseq donne une information claire sur où les facteurs de régulation bind, elle ne reflète pas si il a en effet conduit à des changements dans la transcription14. Par conséquent, produisant des ChIP-seq avec 4sU-seq est la combinaison idéale pour ces questions biologiques. Régulation de l’expression de gène peut également se produire à un stade ultérieur, étant donné que les niveaux d’ARNm et de protéines ne concordent pas nécessairement15,16, indiquant potentiellement important Règlementrelatifà le translationnelle ou poteau-de translation niveau, selon le contexte. Au cours de l’année 2011, ribosome profilage avait été tout d’abord associé RNA-seq et est maintenant la méthode de choix pour quantifier les changements qui se produisent rapidement en protéines, puisqu’il n’y a toujours des limites de sensibilité avec la spectrométrie de masse,17. En effet, tarifs de traduction obtenues par ces méthodes auraient dû être divulgués pour livrer une relativement bonne estimation des changements dans les taux de protéines (au moins mesurées pour les changements à long terme) et permettent une vue encore plus détaillée sur le processus de traduction, par exemple le détermination de la traduction de départ côté et parallèles encadre17. L’utilisation de combinatoire de toutes les quatre méthodes peut être utilisé en régime établi, entre les divers types de cellules, ou dans une série de temps l’expérience d’une évolution rapide cell11. Cette utilisation donne un aperçu de tout le génome de modifications dans la liaison de facteur de transcription qui influencent les RNA transcription, transformation et la traduction.

Protocol

Toutes les méthodes sont en conformité et la conformité avec les orientations institutionnelles, étatiques et fédérales de Helmholtz Zentrum München.

1. préparation

  1. Faire un plan détaillé de l’installation expérimentale incluant un calendrier, quand ajouter 4sU au milieu de culture cellulaire et quand récolter les cellules pour chaque méthode. Selon la question biologique, examiner attentivement les points dans le temps pour exemple de dessin, le temps de marquage 4sU et concentration (tableau 1).
    Remarque : Vérifier l’impact de 4sU sur la viabilité cellulaire et réponse au stress à l’avance (voir « Verify 4sU-étiquetage des conditions optimales » représentant résultats et Figure 1). Il est recommandé d’effectuer un test préliminaire de chaque méthode au moins un échantillon. Vérifier si la qualité et la quantité d’ARN/ADN est suffisant pour le séquençage en profondeur (voir dédié parties du protocole) et pratique rapide mais une manipulation douce des cellules pendant l’expérience.
  2. Calculer le nombre de cellules nécessaires pour chaque point de temps de chaque méthode (voir le tableau 2 pour une évaluation approximative lors de l’utilisation des cellules primaires de T). Aussi, pensez à séquencer moins d’échantillons d’ARN total que juste celui d’ARN 4sU (par exemple, juste pour les taux horaires point traduction ou renouvellement de l’ARN les taux devraient être calculés). Pour confirmer et vérifier la pertinence des résultats (recommandé), créez au moins un réplicat biologique.
    NOTE : Ce qui est important, pour toutes les méthodes et périodes consécutives, échantillons doivent être d’un même pool de départ des cellules. Au moins un chercheur dédié pour chaque méthode est recommandé.
  3. Préparer tout le nécessaire à l’avance (p. ex., aliquotés 4sU, cycloheximide, mammifères tampon de lyse et 1 % de formaldéhyde). Après addition de 4sU, évitez d’exposer les cellules à une lumière vive, car cela pourrait conduire à la réticulation d’ARN marqué 4sU au protéines cellulaires18.
  4. Mettre en commun toutes les cellules d’intérêt dans un ballon juste avant le traitement (Figure 2). Compter les cellules (par exemple, avec un hémocytomètre) et utiliser le montant requis pour le contrôle non traité de chaque méthode (n’oubliez pas d’également étiqueter le témoin non traité pour 4sU-seq avec 4sU). Traiter les cellules restantes et immédiatement divisé le nombre requis de cellules pour chaque point dans le temps et la méthode. Gérer les cellules aussi rapidement que possible afin de minimiser le stress dû à des changements de température ou de niveaux de CO2 .
    NOTE : par exemple, des échantillons sont prélevés 1 h, 2 h, 3 h après le traitement, puis un quart des cellules est utilisée pour témoin non traité et trois quarts sont utilisés pour la commande traitée.

2. marquage 4sU

Remarque : Ce protocole est modifié de Rädle, et al. 19 voir leur protocole pour toute information concernant le marquage métabolique avec 4sU. Pour toutes les méthodes et périodes consécutives, échantillons doivent provenir d’un même pool de départ des cellules.

  1. Début de l’étiquetage
    1. Dégel aliquotés 4sU juste avant utilisation. Ajouter 4sU à chaque point du temps directement sur le support contenant des cellules d’intérêt (voir tableau 2 pour les numéros de cellule T recommandée, moins ARN de 60 µg par point dans le temps), mélanger délicatement et remettre dans l’incubateur. Dispose restant 4sU (ne pas recongeler).
    2. À la fin de l’étiquetage, recueillir des cellules (par exemple, grattoir de cellules) et centrifuger à 330 x g pendant 5 min à 4 ° C dans des tubes en polypropylène (qui résistent à des forces g élevées). Aspirer moyen et ajouter le réactif pour ARN (≥ 1 mL par 3 x 106 cellules, voir matériaux pour recommandation d’utilisation) dans chaque tube. Resuspendre le culot (≥ 1 mL / 3 x 106 cellules) entièrement, incuber pendant 5 min à température ambiante (RT) et congeler les échantillons à-20 ° C. Échantillons peuvent être conservés à-20 ° C pendant au moins 1 mois.
      Mise en garde : Les réactifs utilisés pour l’isolement d’ARN sont extrêmement dangereux quand entrer en contact avec la peau ou les yeux. Les gère avec soin et examiner les consignes de sécurité.
  2. À l’aide de la préparation de RNA modification Protocole d’isolement ARN
    1. Ajouter 0,2 mL de chloroforme par 1 mL de réactif de l’ARN et bien mélanger en agitant pendant 15 s. procédez comme indiqué dans le protocole de marquage métabolique (étape 1-12, 2. À l’aide de la préparation de RNA modifié le protocole) de Rädle et al. 19
    2. Mesurer la concentration en ARN (voir Table des matières), selon les instructions du fabricant. Utilisez cet ARN pour total RNA-seq ainsi (Voir l’étape 3. Total RNA-seq) ou stocker à-80 ° C pendant au moins 1 mois.
  3. Biotinylation thiol-spécifique de l’ARN transcrit nouvellement
    1. Commencez par 30-80 µg d’ARN cellulaire total. 60 µg RNA devrait produire une quantité suffisante de l’ARN transcrit nouvellement.
    2. Préparer la réaction de l’étiquetage. Pipette dans l’ordre suivant (par µg RNA) : 1 µL 10 x Biotinylation tampon, 7 µL RNA (contenant 1 µg RNA dilué en exempte de nucléase H2O) et 2 µL biotine-HPDP (1 mg/mL). Ajouter biotine-HPDP dernier et mélanger immédiatement par pipetage. Envelopper les tubes avec du papier aluminium pour éviter l’exposition à une lumière vive. Voir l’analyse d’une alternative à la biotine-HPDP. Incuber à RT pendant 1,5 h avec rotation.
    3. Tubes d’approprié 2 mL de centrifugeuse (voir Table des matières) à 15 000 x g pendant 2 min. tous le biotinylé RNA Pipeter dans le tube de pré filé 2 mL, ajouter un volume égal de chloroforme et mélangent vigoureusement. Incuber pendant 2-3 min jusqu'à ce que les phases se séparer et les bulles commencent à disparaître.
    4. Centrifuger à 15 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Transvaser avec soin la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube.
    5. Répétez les étapes 2.3.3. et la 2.3.4. une fois. Ajouter 10 % du volume de NaCl (5 M) et un volume égal d’isopropanol à la phase aqueuse. Centrifuger à 20 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
    6. Ajouter qu'un volume égal fraîchement préparés 75 % d’éthanol. Centrifuger à 20 000 x g. jeter le surnageant, tourner brièvement et éliminer l’éthanol restant. Entièrement resuspendre dans 30-100 µL H2O (utilisation 1 µL H2O par 1 µg d’entrée ARN de l’étape 2.3.1) en mélangeant de la pipette.
    7. Vérifier l’intégrité des RNA par analyse électrophorétique, ou prélever une partie aliquote et vérifier plus tard.
  4. Séparation des nouvellement transcrites (marqué) et préexistant RNA (sans étiquette)
    1. Enlever les cordons paramagnétiques (voir Table des matières) de stockage de 4 ° C et laissez reposer pendant au moins 30 min pour les amener à température ambiante. Tampon de lavage 4sU de chaleur (3 mL par exemple) à 65 ° C.
    2. Préparer la solution le dithiothréitol (DTT) de 100 mM. Peser la TNT sur une échelle ultra fine et ajouter la quantité nécessaire d’eau exempte de nucléase. Préparez toujours frais. Utiliser 200 µL par échantillon.
    3. Chauffer les échantillons d’ARN biotinylé (1 µg/µL) à 65 ° C pendant 10 min à dénaturer et placer immédiatement sur la glace. Ajouter 100 perles de streptavidine µL à biotinylé RNA et incuber 15 min avec rotation à RT.
    4. Placez une colonne appropriée (voir Table des matières pour les recommandations) pour chaque échantillon dans le support magnétique et pré équilibrer chaque colonne avec du tampon de lavage 4sU mL 1 température ambiante.
      Remarque : Cela prendra environ 5-10 min. Si une des colonnes ne démarrez pas une vidange après 5 min, appuyer doucement sur le dessus de la colonne de son doigt ganté.
    5. Appliquer un mélange de RNA/perles au milieu de chaque colonne. Jeter le cheminement, sauf si RNA sans étiquette doit être récupéré. Dans l’affirmative, recueillir le cheminement et au moins le premier lavage. Effectuer la récupération de l’ARN, tel que décrit par Rädle et al. (étape 1-7, 7. Récupération d’ARN non étiqueté, indépendant)19.
    6. Laver trois fois avec 0,9 mL 4sU buffer de lavage (préchauffé à 65 ° C de l’étape 2.4.2.) et 0,9 mL RT 4sU lavage, respectivement.
    7. Utiliser des billes paramagnétiques pour récupérer les RNA nouvellement transcrite. Distribuer 400 µL de bien dispersés RT paramagnétiques des perles dans un tube par l’échantillon et les place sous chaque colonne. Éluer l’ARN nouvellement transcrite avec 100 µL 100 mM TNT. Attendez pendant 3 min et effectuer une deuxième élution avec 100 µL 100 mM TNT. (Facultatif : effectuer l’élution et récupération telle que décrite par Rädle et al.) 19
    8. Mix nouvellement transcrites RNA/perles soigneusement mélanger 10 fois la pipette et procéder selon les directives du fabricant. Éluer l’ARN en 11 µL exempte de nucléase H2O.Quantify ARN utilisant un fluorimètre approprié (voir la Table des matières). RNA peut être stockée à-80 ° C pendant au moins 1 mois.
      NOTE : Nouvellement transcrites RNA peut servir à préparer des banques d’ADNc pour l’ordonnancement de prochaine génération (voir Table des matières pour une suggestion sur quelle trousse utiliser) ou d’autres analyses en aval. 100 - 500 ng RNA sont suffisants pour la plupart des kits préparation bibliothèque (voir Discussion).

3. le montant total RNA-Seq

  1. Prendre directement la RNA de 4sU étiqueté RNA après préparation d’ARN avec le réactif modifié pour le protocole d’isolement ARN pour total RNA-seq (Voir l’étape 2.2.2)
  2. Pour la préparation de la bibliothèque, diluer une aliquote de RNA à une concentration finale de 50 à 100 ng / µL. utiliser le kit de même en ce qui concerne la préparation de la bibliothèque de l’ARN nouvellement transcrite. 100 - 500 ng RNA sont suffisants pour la plupart des kits préparation bibliothèque.

4. le ribosome de profilage

Remarque : Pour toutes les méthodes et les points de fois consécutive, les échantillons doivent être d’un même pool de départ des cellules. Pour obtenir des recommandations sur quel kit à utiliser, reportez-vous à la Table des matières.

  1. Préparation et l’isolement des ribosomes protégé des Fragments (PRSA) :
    1. Utiliser des quantités appropriées de cellules pour chaque point dans le temps (voir tableau 2 pour les numéros de cellule T recommandée). Traiter les cellules adhérentes avec cycloheximide tel que décrit dans le protocole du fabricant.
      ATTENTION : Cycloheximide est très toxique et peut provoquer des mutations. Éviter le contact avec la peau et inhalation.
    2. À frais virés et piscine non - ou semi - adherent cellules de chaque fois pointent dans un tube en polypropylène et ajuster la concentration finale de 1 x 106 cellules / mL de milieu spécifique des cellules (par exemple, RPMI complétée pour les lymphocytes T). Ajouter cycloheximide avec une concentration finale de 0,1 mg/mL, mélanger en retournant le tube en polypropylène et incuber pendant 1 min. cellules de Centrifuger pendant 5 min à 330 x g à 4 ° C. Aspirez le milieu et laver les cellules au moins 10 mL de PBS additionné de cycloheximide (concentration finale de 0,1 mg/mL).
    3. Cellules de Centrifuger pendant 5 min à 330 x g à 4 ° C. Aspirez le milieu et ajouter 100 µL de tampon de lyse des cellules de mammifères par 10 x 106 cellules. La composition de pipetage et d’expulser à travers une aiguille stérile de calibre 25 22 à lyser les cellules complètement.
    4. Transférer le lysat cellulaire dans un tube rafraîchies 1,5 mL. Incuber pendant 10 minutes sur la glace avec les inversions périodiques. Centrifuger pendant 10 min à 20 000 x g à 4 ° C, afin de clarifier le lysate. Transférer le surnageant dans un tube rafraîchies 1,5 mL.
    5. Préparer un 01:10 dilution de l’eau exempte de nucléase et lecture de260enregistrement un A à l’aide d’un spectrophotomètre lysate. Utiliser de l’eau exempte de nucléase comme un blanc et un 01:10 dilution de tampon de lyse des cellules de mammifères comme la norme. Calculer la concentration en/ml260A du lysat selon l’équation suivante :
      (Un260 lysat cellulaire - un260 mammifères tampon de lyse) x facteur de dilution 10 = un/de260ml
    6. Créer 200 µL d’extraits du lysat sur glace et poursuivez le traitement nucléase.
      NOTE : Éventuellement, préparer une aliquote de 100 µL d’ARN total, ajouter 10 µL de SDS de 10 % et mélanger. Conserver à 4 ° C et passer à la 4.3.2. L’utilisation d’ARN total de RNA marqué 4sU est recommandée (Voir l’étape 3. Total RNA-seq).
  2. Empreinte de ribosomes
    1. Effectuer le traitement nucléase immédiatement sans geler le lysate. Ajouter 7,5 unités de nucléases (inclus dans le kit recommandé) pour chaque A260 du lysat. Par exemple : 80 A260/ml lysat x 0,2 mL de lysat x 7,5 U/A260nucléase = 120 nucléase de U.
      NOTE : Titrer éventuellement la nucléase pour la digestion tel que décrit par le fabricant.
    2. Incubez la réaction nucléase pendant 45 min à ta avec un mélange doux. Gel 200 µL d’extraits du lysat à l’azote liquide et stocker à-80 ° C, ou arrêter la réaction de nucléase en ajoutant 15 inhibiteur de RNase µL à chaque aliquote de 200 µL et continuez au point 4.3.2.
  3. Purification du PRSA
    1. Débloquer un échantillon du PRSA nucléase digérée et ajouter 15 µL inhibiteur de RNase. Conserver les échantillons sur la glace.
    2. Purifier le PRSA selon le protocole du fabricant (purification de la colonne est recommandée) et mesurer la concentration d’ARN sur un spectrophotomètre.
  4. ARNr épuisement
    1. L’utilisation de 5 µg de PRSA purifiée pour l’épuisement de l’ARNr.
    2. Suivre le protocole du fabricant (Etape 1-2, appauvrissement de la couche primaire ARNr) pour l’épuisement de l’ARNr. Concentration d’ARN mesure d’ARNr appauvri F.p.i. sur un spectrophotomètre.
  5. PAGE de Purification du PRSA
    1. Utilisation 500 ng d’ARNr appauvri PRSA : pour la purification de la PAGE.
    2. Préparer le contrôle de l’ARN, des échantillons et échelle pour la purification de la PAGE. Mix 5 µL de contrôle de l’ARN et 5 µL dénaturation gel colorant dans un tube à microcentrifugation 0,5 mL de chargement. Mix 10 µL de chaque RPF avec 10 µL de dénaturation gel de chargement, respectivement. Préparer une échelle aliquote (4 µL 20/100 ladder, eau exempte de nucléase de 1 µL et 5 µL dénaturation gel colorant de chargement). Le charger entre chaque échantillon et de la lutte pour prévenir la contamination croisée.
    3. Dénaturer les échantillons et échelle en incubant à 95 ° C pendant 5 min et placer immédiatement sur la glace. Charger 20 µL de chaque échantillon (éventuellement charger 10 µL et gel restant échantillons à 20 ° C) séparés par 10 µL d’échelle préparé sur un gel de polyacrylamide-urée 12 % ou 15 %. Charger de 10 µL de contrôle de l’ARN. Exécutez le gel jusqu'à ce que la bande bleu de bromophénol atteigne le bas du gel (180 V, ~ 70 min) (Figure 3).
    4. Souillez le gel selon protocole du fabricant à 4 ° C. Utilisez un Transilluminateur fond noir qui émet une lumière bleue pour visualiser l’ARN. Tranches de gel pour chaque échantillon correspondant à ~ 28 et 30 de l’accise nt en longueur. Prenez le contrôle de l’ARN comme référence et d’accise il.
      NOTE : PRSA est à peine visibles. Tranches à la taille indiquée par le contrôle de l’ARN - contenant deux oligos de TN 28 et 30 de long -, même si les échantillons ne sont pas visibles de l’accise.
    5. Percez un trou dans le fond des tubes de microcentrifuge de 0,5 mL avec une aiguille stérile de calibre 20. Transférer chaque tranche de gel dans une éprouvette et tubes de lieu plafonné dans un tube de 1,5 mL. Centrifuger pendant 2 min à 12 000 x centrifugation de répétition g. si les tranches de gel ne sont pas complètement déchiqueter dans le tube de 1,5 mL.
    6. Éluer l’ARN de tranches de gel perturbé avec l’eau sans nucléase 400 µL d’acétate d’ammonium 40 µL (5 M) et 2 µL SDS (10 %) chaque nuit à 4 ° C.
    7. Transférer la boue à tubes filtre de 1,5 mL (fournis avec le kit recommandé) avec une pointe de pipette de 1 mL (bout de l’échelle-alésage ou self-made 1 mL pointe avec extrémité coupée). Centrifuger pendant 3 min à 2 000 x g pour séparer élué RNA de tranches de gel. Pipetez doucement la solution aqueuse dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 2 glycogène µL (fourni avec le kit recommandé) et 700 µL 100 % isopropanol et magasin à-20 ° C pendant au moins 1 h.
    8. Centrifuger à 4 ° C pendant 20 min à 13 000 x g. jeter surnageant. Laver le culot avec d’éthanol 80 % fraîchement préparée préalablement réfrigérées à 4 ° C pendant 10 min à 13 000 x surnageant Discard g. et sécher à l’air. Remettre en suspension de chaque échantillon dans 20 µL et le contrôle de l’ARN dans l’eau sans nucléase 8 µL. Conserver à-20 ° C si nécessaire.
  6. Fragmentation, réparation fin, 3' adaptateur ligature, Transcription inverse
    1. Effectuez la procédure telle que décrite par le protocole du fabricant (Fragmentation et réparation fin, 3' adaptateur la ligature et transcriptase inverse).
  7. PAGE de Purification du cDNA
    1. Préparer les échantillons, le contrôle de l’ARN et échelle pour la purification de la PAGE : Mix 10 µL de chaque échantillon et témoin de l’ARN avec 10 µL dénaturation gel colorant, de chargement, respectivement. Préparer une échelle aliquote (4 µL 20/100 ladder, 1 eau exempte de nucléase µL, 5 µL dénaturation gel colorant de chargement). Le charger entre chaque échantillon et de la lutte pour prévenir la contamination croisée.
    2. Dénaturer les échantillons et échelle en incubant à 95 ° C pendant 5 min et placer immédiatement sur la glace. Charger 20 µL de chaque échantillon (éventuellement charger 10 µL et gel restant échantillons à 20 ° C) séparés par 10 µL d’échelle préparé sur un 10 % polyacrylamide/7 - 8 M de gel urée/TBE. Charger de 10 µL de contrôle de l’ARN. Exécutez le gel jusqu'à ce que le bleu de bromophénol migre complètement hors gel (180 V, ~ 60 min).
    3. Souillez le gel selon protocole du fabricant à 4 ° C. Utilisez un Transilluminateur fond noir qui émet une lumière bleue pour visualiser l’ARN et les tranches de gel pour chaque échantillon correspondant à ~ 70-80 nt l’accise.
    4. Procéder comme indiqué au point 4.5.5 - 4.5.8 et remettre en suspension de chaque échantillon dans 10 µL d’eau exempte de nucléase.
  8. ADNc Circularization
    1. Préparer suffisamment mélange maître circularization pour toutes les réactions en combinant les réactifs suivants pour chaque échantillon sur la glace : 4,0 µL Circularization réaction Mix, 2,0 µL ATP, 2,0 µL MnCl2et 2.0 µL Ligase.
    2. Ajouter 10 µL du mélange maître à chaque échantillon. Mélanger doucement et centrifuger brièvement. Incuber les échantillons à 60 ° C pendant 2 h. immédiatement lieu d’échantillons sur la glace.
  9. Amplification par PCR
    1. Suivre le protocole du fabricant (étapes 1 à 3, amplification par PCR) pour l’amplification par PCR. Utilisez 4 µL d’ADNc ΦH1 pour l’amplification avec 9 cycles PCR pour les lymphocytes T primaires, pour obtenir les meilleurs résultats.
    2. Purifier les bibliothèques et vérifier leur granulométrie, selon le protocole du fabricant (étape 4-8, l’amplification par PCR). La taille attendue de la bibliothèque amplifiée est bp 140-160 (voir Figure 4).
    3. Pour les bibliothèques de séquençage, se référer au protocole du fabricant et de la facilité de séquencement pour d’autres directives.

5. chIP-Seq

Remarque : Ce protocole est modifié de Blecher-Gonen, et al. 14 voir leur protocole pour plus de renseignements au sujet de ChIP-Seq. Pour toutes les méthodes et les points de fois consécutive, les échantillons doivent être d’un même pool de départ des cellules.

  1. Réticulation et récolte des cellules
    1. Crosslink nombre adéquat de cellules (voir tableau 2 pour les numéros de cellule T recommandée) pour chaque point dans le temps avec une concentration finale de 1 % de formaldéhyde dans un milieu de Cell (p. ex., RPMI complétée pour les lymphocytes T) pendant 10 min à température ambiante avec le doux balancement. Arrêter la réaction de réticulation par l’addition de la glycine à une concentration finale de 0,125 M.
    2. Cellules de centrifugeuse à 330 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et laver les cellules dans du PBS glacée. Répétez l’étape 5.1.2 deux fois et congeler les granules des cellules à-80 ° C. Boulettes congelées peuvent être conservés pendant au moins 6 mois.
  2. Lyse des cellules et la Sonication
    Remarque : Durant toutes les étapes de sonication et de lyse cellulaire, échantillons doivent rester sur la glace ou à 4 ° C pour minimiser la dégradation inversion et protéines de réticulation.
    1. Remettre en suspension les granules des cellules dans le tampon de lyse de la cellule glacée 1 mL avec inhibiteurs de la protéase fraîchement ajouté pour isoler les noyaux (ajouter éventuellement les inhibiteurs de la phosphatase). Incuber pendant 10 min sur glace et centrifuger à 2 600 x g pendant 5 min à 4 ° C.
    2. Aspirer le surnageant et remettre noyaux culot en suspension dans le tampon de lyse de noyaux glacée 1 mL par inhibiteurs de protéase fraîchement ajouté (en option : ajouter des inhibiteurs de la phosphatase). Incuber pendant 10 minutes sur la glace. Laisser agir les cellules pour générer une fraction de taille moyenne ADN de 0,2 - 1,0 Ko (voir Figure 5).
      NOTE : Sonication conditions il fallait être optimisée en fonction du type de cellule et d’autres conditions (par exemple, le nombre de cellules, le volume et tampon). Pour les lymphocytes T primaires, sonication pour 20 à 25 cycles est recommandée (voir matériaux pour la description détaillée).
    3. Prenez un 20-50 µL aliquote de la chromatine cisaillée et chauffer pendant 10 min à 95 ° C et 1 000 tr/min, secouant pour effectuer un croisement de fichiers retour rapide et vérifier la taille de la chromatine. Ajouter 2 à 5 µL protéinase K et incuber pendant 20 min à 56 ° C et 1 000 tr/min secouant. Effectuer l’inactivation par la chaleur pendant 10 min à 95 ° C et 1 000 tr/min secouant. Purifier la chromatine avec un kit approprié (voir la Table des matières). Vérifier la taille de la chromatine sur un gel d’agarose à 1 % et utiliser 100 bp Plus marqueur.
    4. Centrifuger cisaillé la chromatine avec une fraction de l’ADN de 0,2 - 1,0 Ko pendant 10 min à 20 000 x g et 4 ° C de moyenne pour granulés de débris et la chromatine insoluble. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et rester sur la glace.
    5. Garder 5 à 10 % de la chromatine aux ultrasons comme entrée. Congeler à-20 ° C (utilisé à l’étape 5.5.2).
  3. Couple anticorps à perles
    1. Anticorps de couple 10 µg (p. ex., anti-RNA Pol II ; H3K36me3 anti-Histon) dans 220 µL de PBS (0,5 % de BSA et 0,5 % Tween 20) à 80 perles superparamagnetic µL, couplés aux protéines G (voir Table des matières) pendant au moins 1 h à température ambiante avec rotation.
    2. Placer les tubes sur un aimant. Attendez que toutes les perles sont liés à l’aimant et éliminer le surnageant. Autre bloc avec 6 µL sonication saumon sperme ADN dans du PBS (0,5 % de BSA et 0,5 % Tween 20) pendant 30 min à température ambiante avec rotation.
    3. Placer les tubes sur un aimant. Attendez que toutes les perles sont liés à l’aimant et éliminer le surnageant clair. Laver les perles avec un tampon puce IP trois fois.
  4. Immunoprécipitation de la chromatine
    1. Diluer la chromatine au volume total de 1 mL de tampon de lyse des noyaux avec des inhibiteurs de protéase fraîchement ajouté (éventuellement ajouter des inhibiteurs de la phosphatase). Ajouter IP puce tampon avec des inhibiteurs de protéase fraîchement ajouté (éventuellement ajouter des inhibiteurs de la phosphatase) pour un volume final de 3 mL. Rester sur la glace ou à 4 ° C tandis que les anticorps est couplé aux talons.
    2. Ajouter dilué la chromatine à l’anticorps couplé des perles de l’étape 5.3.3 et incuber pendant la nuit à 4 ° C, avec une légère rotation.
    3. Laver avec les tampons suivants (1 mL de chaque, voir Table des matières) à température ambiante pendant 5 min avec rotation, placer les tubes de retour sur l’aimant et éliminer le surnageant : lavage tampon j’ai laver tampon II, III de tampon de lavage et 2 x pH TE 8.0 respectivement.
    4. Jeter le surnageant et sécher pendant environ 5 min.
  5. Inverser la réticulation
    1. Prélèvement d’échantillons de l’aimant. Ajouter 50 µL de tampon d’élution et la composition de pipetage pour éluer complexes protéine-ADN de talons.
    2. Parmi les échantillons d’entrée de cette avancée. Ajouter le tampon d’élution d’entrée ou les échantillons pour un volume final de 50 µL (pour garder la composition du tampon similaire aux exemples ChIP) et traitez avec les échantillons de la puce.
    3. Mix 3 µL de tampon d’élution et 2 µL de RNase (DNase gratuit). Ajouter 5 µL du mélange dans chaque échantillon et incuber 30 min à 37 ° C.
    4. Mix 2,5 µL protéinase K, 1 glycogène µL et 1,5 µL de tampon d’élution par échantillon. Ajouter 5 µL du mélange dans chaque échantillon (1 U protéinase K et 20 µg de glycogène par échantillon) et incuber pendant 2 h à 37 ° C.
    5. Incuber les échantillons à 65 ° C pendant la nuit (au moins 4 h) avec agitation pour effectuer l’inverse de réticulation.
    6. Placer les tubes sur l’aimant pour au moins 30 s et transfert le surnageant dans un nouveau tube. Les échantillons peuvent être congelés à-20 ° C jusqu'à 12 mois.
  6. Purification d’ADN
    1. Ajouter 140 µL de billes paramagnétiques bien dispersés dans 60 µL de l’échantillon (rapport 2.3:1). Pipetter soigneusement et descendre 25 fois pour bien mélanger. Veiller à ce que le liquide contenu dans chaque tube est homogène. Incuber à température ambiante pendant 2 min. Place les tubes sur l’aimant pendant 4 min, ou jusqu'à ce que toutes les perles sont liés à l’aimant et éliminer le surnageant.
    2. Laisser les tubes sur l’aimant et ajouter 200 µL d’éthanol à 70 % fraîchement préparée. Incuber les tubes pendant 30 s sans déranger les perles. Jeter le surnageant et répétez cette étape une fois de plus. Aspirer l’éthanol complètement et laissez le paramagnétique perles sécher pendant 4 min.
      Remarque : Suppression incomplète de l’éthanol peut sérieusement réduire la récupération de l’ADN et rendement. Sécher le culot que jusqu'à ce qu’il soit sec. Le plomb peut réduire la récupération de l’ADN et sa sécheresse rendement.
    3. Retirer les tubes de l’aimant et ajouter 20 µL 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Pipetez doucement la totalité du volume haut et bas 25 fois pour bien mélanger. Incuber pendant 2 min à température ambiante. Remettez les tubes sur l’aimant pendant 4 min et transférer le surnageant dans un autre tube.
    4. Mesurer la quantité d’ADN avec un fluorimètre approprié (voir la Table des matières).
    5. Vérifier que la puce a été réussie par qPCR (diluer 1 µL dans 100 µL d’H2O et l’utilisation de 2 à 5 µl de qPCR). Utiliser des amorces spécifiques pour un positif (site de liaison connue de protéine d’intérêt) et le contrôle négatif (par exemple, un gène qui est silencieuse et/ou pas une cible de la protéine d’intérêt).
      NOTE : Preparation de la bibliothèque peut être réalisé avec 2 ng de puce ADN selon le kit (voir Table des matières pour une suggestion sur quel kit à utiliser).

Representative Results

4 sU étiquetage : vérifier optimale 4 conditions de marquage sU (apoptose, nucléaire stress, stress cytoplasmique), le temps et concentration : Des niveaux élevés de 4sU peuvent inhiber la production et la transformation des ARNr et induisent stress cytoplasmiques et nucléaires30. Par conséquent, cellules d’intérêt doivent être testés pour la contrainte induite par 4sU ainsi que l’apoptose. Analyse par Western blot est recommandée pour visualiser l’accumulation de p53, qui indique la tension nucléaire, augmenter les niveaux de phospho-EIF2a qui affichent stress cytoplasmique et fluorescence-lancée de cellules tri analyse (FACS) pour l’apoptose. Des niveaux élevés et une exposition prolongée à 4sU ou de drogues comme la thapsigargine ou arsénite permet d’induire le stress cellulaire. Pour induire l’apoptose ou la cellule de la mort, les cellules ont été traitées avec BH3I-1 (500 ng/µL) ou couvés pendant 5 min à 95 ° C (choc thermique). Annexine V/7-AAD coloration servait à déterminer apoptotiques (annexine V) et les cellules mortes (7-AAD). Étiquetage de in vitro généré des cellules Th1 primaires pour 0,5 h avec 500 µM 4sU (concentration finale) ou 1 h à 200 µM 4sU induit ni signes de stress cellulaire ni l’apoptose (Figure 1) mais à suffisamment 4sU incorporation.

RNA étiquetage temps peut également être raccourcie (plus de 5 min) qui conduit à une augmentation de courte durée intronic séquences par rapport aux plus étiquetage fois. Pour visualiser les tarifs de raccordement co-transcriptional, marquage 4sU fois ne doivent pas dépasser 30 min. Pour plus de détails sur 4sUlabeling, veuillez consulter Rädle et al. 19

Contrôle de la qualité : Intégrité de RNA est d’une grande importance lors du traitement des RNA. Il est plus commode vérifier la qualité de RNA d’ARN marqué 4sU après biotinylation par analyse suit (voir Table des matières). Envisager la vérification des ARN isolé de l’étape 2.2.2, surtout quand vous l’utilisez pour le séquençage de l’ARN total. RNA intégrité nombre (RIN) doit être ≥ 8 pour garantir l’intégrité de la RNA pour traitement ultérieur (Figure 3).

L’analyse suit peut également servir à vérifier RNA nouvellement transcrite. Sachez que RNA nouvellement transcrite contienne significativement moins mature rRNA par rapport à l’ARN total avec les bandes d’ARNr typique étant beaucoup moins important.

Ribosome profilage : amplification par PCR de l’ADNc : ADNc amplification (étape 4.9.1) est une étape essentielle pour assurer des résultats de séquençage bon. Analyser les bibliothèques amplifiés par l’analyse suit. Un bon échantillon des bibliothèques amplifiés montre un pic autour de 140-160 bp (Figure 4 a). Des quantités excessives d’adaptateur dimères doivent être évitée (Figure 4 b) et ces échantillons devraient être purifiées à l’aide de la procédure de purification PAGE selon le protocole du fabricant (purification de la PAGE des produits PCR). Modèle de trop ou trop de cycles PCR peuvent entraîner l’amplification excessive caractérisée par l’apparition de bandes de poids moléculaire plus élevé que prévu, diffuse des produits PCR et adaptateur dimère produits (Figure 4). Pour la plupart des échantillons 1-5 µL de l’ADNc ΦH1 et 9 cycles PCR amplification ne donneront généralement une quantité suffisante du produit PCR correct.

Puce : chromatine tonte : Des conditions optimales de cisaillement devant être ajustée pour chaque type de cellule. Déterminer à l’avance les conditions de cisaillement (p. ex., nombre de cycles, forte ou faible puissance). Utilisez le même nombre de cellules et le même volume pour l’essai, car une plus faible densité cellulaire augmente l’efficacité de cisaillement. Essayez d’éviter sur - ou sous-tonte la chromatine. Fragments de chromatine grand peuvent affecter dramatiquement de puce résultats de colmatage, et trop de cisaillement peut détruire des épitopes sur la protéine d’intérêt, conduisant à une efficacité plus faible de la liaison de l’anticorps. Dans cette expérience, les meilleurs résultats ont été obtenus lorsque la fraction principale de la chromatine cisaillée était d’environ 1 000 bp ou légèrement plus bas (Figure 5 a).

Vérifier le ChIP de qPCR : Avant de commencer la puce, il est conseillé de tester si l’anticorps utilisé est adapté pour la puce (si possible, utilisez des anticorps de grade puce) par ChIP-qPCR. Vérifier la puce pour le séquençage de qPCR avant de commencer la préparation de la bibliothèque (Voir l’étape 5.6.5). Amorces de conception qui se lient à un site connu de la protéine d’intérêt. Si on ne connaît pas le site cible exacte au sein d’un gène, plusieurs paires d’amorces permet d’analyser le gène et les éléments de régulation. RNAPII puce de Th1 cellules Ifng, qui est transcription augmentée lors de la stimulation, et amorces actine peuvent être utilisés comme témoin positif. SOX9 et insuline servent comme témoin négatif, étant donné que ces gènes ne sont pas exprimés dans les cellules Th1 (Figure 5 b). Rappelez-vous de ne pas utiliser les amorces couvrant exon, qui sont normalement utilisés pour qPCR de l’ARNm. Un contrôle d’IgG peut également servir pour prouver la spécificité de l’anticorps utilisé. Immunoprécipitée ADN peut être mesurée avec un fluorimètre approprié (voir la Table des matières). Quantités d’ADN lié de façon non spécifique par le contrôle de l’IgG devraient être significativement plus bas que la quantité d’ADN liée par l’anticorps d’intérêt.

Réplique : une preuve de signification biologique : Il est fortement conseillé de réaliser l’expérience cinétique pour toutes les méthodes à partir d’un même pool de cellules pour s’assurer que les cellules ont la même identité pour tous les échantillons non traités et traités (Figure 2). Néanmoins, il est recommandé de prendre de petites parties aliquotes des points principaux pour chaque méthode comparer les échantillons à une adaptation biologique (p. ex., par qPCR, analyse des FACS). Cela permet une estimation sommaire si le traitement pour les deux réplicats était reproductible et vous pourriez aller de l’avant avec le séquençage. Validation des répliques doit être exécutée au moyen de l’analyse de bioinformatical. Reproductibilité des résultats peut être évaluée en termes de corrélation entre les valeurs FPKM entre les répétitions et visualisés à l’aide de diagrammes de dispersion (Figure 6).

Figure 1
Figure 1 : Vérification des conditions optimales de marquage 4sU sans perturber la physiologie cellulaire (Figure de Davari et coll.. 11)
(A) de détection de l’apoptose des cellules par l’analyse de FACS : In vitro généré Th0 cellules ont été traitées avec différentes concentrations de 4sU (indiqués entre parenthèses) pour 0,5 h, 1 h et 2 h, respectivement. Traitement BH3I-1 a été utilisé pour induire l’apoptose déterminé par l’annexine V, alors que le choc thermique (5 min à 95 ° C) a été utilisé pour induire la mort cellulaire par 7-AAD. Analyse par Western blot (B) pour p53 de 4sU traités et cellules T activées : échantillons ont été marquées avec 200 µM 4sU pour l’heure indiquée d’activation, sauf le point de temps de 0,5 h qui a été étiqueté avec 500 µM 4sU. (C) immunobuvardage de phospho-EIF2a et EIF2a total dans les cellules Th1 activées avec les mêmes conditions de marquage que (B). Thapsigargine a été utilisée comme témoin positif. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Vue d’ensemble schématique d’une installation cinétique à suivre l’évolution du génome-large
Ce schéma illustre la configuration permettant de combiner 4sU-seq, total RNA-seq, profilage de ribosomes et ChIP-seq pour étudier l’évolution du génome-large sur le traitement des cellules. Mettre en commun les cellules et mettre de côté le nombre requis de cellules témoins non traités. Traiter les cellules restantes et partagé pour chaque point de méthode et de temps. Cellules d’étiquette n’est pas traité ou traité pour 4sU-seq avec 4sU tel que décrit. Points dans le temps et des échantillons pour chaque méthode dépendent de la question biologique spécifique en cours d’examen. Prélever des échantillons pour chaque point dans le temps et la méthode et suivre la partie dédiée du protocole. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : contrôle de la qualité de l’ARN marqué 4sU
Total RNA et biotinylés RNA obtenu à partir des cellules Th1 activées ont été analysés sur une Bioanalyzer. ARNr 18 s et ARNr 28 s sont montrés et nombre d’intégrité RNA (RIN) est donnée par l’instrument pour déterminer l’intégrité de l’ARN. RIN devrait être ≥8 pour garantir l’intégrité de la RNA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Bioanalyzer profils de ribosome profilage des bibliothèques
(A) A bonne bibliothèque : l’exemple montre un pic à la gamme de taille attendue (bp 140-160) et aucune purification plus poussée n’est nécessaire. (B), cet exemple montre le produit amplifié de dimère adaptateur excessive (120 bp) par rapport au produit souhaité (bp 140-160). Cette bibliothèque nécessite davantage de purification. (C) un échantillon trop amplifié : pics de poids moléculaire plus élevé que prévu et barbouillé amplimères PCR sont visibles (indiqué par des flèches). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Taille optimale de la chromatine après la tonte et la vérification de la puce de qPCR
(A) Agarose gel photo montre la taille optimale de fragment de la chromatine cisaillée de trois échantillons qui ont été cisaillées pour 25 cycles sur un sonicateur et purifiée comme décrit précédemment dans le protocole. (B) résultats Q-PCR d’une puce de RNAPII total (anti-RNA Pol II, 8WG16, ab817) est représenté comme un pourcentage de l’apport. IFNg et l’actine amorces ont été utilisées comme positif, tandis que Sox9 et l’insuline sont des témoins négatifs (les deux gènes ne sont pas exprimés dans les cellules Th1 activées). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Comparaison des biologiques réplique (Figure de Davari et al. 11)
Nuage de points représentant en comparant les valeurs de l’expression (FPKM) entre réplique de nouvellement transcrites (4sU) ARN 4 h après la stimulation des lymphocytes Th1 activés. La ligne verte indique des valeurs égales de FPKM et de corrélation des rangs est indiquée dans chaque parcelle.

Durée de l’étiquetage (min) Concentration recommandée 4sU (µM)
120 100 - 200
60 200 - 500
15 - 30 500 - 1000
< 10 500 - 2000

Tableau 1 : Les 4sU concentrations recommandées (de Rädle, et al. 19)
La gamme des concentrations recommandées 4sU est indiquée pour des moments différents de l’étiquetage.

Méthode Nombre de cellules Montant de RNA
4sU-étiquetage ≥ 2 x 107 ≥60µg
Profilage des ribosomes ≥2 x107
ChIP-seq ≥ 2 x 107 - 3 x 107

Tableau 2 : Montant requis de cellules primaires de T
Montant minimum des cellules de T primaires requis pour chaque méthode. Montant peut être moins si vous utilisez d’autres types de cellules.

Discussion

Analyse de l’ensemble du processus de règlement de gène est nécessaire pour bien comprendre les adaptations cellulaires en réponse à un stimulus spécifique ou un traitement. Combinant total RNA-seq, 4sU-seq, ribosome profilage et ChIP-seq à différents moments conduit à une analyse approfondie des principaux processus de régulation génique au fil du temps. Une compréhension approfondie des processus biologiques est nécessaire pour définir le montage expérimental, mais aussi les points dans le temps optimale.

Étant donné que les méthodes pour étudier la régulation génique améliorent rapidement, ces protocoles peuvent être adaptées aux changements rapides. Néanmoins, ils fournissent les moyens les plus importants pour l’étude des mécanismes de régulation génique base dans n’importe quel type de cellule. Ici, nous avons discuter de certains des pièges et des faits, il faut considérer lors de l’utilisation de ces méthodes.

Cellules : Les cellules doivent être très viables et, si vous utilisez des cellules isolées primaires, pureté des populations de cellules doit être garantie (p. ex., analyse des FACS pour des cellules primaires de T). Cellules même légèrement stressés peuvent influencer les résultats de ces méthodes de séquençage très sensible et abaisser la quantité de l’ARN transcrit ou nouvellement traduite et conduire à lectures non désirées de la réaction de stress dans les résultats de séquençage. La vitesse de centrifugation mentionnée dans le présent protocole pour granuler cellules est optimisée pour les cellules T primaires. Ainsi, régler la vitesse selon le type de cellule.

4 sU les effets sur la physiologie cellulaire : En plus des options susmentionnées pour vérifier une perturbation minime à physiologie cellulaire lors de l’addition de 4sU, analyse supplémentaire et/ou complémentaires peut être effectuée, surtout lorsque le nombre de cellules est limité. Effets sur la prolifération cellulaire peuvent être analysés en vérifiant le temps de doublement des cellules en comptant simplement les cellules marquées et non marquées. Induction de stress nucléolaire pourrait également être testée en analysant la morphologie des cellules par immunofluorescence souillant des noyaux et nucléoline. Pour vérifier l’impact de 4sU, expression de gène global pouvait être mesurée en corrélant lire des comtes de l’ARN total marqué à l’ARN total sans étiquette.

Nombre de cellules : Pour in vitro généré des cellules T, nous recommandons commençant par au moins la quantité de cellules indiquées dans le tableau 2. Choisissez un nombre suffisant selon la méthode selon le type de cellules. Étant donné que les cellules T ont moins cytoplasme et ARN par rapport aux autres cellules, des quantités plus faibles probables d’autres cellules sera adéquates. Pour ChIP-seq, nombre de cellules dépendre fortement l’anticorps utilisé et le niveau d’expression de la protéine d’intérêt dans les cellules. Pour les histones ou puce RNAPII, fewe cellules peuvent être utilisés, alors que le nombre de cellules nécessaire d’augmenter lorsque des facteurs de transcription sont utilisés, surtout s’ils sont exprimés à des niveaux faibles.

4 sU-étiquetage et biotinylation RNA : Lors de l’utilisation de cellules adhérentes, 4sU étiquetage peut être adressée comme indiqué par Rädle et al. 19 depuis 4sU très rapidement intégrer des cellules, il peut être ajouté directement au milieu de suspension, adhérentes ou cellules semi adhérentes.

Il est recommandé de commencer la biotinylation avec 60 à 80 µg d’ARN. Néanmoins, des quantités plus faibles de l’ARN peuvent être utilisées, même si nous n’ai pas tester pour moins de 30 µg. Ajouter un coprecipitant (par exemple, GlycoBlue) quelle précipitation RNA si la pastille est difficile à voir. Duffy et coll. ont également montré que biotine methylthiosulfonate-activé (MTS-biotine) plus efficacement réagit avec de l’ARN marqué 4sU que HPDP-biotine31. Par conséquent, il pourrait être utile envisagent de changer de MTS-biotine, en particulier, pour la récupération des petits ARN, qui ont tendance à avoir moins résidus uridine (se référer au protocole biotinylation mentionné par voir de Duffy et al. ; Purification d’ARN marqué 4sU, Procédures expérimentales).

Pour la récupération de l’ARN nouvellement transcrite, il est possible d’utiliser des billes paramagnétiques ou perles de RNA nettoyage de votre choix. Toujours tenir compte du fait que ces kits peuvent ou ne peuvent pas purifier d’ARN spécifiques. Par exemple, si vous êtes intéressé de miARN, envisagez d’utiliser des kits spécifiques pour séquençage et capture de miRNA.

Quantification de l’ARN transcrit nouvellement : Afin de quantifier précisément les RNA nouvellement transcrite, mesure doit être effectuée par un fluorimètre approprié (voir la Table des matières). Moins de 1 h d’exposition 4sU, RNA nouvellement transcrite représente environ 1 à 4 % de l’ARN total. ARN nouvellement transcrite de 1 h étiqueté, les lymphocytes T activés se compose de ~ 90-94 % des ARNr11.

Ribosome profilage : Lors de l’établissement de la méthode, nous avons déterminé que l’utilisation de 1.5 fois le montant de la nucléase que celle suggérée dans le protocole original garantit une bonne digestion. En outre, aucun effet indésirable n’ont été signalés pour des quantités élevées de nucléase. Car il est assez difficile d’overdigest la PRSA alors qu’ils font partie de l’ARN lié par les protéines ribosomales, vous pouvez augmenter encore légèrement le montant pour titrer la digestion nucléasique optimale.

Si moins de 500 ng d’ARN du FPR ont été récupérés à l’étape 4.4.2, répétez l’appauvrissement de l’ARNr et piscine purifiée PRSA avec ARN Clean & concentrateur-5 colonnes. Vous pouvez également charger deux échantillons identiques à côté de l’autre sur le gel (étape 4.5.3) et tranches de gel piscine pendant l’élution RNA du gel (étape 4.5.6).

Il est recommandé de couper le F.p.i. sur un gel aussi étroitement que possible aux bandes nt 28 et 30. Cela aide à éliminer les fragments non désirés d’ARNr et les ARNt, qui plus tard deviendra partie de votre bibliothèque et réduire le séquençage lectures pour votre PRSA.

Il est également recommandé d’éviter la lumière durant la purification du gel UV. Cela peut créer des pseudos dans les fragments d’ARN, mais aussi des dimères de pyrimidine, qui, en fin de compte, peuvent gravement affecter la préparation de la bibliothèque et les résultats du séquençage.

Préparation de la bibliothèque et le séquençage des données : Ribosome profilage de protocole permet de générer une banque d’ADNc convenant au séquençage. Généré par 4sU-étiquetage des échantillons peuvent être utilisés directement pour la préparation de la bibliothèque avec n’importe quel kit de séquençage ARN approprié. Depuis l’ARN nouvellement transcrite, surtout lorsqu’à l’aide de quelques fois, l’étiquetage peut pas encore polyadénylé, aucune sélection de poly-A ne doit être effectuée. Au lieu de cela, nous recommandons fortement de déplétion ARNr pour empêcher réduisant la profondeur de séquençage de l’échantillon réel. À l’aide de cellules T, nous avons commencé avec 400 ng d’ARN nouvellement transcrite et total (selon le kit, voir matériaux), jouée ARNr épuisement et réduit les cycles pour l’amplification PCR à minimiser le biais PCR. Preparation de la bibliothèque peut être réalisé avec des matériaux moins. Pour tenir compte de la bibliothèque complexité un nombre de cycles PCR doit être optimisé.

Pour ChIP-seq il y a aussi de nombreux kits disponibles pour la préparation de la bibliothèque. Dans notre bibliothèque de mains préparation a travaillé bien à partir de 2 ng de puce ADN (voir la documentation pour une suggestion sur quel kit à utiliser). N’oubliez pas de vérifier les indices pour la balance des couleurs pendant le séquencement. Nous vous recommandons une profondeur de séquençage au moins 40 x 106 lectures chaque 4sU-seq, total RNA-seq, et ChIP-seq échantillons et ≥80 x 106 lectures pour ribosome profilage des échantillons. La profondeur de séquençage dépend de l’échantillon et l’analyse bioinformatique en aval et sont à considérer avec précaution. Pour analyser les lectures intronic pour cotranscriptional l’épissure, 100 séquençage jumelé-fin de bp doit être choisi.

Séquençage biais : Le séquençage est devenu l’étalon-or lors de la détermination des changements globaux dans la transcription, la traduction ou la liaison de facteur de transcription. Au sein de ces dernières années, les méthodes existantes ont été poussés à leurs limites ou de nouvelles techniques ont été développées pour le séquençage de plus en plus petites quantités de départ de l’ARN. Pour cela, l’amplification de l’ADNc, qui introduit le bruit ou la partialité. Récemment, des identificateurs uniques moléculaires (UMIs) ont été développés pour identifier expérimentalement les doublons introduits par PCR. Récemment, il a été démontré que UMIs juste légèrement améliorent la puissance de séquençage et le taux de fausse découverte d’expression différentielle des gènes32. Néanmoins, envisagez d’utiliser des identificateurs uniques moléculaires (UMIs) pour toutes les bibliothèques de séquençage au contrôle pour la complexité de la bibliothèque, en particulier lors du démarrage avec de faibles quantités d’ARN et lors de nombreux cycles de PCR sont nécessaires.

Tampons et solutions de stock : Tous les tampons pour 4sU-seq et ribosomes profilage doivent être préparées dans des conditions strictes de RNase-libre à l’aide de l’eau exempte de nucléase. Il est recommandé d’acheter pré-faites NaCl exempte de nucléase, Tris-HCl, EDTA, citrate de sodium et d’eau. Afin d’assurer des conditions sans nucléase, une solution de décontamination de RNase peut être utilisée pour nettoyer les surfaces ou les pipettes. Tous les tampons pour ChIP-seq doivent être au moins exempte de DNase et peut être stocké à température ambiante. Toujours ajouter les inhibiteurs de protéase et, éventuellement, les inhibiteurs de la phosphatase juste avant utilisation et le garder sur la glace.

Bio-informatique : Analyse toutes les données de séquençage (c.-à-d., ChIP-seq, RNA-seq et ribsosome profilage) implique le contrôle de la qualité (par exemple, à l’aide de FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), règlage de l’adaptateur (par exemple, avec cutadapt20) suivie de mappage vers le génome de référence pour les cellules à l’étude. Pour les données de RNA-seq (total et 4sU-seq), ainsi que ribosome données de profilage, un mappeur de RNA-seq épissé est nécessaire, comme ContextMap 221. Des alignements de données unspliced ChIP-seq, à l’aide de BWA-MEM22 est suffisant. L’expression des gènes peut être calculée à l’aide de la RPKM modèle (lectures par kilobases de Exon par Million de Fragments mappé)1, après avoir déterminé lire des comptes par le gène à l’aide d’un programme, par exemple featureCounts23. Pour les appels de pic de données ChIP-seq, un certain nombre de programmes est disponible, par exemple, Mac24 ou GEM25. Autres analyses en aval peuvent être effectuées en R26, en particulier à l’aide des outils fournis par le projet de Bioconductor27.

Ici, un défi majeur dans l’intégration des niveaux d’ARN - 4sU et total et l’activité traductionnelle du ribosome profilage est normalisation. Une approche classique pour régler ce problème est de normaliser au niveau des gènes de maintien de la maison. Pour réduire le bruit dû aux fluctuations aléatoires des gènes individuels de maintien de la maison, il est recommandé d’utiliser non seulement quelques gènes de ménager mais niveaux médians pour un ensemble plus vaste, par exemple la > 3 000 gènes de ménager compilées par Eisenberg et Levanon28 . Pour le calcul du taux de roulement du RNA des ratios de 4sU-à QU'ARN total, normalisation est basé sur le chiffre d’affaires moyen taux (par exemple, en supposant une demi-vie de RNA de 5 h)29. Cependant, puisque cela ne suppose aucun changement global pour les gènes de maintien de la maison, nous recommandons l’utilisation d’approches d’analyse indépendante de la normalisation, par exemple, d’une série chronologique des types de données différents pour identifier les groupes de gènes de clustering basé sur corrélation avec un comportement distinct dans la transcription et la traduction lors de l’activation. Pour une description détaillée sur bioinformatical intégration des types de données différents, nous nous référons à l’origine de publication11.

Analyse de l’intégration de données et les taux de chiffre d’affaires : Un article récemment publié33 comparant les demi-vies déterminées par un contrôle de gène multiplexé (MGC) à des méthodes globales pourraient montrer que les demi-vies correspondent mieux avec ceux obtenus par des méthodes de marquage métaboliques par rapport aux autres méthodes (par exemple, inhibition générale de transcription de médicaments). Toutefois, il convient de mentionner que les différences entre les calculs de Half-Life peuvent survenir et ont été décrits 15,34. Nous représentent la majeure partie des problèmes et des différences qui sont introduites par la réaction de stress dus à l’exposition prolongée 4sU. Il est donc indispensable d’exclure de la réponse au stress introduite par 4sU-étiquetage. Afin de valider davantage le taux de roulement, nous recommandons l’utilisation du MSG.

En outre, un groupe de données généré ici pourrait également être utilisé pour un plus intégrative données analyse (p. ex., règlement d’ARN long non codantes)35,36.

Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Nous remercions Lars Dölken pour obtenir des conseils pour établir 4sU étiquetage pour les lymphocytes T primaires ; Elisabeth Graf et Thomas Schwarzmayr critique aidés à générations de bibliothèque et de séquençage ; Dirk Eick et Andrew Flatley pour fournir des anticorps RNAPII et les lymphocytes T ; N. Henriette Uhlenhaut et Franziska Greulich de l’aide en vue de la bibliothèque de ChIP-seq ; Caroline C. Friedel a été soutenu par les subventions FR2938/7-1 et CRC 1123 (Z2) de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) ; Elke Glasmacher était soutenue par la subvention GL 870/1-1 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) et le Centre allemand pour la recherche diabète (DZD), Helmholtz Zentrum München.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4sU-labeling
4-thiouridine (100 mg) Carbosynth 13957-31-8 Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at –20°C in aliquots of 50-500 µl; do not refreeze.
1.5 ml safe-lock tubes Eppendorf 30121589 Optional
1.5 ml screw-top polypropylene tubes Sarstedt 72692005 Compatible with Dimethylformamide
15 ml tubes BD Falcon 352096 Compatible with Dimethylformamide
2.0 ml screw-top polypropylene tubes Sarstedt 72694005 Compatible with Dimethylformamide
50 ml tubes BD Falcon 352070 Compatible with Dimethylformamide
Agencourt RNAClean XP Beckman Coulter A63987 We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C
Chloroform Sigma Aldirch 372978 WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH
Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
Dithiothreitol (DTT) Roth 6908.1 Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh
Ethanol Merck 1.00983.1000
EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg) Pierce 21341 Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4°C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes.
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626
Isopropanol Merck 1.09634.1011
NaCl (5M) Sigma Aldrich 71386 Stock solution
nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0 Invitrogen 15575-020 Stock solution
Nuclease-free H2O Sigma Aldrich W4502 Stock solution
nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4 Lonza 51237 Stock solution
Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml) 5Prime 2302830 Use in step 1.3.4.
Polypropylene 15 ml centrifuge tubes Greiner Bio-One 188271 Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 × g
QIAzol Lysis Reagent (200 ml) Qiagen 79306 Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol)
Qubit RNA HS assay kit Life Technologies Q32852 Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11
RNeasy MinElute Kit Qiagen 74204 Optional; includes Buffer RLT
Sodium citrat Sigma Aldrich C8532 Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water
Tween 20 Sigma Aldrich P1379
µMacs Streptavidin Kit Miltenyi 130-074-101 Store at 4°C, includes µMacs columns used in step 1.4.6. (store at RT)
Cell viability and stress assay
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD Biosciences 559763 Optional
Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 Optional
p53 abcam ab26 Optional
p-EIF2a (Ser51) Cell Signaling 9721 Optional
BH3I-1 Sigma-Aldrich B 8809 Optional
Buffers
4sU Washing Buffer store at RT 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O
Biotinylation Buffer (10x) store at 4 °C 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4°C
RNA precipitation buffer store at RT 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.
Equipment
2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939BA
RNA 6000 Nano Kit Agilent 5067-1511 Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10
RNA 6000 Pico Kit Agilent 5067-1513 Optional
UV/VIS spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 1000 Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3
High-speed centrifuge Thermo Scientific Heraeus Multifuge X3R Or equivalent equipment capable of reaching 13,000 × g
High-speed rotor Thermo Scientific Fiberlite F15-6 x 100y
Adaptors for 15 ml tubes
Refrigerated table-top centrifuge Eppendorf 5430 R Or equivalent.
Thermomixer Eppendorf Thermomixer C Or equivalent.
Magnetic stand Miltenyi Biotec 130-042-109 One stand holds 8 µMacs columns.
Ultra-fine scale Mettler Toledo ML204T Or equivalent.
E-Gel iBase Power System Invitrogen G6400UK For RNA gels; or equivalent.
E-Gel EX 1% agarose precast gels Invitrogen G4020-01 For RNA gels; or equivalent.
DynaMag-2 Magnet-1 each Life Technologies 12321D
RNaseZap Sigma R2020 Optional
TruSeq stranded total RNA library prep kit Illumina RS-122-2201 Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit
Nanodrop Thermo Scientific use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration
Ribosome Profiling
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) Illumina RPYSC12116 (Yeast)
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) Illumina RPHMR12126 (Mammalian)
Illustra MicroSpin S-400 HR Columns GE Healthcare 27-5140-01
RNA Clean & Concentrator-25 kit Zymo Research R1017
RNA Clean & Concentrator-5 kit Zymo Research R1015
Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) Illumina MRZG126 or MRZG12324
(High Sensitivity DNA Kit) Agilent Technologies 5067-4626 Already needed for 4sU-seq
All other consumables and equipment are listed in the User guide !!! Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels)
ChIP
10 mM Tris-HCl (pH 8.0) gereral lab supplier
100 bp Plus Marker Thermo Fisher SM0323
16 % Formaldehyde Thermo Fisher 28908 Add to a final concentration of 1 %
70% EtOH gereral lab supplier Always prepare fresh
Agarose gereral lab supplier
Agencourt RNAClean XP beads Beckman Coulter A63987 We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C
ChIP library preparation kit KapaBiosystems KK8504 Or use the kit of your choice
DNA low bind microcentrifuge tubes Eppendorf Z666548-250EA or equivalent
Dynabeads Protein G Invitrogen 10004D Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use
Glycine gereral lab supplier Prepare a 2M stock solution
Glycogen Roche 10-901-393-001
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4.
Phosphatase Inhibitor (PhosStop) Roche 4906837001 Add freshly to the buffer and keep on ice
Power SYBRgreen Master mix Thermo Fisher 4367659
Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free) Roche 11873580001 Add freshly to the buffer and keep on ice
Proteinase K Invitrogen 25530049
Qubit dsDNA HS Assay kit Invitrogen Q32851 Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer
Rnase, DNase free Roche 11-119915001
Salmon sperm (sonicated to around 100bp) Sigma D1626
TE pH 8.0 gereral lab supplier
Antibodies (ChIP grade if possible)
anti-RNA Pol II [8WG16] abcam ab817
anti-Histon H3K36me3 abcam ab9050
or antibody of interest
Buffers
Binding/Blocking buffer Store at RT PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20
Cell-Lysis buffer Store at RT 5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40
ChIP IP buffer Store at RT 0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7 mM NaCl
Elution buffer Store at RT up to 6 months 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS
Nuclei-Lysis buffer Store at RT 50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS
Wash buffer I Store at RT 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl
Wash buffer II Store at RT 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 500 mM NaCl
Wash buffer III Store at RT 0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 8.1
Equipment
2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939BA use this instrument for electrophoretical analysis
Nanodrop Thermo Scientific
Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml Diagenode C30010010
or tubes special for your sonication device
Bioruptor sonication device or sonication device of your choice Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 µl each tube)
Magnetic stand for tubes
Thermomixer
Agarose gel electrophoresis
Qubit Fluorometer Thermo Scientific Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA

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References

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Analyse en temps réel du facteur de Transcription Binding, Transcription, traduction et chiffre d’affaires pour afficher des événements mondiaux au cours de l’Activation cellulaire
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Davari, K., Lichti, J., Friedel, C. C., Glasmacher, E. Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation. J. Vis. Exp. (133), e56752, doi:10.3791/56752 (2018).

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