Summary
इस प्रोटोकॉल में सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं के लिए चिप-seq, 4sU-seq, कुल आरएनए-seq, और ribosome profile के मिश्रित उपयोग का वर्णन है । यह समय के साथ प्रतिलेखन फ़ैक्टर बाइंडिंग, de नोवो प्रतिलेखन, आरएनए प्रोसेसिंग, कारोबार और अनुवाद में परिवर्तन पर नज़र रखने में सक्षम बनाता है, और सक्रिय और/या तेजी से बदलती कोशिकाओं में घटनाओं के समग्र पाठ्यक्रम प्रदर्शित
Abstract
सक्रियण पर, कोशिकाओं को तेजी से अपने कार्यात्मक कार्यक्रमों को बदलने और, जिससे, उनके जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल । जीन अभिव्यक्ति में बड़े पैमाने पर परिवर्तन, उदाहरण के लिए, सेलुलर भेदभाव, morphogenesis के दौरान, और कार्यात्मक उत्तेजना (जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सक्रियकरण के रूप में), या दवाओं और स्थानीय वातावरण से अंय कारकों के लिए जोखिम के बाद हो । उत्तेजना और कोशिका के प्रकार पर निर्भर करता है, इन परिवर्तनों को तेजी से होते है और जीन विनियमन के किसी भी संभव स्तर पर । उत्तेजना के एक निश्चित प्रकार के लिए एक प्रतिक्रिया सेल के सभी आणविक प्रक्रियाओं को प्रदर्शित/आणविक जीवविज्ञान में सबसे कठिन कार्यों में से एक है । यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि जीन विनियमन के कई परतों के एक साथ विश्लेषण सक्षम बनाता है का वर्णन । हम विशेष रूप से तुलना, प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी (क्रोमेटिन-immunoprecipitation-अनुक्रमण (चिप-seq)), de नोवो प्रतिलेखन (4-thiouridine-अनुक्रमण (4sU-seq)), mRNA प्रसंस्करण, और कारोबार के रूप में अच्छी तरह के रूप में अनुवाद (ribosome profile). इन तरीकों के संयोजन से, यह कार्रवाई की एक विस्तृत और जीनोम व्यापक पाठ्यक्रम प्रदर्शित करने के लिए संभव है ।
अनुक्रमण नव लिखित आरएनए विशेष रूप से सिफारिश की है जब तेजी से अनुकूलन या सिस्टम को बदलने, विश्लेषण के बाद से यह 4sU जोखिम के समय के दौरान सभी जीन की transcriptional गतिविधि को दर्शाया गया है (चाहे वे कर रहे है या downregulated) । कुल आरएनए-seq और ribosome profile के मिश्रित उपयोग आरएनए कारोबार और अनुवाद दरों की गणना की अनुमति देता है । उच्च प्रवाह अनुक्रमण परिणाम के Bioinformatic विश्लेषण के विश्लेषण और डेटा की व्याख्या के लिए कई साधन के लिए अनुमति देता है । उत्पंन डेटा भी ट्रैकिंग सह transcriptional और वैकल्पिक ब्याह, बस कुछ संभावित परिणामों का उल्लेख करने के लिए सक्षम बनाता है ।
संयुक्त दृष्टिकोण यहां वर्णित विभिंन मॉडल जीवों या कक्ष प्रकार, प्राथमिक कोशिकाओं सहित के लिए लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, हम प्रत्येक विधि के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, गुणवत्ता नियंत्रण सहित, और संभावित समस्याओं और नुकसान पर चर्चा ।
Introduction
हाल के वर्षों में, आरएनए-अनुक्रमण (आरएनए-seq) एक कोशिका या एक जीव1के भीतर सभी व्यक्त RNAs का विश्लेषण करने के लिए मानक उपकरण बन गया है । हालांकि, एक विशिष्ट उत्तेजना के जवाब में अनुकूल कोशिकाओं की पूरी प्रक्रिया को समझने के लिए/दवा, यह पूरी तरह से सभी अंतर्निहित प्रक्रियाओं, प्रसंस्करण, कारोबार, और अनुवाद करने के लिए mRNA प्रतिलेखन से लेकर निर्धारित करने के लिए आवश्यक है । आरएनए प्रतिलेखन में अल्पकालिक परिवर्तन शायद ही कुल RNAseq द्वारा मापा जा सकता है, के बाद से कुल आरएनए के परिवर्तन कारकों पर निर्भर करते हैं जैसे आरएनए आधा जीवन और transcriptional गतिविधि, जो कोशिकाओं के अनुकूलन को प्रतिबिंबित करने के लिए एक गरीब टेम्पलेट हैं पर्यावरणीय प्रभाव2,3. वास्तव में, नए अनुक्रमण तकनीक की एक किस्म विकसित किया गया है कि जीन विनियमन4 की प्रक्रिया में जब सही तरीके से संयुक्त में विभिंन चरणों का एक विश्लेषण की अनुमति । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे कुछ नहीं बल्कि आसानी से लागू अनुक्रमण तकनीक है कि एक तुलनात्मक तरीके से mRNA की आवश्यक परतों के विनियमन पर नज़र रखने की अनुमति गठबंधन के लिए । transcriptional गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए, तरीकों की एक किस्म का वर्णन किया गया है, जैसे कि टोपी विश्लेषण के रूप में जीन अभिव्यक्ति (पिंजरे)5, देशी बढ़ाव प्रतिलिपि अनुक्रमण (NET-seq)6, और जीनोम-वाइड परमाणु रन पर (मूह-seq)7 , 8, साथ ही bromouridine अनुक्रमण (बरू-seq) और 4-thiouridine-अनुक्रमण (4sU-seq), जो चयापचयों कि नव लिखित आरएनए9में शामिल कर रहे हैं का उपयोग करें,10, बस कुछ उल्लेख करने के लिए. जबकि पिंजरे सटीक प्रतिलेखन शुरू साइट की पहचान करता है, नेट-seq और मूह-seq दिशाओं पढ़ने के बारे में अधिक सटीक जानकारी देने, और 4sU-seq (जो विधि यहां वर्णित है) केवल नए लिखित आरएनए का पता लगाता है । हालांकि, 4sU-seq अत्यधिक संवेदनशील है और सक्रिय रूप से बदलती कोशिकाओं में मात्रात्मक transcriptional गतिविधि को मापने के लिए, साथ ही mRNA प्रोसेसिंग में मात्रात्मक परिवर्तन (जो मिनटों में होता है)9, के लिए विभिंन समय फ़्रेम में लागू किया जा सकता है, 11,12. इसके अलावा, 4sU-seq आरएनए के साथ गठबंधन करने के लिए आदर्श है-seq के लिए आरएनए कारोबार दरों की गणना करने के लिए9. mRNA की प्रतिलेखनी आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय (RNAPII) द्वारा किया जाता है, जो इस तरह के प्रतिलेखन कारकों, हिस्टोन संशोधनों के रूप में कारकों की एक भीड़ से प्रभावित बारी में है, और सामान्य उत्प्रेरक/दमन कि भी transcriptional का हिस्सा हो सकता है परिसर. कितने जीन/प्रमोटर/बढ़ाने क्षेत्रों का परीक्षण करने के लिए एक कारक से बंधे हैं, चिप-seq विकसित किया गया है, जो अब इस प्रयोजन के लिए मानक विधि है, कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी13के कारण । हालांकि, हालांकि ChIPseq जहां विनियमन कारकों को बांध पर स्पष्ट जानकारी देता है, यह प्रतिबिंबित अगर यह वास्तव में प्रतिलेखन में परिवर्तन की ओर जाता नहीं है14। इसलिए, 4sU-seq के साथ चिप seq प्रदर्शन ऐसे जैविक प्रश्नों के लिए आदर्श संयोजन है । जीन अभिव्यक्ति का विनियमन भी बाद के चरण में हो सकता है, क्योंकि mRNA और प्रोटीन के स्तर को जरूरी15,16सहसंबंधी नहीं बनाना, शोधों या पद-शोधों पर संभावित महत्वपूर्ण नियमन का संकेत स्तर, संदर्भ के आधार पर । वर्ष 2011 में, ribosome रूपरेखा पहले आरएनए-seq के साथ संयुक्त किया गया था और अब परिवर्तन है कि तेजी से प्रोटीन में होते हैं, के बाद से वहाँ अभी भी जन स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ कुछ संवेदनशीलता सीमा कर रहे हैं करने के लिए पसंद की विधि है17. वास्तव में, अनुवाद इस तरह के तरीकों से प्राप्त दरों को प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन का एक अपेक्षाकृत अच्छा अनुमान देने दिखाया गया है (कम से अधिक लंबी अवधि के परिवर्तन के लिए मापा) और अनुवाद की प्रक्रिया पर एक भी अधिक विस्तृत देखने की अनुमति, उदा स्टार्ट-साइड और वैकल्पिक अनुवाद का निर्धारण17फ्रेम । सभी चार विधियों का मिश्रित उपयोग स्थिर अवस्था में, विभिंन सेल प्रकारों के बीच, या एक समय में तेजी से बदलते सेल11के धारावाहिक प्रयोग में इस्तेमाल किया जा सकता है । यह उपयोग आरएनए प्रतिलेखन, प्रसंस्करण, और अनुवाद को प्रभावित करने वाले प्रतिलेखन कारक में परिवर्तन का एक जीनोम चौड़ा सिंहावलोकन प्रदान करता है ।
Protocol
सभी तरीके Helmholtz ज़ेंत्रम München संस्थागत, राज्य और संघीय दिशानिर्देशों के अनुरूप और अनुपालन में हैं ।
1. तैयारी
- एक समय अनुसूची सहित प्रयोगात्मक सेटअप की एक विस्तृत योजना बनाओ, जब सेल संस्कृति माध्यम में 4sU जोड़ने के लिए, और जब प्रत्येक विधि के लिए कोशिकाओं फसल के लिए । जैविक प्रश्न के आधार पर, सावधानीपूर्वक नमूना आरेखण, 4sU-लेबलिंग समय, और एकाग्रता (तालिका 1) के लिए समय बिंदुओं पर विचार करें ।
नोट: अग्रिम में सेल व्यवहार्यता और तनाव प्रतिक्रिया पर 4sU के प्रभाव की पुष्टि करें (देखें "सत्यापित इष्टतम 4sU-लेबलिंग शर्तों" प्रतिनिधि परिणामों में और चित्रा 1) । यह करने के लिए अनुशंसित है प्रत्येक विधि के एक प्रारंभिक परीक्षण करने के लिए कम से एक नमूना । सत्यापित करें कि आरएनए/डीएनए की गुणवत्ता और राशि गहरी अनुक्रमण के लिए पर्याप्त है (प्रोटोकॉल का समर्पित भागों देखें), और प्रयोग के दौरान कोशिकाओं की तेजी से लेकिन कोमल हैंडलिंग का अभ्यास । - प्रत्येक विधि के प्रत्येक समय बिंदु के लिए आवश्यक कक्षों की संख्या परिकलित करें (प्राथमिक T कक्षों का उपयोग करते समय किसी न किसी अनुमान के लिए तालिका 2 देखें) । इसके अलावा, बस 4sU आरएनए की तुलना में कुल आरएनए के कम नमूनों sequencing पर विचार (उदा., बस समय बिंदु अनुवाद दर या आरएनए कारोबार दरों के लिए गणना की जानी चाहिए). पुष्टि करने के लिए और परिणामों के महत्व को सत्यापित करने के लिए (अनुशंसित), कम से एक जैविक प्रतिकृति बनाएं ।
नोट: महत्वपूर्ण रूप से, सभी विधियों और लगातार समय बिंदुओं के लिए, नमूने कक्षों की एक ही प्रारंभिक पूल से होना चाहिए । प्रत्येक विधि के लिए कम से एक समर्पित शोधकर्ता की सिफारिश की है । - पहले से आवश्यक सब कुछ तैयार करें (उदा, aliquoted 4sU, cycloheximide, स्तनधारी Lysis बफ़र, और 1% formaldehyde) । 4sU के अलावा, चमकदार रोशनी के लिए कोशिकाओं को उजागर करने से बचें, के रूप में यह सेलुलर प्रोटीन के लिए 4sU-लेबल आरएनए के crosslinking के लिए नेतृत्व कर सकते हैं18.
- पूल एक कुप्पी में ब्याज की सभी कोशिकाओं को सिर्फ उपचार से पहले (चित्रा 2) । कक्षों को गिनना (उदा., किसी hemocytometer के साथ) और प्रत्येक विधि के अनुपचारित नियंत्रण के लिए आवश्यक राशि का उपयोग करें (4sU-seq के लिए अनुपचारित नियंत्रण को 4sU के साथ लेबल करना न भूलें) । शेष कोशिकाओं का इलाज और तुरंत प्रत्येक समय बिंदु और विधि के लिए कक्षों की आवश्यक संख्या को विभाजित । तापमान या सह2 स्तरों में परिवर्तन के कारण तनाव को कम करने के लिए जितनी जल्दी हो सके कोशिकाओं को संभालें ।
नोट: उदाहरण के लिए, नमूने 1 h, 2 h, और 3 h के उपचार के बाद लिया जाता है, तो कक्षों की एक चौथाई अनुपचारित नियंत्रण के लिए उपयोग किया जाता है, और तीन तिमाहियों का इलाज नियंत्रण के लिए उपयोग किया जाता है ।
2.4sU-लेबलिंग
नोट: इस प्रोटोकॉल Rädle, एट अलसे संशोधित किया गया है । 19 4sU के साथ चयापचय लेबलिंग के बारे में अधिक जानकारी के लिए अपने प्रोटोकॉल को देखें । सभी विधियों और लगातार समय बिंदुओं के लिए, नमूने कक्षों की एक ही प्रारंभिक पूल से शुरू करना होगा ।
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लेबलिंग का प्रारंभ
- गल aliquoted 4sU बस प्रयोग अघि । ब्याज की कोशिकाओं से युक्त माध्यम करने के लिए सीधे एक बार बिंदु पर 4sU जोड़ें (अनुशंसित टी सेल संख्या के लिए तालिका 2 को देखें, समय बिंदु प्रति कम से 60 µ g आरएनए), धीरे मिश्रण, और वापस मशीन में जगह है । निपटारा बाँकी 4sU (reफ्रीज़ नहीं) ।
- लेबलिंग के अंत में, कोशिकाओं को इकट्ठा (उदा., सेल खुरचनी) और 5 मिनट के लिए 330 x जी में 4 डिग्री सेल्सियस से कम में (जो उच्च जी बलों का विरोध) । महाप्राण माध्यम और आरएनए अलगाव के लिए रिएजेंट जोड़ें (≥ 1 एमएल प्रति 3 एक्स 106 कोशिकाओं, प्रत्येक ट्यूब के लिए सिफारिश जो उपयोग करने के लिए सामग्री देखें) । पूरी तरह से गोली reसस्पेंड (≥ 1 एमएल प्रति 3 एक्स 106 कोशिकाओं), कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन (आरटी), और-20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने फ्रीज । नमूनों में-20 डिग्री सेल्सियस से कम 1 महीने के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
सावधानी: आरएनए अलगाव के लिए इस्तेमाल किया एजेंट त्वचा या आंखों के साथ संपर्क में हो रही है जब बेहद खतरनाक हैं । देखभाल के साथ इन संभाल और सुरक्षा के निर्देश पर विचार करें।
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आरएनए तैयारी संशोधित आरएनए आइसोलेशन प्रोटोकॉल का उपयोग
- आरएनए अलगाव के लिए 1 मिलीलीटर एजेंट प्रति 0.2 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म जोड़ें, और चयापचय लेबलिंग प्रोटोकॉल (चरण 1-12, 2 में उल्लेख के रूप में 15 एस के लिए झटकों से अच्छी तरह से मिश्रण । आरएनए तैयारी संशोधित trizol प्रोटोकॉल का उपयोग कर) Rädle एट अलसे । 19
- ( सामग्री की तालिकादेखें), निर्माता के निर्देशों के अनुसार) आरएनए एकाग्रता उपाय. कुल आरएनए-seq के लिए इस आरएनए का उपयोग करें के रूप में अच्छी तरह से (चरण 3 देखें । कुल आरएनए-seq) या स्टोर पर-80 ° c कम से कम 1 महीने के लिए ।
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नव लिखित आरएनए के Thiol-विशिष्ट Biotinylation
- कुल सेलुलर आरएनए के 30-80 µ g के साथ प्रारंभ करें । 60 µ g आरएनए नव लिखित आरएनए की पर्याप्त मात्रा में उपज चाहिए ।
- लेबलिंग रिएक्शन तैयार करें । निम्नलिखित क्रम में पिपेट (प्रति µ जी आरएनए): 1 µ एल 10x Biotinylation बफर, 7 µ एल आरएनए (युक्त 1 µ जी आरएनए में पतला nuclease-मुक्त एच2O), और 2 µ l बायोटिन-HPDP (1 mg/ बायोटिन जोड़ें-HPDP पिछले और मिश्रण तुरंत pipetting द्वारा । एल्यूमीनियम पंनी के साथ लपेटो ट्यूबों उज्ज्वल प्रकाश के लिए जोखिम से बचने के लिए । बायोटिन-HPDP के लिए एक विकल्प के लिए चर्चा देखें । रोटेशन के साथ 1.5 एच के लिए आर टी पर मशीन ।
- केंद्रापसारक उपयुक्त 2 मिलीलीटर ट्यूबों ( सामग्री की तालिकादेखें) 2 min. पिपेट के लिए 15,000 x जी में biotinylated आरएनए के सभी पूर्व काता 2 एमएल ट्यूब में, क्लोरोफॉर्म की एक बराबर मात्रा जोड़ने, और जोरदार मिश्रण । 2-3 मिनट के लिए मशीन जब तक चरणों अलग और बुलबुले के लिए शुरू करने के लिए गायब हो शुरू करते हैं ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 15,000 x जी में केंद्रापसारक । ध्यान से एक नया ट्यूब में ऊपरी जलीय चरण हस्तांतरण ।
- चरण 2.3.3 दोहराएँ. और 2.3.4 । बार. NaCl की मात्रा का 10% जोड़ें (5 एम) और जलीय चरण के लिए isopropanol के एक बराबर मात्रा । 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20,000 x g पर केंद्रापसारक । supernatant छोड़ें ।
- एक बराबर मात्रा में जोड़ें हौसले से तैयार 75% इथेनॉल । के लिए 20,000 x जी पर केंद्रापसारक supernatant त्यागें, संक्षेप में स्पिन, और शेष इथेनॉल हटा दें । 30-100 µ एलएच2 ओ में पूरी तरह से reसस्पेंड (प्रयोग 1 µ एलएच2 हे प्रति 1 µ जी इनपुट आरएनए से कदम 2.3.1) द्वारा पिपेट मिश्रण.
- electrophoretic विश्लेषण द्वारा आरएनए अखंडता की पुष्टि करें, या एक aliquot ले और बाद में पुष्टि करें ।
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नव लिखित (लेबल) और मौजूदा (unलेबल्ड) आरएनए के पृथक्करण
- paramagnetic मोती निकालें ( सामग्री की तालिकादेखें) से 4 डिग्री सेल्सियस भंडारण और इसे कमरे के तापमान के लिए उन्हें लाने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए खड़े हो जाओ । गर्मी 4sU धोने बफर (नमूना प्रति 3 मिलीलीटर) के लिए 65 डिग्री सेल्सियस ।
- 100 mM dithiothreitol (डीटीटी) सॉल्यूशन तैयार करें । एक अल्ट्रा ठीक पैमाने पर डीटीटी तौलना और nuclease-मुक्त पानी की आवश्यक राशि जोड़ें । हमेशा फ्रेश तैयार करें । प्रति नमूना 200 µ l का उपयोग करें ।
- गर्मी biotinylated आरएनए नमूने (1 µ g/µ l) के लिए 65 ° c करने के लिए 10 मिनट के लिए स्वभाव और तुरंत बर्फ पर जगह. biotinylated आरएनए के लिए 100 µ एल streptavidin मोती जोड़ें और आरटी पर रोटेशन के साथ 15 मिनट के लिए मशीन ।
- एक उपयुक्त स्तंभ प्लेस (सिफारिशों के लिए सामग्री की तालिका देखें) चुंबकीय स्टैंड में प्रत्येक नमूने के लिए, और पूर्व equilibrate 1 मिलीलीटर कमरे के तापमान 4sU धोने बफर के साथ प्रत्येक कॉलम ।
नोट: यह लगभग 5-10 मिनट लग जाएगा । यदि कॉलम के किसी भी 5 मिनट के बाद draining शुरू नहीं करते हैं, एक दस्ताने उंगली से कॉलम के शीर्ष पर धीरे से दबाएं । - प्रत्येक स्तंभ के मध्य में एक आरएनए/मोती मिश्रण लागू करें । प्रवाह-थ्रू छोड़ें, जब तक कि अनलेबल्ड आरएनए को पुनर्प्राप्त करने की आवश्यकता न हो. यदि हां, तो प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा और कम से पहले धो लो । Rädle एट अल द्वारा वर्णित के रूप में आरएनए की वसूली प्रदर्शन. (स्टेप 1-7, 7. अनलेबल्ड, असीम आरएनए की वसूली)19.
- 0.9 मिलीलीटर 4sU धोने बफर के साथ तीन बार धो (पहले से ही 65 डिग्री सेल्सियस के लिए कदम 2.4.2.) और 0.9 एमएल आरटी 4sU वाशिंग बफर, क्रमशः ।
- नव लिखित आरएनए ठीक करने के लिए paramagnetic मोतियों का प्रयोग करें । पिपेट 400 µ एल अच्छी तरह से फैलाया आरटी paramagnetic मोतियों का नमूना प्रति एक ट्यूब और जगह में प्रत्येक कॉलम के नीचे । 100 µ एल 100 मिमी डीटीटी के साथ नव लिखित आरएनए Elute. 3 मिनट के लिए रुको और 100 µ एल 100 मिमी डीटीटी के साथ एक दूसरा रेफरेंस प्रदर्शन करते हैं । (वैकल्पिक: Rädle एट अलद्वारा वर्णित के रूप में रेफरेंस और वसूली प्रदर्शन.) 19
- पिपेट मिश्रण द्वारा नव लिखित आरएनए/मोतियों को अच्छी तरह मिलाकर 10 बार मिलाएं और निर्माता के दिशानिर्देश के अनुसार आगे बढ़ें । 11 µ l nuclease में Elute आरएनए-फ्री एच2ओ. यों तो एक उपयुक्त fluorometer का उपयोग कर आरएनए ( सामग्री की तालिकादेखें). आरएनए में संग्रहित किया जा सकता है-80 ° c कम से कम 1 महीने के लिए ।
नोट: नव लिखित आरएनए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए सीडीएनए पुस्तकालयों को तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (जो किट का उपयोग करने के लिए एक सुझाव के लिए सामग्री की तालिका देखें) या आगे बहाव विश्लेषण. 100-एनजी आरएनए सबसे पुस्तकालय तैयारी किट के लिए पर्याप्त है (चर्चा देखें) ।
3. कुल आरएनए-Seq
- आरएनए तैयारी कुल आरएनए-seq के लिए आरएनए अलगाव प्रोटोकॉल के लिए संशोधित एजेंट का उपयोग करने के बाद 4sU लेबल आरएनए से सीधे आरएनए ले (चरण -8 देखें.)
- पुस्तकालय की तैयारी के लिए, एक आरएनए aliquot 50 के अंतिम एकाग्रता के लिए पतला-100 एनजी/µ एल नव लिखित आरएनए के पुस्तकालय तैयारी के लिए के रूप में एक ही किट का उपयोग करें । 100-एनजी आरएनए सबसे पुस्तकालय तैयारी किट के लिए पर्याप्त हैं ।
4. Ribosome profile
नोट: सभी विधियों और लगातार समय बिंदुओं के लिए, नमूने कक्षों की एक ही प्रारंभिक पूल से होना चाहिए । जिन पर किट का उपयोग करने की अनुशंसाओं के लिए, सामग्री की तालिकादेखें ।
- तैयारी और अलगाव की Ribosome संरक्षित टुकड़े (RPFs):
- प्रत्येक समय बिंदु के लिए उचित मात्रा में कक्षों का उपयोग करें (अनुशंसित T कक्ष संख्याओं के लिए तालिका 2 देखें) । cycloheximide के साथ अनुयाई कक्षों को निर्माता के प्रोटोकॉल में वर्णित मानें ।
चेतावनी: Cycloheximide अत्यधिक विषाक्त है और उत्परिवर्तनों का कारण हो सकता है । त्वचा से संपर्क करें और साँस लेना । - लीजिए और प्रत्येक समय बिंदु से पूल गैर या अर्द्ध अनुयाई कोशिकाओं में से एक के ट्यूब में और अंतिम एकाग्रता समायोजित करने के लिए 1 x 106 कोशिकाओं की मिलीलीटर सेल-विशिष्ट माध्यम (जैसे, पूरक RPMI टी कोशिकाओं के लिए). के लिए एक अंतिम एकाग्रता के साथ cycloheximide जोड़ें 0.1 मिलीग्राम/एमएल, मिश्रण के के साथ है, और 1 मिनट के लिए तैयार करने के लिए मशीन 5 मिन 4 डिग्री सेल्सियस पर 330 x g पर । महाप्राण मध्यम और धो कोशिकाओं के साथ कम से 10 मिलीलीटर पंजाब cycloheximide के साथ पूरक (अंतिम एकाग्रता के 0.1 मिलीग्राम/एमएल) ।
- 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 330 x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । महाप्राण मध्यम और 10 x 106 कोशिकाओं के प्रति 100 µ एल स्तनधारी सेल lysis बफर जोड़ें । pipetting द्वारा मिश्रण और पूरी तरह से कोशिकाओं को लाइसे करने के लिए एक बाँझ २२ २५ गेज सुई के माध्यम से निष्कासित.
- सेल lysate को एक ठंडा 1.5 एमएल ट्यूब पर ट्रांसफर करें । आवर्ती उलटा के साथ बर्फ पर 10 मिनट के लिए मशीन । lysate स्पष्ट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20,000 x g पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक । supernatant एक ठंडा 1.5 एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
- nuclease-मुफ्त पानी के साथ lysate के एक 1:10 कमजोर पड़ने तैयार है और एक एक spectrophotometer का उपयोग कर एक260पढ़ने रिकॉर्ड । मानक के रूप में स्तनधारी सेल lysis बफर के एक खाली और एक 1:10 कमजोर पड़ने के रूप में nuclease-मुफ्त पानी का उपयोग करें । निंन समीकरण के अनुसार lysate की260/mL एकाग्रता की गणना करें:
(a260 cell lysate-a260 स्तनधारी Lysis बफ़र) x 10 कमजोर कारक = a260/mL - बर्फ पर lysate के 200 µ l aliquots बनाएं और nuclease उपचार के साथ आगे बढ़ें ।
नोट: वैकल्पिक रूप से, कुल आरएनए के लिए एक 100 µ l aliquot तैयार करें, 10% एसडीएस और मिश्रण के 10 µ l को जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और 4.3.2 के साथ आगे बढ़ना । 4sU से कुल आरएनए का उपयोग-लेबल आरएनए की सिफारिश की है (चरण 3 देखें. कुल आरएनए-seq).
- प्रत्येक समय बिंदु के लिए उचित मात्रा में कक्षों का उपयोग करें (अनुशंसित T कक्ष संख्याओं के लिए तालिका 2 देखें) । cycloheximide के साथ अनुयाई कक्षों को निर्माता के प्रोटोकॉल में वर्णित मानें ।
- Ribosome पदचिह्न
- lysate को जमने के बिना तुरंत nuclease उपचार करें । nuclease के 7.5 इकाइयों जोड़ें (अनुशंसित किट में शामिल) lysate के प्रत्येक एक के लिए260 । उदाहरण के लिए: 80 a260/mL lysate x 0.2 mL lysate x 7.5 u/A260nuclease = 120 u nuclease.
नोट: वैकल्पिक रूप से, निर्माता द्वारा बताए गए अनुसार पाचन के लिए nuclease को अनुमापन । - कोमल मिश्रण के साथ आरटी पर 45 मिनट के लिए nuclease प्रतिक्रिया की मशीन । तरल नाइट्रोजन के साथ lysate के 200 µ एल aliquots फ्रीज और-80 ° c पर स्टोर, या प्रत्येक 200 µ l RNase के लिए 15 µ l aliquot अवरोधक जोड़कर nuclease प्रतिक्रिया बंद करो, और कदम 4.3.2 के साथ जारी है.
- lysate को जमने के बिना तुरंत nuclease उपचार करें । nuclease के 7.5 इकाइयों जोड़ें (अनुशंसित किट में शामिल) lysate के प्रत्येक एक के लिए260 । उदाहरण के लिए: 80 a260/mL lysate x 0.2 mL lysate x 7.5 u/A260nuclease = 120 u nuclease.
- RPFs का शुद्धिकरण
- nuclease पच RPFs के एक नमूने अनफ़्रीज़ और 15 µ l RNase अवरोधक जोड़ें । नमूनों को बर्फ पर रखें ।
- निर्माता के प्रोटोकॉल (कॉलम शुद्धि की सिफारिश की है) और एक spectrophotometer पर आरएनए एकाग्रता उपाय के अनुसार RPFs शुद्ध ।
- rRNA घट
- rRNA घट के लिए शुद्ध RPFs के 5 µ g का प्रयोग करें ।
- rRNA कमी के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल (चरण 1-2, प्राथमिक rRNA घट) का पालन करें । एक spectrophotometer पर rRNA घट RPFs की आरएनए एकाग्रता उपाय.
- RPFs का पृष्ठ शुद्धिकरण
- पृष्ठ शुद्धि के लिए rRNA घट RPFs के 500 उपयोग करें ।
- आरएनए नियंत्रण, नमूने, और सीढ़ी पृष्ठ शुद्धि के लिए तैयार करें । एक 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 5 µ एल आरएनए नियंत्रण और 5 µ एल denaturing जेल लोडिंग डाई मिक्स । denaturing जेल लोड हो रहा है, क्रमशः के 10 µ एल के साथ प्रत्येक RPF के 10 µ एल मिश्रण । एक सीढ़ी aliquot तैयार (4 µ एल 20/100 सीढ़ी, 1 µ एल nuclease-मुफ्त पानी, और 5 µ एल denaturing जेल लोडिंग डाई) । यह प्रत्येक नमूने और नियंत्रण के बीच लोड crosscontamination को रोकने के लिए ।
- 5 मिनट के लिए 95 ° c पर मशीन द्वारा विकृत नमूनों और सीढ़ी और तुरंत बर्फ पर जगह है । प्रत्येक नमूने के 20 µ एल लोड (वैकल्पिक, लोड 10 µ एल और 20 डिग्री सेल्सियस पर शेष नमूने फ्रीज) एक 12% या 15% यूरिया पर तैयार सीढ़ी के 10 µ एल द्वारा अलग-polyacrylamide जेल । आरएनए नियंत्रण के 10 µ एल लोड । जेल भागो जब तक bromophenol ब्लू बैंड जेल के नीचे पहुंचता है (180 V, ~ 70 मिनट) (चित्रा 3) ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार जेल दाग । आरएनए की कल्पना करने के लिए नीली बत्ती का उत्सर्जन करने वाले एक काले क्षेत्र के transilluminator का उपयोग करें । एक्साइज जेल स्लाइस के लिए प्रत्येक नमूना संगत ~ 28 और 30 nt लंबाई में । संदर्भ और उत्पाद के रूप में आरएनए नियंत्रण ले लो ।
नोट: RPFs शायद ही दिखें । आरएनए नियंत्रण-28 और 30 nt की लंबाई में दो ओलिगोस्पर्मिया के द्वारा दर्शाया गया आकार में एक्साइज स्लाइस-भले ही नमूने दिखाई नहीं दे रहे हैं । - एक बाँझ 20 गेज सुई के साथ 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के तल में एक छेद पंचर । स्थानांतरण प्रत्येक जेल टुकड़ा एक अलग ट्यूब और जगह में एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में छाया हुआ ट्यूबों । 12,000 x जी में 2 मिनट के लिए केंद्रापसारक अगर जेल स्लाइसें 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में पूरी तरह से टुकड़ा नहीं हैं ।
- Elute को 400 µ l nuclease-मुफ्त पानी, 40 µ l अमोनियम एसीटेट (5 मी.), और 2 µ l एसडीएस (10%), 4 डिग्री सेल्सियस पर हर रात एक साथ बाधित जेल स्लाइस से शाही
- घोल को 1.5 मिलीलीटर फ़िल्टर ट्यूबों में स्थानांतरित करें (अनुशंसित किट के साथ) एक 1 मिलीलीटर पिपेट टिप के साथ (वाइड-टिप या सेल्फ-कट एंड के साथ 1 मिलीलीटर टिप बनाया) । 2,000 x जी में 3 मिनट के लिए जेल स्लाइस से अलग eluted आरएनए के लिए केंद्रापसारक । धीरे से एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में पिपेट जलीय समाधान । 2 µ एल ग्लाइकोजन जोड़ें (अनुशंसित किट के साथ प्रदान की) और 700 µ एल 100% isopropanol और स्टोर पर-20 डिग्री सेल्सियस के लिए न्यूनतम 1 ज.
- 13,000 x जी में 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक supernatant त्यागें । पूर्व ठंडा के साथ गोली धो 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 13,000 एक्स जी में 80% इथेनॉल तैयार supernatant और हवा-शुष्क । 20 µ एल में प्रत्येक नमूने और आरएनए नियंत्रण 8 µ l nuclease-मुक्त पानी में पुनः निलंबित । यदि आवश्यक हो तो-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
- विखंडन, अंत मरंमत, 3 ' अनुकूलक बंधाव, रिवर्स प्रतिलेखन
- निर्माता के प्रोटोकॉल (विखंडन और अंत सुधार, 3 ' एडेप्टर बंधाव, और उल्टा प्रतिलेखन) द्वारा वर्णित के रूप में प्रक्रिया निष्पादित करें ।
- सीडीएनए का पृष्ठ शुद्धिकरण
- तैयार नमूने, आरएनए नियंत्रण और सीढ़ी पृष्ठ शुद्धि के लिए: 10 µ एल denaturing जेल लोडिंग डाई, क्रमशः के साथ प्रत्येक नमूना और आरएनए नियंत्रण के 10 µ एल मिश्रण. एक सीढ़ी aliquot (4 µ एल 20/100 सीढ़ी, 1 µ एल nuclease-मुफ्त पानी, 5 µ एल denaturing जेल लोडिंग डाई) तैयार करें । यह प्रत्येक नमूने और नियंत्रण के बीच लोड crosscontamination को रोकने के लिए ।
- 5 मिनट के लिए 95 ° c पर मशीन द्वारा विकृत नमूनों और सीढ़ी और तुरंत बर्फ पर जगह है । प्रत्येक नमूने के 20 µ एल लोड (वैकल्पिक रूप से, लोड 10 µ एल और 20 डिग्री सेल्सियस पर शेष नमूने फ्रीज) 10% polyacrylamide/7-8 एम यूरिया/TBE जेल पर तैयार सीढ़ी के 10 µ एल द्वारा अलग कर दिया । आरएनए नियंत्रण के 10 µ एल लोड । जेल भागो जब तक bromophenol ब्लू पूरी तरह से जेल (180 V, ~ 60 मिनट) से बाहर स्थानांतरित करता है ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार जेल दाग । एक काले क्षेत्र transilluminator है कि शाही सेना की कल्पना और एक नमूना इसी ~ 70-80 nt के लिए जेल स्लाइसें आबकारी के लिए नीली बत्ती का उत्सर्जन करता है का उपयोग करें ।
- चरण 4.5.5-4.5.8 में बताए गए अनुसार आगे बढ़ें और प्रत्येक नमूने को 10 µ l nuclease-मुक्त जल में पुनः निलंबित करें.
- सीडीएनए Circularization
- बर्फ पर प्रत्येक नमूने के लिए निम्नलिखित एजेंट के संयोजन से सभी प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त circularization मास्टर मिक्स तैयार: 4.0 µ l circularization रिएक्शन मिक्स, 2.0 µ l एटीपी, 2.0 µ l MnCl2, और 2.0 µ l Ligase.
- प्रत्येक नमूने के लिए मास्टर मिश्रण के 10 µ एल जोड़ें । धीरे से मिश्रण और संक्षेप में केंद्रापसारक । 2 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन तुरंत बर्फ पर नमूने जगह है ।
- पीसीआर प्रवर्धन
- पीसीआर प्रवर्धन के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल (चरण 1-3, पीसीआर प्रवर्धन) का पालन करें । प्राथमिक टी कोशिकाओं के लिए 9 पीसीआर चक्र के साथ प्रवर्धन के लिए परिपत्र सीडीएनए के 4 µ l का प्रयोग करें, सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए ।
- पुस्तकालयों को शुद्ध और उनके आकार वितरण की जांच, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार (कदम 4-8, पीसीआर प्रवर्धन) । प्रवर्धित पुस्तकालय का अपेक्षित आकार 140-160 bp है ( चित्र 4देखें) ।
- sequencing लायब्रेरीज़ के लिए, आगे मार्गदर्शन के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल और sequencing सुविधा देखें ।
5. चिप-Seq
नोट: इस प्रोटोकॉल Blecher-Gonen, एट अलसे संशोधित किया गया है । 14 चिप-seq के बारे में अधिक जानकारी के लिए अपने प्रोटोकॉल का संदर्भ लें । सभी विधियों और लगातार समय बिंदुओं के लिए, नमूने कक्षों की एक ही प्रारंभिक पूल से होना चाहिए ।
- Crosslinking और कटाई कोशिकाओं
- Crosslink कक्षों की उचित संख्या (अनुशंसित t कक्ष संख्याओं के लिए तालिका 2 को देखें) एक cellspecific माध्यम में 1% formaldehyde के अंतिम एकाग्रता के साथ प्रत्येक समय बिंदु के लिए (उदा., t कोशिकाओं के लिए पूरक RPMI) कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए कोमल कमाल के साथ । ०.१२५ मीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए glycine के अलावा द्वारा crosslinking प्रतिक्रिया बंद करो ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 330 x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें और आइस-कोल्ड पंजाबियों में कोशिकाओं को धोएं । दोहराएँ चरण 5.1.2 दो बार और फ्रीज सेल छर्रों पर-80 ° c. जमे हुए छर्रों कम 6 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
- सेल Lysis और Sonication
नोट: सभी सेल lysis और sonication के चरणों के दौरान, नमूने बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए crosslink उत्क्रमण और प्रोटीन क्षरण को कम करने के लिए ।- 1 मिलीलीटर बर्फ में सेल छर्रों reसस्पेंड-नए सिरे से जोड़ा चिढ़ाने के लिए नाभिक को अलग करने के साथ ठंड सेल lysis बफर (फॉस्फेट अवरोधकों को वैकल्पिक रूप से जोड़ें) । बर्फ पर 10 मिनट के लिए मशीन और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर २,६०० x g पर केंद्रापसारक ।
- महाप्राण supernatant और 1 मिलीलीटर बर्फ में नाभिक गोली reसस्पेंड-ठंड नाभिक lysis बफर हौसले से जोड़ा चिढ़ाना अवरोधकों के साथ (वैकल्पिक: फॉस्फेट अवरोधकों जोड़ें) । बर्फ पर 10 मिनट के लिए मशीन । Sonicate कोशिकाओं 0.2-1.0 kb का एक मतलब डीएनए आकार अंश उत्पन्न करने के लिए ( चित्रा 5देखें).
नोट: Sonication शर्तों को कक्ष प्रकार और आगे की स्थितियों (उदा., कक्ष संख्या, वॉल्यूम और बफ़र) के अनुसार ऑप्टिमाइज़ करने की आवश्यकता होती है । प्राथमिक टी कोशिकाओं के लिए, 20-25 चक्र के लिए sonication की सिफारिश की है (विस्तृत विवरण के लिए सामग्री देखें) । - एक तेज रिवर्स crosslink प्रदर्शन और क्रोमेटिन आकार सत्यापित करने के लिए एक 20-50 µ एल aliquot और 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए गर्मी और 1,000 rpm मिलाते हुए । जोड़ें 2-5 µ एल Proteinase कश्मीर और 56 डिग्री सेल्सियस और 1,000 rpm मिलाते में 20 मिनट के लिए गर्मी । 95 डिग्री सेल्सियस और 1,000 rpm मिलाते हुए 10 मिनट के लिए गर्मी निष्क्रियता प्रदर्शन । एक उपयुक्त किट के साथ शुद्ध क्रोमेटिन ( सामग्री की तालिकादेखें). एक 1% agarose जेल पर क्रोमेटिन आकार की जाँच करें और 100 बीपी प्लस मार्कर का उपयोग.
- एक मतलब डीएनए आकार के अंश के साथ कतरनी क्रोमेटिन 0.2-1.0 केबी के लिए 10 मिनट में 20,000 x g और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अघुलनशील क्रोमेटिन और मलबे गोली । एक नई ट्यूब के लिए supernatant स्थानांतरण और बर्फ पर रहते हैं ।
- sonicated क्रोमेटिन के 5-10% इनपुट के रूप में रखें । फ्रीज-20 ° c (चरण 5.5.2 में प्रयुक्त) ।
- दंपति एंटीबॉडी को मोतियों की माला
- दम्पत्ति 10 µ g एंटीबॉडी (उदा., विरोधी आरएनए पोल द्वितीय; विरोधी Histon H3K36me3) में 220 µ l पंजाबियों (0.5% BSA और 0.5% के बीच 20 के बीच) 80 µ एल superparamagnetic मोती प्रोटीन जी को युग्मित करने के लिए ( सामग्री की तालिकादेखें) रोटेशन के साथ कमरे के तापमान पर कम से 1 घंटे के लिए ।
- एक चुंबक पर ट्यूबों प्लेस । रुको जब तक सभी मोतियों चुंबक के लिए बाध्य कर रहे है और supernatant हटा दें । इसके अलावा ब्लॉक के साथ 6 µ एल sonicated सामन शुक्राणु पंजाब में डीएनए (0.5% BSA और 0.5% के बीच 20) के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए रोटेशन के साथ ।
- एक चुंबक पर ट्यूबों प्लेस । रुको जब तक सभी मोतियों चुंबक के लिए बाध्य कर रहे है और स्पष्ट supernatant हटा दें । तीन बार चिप आईपी बफर के साथ मोती धो लें ।
- क्रोमेटिन Immunoprecipitation
- क्रोमेटिन पतला नाभिक lysis बफर में 1 मिलीलीटर कुल मात्रा के साथ हौसले से जोड़ा चिढ़ाना अवरोधकों (वैकल्पिक रूप से, फॉस्फेट अवरोधकों जोड़) । नए सिरे से जोड़ा चिढ़ाना अवरोधकों के साथ चिप आईपी बफर जोड़ें (वैकल्पिक रूप से, फॉस्फेट अवरोधकों जोड़ने) 3 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए । बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें, जबकि एंटीबॉडी मोतियों को युग्मित है ।
- कदम 5.3.3 से एंटीबॉडी युग्मित मोतियों को पतला क्रोमेटिन जोड़ें और कोमल रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में गर्मी ।
- निम्नलिखित बफ़र्स के साथ धो (1 मिलीलीटर प्रत्येक, सामग्री की तालिकादेखें) रोटेशन के साथ 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर, जगह ट्यूबों चुंबक पर वापस और supernatant को दूर: धो बफर मैं, धो बफर द्वितीय, धो बफर III, और 2x ते पीएच 8.0 क्रमशः ।
- त्यागें supernatant और हवा के लिए सूखी ~ 5 मिनट ।
- रिवर्स crosslinking
- चुंबक से नमूने निकालें । मोतियों से elute प्रोटीन-डीएनए कॉम्प्लेक्स को pipetting करके 50 µ एल रेफरेंस बफर और मिक्सी से जोड़ दें ।
- इस चरण से आगे इनपुट नमूना (s) शामिल करें । 50 µ l के अंतिम खंड के लिए इनपुट नमूना (ओं) के लिए रेफरेंस बफर जोड़ें (बफर संरचना चिप नमूनों के समान रखने के लिए) और एक साथ प्रक्रिया चिप के नमूनों के साथ.
- RNase (DNase free) के रेफरेंस बफर और 2 µ l के 3 µ l को मिक्स करें । प्रत्येक नमूने के लिए मिश्रण के 5 µ एल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
- सैंपल के अनुसार 2.5 µ l proteinase K, 1 µ l ग्लाइकोजन, और 1.5 µ l रेफरेंस बफर मिलाएं । प्रत्येक नमूने के लिए मिश्रण के 5 µ एल जोड़ें (1 यू proteinase K और 20 µ जी ग्लाइकोजन प्रति नमूना) और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए मशीन ।
- 65 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर नमूनों की मशीन (कम से 4 एच) रिवर्स crosslinking प्रदर्शन करने के लिए मिलाते के साथ ।
- चुंबक पर ट्यूबों के लिए कम से 30 एस प्लेस और एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण । नमूने 12 महीने तक के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर जम सकता है ।
- डीएनए शुद्धि
- नमूना (2.3:1 अनुपात) के 60 µ एल के लिए अच्छी तरह से फैलाया paramagnetic मोतियों की 140 µ एल जोड़ें । ध्यान से पिपेट ऊपर और नीचे 25 बार अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक ट्यूब में तरल समरूप है । 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन 4 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब प्लेस, या जब तक सभी मोती चुंबक से बंधे हैं, और supernatant त्यागें ।
- चुंबक पर ट्यूबों छोड़ दो और हौसले से तैयार 70% इथेनॉल के 200 µ एल जोड़ें । मोती परेशान बिना 30 एस के लिए ट्यूबों की मशीन । supernatant को त्यागें और इस चरण को एक बार फिर दोहराएं । महाप्राण इथेनॉल पूरी तरह से और दो paramagnetic मोती हवा-4 मिनट के लिए सूखी ।
नोट: अपूर्ण इथेनॉल हटाने गंभीरता से डीएनए वसूली और उपज को कम कर सकते हैं । केवल जब तक यह सूखी गोली सूखी । गोली सूख अधिक डीएनए वसूली और उपज को कम कर सकते हैं । - चुंबक से ट्यूबों निकालें और 20 µ एल 10 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच 8.0) जोड़ें । धीरे पिपेट पूरी मात्रा को ऊपर और नीचे 25 बार अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए । कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए मशीन । ट्यूबों वापस 4 मिनट के लिए चुंबक पर प्लेस और एक और ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण ।
- एक उपयुक्त fluorometer के साथ डीएनए की मात्रा को मापने ( सामग्री की तालिकादेखें).
- सत्यापित करें कि चिप qPCR द्वारा सफल था (पतला 1 µ l में 100 µ l H2O और उपयोग 2-5 µ l for qPCR) । एक सकारात्मक (ब्याज के प्रोटीन के ज्ञात बंधन साइट) और नकारात्मक नियंत्रण (उदाके लिए विशिष्ट प्राइमरों का प्रयोग करें, एक जीन है कि चुप है और/
नोट: पुस्तकालय की तैयारी 2 चिप डीएनए के एनजी किट के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है ( सामग्री की मेज पर एक सुझाव है जो किट का उपयोग करने के लिए देखें) ।
Representative Results
4 सु लेबलिंग: सत्यापित करें इष्टतम 4 सु-लेबलिंग शर्तें (apoptosis, नाभिकीय तनाव, cytoplasmic तनाव), समय और एकाग्रता: 4sU के उच्च स्तर के उत्पादन और rRNA के प्रसंस्करण और प्रेरित cytoplasmic के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परमाणु तनाव30को बाधित कर सकते हैं । इसलिए, ब्याज की कोशिकाओं 4sU प्रेरित तनाव के रूप में अच्छी तरह के रूप में apoptosis के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए । पश्चिमी दाग विश्लेषण p53 संचय, जो परमाणु तनाव को इंगित करता है visualizing के लिए सिफारिश की है, phospho-EIF2a स्तर जो cytoplasmic तनाव और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) apoptosis के लिए विश्लेषण प्रदर्शन बढ़ रही है । उच्च स्तर और 4sU या thapsigargin या arsenite तरह दवाओं के लिए लंबा जोखिम सेलुलर तनाव पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । apoptosis या कोशिका मृत्यु के लिए प्रेरित करने के लिए, कोशिकाओं BH3I-1 के साथ इलाज किया गया (500 एनजी/µ एल) या 95 डिग्री सेल्सियस (गर्मी सदमे) में 5 मिनट के लिए मशीन । Annexin v/7-AAD धुंधला अपोप्तोटिक (Annexin v) और मृत (7-AAD) कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । लेबलिंग इन विट्रो में 500 µ एम 4sU (अंतिम एकाग्रता) के साथ 0.5 एच के लिए प्राथमिक Th1 कोशिकाओं उत्पन्न या 200 µ मीटर के साथ 1 एच 4sU न तो सेलुलर तनाव के संकेत लाती है और न ही apoptosis (चित्रा 1) लेकिन पर्याप्त 4sU शामिल करने के लिए नेतृत्व.
आरएनए लेबलिंग समय भी छोटा किया जा सकता है (≤ 5 मिनट) जो अब लेबलिंग समय की तुलना में कम रहते intronic दृश्यों में वृद्धि की ओर जाता है. सह transcriptional ब्याह दर कल्पना करने के लिए, 4sU-लेबलिंग बार 30 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए । 4sUlabeling के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया Rädle एट अलदेखें । 19
गुणवत्ता नियंत्रण: आरएनए अखंडता बहुत महत्व की है जब शाही सेना प्रसंस्करण । यह electrophoretical विश्लेषण द्वारा biotinylation के बाद 4sU-लेबल आरएनए की आरएनए गुणवत्ता की जाँच करने के लिए सबसे सुविधाजनक है ( सामग्री की तालिकादेखें). चरण -8 से पृथक आरएनए सत्यापित करने पर विचार करें, विशेष रूप से कुल आरएनए के अनुक्रमण के लिए इसका उपयोग करते समय. आरएनए अखंडता संख्या (रिण) आगे की प्रक्रिया (चित्रा 3) के लिए आरएनए अखंडता सुनिश्चित करने के लिए 8 ≥ होना चाहिए.
Electrophoretical विश्लेषण भी नव लिखित आरएनए सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ध्यान रखें कि नव लिखित आरएनए काफी कम प्रमुख होने के नाते ठेठ rRNA बैंड के साथ कुल आरएनए की तुलना में महत्वपूर्ण कम परिपक्व rRNAs शामिल हैं ।
Ribosome profile: सीडीएनए लाइब्रेरी के पीसीआर प्रवर्धन: सीडीएनए प्रवर्धन (कदम 4.9.1) अच्छा अनुक्रमण परिणाम सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. electrophoretical विश्लेषण द्वारा प्रवर्धित पुस्तकालयों का विश्लेषण. प्रवर्धित पुस्तकालयों का एक अच्छा नमूना 140-160 bp (चित्र 4a) के आसपास एक चोटी से पता चलता है । एडेप्टर dimers की अत्यधिक मात्रा (चित्रा 4B) से बचना चाहिए और उन नमूनों को आगे के निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार पृष्ठ शुद्धि प्रक्रिया का उपयोग कर शुद्ध किया जाना चाहिए (पीसीआर उत्पादों के पृष्ठ शुद्धि). बहुत अधिक टेम्पलेट या बहुत अधिक पीसीआर चक्र अधिक से अधिक उम्मीद आणविक भार बैंड, धब्बा पीसीआर उत्पादों, और एडाप्टर डिमर उत्पादों (चित्र 4c) की उपस्थिति की विशेषता से अधिक प्रवर्धन में परिणाम कर सकते हैं. सबसे नमूनों के लिए 1-5 परिपत्र सीडीएनए के µ एल और प्रवर्धन के लिए 9 पीसीआर चक्र आम तौर पर सही पीसीआर उत्पाद की पर्याप्त मात्रा में निकलेगा ।
चिप: क्रोमेटिन बाल काटना: इष्टतम कतरनी शर्तों सेल के प्रत्येक प्रकार के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है । बाल काटना की स्थिति का निर्धारण (उदा, चक्र, उच्च या कम शक्ति की संख्या) अग्रिम में । कोशिकाओं की एक ही संख्या और परीक्षण प्रयोजनों के लिए एक ही मात्रा का प्रयोग करें, के बाद से एक कम सेल घनत्व बाल काटना दक्षता बढ़ जाती है । से बचने की कोशिश करो-या के तहत क्रोमेटिन-बाल काटना । बड़े क्रोमेटिन टुकड़े नाटकीय रूप से कॉलेस्ट्रॉल द्वारा चिप परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं, और अधिक-बाल काटना ब्याज की प्रोटीन पर epitopes को नष्ट कर सकते हैं, एंटीबॉडी द्वारा एक कम बाध्यकारी दक्षता के लिए अग्रणी । इस प्रयोग में, सबसे अच्छे परिणाम तब प्राप्त हुए जब कतरनी क्रोमेटिन के मुख्य अंश में लगभग 1,000 बीपी या थोड़ा लोअर (फिगर 5 ए) था ।
qPCR द्वारा चिप की जांच: चिप शुरू करने से पहले, यह परीक्षण करने के लिए उचित है अगर इस्तेमाल किया एंटीबॉडी चिप के लिए उपयुक्त है (यदि संभव हो, चिप ग्रेड एंटीबॉडी का उपयोग करें) चिप qPCR द्वारा । पुस्तकालय की तैयारी शुरू करने से पहले qPCR द्वारा अनुक्रमण के लिए चिप की जाँच करें (चरण 5.6.5 देखें). डिजाइन प्राइमरों कि ब्याज की प्रोटीन की एक ज्ञात लक्ष्य साइट के लिए बाध्य । यदि एक जीन के भीतर सटीक लक्ष्य साइट अज्ञात है, कई प्राइमरी जोड़े जीन और जुड़े विनियामक तत्वों को स्कैन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । Th1 कोशिकाओं के RNAPII चिप के लिए Ifng, जो उत्तेजना पर transcriptionally विनियमित है, और actin प्राइमर एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । Sox9 और इंसुलिन एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा, क्योंकि इन जीनों Th1 कोशिकाओं (चित्रा 5B) में व्यक्त नहीं कर रहे हैं. एक्सॉन-खप प्राइमरों, जो आम तौर पर mRNA के qPCR के लिए उपयोग किया जाता है का उपयोग नहीं याद रखें । एक आईजीजी नियंत्रण भी इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की विशिष्टता साबित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । Immunoprecipitated डीएनए एक उपयुक्त fluorometer के साथ मापा जा सकता है ( सामग्री की तालिकादेखें). आईजीजी नियंत्रण द्वारा विशेष रूप से बंधे डीएनए की मात्रा काफी कम होना चाहिए डीएनए ब्याज की एंटीबॉडी से बंधे राशि की तुलना में ।
प्रतिकृति: जैविक महत्व के प्रमाण: यह दृढ़ता से सभी कक्षों का एक ही पूल से शुरू करने के लिए कोशिकाओं को सुनिश्चित करने के लिए काइनेटिक प्रयोग प्रदर्शन करने की सलाह दी है सभी अनुपचारित और इलाज के नमूनों के लिए एक ही पहचान है (चित्र 2) । फिर भी, यह एक जैविक दोहराने के लिए नमूनों की तुलना करने के लिए प्रत्येक विधि के लिए मुख्य समय अंक के छोटे aliquots लेने के लिए सिफारिश की है (जैसे, qPCR द्वारा, FACS विश्लेषण). यह एक किसी न किसी अनुमान के लिए अनुमति देता है दोनों प्रतिकृति के लिए उपचार reproducible था और आप अनुक्रमण के साथ आगे बढ़ सकता है । प्रतिकृति के सत्यापन bioinformatical विश्लेषण के माध्यम से किया जाना चाहिए । Reproducibility के बीच FPKM मानों के बीच सहसंबंध के संदर्भ में मूल्यांकन किया जा सकता है और कैटर प्लॉट (आरेख 6) का उपयोग कर विज़ुअलाइज़ करें ।
चित्रा 1: perturbing कोशिका फिजियोलॉजी के बिना इष्टतम 4sU-लेबलिंग शर्तों का सत्यापन (डवारी एट अलसे चित्रा । 11)
(क) FACS विश्लेषण द्वारा सेल apoptosis का पता लगाने: इन विट्रो जनित Th0 कोशिकाओं 4sU के विभिंन सांद्रता के साथ इलाज किया गया (कोष्ठक में संकेत) 0.5 एच, 1 एच के लिए, और 2 एच, क्रमशः । BH3I-1 उपचार Annexin वी द्वारा निर्धारित apoptosis प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, जबकि हीट शॉक (95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट) कोशिका मौत 7-AAD द्वारा निर्धारित प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । (ख) 4sU इलाज और सक्रिय टी कोशिकाओं के p53 के लिए पश्चिमी दाग विश्लेषण: नमूनों को सक्रियण के संकेत दिया समय के लिए 200 µ m 4sU के साथ लेबल किया गया था, सिवाय 0.5 h समय बिंदु है कि 500 µ m 4sU के साथ लेबल किया गया था. (ग) phospho के पश्चिमी दाग विश्लेषण-EIF2a और कुल EIF2a में सक्रिय Th1 कोशिकाओं में (बी) के रूप में समान लेबलिंग शर्तों के साथ । Thapsigargin का प्रयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: एक काइनेटिक सेटअप के योजनाबद्ध सिंहावलोकन जीनोम-व्यापक परिवर्तन ट्रैक करने के लिए
इस योजना के संयोजन के लिए सेटअप दिखाता है 4sU-seq, कुल आरएनए-seq, Ribosome profiling, और चिप-seq सेल उपचार पर जीनोम व्यापक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए । पूल कोशिकाओं और अलग अनुपचारित नियंत्रण के लिए कोशिकाओं की आवश्यक संख्या निर्धारित करें । शेष कोशिकाओं और प्रत्येक विधि और समय बिंदु के लिए विभाजित समझो । 4sU-seq के लिए 4sU के रूप में वर्णित के लिए अनुपचारित/इलाज कक्षों का लेबल । समय अंक और प्रत्येक विधि के लिए नमूनों की जांच की जा रही विशिष्ट जैविक प्रश्न पर निर्भर करते हैं । प्रत्येक समय बिंदु और विधि के लिए नमूने ले लो, और प्रोटोकॉल के समर्पित भाग का पालन करें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3:4sU-लेबल आरएनए की गुणवत्ता नियंत्रण
कुल आरएनए और biotinylated आरएनए सक्रिय Th1 कोशिकाओं से प्राप्त एक विश्लेषक पर विश्लेषण किया गया. 18S rRNA और 28S rRNA दिखाया गया है और आरएनए वफ़ादारी संख्या (रिण) आरएनए की अखंडता का निर्धारण करने के लिए साधन द्वारा दिया जाता है । आरएनए अखंडता सुनिश्चित करने के लिए रिण 8 ≥ होना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: ribosome रूपरेखा पुस्तकालयों के विश्लेषक प्रोफाइल
(a) एक अच्छा पुस्तकालय: नमूना अपेक्षित आकार सीमा (140-160 बीपी) पर एक चोटी से पता चलता है और कोई आगे शुद्धि की जरूरत है । (B) यह नमूना इच्छित उत्पाद (140-160 bp) के सापेक्ष अत्यधिक एडेप्टर डिमर प्रवर्धित उत्पाद (120 bp) दिखाता है । इस पुस्तकालय को और शुद्धिकरण की आवश्यकता है । (ग) एक से अधिक परिवर्धित नमूना: उच्च-अपेक्षित आणविक भार चोटियों और धब्बा पीसीआर amplicons दिखाई दे रहे हैं (तीर द्वारा संकेत) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5: बाल काटना और qPCR द्वारा चिप के सत्यापन के बाद इष्टतम क्रोमेटिन आकार
(ए) Agarose जेल तस्वीर तीन नमूनों कि एक sonicator पर 25 चक्र के लिए कतरनी और प्रोटोकॉल में पहले वर्णित के रूप में शुद्ध किया गया से कतरनी क्रोमेटिन के इष्टतम टुकड़ा आकार से पता चलता है । (ख) क्यू-पीसीआर कुल RNAPII चिप के परिणाम (विरोधी आरएनए पोल द्वितीय, 8WG16, ab817) इनपुट का एक प्रतिशत के रूप में प्रतिनिधित्व किया है । Ifng और actin प्राइमरों के रूप में इस्तेमाल किया गया एक सकारात्मक जबकि Sox9 और इंसुलिन नकारात्मक नियंत्रण कर रहे हैं (दोनों जीन सक्रिय Th1 कोशिकाओं में व्यक्त नहीं कर रहे हैं). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 6: जैविक प्रतिकृति की तुलना (चित्रा डवारी एट अल से । 11)
प्रतिनिधि तितर बितर साजिश सक्रिय Th1 कोशिकाओं की उत्तेजना के बाद नव लिखित (4sU) आरएनए 4 एच की प्रतिकृति के बीच अभिव्यक्ति मूल्यों (FPKM) की तुलना. हरी रेखा को इंगित करता है समान FPKM मान और रैंक सहसंबंध प्रत्येक प्लॉट में इंगित किया गया है ।
| लेबलिंग की अवधि (min) | रोजच्या 4sU एकाग्रता (µ मी) |
| १२० | 100-200 |
| 60 | 200-500 |
| 15-30 | 500-1000 |
| < 10 | 500-2000 |
तालिका 1: अनुशंसित 4sU सांद्रता (Rädle, एट अलसे । 19)
अनुशंसित 4sU सांद्रता की श्रेणी लेबलिंग के विभिंन समयों के लिए दर्शाई गई है ।
| विधि | कक्ष संख्या | आरएनए राशि |
| 4sU-लेबलिंग | ≥ 2 x 107 | ≥ 60 µ g |
| Ribosome profile | ≥ 2 x107 | |
| चिप-seq | ≥ 2 x 107 -3 x 107 |
तालिका 2: प्राथमिक T कक्षों की आवश्यक मात्रा
प्रत्येक पद्धति के लिए आवश्यक प्राथमिक T कक्षों की ंयूनतम मात्रा । अंय कक्ष प्रकारों का उपयोग करते समय मात्रा कम हो सकती है ।
Discussion
जीन विनियमन की पूरी प्रक्रिया का विश्लेषण पूरी तरह से एक विशिष्ट उत्तेजना या उपचार के जवाब में सेलुलर रूपांतरों को समझने के लिए आवश्यक है । कुल आरएनए का मेल-seq, 4sU-seq, ribosome profile, और चिप-seq अलग समय बिंदुओं पर समय के साथ जीन विनियमन की मुख्य प्रक्रियाओं की एक व्यापक विश्लेषण की ओर जाता है । जैविक प्रक्रियाओं की एक गहन समझ के साथ ही प्रयोगात्मक सेटअप परिभाषित करने के लिए आवश्यक है इष्टतम समय अंक ।
के बाद से तरीके जीन विनियमन का अध्ययन तेजी से सुधार, इन प्रोटोकॉल तेजी से परिवर्तन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इसके बावजूद, वे सेल के किसी भी प्रकार में बुनियादी जीन विनियामक तंत्र का अध्ययन करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण तरीके प्रदान करते हैं । यहां, हम नुकसान और तथ्यों के कुछ एक पर विचार के लिए जब इन तरीकों का उपयोग कर रहा है पर चर्चा की ।
कक्ष: कोशिकाओं को अत्यधिक व्यवहार्य होना चाहिए और, यदि प्राथमिक पृथक कोशिकाओं का उपयोग, कोशिका आबादी की पवित्रता की गारंटी होनी चाहिए (उदा, प्राथमिक टी कोशिकाओं के लिए FACS विश्लेषण) । यहां तक कि थोड़ा बल दिया कोशिकाओं को इन बहुत ही संवेदनशील अनुक्रमण तरीकों के परिणाम को प्रभावित और नव लिखित या अनुवादित आरएनए की मात्रा कम है, और अनुक्रमण परिणामों में तनाव प्रतिक्रिया के अवांछित readouts के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । केंद्रापसारक गति इस प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गोली कोशिकाओं को प्राथमिक टी कोशिकाओं के लिए अनुकूलित है । इस प्रकार, गति सेल प्रकार के अनुसार समायोजित करें ।
4 कोशिका शरीर क्रिया विज्ञान पर सु प्रभाव: 4sU अलावा पर सेलुलर फिजियोलॉजी के लिए ंयूनतम गड़बड़ी सत्यापित करने के लिए aforementioned विकल्पों के अलावा, और/या अतिरिक्त विश्लेषण किया जा सकता है, खासकर जब सेल संख्या सीमित हैं । सेल प्रसार पर प्रभाव बस लेबल और unलेबल्ड कोशिकाओं गिनती द्वारा कोशिकाओं के दोहरीकरण समय की पुष्टि के द्वारा परीक्षण किया जा सकता है । Nucleolar तनाव प्रेरण भी nucleolin और नाभिक के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के माध्यम से सेल आकृति विज्ञान का विश्लेषण द्वारा परीक्षण किया जा सकता है । आगे 4sU के प्रभाव को सत्यापित करने के लिए, बदल वैश्विक जीन अभिव्यक्ति द्वारा मापा जा सकता है correlating पढ़ें कुल आरएनए लेबल से कुल आरएनए की गिनती ।
कक्ष क्रमांक: के लिए इन विट्रो जनरेट किया गया T कक्ष, हम अनुशंसा करते है कम से तालिका 2में इंगित कक्षों की मात्रा के साथ प्रारंभ कर रहा है । कक्षों के प्रकार के अनुसार प्रति विधि पर्याप्त संख्याएं चुनें । के बाद से टी कोशिकाओं को कम कोशिका द्रव्य और आरएनए अन्य कोशिकाओं की तुलना में, अन्य कोशिकाओं की सबसे अधिक संभावना कम मात्रा पर्याप्त हो जाएगा. चिप-seq के लिए, सेल नंबर अत्यधिक इस्तेमाल किया एंटीबॉडी पर निर्भर करता है और कोशिकाओं के भीतर ब्याज की अभिव्यक्ति के स्तर के प्रोटीन । हिस्टोन या RNAPII चिप के लिए, fewe कोशिकाओं, इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि सेल संख्या में वृद्धि की जरूरत है जब प्रतिलेखन कारकों का उपयोग किया जाता है, खासकर यदि वे निंन स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं ।
4 र-लेबलिंग और आरएनए biotinylation: अनुयाई कोशिकाओं का उपयोग करते समय, 4sU लेबलिंग Rädle एट अलद्वारा वर्णित के रूप में निर्देशित किया जा सकता है । 19 के बाद से कोशिकाओं को बहुत तेजी से 4sU शामिल, यह निलंबन, अनुयाई, या अर्द्ध अनुयाई कोशिकाओं के माध्यम से सीधे जोड़ा जा सकता है ।
यह biotinylation के 60-80 µ जी आरएनए के साथ शुरू करने के लिए सिफारिश की है । फिर भी, आरएनए के कम मात्रा में इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि हम 30 से कम µ जी के लिए परीक्षण नहीं किया है एक coprecipitant जोड़ें (उदा., GlycoBlue) जब आरएनए तेज अगर गोली देखना मुश्किल है । गूंथा हुआ एट अल. यह भी दिखाया गया है कि methylthiosulfonate-सक्रिय बायोटिन (MTS-बायोटिन) अधिक कुशलता से HPDP-बायोटिन31की तुलना में 4sU-लेबल आरएनए के साथ प्रतिक्रिया करता है । इसलिए, यह टन के लिए स्विचन-बायोटिन, विशेष रूप से, छोटे RNAs है, जो कम uridine अवशेषों के लिए करते है की वसूली के लिए पर विचार करने लायक हो सकता है (गूंथा हुआ आटा एट अल द्वारा उल्लेख biotinylation प्रोटोकॉल को देखें .; 4sU का शुद्धिकरण देखें-त्यसपछि आरएनए, प्रायोगिक प्रक्रियाएं) ।
नव लिखित आरएनए की वसूली के लिए, यह अपनी पसंद के paramagnetic मोती या आरएनए सफाई मोतियों का उपयोग करने के लिए संभव है । हमेशा ध्यान में रखना है कि इन किट या विशिष्ट RNAs के लिए शुद्ध नहीं हो सकता है । उदाहरण के लिए, यदि आप miRNAs में रुचि रखते हैं, miRNA कैप्चर और sequencing के लिए विशिष्ट किट का उपयोग करने पर विचार करें ।
नव लिखित आरएनए के ठहराव: सही रूप में नव लिखित आरएनए को मापने के लिए, माप एक उपयुक्त fluorometer ( सामग्री की तालिकादेखें) द्वारा किया जाना चाहिए । 4sU एक्सपोजर के 1 एच के भीतर, नव लिखित आरएनए कुल आरएनए के लगभग 1-4% का प्रतिनिधित्व करता है । 1 एच लेबल की नव लिखित आरएनए, सक्रिय टी कोशिकाओं के होते हैं ~ 90-rRNA के 94%11.
Ribosome profile: जब विधि की स्थापना, हम निर्धारित किया है कि 1.5 x का उपयोग कर nuclease की राशि से मूल प्रोटोकॉल में सुझाव दिया उचित पाचन की गारंटी देता है । इसके अलावा, nuclease की उन्नत मात्रा के लिए कोई प्रतिकूल प्रभाव रिपोर्ट किया गया है । चूंकि यह RPFs को पचाने में काफी मुश्किल है, जबकि वे राइबोसोमल प्रोटीन से बंधे आरएनए का हिस्सा हैं, आप अभी भी थोड़ा अनुमापन इष्टतम nuclease पाचन के लिए राशि में वृद्धि कर सकते हैं ।
RPF आरएनए के 500 से कम एनजी चरण 4.4.2 में बरामद किया गया था, rRNA कमी और आरएनए स्वच्छ और ध्यान देने वाला-5 कॉलम के साथ शुद्ध RPFs पूल दोहराएँ. वैकल्पिक रूप से, जेल (step 4.5.3) पर एक दूसरे के बगल में दो समान नमूने लोड करें और जेल (step 4.5.6) से आरएनए रेफरेंस के दौरान पूल जेल स्लाइस करें ।
हम 28 और 30 nt बैंड के लिए संभव के रूप में कसकर एक जेल पर RPFs काटने की सिफारिश । यह rRNAs और tRNAs से अवांछित अंशों को नष्ट करने में मदद करता है, जो बाद में आपकी लाइब्रेरी का हिस्सा बन जाएगा और आपके RPFs के लिए अनुक्रमण पढ़ता कम करेगा ।
यह भी जेल शुद्धि के दौरान यूवी प्रकाश से बचने के लिए सिफारिश की है । यह आरएनए टुकड़े में निक बना सकते हैं, साथ ही न्यूक्लियोटाइड dimers, कि अंत में गंभीर रूप से पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं.
लाइब्रेरी तैयार करना और डेटा का अनुक्रमण करना: Ribosome profiling प्रोटोकॉल sequencing के लिए उपयुक्त एक सीडीएनए लायब्रेरी जनरेट करने के लिए सक्षम करता है । 4sU-लेबलिंग द्वारा उत्पंन नमूनों सीधे किसी भी उपयुक्त आरएनए अनुक्रमण किट के साथ पुस्तकालय तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चूंकि नव लिखित आरएनए, खासकर जब लघु लेबलिंग बार का उपयोग कर, अभी तक polyadenylated नहीं हो सकता है, नहीं पाली-एक चयन किया जाना चाहिए । इसके बजाय, हम दृढ़ता से वास्तविक नमूने के लिए अनुक्रमण गहराई को कम करने को रोकने के लिए rRNA कमी की सिफारिश । टी कोशिकाओं का उपयोग करना, हम 400 नव लिखित और कुल आरएनए के एनजी के साथ शुरू किया (किट पर निर्भर करता है, सामग्री को देखने), पीसीआर प्रवर्धन के लिए rRNA कमी और कम चक्र के लिए प्रदर्शन किया । पुस्तकालय की तैयारी कम प्रारंभिक सामग्री के साथ किया जा सकता है । पीसीआर साइकिल की जटिलता नंबर पुस्तकालय के लिए खाते के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
चिप के लिए seq वहां भी कई किट पुस्तकालय की तैयारी के लिए उपलब्ध हैं । हमारे हाथ पुस्तकालय की तैयारी में अच्छी तरह से काम किया 2 चिप डीएनए के एनजी के साथ शुरू (जो किट का उपयोग करने के लिए एक सुझाव के लिए सामग्री देखें) । अनुक्रमण के दौरान रंग संतुलन के लिए सूचकांक की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें । हम अनुशंसा करते हैं एक sequencing गहराई ≥ 40 x 106 के लिए प्रत्येक पढ़ता है 4sU-seq, कुल आरएनए-seq, और चिप-seq नमूने, और ≥ 80 x 106 पढ़ता है ribosome नमूने के लिए । अनुक्रमण गहराई नमूना और बहाव bioinformatics विश्लेषण पर निर्भर करता है और ध्यान से विचार किया जाना चाहिए । का विश्लेषण करने के लिए intronic cotranscriptional ब्याह के लिए पढ़ता है, 100 बीपी युग्मित-अंत अनुक्रमण चुना जाना चाहिए ।
sequencing बायस: अनुक्रमण सोने के मानक बन गया है जब प्रतिलेखन, अनुवाद, या प्रतिलेखन कारक बंधन में वैश्विक परिवर्तन का निर्धारण । हाल के वर्षों के भीतर, मौजूदा तरीकों उनकी सीमा को धक्का दिया या नई तकनीक आरएनए के तेजी से छोटे शुरू मात्रा अनुक्रमण के लिए विकसित किए गए थे । यह सीडीएनए के प्रवर्धन की आवश्यकता है, जो शोर या पूर्वाग्रह का परिचय । हाल ही में, अनंय आणविक पहचानकर्ता (UMIs) को पीसीआर द्वारा पेश किए गए डुप्लिकेट की पहचान करने के लिए विकसित किया गया था । हाल ही में, यह है कि UMIs बस हल्का अनुक्रमण शक्ति और अंतर जीन अभिव्यक्ति32के लिए झूठी खोज दर में सुधार दिखाया गया था । फिर भी, सभी अनुक्रमण पुस्तकालयों के लिए पुस्तकालय जटिलता के लिए नियंत्रित करने के लिए अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (UMIs) का उपयोग करने पर विचार, खासकर जब आरएनए की कम मात्रा के साथ शुरू करने और कई पीसीआर चक्र की जरूरत है जब.
बफ़र और स्टॉक समाधान: 4sU-seq और ribosome profiling के लिए सभी बफ़र्स nuclease-मुक्त पानी का उपयोग कर सख्त RNase मुक्त शर्तों के तहत तैयार किया जाना चाहिए । यह पूर्व बनाया nuclease-मुक्त NaCl, Tris-एचसीएल, EDTA, सोडियम साइट्रेट, और पानी खरीदने के लिए सिफारिश की है । nuclease-मुक्त शर्तों को सुनिश्चित करने के लिए, एक RNase दूषित समाधान पिपेट या सतहों को साफ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चिप-seq के लिए सभी बफ़र्स कम से DNase मुक्त होना चाहिए और कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है । हमेशा का उपयोग करने से पहले, फॉस्फेट अवरोधकों जोड़ने और बर्फ पर रखने के लिए ।
Bioinformatics: सभी अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण (यानी, चिप-seq, आरएनए-seq, और ribsosome profiling) गुणवत्ता नियंत्रण शामिल है (उदा., FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/का उपयोग करना), अनुकूलक ट्रिमिंग (जैसे, साथ cutadapt20) अध्ययन के तहत कोशिकाओं के लिए संदर्भ जीनोम को मानचित्रण द्वारा पीछा किया । आरएनए-seq डेटा के लिए (कुल और 4sU-seq दोनों), साथ ही साथ ribosome डेटा की रूपरेखा, एक ब्याह आरएनए-seq मैपर आवश्यक है, जैसे ContextMap 221। चिप-seq डेटा के लिए, BWA का उपयोग करते हुए-मेम22 पर्याप्त है । जीन अभिव्यक्ति RPKM मॉडल का उपयोग कर गणना की जा सकती है (प्रति दस लाख टुकड़े मैप प्रति एक्सॉन के Kilobase)1, का निर्धारण करने के बाद एक कार्यक्रम का उपयोग कर जीन प्रति पढ़ें गिनती, featureCounts23 उदा । पीक चिप से बुला-seq डेटा के लिए, प्रोग्राम के एक नंबर उपलब्ध हैं, उदा, एमएसीएस24 या मणि25। इसके अलावा बहाव का विश्लेषण आर26में किया जा सकता है, विशेष रूप से द्वारा प्रदान की उपकरण का उपयोग कर27।
यहां, 4sU-और कुल आरएनए स्तर और ribosome profiling से शोधों की गतिविधि को एकीकृत करने में एक बड़ी चुनौती सामांयीकरण है । इस समस्या को हल करने के लिए एक शास्त्रीय दृष्टिकोण के लिए घर के स्तर को सामान्य रखने के जीन है. व्यक्तिगत घर के लिए यादृच्छिक उतार चढ़ाव के कारण शोर को कम रखने के जीन, यह सिर्फ कुछ घर का उपयोग नहीं करने की सिफारिश की है, लेकिन एक बड़ा सेट के लिए औसत स्तर रखने जीन, > 3, 000 घर-ट्विटर और Levanon 28 द्वारा संकलित जीन रखने उदा . 4sU के अनुपात से आरएनए कारोबार दर की गणना के लिए-कुल आरएनए के लिए, सामान्यता औसत कारोबार दरों पर आधारित है (जैसे, एक आरएनए 5h के आधा जीवन संभालने)29. हालांकि, के बाद से यह घर रखने के जीन के लिए कोई समग्र परिवर्तन, हम अनुशंसा करते है सामांय से स्वतंत्र विश्लेषण दृष्टिकोण का उपयोग कर, उदा, सहसंबंध-आधारित clustering एक समय के विभिंन प्रकार के डेटा के समूहों की पहचान करने के लिए जीन सक्रियकरण के दौरान प्रतिलेखन और अनुवाद में विशिष्ट व्यवहार के साथ । विभिंन डेटा प्रकारों के bioinformatical एकीकरण पर विस्तृत वर्णन के लिए, हम मूल प्रकाशन11को संदर्भित करते हैं ।
टर्नओवर दरों और डेटा एकीकरण का विश्लेषण: हाल ही में प्रकाशित एक पेपर33 की तुलना में एक मल्टीप्लेक्सेड जीन नियंत्रण (MGC) द्वारा वैश्विक तरीकों के लिए निर्धारित आधा जीवन दिखा सकता है कि आधे जीवन अंय तरीकों की तुलना में चयापचय लेबलिंग विधियों द्वारा प्राप्त उन लोगों के साथ सबसे अच्छा संबंधित (उदा, दवाओं द्वारा प्रतिलेखन के सामांय निषेध) । हालांकि, यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि आधा जीवन गणना के बीच मतभेद पैदा कर सकते है और 15,34वर्णित किया गया है । हम समस्याओं और मतभेद है कि तनाव की प्रतिक्रिया से लंबे समय तक 4sU जोखिम के कारण पेश कर रहे है के अधिकांश के लिए खाते । इसलिए, यह 4sU-लेबलिंग द्वारा शुरू की तनाव प्रतिक्रिया को बाहर करने के लिए अपरिहार्य है । आगे कारोबार दरों को मांय करने के लिए, हम MGCs के उपयोग की सलाह देते हैं ।
इसके अतिरिक्त, एक डेटा सेट के रूप में यहां भी एक अधिक एकीकृत डेटा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकताहै (उदा, लंबे समय गैर कोडिंग RNAs के विनियमन)35,36।
Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
हम लार्स Dölken सलाह के लिए प्राथमिक टी कोशिकाओं के लिए 4sU लेबलिंग स्थापित करने के लिए धन्यवाद; Elisabeth ग्रेफ और थॉमस Schwarzmayr पुस्तकालय पीढ़ियों और अनुक्रमण में महत्वपूर्ण मदद के लिए; RNAPII और टी सेल एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए कटार Eick और एंड्रयू Flatley; N. Henriette Uhlenhaut और Franziska Greulich चिप-seq के लिए पुस्तकालय तैयार करने में मदद के लिए; wedding C. Friedel को ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) से अनुदान FR2938/7-1 और सीआरसी ११२३ (Z2) द्वारा समर्थित किया गया; एलके Glasmacher ने ग्रांट जीएलई 870/1-1 से ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) और जर्मन सेंटर फॉर डायबिटीज रिसर्च (DZD), Helmholtz ज़ेंत्रम München का समर्थन किया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4sU-labeling | |||
| 4-thiouridine (100 mg) | Carbosynth | 13957-31-8 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at –20°C in aliquots of 50-500 µl; do not refreeze. |
| 1.5 ml safe-lock tubes | Eppendorf | 30121589 | Optional |
| 1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72692005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
| 2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72694005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
| Chloroform | Sigma Aldirch | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.1 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh |
| Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
| EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg) | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4°C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Isopropanol | Merck | 1.09634.1011 | |
| NaCl (5M) | Sigma Aldrich | 71386 | Stock solution |
| nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
| Nuclease-free H2O | Sigma Aldrich | W4502 | Stock solution |
| nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4 | Lonza | 51237 | Stock solution |
| Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml) | 5Prime | 2302830 | Use in step 1.3.4. |
| Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 × g |
| QIAzol Lysis Reagent (200 ml) | Qiagen | 79306 | Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol) |
| Qubit RNA HS assay kit | Life Technologies | Q32852 | Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11 |
| RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Optional; includes Buffer RLT |
| Sodium citrat | Sigma Aldrich | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| µMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store at 4°C, includes µMacs columns used in step 1.4.6. (store at RT) |
| Cell viability and stress assay | |||
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences | 559763 | Optional |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Optional |
| p53 | abcam | ab26 | Optional |
| p-EIF2a (Ser51) | Cell Signaling | 9721 | Optional |
| BH3I-1 | Sigma-Aldrich | B 8809 | Optional |
| Buffers | |||
| 4sU Washing Buffer | store at RT | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O | |
| Biotinylation Buffer (10x) | store at 4 °C | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4°C | |
| RNA precipitation buffer | store at RT | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | |
| Equipment | |||
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10 |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | Optional |
| UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3 |
| High-speed centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Multifuge X3R | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000 × g |
| High-speed rotor | Thermo Scientific | Fiberlite F15-6 x 100y | |
| Adaptors for 15 ml tubes | |||
| Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | Or equivalent. |
| Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 µMacs columns. |
| Ultra-fine scale | Mettler Toledo | ML204T | Or equivalent. |
| E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
| E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |
| DynaMag-2 Magnet-1 each | Life Technologies | 12321D | |
| RNaseZap | Sigma | R2020 | Optional |
| TruSeq stranded total RNA library prep kit | Illumina | RS-122-2201 | Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit |
| Nanodrop | Thermo Scientific | use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration | |
| Ribosome Profiling | |||
| TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPYSC12116 (Yeast) | |
| TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPHMR12126 (Mammalian) | |
| Illustra MicroSpin S-400 HR Columns | GE Healthcare | 27-5140-01 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 kit | Zymo Research | R1017 | |
| RNA Clean & Concentrator-5 kit | Zymo Research | R1015 | |
| Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) | Illumina | MRZG126 or MRZG12324 | |
| (High Sensitivity DNA Kit) | Agilent Technologies | 5067-4626 | Already needed for 4sU-seq |
| All other consumables and equipment are listed in the User guide | !!! | Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels) | |
| ChIP | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) | gereral lab supplier | ||
| 100 bp Plus Marker | Thermo Fisher | SM0323 | |
| 16 % Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | Add to a final concentration of 1 % |
| 70% EtOH | gereral lab supplier | Always prepare fresh | |
| Agarose | gereral lab supplier | ||
| Agencourt RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
| ChIP library preparation kit | KapaBiosystems | KK8504 | Or use the kit of your choice |
| DNA low bind microcentrifuge tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | or equivalent |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use |
| Glycine | gereral lab supplier | Prepare a 2M stock solution | |
| Glycogen | Roche | 10-901-393-001 | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4. |
| Phosphatase Inhibitor (PhosStop) | Roche | 4906837001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
| Power SYBRgreen Master mix | Thermo Fisher | 4367659 | |
| Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer |
| Rnase, DNase free | Roche | 11-119915001 | |
| Salmon sperm (sonicated to around 100bp) | Sigma | D1626 | |
| TE pH 8.0 | gereral lab supplier | ||
| Antibodies (ChIP grade if possible) | |||
| anti-RNA Pol II [8WG16] | abcam | ab817 | |
| anti-Histon H3K36me3 | abcam | ab9050 | |
| or antibody of interest | |||
| Buffers | |||
| Binding/Blocking buffer | Store at RT | PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20 | |
| Cell-Lysis buffer | Store at RT | 5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40 | |
| ChIP IP buffer | Store at RT | 0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7 mM NaCl | |
| Elution buffer | Store at RT up to 6 months | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS | |
| Nuclei-Lysis buffer | Store at RT | 50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS | |
| Wash buffer I | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl | |
| Wash buffer II | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 500 mM NaCl | |
| Wash buffer III | Store at RT | 0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 8.1 | |
| Equipment | |||
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | use this instrument for electrophoretical analysis |
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml | Diagenode | C30010010 | |
| or tubes special for your sonication device | |||
| Bioruptor sonication device or sonication device of your choice | Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 µl each tube) | ||
| Magnetic stand for tubes | |||
| Thermomixer | |||
| Agarose gel electrophoresis | |||
| Qubit Fluorometer | Thermo Scientific | Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA |
References
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Chavez, S., Garcia-Martinez, J., Delgado-Ramos, L., Perez-Ortin, J. E. The importance of controlling mRNA turnover during cell proliferation. Curr Genet. 62 (4), 701-710 (2016).
- Rutkowski, A. J., et al. Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection. Nat Commun. 6, 7126 (2015).
- Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).
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