Summary
このプロトコルは、チップ seq、4sU seq、総 RNA シーケンス、およびリボソームが細胞および細胞のためプロファイリングの組合せの使用を説明します。転写因子のバインド、 de novo転写、RNA の処理、離職率、時間をかけて翻訳と活性化および/または急速に変化するセルのイベントの全体のコースを表示の変更を追跡できます。
Abstract
起動時に、細胞は急速に機能プログラムを変更し、それにより、その遺伝子発現プロファイル。、たとえば、細胞の分化、形態形成や (免疫細胞の活性化)、などの機能性の刺激の間に遺伝子発現の大規模な変化は発生するまたはローカル環境から薬やその他の要因への暴露後。刺激し、細胞の種類によっては、これらの変更は、急速に、遺伝子発現制御の任意の可能なレベルを発生します。刺激/薬物の特定の種類に反応細胞のすべての分子プロセスを表示するは、分子生物学の最も困難な作業の 1 つです。ここでは、遺伝子の規則の多重層の同時分析を可能にするプロトコルについて述べる。比較すると、特に、(リボソームの翻訳と同様、転写因子 (クロマチン免疫沈降-配列 (チップ seq)) を結合、 de novo転写 (4-thiouridine-シーケンス (seq-4sU))、mRNA プロセシングと売り上げ高プロファイリング)。これらの方法を組み合わせることによってアクションの詳細とゲノム広いコースを表示することが可能です。
急速に適応またはこれは (彼らが新鮮かどうか) に関係なく 4sU 露出の時にすべての遺伝子の転写活性を示していますので、システムの変更を分析する際、新たに転写された RNA の配列することを特にお勧めします。総 RNA シーケンスとリボソームのプロファイリングの組合せの使用は、RNA の売り上げ高と翻訳料金の計算をさらにできます。高スループット シーケンス結果のバイオ情報解析は、データの分析と解釈のための多くの手段のことができます。生成されたデータは、co-transcriptional と代替のスプライシング、いくつかの可能な結果に言及するだけの追跡もできます。
別のモデル有機体または細胞の種類、細胞を含むためここで説明した結合されたアプローチを適用できます。また、品質管理を含む、各メソッドの詳細なプロトコルを提供し、潜在的な問題や落とし穴を議論します。
Introduction
近年では、RNA シーケンス (seq RNA) セルまたは生物1内ですべて表現された Rna を分析する標準的なツールとなっています。ただし、特定の刺激/薬剤に対して適応セルの全体のプロセスを理解する mRNA の転写から処理、回転、および変換に至るまで、すべての基になるプロセスを完全に決定する必要は。総 RNA の変化に依存要因例えばRNA 半減と転写活性は総 RNAseq による RNA 転写の短期的な変化を測定することができますはほとんど細胞の適応を反映させるため貧しいテンプレートであります。環境への影響2,3。確かに、遺伝子の規則4右のように組み合わせた場合の過程で様々 なステップの分析を許可するさまざまな新しいシーケンス技術を開発されています。このプロトコルでは、比較の方法で mRNA の不可欠なレイヤーの規制の追跡を許可いくつかのではなく簡単に該当するシーケンス技術を結合する方法について説明します。転写活性を分析するさまざまな方法が記載されている、遺伝子表現 (ケージ)5、ネイティブ伸長トラン スクリプト シーケンス (seq NET)6、およびゲノムワイド核実行 (GRO seq)7のキャップ分析など,8と同様、bromouridine シーケンス (seq Bru) と 4-thiouridine-シーケンス (seq 4sU)、代謝産物を使用して新たに組み込まれている転写 RNA9,10、ちょうどいくつかの言及します。ケージは、正確な転写開始部位を識別、NET seq と GRO seq 読み取り方向、についてより正確な情報を提供、(ここで説明したメソッドである) 4sU seq を新しく検出は RNA に転写されます。しかし、4sU seq の高感度は、積極的に変更 (これは数分以内に起こる) mRNA プロセシングの量的変化と同様に、細胞の定量的転写活性を測定する別のタイム フレームで適用することができます9、 11,12。さらに、4sU seq は遺伝子9RNA 離職率を計算するための RNA シーケンスとを結合する理想的です。MRNA の転写は実施による RNA ポリメラーゼ II (RNAPII)、転写因子、ヒストン修飾なども一般のアクティベーター/リプレッサー、転写の一部となるなど、多くの要因に左右順番複雑です。遺伝子、プロモーター、エンハンサー領域の数が 1 つの要因に拘束されているをテストするため、今このために、多くの市販抗体13のための標準的な方法である、チップ seq が開発されています。しかし、ChIPseq は、バインドがどこを規制する要因について明確な情報を与える、それ反映されるとはかどうか、それは確かに転写14の変化に 。したがって、4sU seq のチップ seq の共演は、このような生物学的質問のための理想的な組み合わせです。遺伝子発現の調節は、mRNA やタンパク質のレベルが15,16, 並進や翻訳後修飾の可能性のある重要な規則を示すを必ずしも相関するのでも発生後の段階でレベル、状況に応じて。2011 年には、リボソーム プロファイリングまず RNA シーケンスと組み合わせていたし、質量17といくつかの感度の限界があるので、蛋白質で急速に発生する変更を定量化する最適な方法は、今。確かに、このような方法から得られた翻訳速度が (少なくとも長期的変化を測定) 蛋白質のレベルの変更の比較的よい見積もりを提供でき、翻訳などの過程に関するさらに詳細なビューに示されている、開始側と代替翻訳による17 ををフレームします。すべての 4 つの方法の組合せの使用は様々 な細胞のタイプの間の安定した状態で使用できるまたは急速に変化するセル11時間連続の実験します。この使用は、転写因子結合 RNA 転写、処理、および変換に影響を与える変化のゲノムの概要を提供します。
Protocol
すべてのメソッドは、調和とヘルムホルツ ツェントルム ミュンヘンの機関、州、および連邦政府のガイドラインの遵守です。
1. 準備
- タイム スケジュールを含む実験のセットアップの詳細な計画を立てる方法ごとに細胞を収穫するときと細胞培養培地に 4sU を追加するとき。生物の質問に応じてサンプル図面と 4sU ラベルの時間と濃度 (表 1) の時間ポイントを慎重に検討します。
注: セル実行可能性の 4sU の影響を確認し、ストレス応答事前に (「確認最適な 4sU ラベル付けの条件」代表結果と図 1の参照)。少なくとも 1 つのサンプルのそれぞれの方法の予備的なテストを実行することをお勧めします。品質と RNA ・ DNA の量はディープ シーケンス (プロトコルの専用参照してください部分) と高速練習ですが実験中にセルの穏やかな処理のための十分なかどうかを確認します。 - 各メソッドのすべての時点に必要な細胞数を計算 (主な T 細胞を使用する場合は、大まかな推定の表 2を参照)。また、4sU RNA (例えば、時間ポイント翻訳レートまたは RNA 回転率を計算する必要がありますのためにだけ) よりちょうど総 RNA の少ないサンプルを配列することを検討してください。確認して (推奨) 結果の有効性を確認するには、少なくとも 1 つの生物の複製を作成します。
注: 重要なは、すべてのメソッドと連続した時間点、サンプル必要がありますセルの同じ開始プールから。各メソッドの少なくとも 1 つの専用の研究者をお勧めします。 - (例えば、検体の 4sU、シクロヘキシミド、哺乳類換散バッファー、および 1% のホルムアルデヒド) 事前に必要なすべてを準備します。4sU の付加の後でように明るい光に細胞を公開これは 4sU された RNA を細胞蛋白質18への架橋につながる可能性があります。
- 治療 (図 2) の前にちょうど 1 つのフラスコに興味のすべてのセルをプールします。(例えば診断と) のセルをカウントし、各メソッドの未処理のコントロールの必要量を使用 (また 4sU と 4sU seq の未処理のコントロールにラベルを付けることを忘れないでください)。残りのセルを扱うし、すぐに必要な各時点とメソッドのセル数を分割します。細胞を温度または CO2レベルの変化によるストレスを最小限に抑えるために可能な限り迅速に処理します。
注: たとえば、採取、1 h、2 h と治療後 3 h しセルの 4 分の 1 は無処理、および処理コントロールの 4 分の 3 を使用します。
2. 4sU ラベル
注: このプロトコルは、Rädle から変更はら。19は 4sU で代謝ラベリング プログラムに関してさらに情報のためのプロトコルを参照してください。すべてのメソッドや連続した時間点、サンプルする必要がありますセルの同じ開始プールに属します。
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ラベルの開始
- 使用直前の検体の 4sU を解凍します。興味のセルを含む培地に直接各時点での 4sU を追加 (表 2推奨の T 細胞数、時間あたり少なくとも 60 μ g RNA を参照)、優しく、ミックスし、インキュベーターに戻します。残りの 4sU dispose (再冷凍)。
- ラベルの最後に、セル (例えば、セル スクレーパー) および 330 x g でポリプロピレン チューブ (これは高い g 力に抵抗) で 4 ° C で 5 分間遠心を収集します。培地を吸引し、RNA の隔離のための試薬を追加 (3 x 10 の6セルあたり 1 ミリリットル表示勧告のための材料を使用する) 各管に。完全に (3 x 106セルあたり 1 mL) ペレットを再懸濁します (RT)、室温で 5 分間インキュベート、-20 ° C の凍結サンプルは、少なくとも 1 ヶ月-20 ° C で保存できます。
注意:RNA 分離用試薬は、皮膚や目に接触して得ること非常に危険です。取り扱いに注意して、安全上の注意.
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RNA による RNA の隔離のプロトコルを変更
- RNA の隔離のための 1 mL 試薬あたり 0.2 mL のクロロホルムを追加し、前述の代謝ラベリング プロトコル (手順 1-12 2 15 s. 続行を揺することによって徹底的にミックスします。RNA 法による trizol のプロトコルを変更) Rädleらから。19
- RNA 濃度を測定 (材料の表を参照)、製造元の指示に従って。この RNA を総 RNA シーケンスも使用 (手順 3 を参照してください。RNA シーケンスの合計) または少なくとも 1 ヶ月間-80 ° C で保存します。
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新たに転写された RNA のチオール特定ビオチン化
- 総細胞 RNA の 30-80 μ g で開始します。60 μ g RNA は、新たに転写された RNA の十分な量を得られるはず。
- 標識反応を準備します。ピペット (RNA μ g) あたり次の順序で: 1 μ 10 x 7 μ L RNA ビオチン化バッファー (1 μ ヌクレアーゼ フリー H で希釈した RNA を含む2O)、および 2 μ L ビオチン HPDP (1 mg/mL)。ビオチン HPDP 最後、すぐにピペッティングで混ぜます。明るいライトへの露出を避けるためにアルミ箔でチューブをラップします。ビオチン HPDP の代わりのための議論を参照してください。回転で 1.5 時間室温で孵化させなさい。
- 2 分 15,000 × g で遠心分離機適切な 2 mL 管 (材料の表を参照してください) は、事前スピン 2 mL 管にピペットのビオチン標識 RNA のすべて、クロロホルムの等量を追加し、精力的に混ぜます。2-3 分を個別に開始段階までと泡が消え始めます。
- 4 ° C で 15 分間 15,000 × g で遠心します。慎重に新しいチューブに上層の水相を転送します。
- 2.3.3 の手順を繰り返します。2.3.4。ある時。10% 塩化ナトリウム (5 M) の量と等量のイソプロパノールを水相に追加します。4 ° C で 20 分 20,000 × g で遠心します。上清を捨てます。
- 作りたての等しいボリューム 75% エタノールを追加します。20,000 x g 破棄上清に遠心分離機、簡単に言えば、スピンし、残りのエタノールを削除します。30-100 μ L H2O (使用 1 μ L H2O 2.3.1 のステップから 1 μ g 入力 RNA あたり) ピペットを混合することによって完全に再懸濁します。
- 電気泳動分析 RNA の整合性を確認したり、因数を取得したり、後で確認します。
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分離が新しく転写 (ラベル) 既存の (ラベル) の RNA と
- 4 ° C のストレージから常磁性ビーズ (材料の表を参照) を削除、室温にそれらを持って、少なくとも 30 分間放置します。熱 4sU 洗浄液 (サンプルあたり 3 mL) 65 ° c
- 100 mM ジチオトレイトール (DTT) ソリューションを準備します。超微細の DTT の重量を量る、ヌクレアーゼ フリー水の必要量を追加します。常に新鮮な準備します。サンプルあたり 200 μ L を使用します。
- ビオチン標識 RNA サンプル (1 μ g/μ L) を変化させなさい、すぐに氷の上に 10 分の 65 ° C の熱します。ビオチン標識 RNA に 100 μ L ストレプトアビジン ビーズを追加し、RT で回転 15 分間インキュベートします。
- 適切な列を配置 (提言の材料表を参照) の各マグネット スタンドにサンプルの事前 1 mL 室温 4sU 洗浄バッファーの各列を平衡します。
注: これは約 5-10 分かかります。任意の列は 5 分後に排水を開始しないでください場合、は、手袋をはめた指で列の上に軽く押します。 - 各列の中間に RNA/ビーズ ミックスを適用されます。ラベル付けされていない RNA を回復する必要がない限り流れを破棄します。もしそうなら、フローを通じて、少なくとも最初の洗浄を収集します。前述の Rädleらによって RNA の回復を実行します。(1-7、7 ステップします。ラベルのない、非連結のリカバリー)19。
- (ステップ 2.4.2 から 65 ° c 焼く。) 0.9 mL 4sU 洗浄バッファーと 0.9 mL RT 4sU 洗浄バッファー、3 回をそれぞれ洗浄します。
- 常磁性ビーズを使用して、新しく転写 RNA を回復します。チャンネルフォーマット、および各列の下にある場所の管によく分散している RT 常磁性ビーズの 400 μ L をピペットします。100 μ L 100 mM DTT で新しく転写 RNA を溶出します。3 分待つし、100 μ 100 mM DTT と 2 番目の溶出を実行します。(オプション: Rädleらによって記述された溶出や回復を実行)19
- ミックスは新しくピペット 10 倍の混合による RNA/ビーズを徹底的に転写し、製造元のガイドラインに従って進みます。ヌクレアーゼ フリー 11 μ L の RNA を溶出 H2適切な蛍光光度計を使用して O.Quantify RNA (材料の表を参照してください)。RNA は、少なくとも 1 ヶ月間-80 ° C で保存できます。
注: 新しく転写 RNA は次世代シーケンシングの cDNA ライブラリを準備する使用ことができます (使用するキットの提案の材料表を参照してください) またはそれ以上の下流解析。100-500 ng RNA はほとんど図書館準備キット (説明参照) に対して十分です。
3. 総 RNA シーケンス
- 4sU 総 RNA シーケンスの RNA の隔離のプロトコルの変更された試薬を使用して RNA 調製後 RNA をラベルから RNA を直接取る (2.2.2 の手順を参照してください)。
- ライブラリの準備のため希釈 50 100 ng の最終的な集中に RNA 因数/μ L。 新しく転写 RNA のライブラリの準備に関しては同じキットを使用します。100-500 ng RNA は十分ほとんどのライブラリ作成キットです。
4. リボソームのプロファイリング
注: すべてのメソッドや連続した時間点、サンプルはセルの同じ開始プールからする必要があります。材料表を参照して、使用するキットの推奨事項。
- 準備とリボゾームの分離 (RPFs) の断片を保護されます。
- 各時点の細胞の適切な量を使用 (推奨される T 細胞数の表 2を参照してください)。製造元のプロトコルに従って、シクロヘキシミドと付着性のセルを扱います。
注意: シクロヘキシミド、毒性、突然変異を起こすことがあります。皮膚への接触や吸入を避けます。 - 収集とプール非- または半-adherent 細胞たび 1 つポリプロピレン チューブにポイントし、セル固有の媒体 (例えば、T 細胞に補われた RPMI) 1 mL あたり 1 x 10 の6セルを最終濃度を調整します。最終濃度 0.1 mg/mL とシクロヘキシミドを追加、ポリプロピレン チューブを反転してミックス、4 ° C で 330 x g で 5 分間遠心分離セル 1 分間インキュベート培地を吸引し、少なくとも 10 ml の PBS シクロヘキシミド (最終濃度 0.1 mg/mL) を添加した細胞を洗ってください。
- 4 ° C で 330 x g で 5 分間遠心分離細胞培地を吸引し、10 x 10 の6セルあたり 100 μ L 哺乳類の細胞の換散バッファーを追加します。ピペッティングで混ぜるし、完全に細胞を溶解する滅菌 22 25 ゲージ針を通して排出します。
- 冷却 1.5 mL チューブに細胞ライセートを転送します。周期的な逆転と氷の上に 10 分間インキュベートします。ライセートを明らかにする 4 ° C で 20,000 × g で 10 分間遠心します。冷却 1.5 mL チューブに上清を転送します。
- 準備、1:10 ヌクレアーゼ フリー水と分光光度計を使用してレコード A260読書ライセートの希薄化。ヌクレアーゼ フリー水を使用して、空白や、1:10 の標準として哺乳類の細胞の換散バッファーの希釈。次の式に従ってライセート A260/mL の濃度を計算します。
(260セル lysate -260哺乳類の換散バッファー) 10 希釈係数 x =260/mL - 氷の上の液 200 μ L 因数を作成、ヌクレアーゼ治療に進みます。
注: 必要に応じて、100 μ L 分注を総 RNA の準備、10 %sds の 10 μ L を追加し、ミックスします。4 ° C で保存、4.3.2 に進みます。4sU 標識 RNA からの総 RNA の使用をお勧めします (手順 3 を参照してください。総 RNA の seq)。
- 各時点の細胞の適切な量を使用 (推奨される T 細胞数の表 2を参照してください)。製造元のプロトコルに従って、シクロヘキシミドと付着性のセルを扱います。
- リボソームのフット プリント
- ライセート凍結せずヌクレアーゼ治療をすぐに実行します。各 A260ライセートのヌクレアーゼ (おすすめのキットに含まれる) の 7.5 単位を追加します。たとえば: 80 A260/mL 0.2 mL x 7.5 U/A260ヌクレアーゼ ライセート x ライセート 120 U ヌクレアーゼを =。
注: は、前述の製造元によって必要に応じて、消化ヌクレアーゼを滴定します。 - 穏やかな混合と RT の 45 分のヌクレアーゼ反応を孵化させなさい。液体窒素でライセートの 200 μ 因数を凍結し、-80 ° C で保存または 15 μ L RNase 阻害剤を各 200 μ L 分注に追加することによってヌクレアーゼ反応を停止、4.3.2 の手順に進みます。
- ライセート凍結せずヌクレアーゼ治療をすぐに実行します。各 A260ライセートのヌクレアーゼ (おすすめのキットに含まれる) の 7.5 単位を追加します。たとえば: 80 A260/mL 0.2 mL x 7.5 U/A260ヌクレアーゼ ライセート x ライセート 120 U ヌクレアーゼを =。
- RPFs の精製
- ヌクレアーゼ消化 RPFs のサンプルを 1 つの固定を解除し、15 μ L RNase 阻害剤を追加します。氷のサンプルを保ちます。
- 製造元のプロトコルに従って RPFs を浄化 (コラムの浄化をお勧めします) と分光光度計の RNA 濃度を測定します。
- rRNA の枯渇
- RRNA 枯渇のため精製 RPFs の 5 μ g を使用します。
- 製造元のプロトコル (手順 1-2、プライマリ rRNA 枯渇) rRNA の枯渇のために従ってください。RRNA の RNA 濃度を測定は、分光光度計の RPFs を枯渇しました。
- RPFs のページ浄化
- RRNA の使用 500 ng は、ページ浄化用の RPFs を消耗しました。
- ページの浄化のため、RNA の制御、サンプル、および梯子を準備します。ミックス 5 μ L の RNA 制御して 5 μ L 変性ゲルのローディングの 0.5 mL の遠心管に染料。ミックス 10 μ L 各 RPF のゲルを読み込み、それぞれの変化の 10 μ L。はしご因数を準備 (4 μ L 20/100 梯子、ヌクレアーゼ フリー水 1 μ L、5 μ L を変化させるゲルのローディングの染料)。各サンプルと守を防ぐために制御の間にロードします。
- 95 ° C、5 分のインキュベーションでサンプルとはしごを変化させなさい、すぐに氷の上。各サンプルの 20 μ L を読み込む (10 μ L と残りの 20 ° C でのサンプルの凍結、必要に応じてロード) 12% または 15% 尿素ポリアクリルアミドのゲルに梯子を準備の 10 μ L で区切られました。10 μ L の RNA コントロールをロードします。ブロモフェノール ブルー バンド ゲル (180 V ~ 70 分) の下部に達するまでゲルを実行 (図 3)。
- 4 ° C で製造元のプロトコルに従ってゲルを染色します。RNA を視覚化する青い光を発する暗視野 transilluminator を使用します。消費税 〜 28 と 30 に対応する各サンプルのゲルのスライスの長さの nt。参照として RNA の制御を取るし、それ。
注: RPFs は、ほとんど見えない。サンプルが表示されない場合でもを含む長さの 28 と 30 nt の 2 つ oligos - RNA 制御によって示されるサイズでスライスを切除します。 - 滅菌 20 ゲージ針で 0.5 mL の遠心管の底に穴をあけます。別々 のチューブと 1.5 mL チューブのキャップの場所管に各ゲルのスライスを転送します。12,000 × g. 繰り返し遠心分離ゲルのスライスは、1.5 mL チューブに完全に寸断されない場合で 2 分間遠心します。
- 4 ° C でそれぞれ一晩 400 μ L ヌクレアーゼ フリー水、40 μ L 酢酸アンモニウム (5 M)、2 μ L SDS (10%) と中断のゲルのスライスからの RNA を溶出します。
- (ワイドボア ヒントや切り口でチップを自作 1 mL) 1 mL ピペット チップとスラリーを 1.5 mL フィルター チューブ (おすすめキットに付属) に転送します。分離する 2,000 x g で 3 分間遠心分離機は、ゲルのスライスから RNA を溶出します。1.5 mL チューブに水溶液をゆっくりピペットします。2 μ L グリコーゲン (おすすめキットに付属) と 700 μ L 100% イソプロパノール ストアを追加少なくとも 1 時間-20 ° C で。
- 13,000 x g に 20 分のための 4 ° C で遠心分離機の破棄上清。G. 破棄清 × 13,000 で 10 分の 4 ° C であらかじめ冷えた作りたて 80% エタノールでペレットを洗浄し、空気乾燥します。20 μ L の各サンプルと 8 μ L ヌクレアーゼ フリー水に RNA 制御を再懸濁します。必要な場合は、-20 ° C で保存します。
- 断片化、最後修理 3' アダプター結紮、逆のトランスクリプション
- 製造元のプロトコル (断片化と終わり修理、3' アダプター結紮、および逆のトランスクリプション) で説明されているように手順を実行します。
- CDNA のページ浄化
- ページの浄化のためのサンプル、RNA 制御および梯子を準備: ミックス 10 μ L の各サンプルと RNA 制御 10 μ L をゲルのローディングの染料、それぞれの変化します。はしご因数を準備 (4 μ L 20/100 梯子、1 μ L ヌクレアーゼ フリー水、5 μ L をゲルのローディングの染料の変化)。各サンプルと守を防ぐために制御の間にロードします。
- 95 ° C、5 分のインキュベーションでサンプルとはしごを変化させなさい、すぐに氷の上。各サンプルの 20 μ L を読み込む (10 μ L と残りの 20 ° C でのサンプルの凍結、必要に応じてロード) 10% ポリアクリルアミド/7 - 8 M 尿素/TBE ゲルに梯子を準備の 10 μ L で区切られました。10 μ L の RNA コントロールをロードします。ブロモフェノール ブルーは、ゲル (180 V ~ 60 分) から完全に移行するまでは、ゲルを実行します。
- 4 ° C で製造元のプロトコルに従ってゲルを染色します。RNA を視覚化して、70 〜 80 nt に対応する各サンプルのゲルのスライスに青発光暗視野 transilluminator を使用します。
- 4.5.5 - 4.5.8 の手順で説明するように進むし、10 μ L ヌクレアーゼ フリー水の各サンプルを再懸濁します。
- cDNA 環状
- 氷の各サンプルの次の試薬を組み合わせることにより、すべての反応に十分な環状のマスター ミックスを準備: 4.0 μ L 2.0 μ L、2.0 μ L MnCl2、2.0 μ L ATP 環状反応ミックス リガーゼ。
- マスター ミックスの 10 μ L を各サンプルに追加します。優しく混ぜ、遠心分離機の簡潔に。すぐに氷のサンプルの場所 2 のための 60 ° c のサンプルをインキュベートします。
- PCR の拡大
- 製造元のプロトコル (手順 1-3、PCR 増幅) PCR の拡大のために従ってください。最良の結果を達成するために主な T 細胞の 9 の PCR のサイクルの増幅用円形 cDNA の 4 μ L を使用します。
- ライブラリを浄化し、製造元のプロトコル (手順 4-8、PCR 増幅) によるとその大きさの分布状況を確認します。増幅されたライブラリの予想サイズは 140-160 bp (図 4を参照)。
- シーケンス ライブラリ、製造元のプロトコルおよび詳細については、シーケンス機能を参照してください。
5. チップ Seq
注: このプロトコルが変更 Blecher Gonen からら。14チップ以下に関する詳細について、プロトコルを参照してください。すべてのメソッドと連続時間ポイント、セルの同じ開始プールからサンプル必要があります。
- 架橋とセルを収穫
- 架橋数の最終 cellspecific 媒体 (例えば、T 細胞に補われた RPMI) 室温で 10 分間の 1% のホルムアルデヒド濃度と各時点の細胞 (推奨される T 細胞数の表 2を参照してください)穏やかなロッキング。0.125 M の最終的な集中にグリシン添加による架橋反応を停止します。
- 4 ° C で 5 分間 330 × g で遠心分離細胞上澄みを廃棄し、氷冷 PBS のセルを洗浄します。5.1.2 の手順を 2 回繰り返し、-80 ° C で細胞ペレットを凍結冷凍餌は、少なくとも 6 ヶ月間保存できます。
- セル換散および超音波処理
注: すべてのセル換散および超音波処理ステップの間に、氷の上や架橋反転とタンパク質の劣化を最小限に抑えるための 4 ° C でサンプルを保たれなければなりません。- 1 mL 冷たいセル換散バッファー (ホスファターゼの抑制剤を必要に応じて追加) 核を分離する新しく追加されたプロテアーゼ阻害で細胞ペレットを再懸濁します。氷と 2,600 x g で 4 ° C で 5 分間遠心する上で 10 分間インキュベートします。
- 上清を吸引し、新しく追加されたプロテアーゼ阻害剤 1 mL 冷たい核換散バッファーで核ペレットを再懸濁します (必要に応じて: ホスファターゼの抑制剤を追加)。氷で 10 分間インキュベートします。0.2 - 1.0 kb の平均 DNA サイズ画分を生成する細胞を超音波 (図 5参照)。
注: セルの種類に応じて最適化し、さらに超音波照射条件必要条件 (例えば細胞数、ボリューム、およびバッファー)。主な T 細胞の 20-25 サイクルの超音波処理推奨します (詳細な説明の資料を参照してください)。 - せん断クロマチンと 95 ° C で、1,000 rpm 高速逆架橋を行い、クロマチンのサイズを確認するために揺れ 10 分間熱の分注 20-50 μ L を取る。プロティナーゼ K 2-5 μ L を追加し、56 ° C および 1,000 の rpm の振動で 20 分間インキュベートします。95 ° C および 1,000 rpm の振動で 10 分間の熱不活化を実行します。適切なキットレンズ クロマチンを浄化 (材料の表を参照してください)。1% アガロースゲルのクロマチン サイズを確認し、100 bp プラス マーカーを使用します。
- 不溶解性クロマチンと破片をペレットにせん断クロマチン DNA サイズ量 0.2 - 1.0 kb 20,000 × g と 4 ° C で 10 分間の平均を遠心します。上清を新しいチューブに転送して氷の上。
- 入力として熱量クロマチンの 5-10% を維持します。(5.5.2 のステップで使用される)-20 ° C で凍結します。
- カップル抗体ビーズ
- カップル 10 μ g 抗体 (例えば、抗 RNA Pol II; 抗ヒストン H3K36me3) 220 μ L の PBS で (0.5% 0.5 %bsa とトゥイーン 20) 80 μ L 超常磁性ビーズ G の蛋白質に結合する (材料の表を参照してください) 回転に室温で少なくとも 1 時間。
- 磁石にチューブを置きます。すべてのビードは磁石にバインドされ、上澄みを除去まで待ちます。6 μ L でさらにブロック超音波処理サケ精子 DNA PBS (0.5% 0.5 %bsa とトゥイーン 20) 回転と室温で 30 分間。
- 磁石にチューブを置きます。すべてのビードが磁石にバインドされている明確な上清を除去まで待ちます。チップの IP バッファーとビーズを 3 回洗浄します。
- クロマチン免疫沈降
- クロマチンたて追加プロテアーゼ阻害剤で核換散バッファーの容量は 1 mL を希釈 (必要に応じて、ホスファターゼの抑制剤を追加)。新しく追加されたプロテアーゼ阻害剤とチップの IP バッファーを追加 (必要に応じて、追加のホスファターゼの抑制剤) 3 mL の最終巻に。ビーズに抗体を結合しながら氷の上または 4 ° c を維持します。
- 抗体希釈クロマチン ステップ 5.3.3 からビーズを結合し、緩やかな回転で 4 ° C で一晩インキュベートを追加します。
- 回転で 5 分間室温で次のバッファー (各 1 mL材料表を参照してください) で洗って、磁石チューブをバックに、上清を除去: 洗浄バッファー類、洗浄バッファー II、洗浄バッファー III、および TE pH 8.0 x 2 それぞれ。
- 上澄みを廃棄し、~ 5 分風乾します。
- 逆に架橋
- 磁石からサンプルを削除します。50 μ L の溶出バッファーを加え、ビーズからタンパク質-DNA 複合体の溶出にピペッティングで混ぜます。
- この一歩から入力の見本があります。最終巻 (維持するためにバッファー組成チップ サンプル) 50 μ l の試料を入力する溶出バッファーを追加とチップ サンプルと共にプロセス。
- ミックス 3 μ L の溶出バッファーと rnase (DNase 無料) 2 μ L。各サンプルにミックスの 5 μ L を追加し、37 ° C で 30 分間インキュベート
- ミックス 2.5 μ L プロティナーゼ K、1 μ L グリコーゲンおよびサンプルあたり 1.5 μ L の溶出バッファー。(1 U プロティナーゼ K およびサンプルあたり 20 μ g のグリコーゲン) に各サンプルにミックスの 5 μ L を追加し、37 ° C で 2 時間インキュベート
- 逆の架橋を実行する揺れで 65 ° C 一晩 (少なくとも 4 h) でサンプルをインキュベートします。
- 少なくとも 30 s と転送のための磁石にチューブを置く新しいチューブに上清。サンプルは、12 ヶ月の-20 ° C で凍結できます。
- DNA 精製
- よく分散した常磁性ビーズの 140 μ L を 60 μ L のサンプル (本邦比) に追加します。慎重に徹底的にミックスを 25 回上下ピペットします。各管の液が均質であることを確認します。2 分 4 分のため、またはすべてのビードまでマグネット チューブ、磁石にバインドされ、上澄みを廃棄場所の室温で孵化させなさい。
- 磁石にチューブを残すし、作りたての 70% エタノールを 200 μ l 添加します。30 のチューブをインキュベート ビーズを乱すことがなく s。上澄みを廃棄し、この手順をもう一度繰り返します。エタノールを完全に吸引し、常磁性ビーズが 4 分風乾します。
メモ: 不完全なエタノールの除去可能性があります、真剣に DNA の回復を減らすし、降伏。それが乾燥するまでの間だけは、ペレットを乾燥します。ペレットを過剰乾燥 DNA の回復を軽減し、降伏。 - 磁石からチューブを外し、10 mM トリス-HCl (pH 8.0) 20 μ L を追加します。軽く混和 25 度上下全体のボリュームをピペットします。常温で 2 分間インキュベートします。4 分のための磁石にチューブを置き、上清を別のチューブに転送します。
- 適切な蛍光光度計と DNA の量を測定 (材料の表を参照してください)。
- チップは qPCR (qPCR 用 100 μ l H2O および使用 2-5 μ L で希釈 1 μ L) によって成功したを確認します。肯定的な (興味の蛋白質の既知のバインディング サイト) のネガティブ コントロール (例えば、サイレントおよび/または興味の蛋白質のないターゲット遺伝子) 特異的プライマーを使用します。
注: ライブラリの準備は 2 で実行できるキットによって DNA チップの ng (使用するキットの提案の材料表を参照してください)。
Representative Results
4sU ラベル: 最適なことを確認4sU ラベル条件 (アポトーシス、核ストレス、細胞ストレス)、時刻、および濃度:4sU の高レベルは rrna 処理と生産を抑制でき、細胞質と核の応力30を誘発します。したがって、4sU 誘起応力としてアポトーシスの興味のセルをテストする必要があります。西部のしみの分析は、原子力のストレスを示す p53 蛋白の蓄積を可視化するため推奨細胞ストレスおよび蛍光活性化細胞のアポトーシス (FACS) 解析を選別表示リン EIF2a レベルを上げます。高レベルと 4sU またはアーゼファミリーや亜ヒ酸のような薬剤への長い露出は、細胞ストレスを誘導するために使用できます。BH3I 1 と扱われた細胞アポトーシスや細胞死を誘導する (500 ng/μ L) または 95 ° C (ヒート ショック) で 5 分間インキュベートしました。アネキシン V/7 AAD の染色は、アポトーシス (アネキシン V) と死者 (7 AAD) セルを決定に使用されました。500 μ M 4sU で 0.5 h のプライマリの Th1 細胞を生成の in vitroのラベリング (最終濃度) または 200 μ M 4sU で 1 h も誘導する細胞ストレスの兆候もアポトーシス (図 1) は、十分な 4sU 設立に 。
RNA の分類の時間も短縮できます (≤5 分) もはやに比べてラベリング回のシーケンス イントロン短時間の増加に 。Co-transcriptional 融着接続率を可視化、4sU ラベルの時間は 30 分を超えない。4sUlabeling に関する詳細については、Rädleらを参照してください。19
品質管理:RNA を処理するとき、RNA の整合性は非常に重要なのです。電気泳動分析によるビオチン化後 4sU された RNA の RNA の品質をチェックすると便利です (材料の表を参照してください)。総 RNA の塩基配列決定に使用する場合に特に、2.2.2 のステップから隔離された RNA の検証を検討してください。RNA の整合性の数 (鈴) は、さらなる処理 (図 3) のための RNA の整合性を確保する ≥8 をする必要があります。
電気泳動分析は、新しく転写 RNA を確認する使用できます。新しく転写 RNA にされてはるかに少ない顕著な典型的な rRNA バンドと総 RNA と比較して著しく少ない成熟した Rrna が含まれていることに注意します。
リボソームのプロファイリング: cDNA ライブラリの PCR の拡大: cDNA 増幅 (ステップ 4.9.1) は良いシーケンス結果を確保するための重要なステップです。電気泳動分析によって増幅されたライブラリを分析します。増幅されたライブラリの良いサンプルが付近でピークを示しています 140 160 bp (図 4 a)。二量体であるべきアダプターの過剰な量は避ける (図 4 b)、これらのサンプルは製造元のプロトコル (PCR の製品の浄化ページ) によるとページの精製の手順を使用してさらに浄化する必要があります。あまりにも多くのテンプレートまたはあまりにも多くの PCR のサイクルは、期待を超える分子量バンド、にじんだり PCR 製品、およびアダプター ダイマー製品 (図 4) の出現によって特徴付けられる過剰増幅で起因できます。ほとんどのサンプルの円形の cDNA の 1-5 μ L と増幅用 9 PCR のサイクルは通常正しい PCR の製品の十分な量を得られます。
チップ: クロマチンのせん断:最適な剪断条件は、細胞の種類ごとに調整する必要があります。事前にせん断条件 (例えば、高または低電源サイクル数) を決定します。低い細胞密度がせん断効率を高めるので、テスト目的のため、同じ数の細胞と同じボリュームを使用します。上または下-剪断、クロマチンを回避ましょう。大規模なクロマチン フラグメントことができます詰まらせて、チップ結果に影響劇的とエピトープ抗体に結合効率の低下につながる興味の蛋白質過剰せん断破壊できます。せん断のクロマチンの主要な割合の約 1,000 頃この実験で最良の結果が達成された bp か (図 5 a) を少し下げます。
QPCR によるチップの検証:チップを開始する前に、それは使用される抗体がチップに適して場合をテストすることをお勧め (可能であれば、使用チップ グレード抗体) チップ qPCR による。QPCR によるライブラリの準備を開始する前にシーケンスのためにチップを確認 (手順 5.6.5 参照)。興味の蛋白質の既知のターゲット サイトにバインドのプライマーを設計します。遺伝子内の正確なターゲット サイトが既知の場合は、遺伝子と関連する規制要素をスキャンするいくつかのプライマーのペアを使用できます。RNAPII チップの Th1 細胞Ifngのが発現刺激、誘導とアクチンのプライマーをポジティブ コントロールとして使用できます。これらの遺伝子は Th1 細胞 (図 5 b) に表されないので、 Sox9とインスリンはネガティブ コントロールとして機能します。MRNA の qPCR 用通常エクソン スパニングのプライマーを使用しないように注意してください。IgG コントロールは、使用される抗体の特異性を証明するためにも使用できます。沈澱 DNA は適切な蛍光光度計で測定可能 (材料の表を参照してください)。IgG 制御による連結特異的 DNA の量大幅削減とを比較する興味の抗体によってバインドされている DNA 量。
複製: 生物学的意義の証明:強く、細胞すべて未処理と処理のサンプル (図 2) の id が同じであることを確認するためのセルの同じプールから始まってすべてのメソッドの運動の実験を実行することをお勧めします。それにもかかわらず、生物学的複製 (例えばqPCR、FACS 解析によって) とサンプルを比較する各メソッドの主な時間ポイントの小さい因数を取ることをお勧めします。これにより大まかな推定のため、両方のレプリケートのため治療が再現可能なシーケンスを続行することができる場合。基づく分析による複製の検証を実行する必要があります。結果の再現性は、複製間の FPKM 値との相関の観点から評価することができ、散布 (図 6) を用いて可視化します。
図 1: 細胞生理学の摂動なしの最適な 4sU ラベル条件の検証 (ダーバリー工房らから図。11)
(A) FACS 解析によるアポトーシスの検出: それぞれ体外生成された Th0 細胞は 4sU (角かっこで示されます) の異なる濃度の 0.5 h、1 h、2 h の扱われました。ヒート ショック (95 ° c 5 分) 7 AAD により細胞死を誘導するために使用されたに対しアポトーシス アネキシン V によって決定を誘導するために使用した BH3I 1 治療法。(B) 西部のしみの分析 4sU の p53 の扱われ、T 細胞を活性化: サンプルは 200 μ M 4sU で活性化、500 μ M の 4sU が付いていた 0.5 h 時間ポイント以外の指定された時間のため付けられました。(C) ウエスタンブロット法リン EIF2a と (B) のように同じラベルの条件で活性化 Th1 細胞で合計 EIF2a。アーゼファミリーは肯定的な制御として使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ゲノム全体の変更を追跡するキネティック セットアップの概要
この方式は、4sU seq、総 RNA シーケンス、リボソーム プロファイル、および細胞治療時にゲノム変化を研究するチップ seq を結合するためのセットアップを示しています。細胞をプールして必要な対照の細胞数をおきます。残りのセルを扱い、各メソッドおよび時間ポイントの分割します。前述の 4sU と 4sU seq の放置処理セルのラベルを付けます。タイム ポイントと各メソッドのサンプルは、検討されている特定の生物学的問題に依存します。各時点のメソッド、サンプルとプロトコルの専用の一部に従います。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 4sU された RNA の品質管理
総 RNA とビオチン化活性化 Th1 細胞から得られた RNA は、バイオアナライザーを分析しました。18 s rRNA、28 s rRNA が表示され RNA 整合性数 (鈴) は、RNA の整合性を判断する計測器で与えられます。凛は、RNA の整合性を確保する ≥8 をする必要があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: バイオアナライザー プロファイル ライブラリをプロファイリングするリボソームの
(A) A の良いライブラリ: 予想されるサイズの範囲 (140-160 bp) でピークを示し、更に精製する必要はありません。(B) このサンプルは過剰なアダプター ダイマー増幅産物を示しています (120 bp) (140-160 bp) の目的の製品を基準にしています。このライブラリには、浄化が必要です。(C) 過剰に増幅したサンプル: (矢印によって示されます)、期待を超える分子量ピークとまみれて PCR 産物が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 最適なクロマチン サイズせん断と qPCR によるチップの検証後
(A) Agarose のゲル画像 25 サイクル、超音波発生装置でせん断され、プロトコルで前に説明したようにして精製した 3 つのサンプルからせん断クロマチンの最適なフラグメントのサイズを示しています。(B) 合計 RNAPII チップ (抗 RNA Pol II、8WG16、ab817) の Q PCR の結果、入力の割合として表されます。Ifng 、アクチンのプライマーは、 Sox9とインスリンマイナス コントロールです (両方の遺伝子は活性化 Th1 細胞では表されません)、正として使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 生物の比較 (ダーバリー工房らから図を複製します。11)
代表的な散布式の値 (FPKM) を比較を活性化 Th1 細胞の刺激後新しく転写 (4sU) RNA 4 h のレプリケートします。緑の線は、FPKM の値に等しいを示し、順位相関は、各プロットに示されています。
| 持続時間 (分) を表示 | 推奨 4sU 濃度 (μ M) |
| 120 | 100-200 |
| 60 | 200-500 |
| 15-30 | 500-1000 |
| < 10 | 500-2000 |
表 1: 推奨 4sU 濃度 (Rädle からら 。19)
ラベルの異なる時間の推奨 4sU 濃度の範囲が示されます。
| メソッド | セル数 | RNA の量 |
| 4sU ラベル | ≥2 10 x7 | ≥60µg |
| リボソームのプロファイリング | ≥2 x107 | |
| チップ seq | ≥2 10 x7 - 3 × 107 |
表 2: 主な T 細胞の必要量
各メソッドに必要な主な T 細胞の最小量。他の細胞型を使用するときの金額は小さくなります。
Discussion
遺伝子の規則の全体のプロセスを分析治療または特定の刺激への応答の細胞の適応を十分に理解する必要は。総 RNA シーケンスを組み合わせて、4sU seq、プロファイリング、リボソームと異なる時点でチップ seq は時間をかけて遺伝子の規則の主要なプロセスの包括的な分析に します。実験のセットアップだけでなく、最適な時間ポイントを定義するには、生物学的プロセスの深い理解が必要。
遺伝子を研究する手法を急速に向上させるため、これらのプロトコルの急激な変化に適応できます。それにもかかわらず、彼らはセルの任意の種類の基本的な遺伝子の調節機構を研究するための最も重要なメソッドを提供します。ここでは、我々 はいくつかの落とし穴と 1 つはこれらのメソッドを使用する場合を検討している事実について説明します。
細胞:細胞は非常に現実的なする必要があります、セル人口の純度主隔離されたセルを使用している場合 (例えば、主な T 細胞の FACS 解析) 保証が必要があります。少しでも強調した細胞はこれらの非常に敏感な配列方法の結果に影響し、新しく転写や翻訳の RNA の量を下げるやシーケンスの結果のストレス反応の不要な読み出しに 。細胞のペレットをこのプロトコルに記載されている遠心速度は主な T 細胞に最適です。したがって、細胞の種類に応じて速度を調整します。
4sU に及ぼす細胞生理学研究:4sU 添加によって細胞生理学に最小限の摂動を確認するため、前述のオプションに加えてさらにおよび/または追加の解析を実行できます、細胞数が限られている場合は特に。単にラベルとラベルのないセルをカウントすることによって細胞の倍加時間を確認することによって、細胞の増殖に及ぼす影響をテストできます。核小体のストレス誘導は、ヌクレオリンと核の免疫蛍光染色による細胞の形態を分析することによってテストできます。4sU の影響をさらに確認するには、ラベル付きの総 RNA からラベルの総 RNA にカウントを読むを関連付けることによって世界的な遺伝子発現変化を測定すること。
セルの番号:T 細胞の in vitro生成少なくとも表 2に示された細胞の量で開始することをお勧めします。セルの種類に応じてメソッドごとの十分な番号を選択します。T 細胞は少ない細胞と他の細胞と比較して RNA を持っている、ので他の細胞の最も可能性の高い値を下げるほど十分であります。チップ seq セル番号高使用抗体と細胞内で興味の蛋白質の発現レベルに依存します。ヒストンや RNAPII チップは、fewe セルすることができます使用が細胞数が低レベルで出された場合は特に転写因子を使用すると、増加する必要があります。
4sU ラベリングと RNA ビオチン化:付着性のセルを使用する場合は、Rädleらで説明されているように指示されることができます 4sU ラベルします。19セル非常に急速に組み込む 4sU から追加できます懸濁液、付着、または半付着性のセルの中に直接。
RNA の 60-80 μ g、ビオチン化を開始することをお勧めします。それにもかかわらず、RNA の量を減らすことができます使用する、30 未満ではテストしませんでしたが μ g。 追加 (例えば、GlycoBlue) のクロムと、ペレットが見にくい場合、RNA を沈殿させます。ダッフィーらまた methylthiosulfonate 活性化ビオチン (MTS ビオチン) より効率的に HPDP ビオチン31より 4sU された RNA と反応を示した。したがって、少ないウリジン残基 (ダフィーら;を参照してください 4sU ラベルの RNA の浄化によって述べられるビオチン化プロトコルを参照してくださいする傾向がある、小さな Rna の回復のため特に、MTS-ビオチンに切り替えを検討して価値があるかもしれない実験プロシージャ)。
新たに転写された RNA の回復、常磁性ビーズや RNA のクリーンアップお好みのビーズを使用することが可能です。常にこれらのキットや、特定の Rna の浄化可能性がありますいないことを考慮します。たとえば、miRNAs に興味がある場合は、miRNA キャプチャとシーケンスの特定のキットを使用することを検討します。
新しく転写された RNA の定量化:新しく転写の RNA を正確に定量化する測定適した蛍光光度計によって実行される (材料の表を参照してください)。4sU 露出の 1 時間以内は、新しく転写 RNA は総 RNA の約 1-4% を表します。ラベル 1 h の新たに転写された RNA は、活性化 T 細胞は、rRNA1190 ~ 94% で構成されています。
リボソームプロファイリング:メソッドを確立し、我々 は、元のプロトコルの提案よりも 1.5 倍のヌクレアーゼの量を使用して適切な消化力を保証決定されます。また、ヌクレアーゼの上昇量の副作用は報告されています。リボソームタンパク質によってバインドされている RNA の一部である間、RPFs を overdigest ことはかなり困難なのでまだ若干最適ヌクレアーゼ消化を滴定する量を増やすことができます。
場合未満 500 ステップ 4.4.2 で回収された RPF RNA の ng、rRNA の枯渇とプールは RNA クリーン & コンセントレーター 5 列を持つ RPFs を精製を繰り返します。また、RNA 溶出 (手順 4.5.6) ゲルの中にゲル (ステップ 4.5.3) の互いとプール ゲルのスライスの横にある 2 つの同一のサンプルをロードします。
28 と 30 の nt バンドをできるだけしっかりとゲルの RPFs を切断をお勧めします。これは Rrna、Trna、後であなたのライブラリの一部となって、あなたの RPFs の配列の読み取りを削減するから不要なフラグメントを排除することに役立ちます。
また、ゲルの浄化中に紫外線を避けるためにことをお勧めします。これはピリミジン二量体、最後に深刻なライブラリの作製とシーケンスの結果に影響を与えると同様に、RNA 断片でニックネームを作成できます。
ライブラリの準備とデータのシーケンス:プロトコルをプロファイリング リボソーム配列に適した cDNA ライブラリを生成できるようにします。4sU ラベルによって生成されるサンプルは、任意の適切な RNA シーケンス キットとライブラリの準備のため直接使用できます。新しく転写 RNA から特に短い時間をラベル付けできない場合場合まだ polyadenylated、ポリ A 選択する必要がありますは実行されません。代わりに、我々 は強く rRNA の枯渇を防ぐためをお勧めします実際のサンプルのシーケンスの深さを減らすこと。T 細胞を使用して、我々 は 400 の実行 (、キットは材料を参照) によって新しく転写と総 RNA の ng rRNA 枯渇を開始し、PCR バイアスを最小限に抑えるために pcr のサイクルを短縮します。ライブラリの準備より少ない原料で実行できます。ライブラリ複雑さ PCR のサイクル数を考慮して最適化する必要があります。
チップ seq ありますも多くキット ライブラリの準備のため。手ライブラリで準備作業も 2 から始まる DNA チップの ng (用材料を使用するキットの提案を参照してください)。シーケンス処理中にカラー バランスの指標をチェックすることを確認します。4sU seq の RNA シーケンス、チップ seq サンプルの合計のための各 10 の6読み取り x ≥40 とプロファイリング サンプル リボソームの 10 の6読み取り x ≥80 のシーケンスの深さをお勧めします。シーケンスの深さはサンプルと下流のバイオインフォマティクス解析に依存し、慎重に検討する必要があります。Cotranscriptional スプライシング、100 のイントロンの読み取りを分析するには、bp ペアエンド シーケンスを選択する必要があります。
バイアスをシーケンス:シーケンスは、転写、翻訳、または転写因子結合でグローバルな変更を決定する際のゴールド スタンダードになりました。近年、既存の方法はその限界に押されたまたは RNA 量がますます少ない開始のシーケンス処理の新しい技術を開発しました。CDNA は、ノイズまたはバイアス導入の拡大が必要です。最近では、分子の一意の識別子 (Umi) は実験的 PCR によって導入された重複を識別するために開発されました。最近では、行政は、シーケンス処理力と差動遺伝子発現32虚偽の発見率にだけ軽度改善が示されました。それにもかかわらず、特に RNA の少量で開始し、多くの PCR のサイクルが必要な場合、コントロール ライブラリの複雑さのためにすべてのシーケンス ライブラリ分子の一意の識別子 (Umi) を使用を検討します。
バッファーおよび貯蔵液:4sU seq とリボソームのプロファイルのすべてのバッファーは、ヌクレアーゼ フリー水を用いた厳密な RNase フリーの条件下で準備されなければなりません。既製のヌクレアーゼ フリーの NaCl、トリス-HCl、EDTA、クエン酸ナトリウム、水を購入することをお勧めします。ヌクレアーゼ フリーの条件を確保するため RNase 擦りあわせるソリューションは、ピペットや表面をきれいにする使用できます。チップ seq のすべてのバッファーは、する必要があります少なくとも DNase 自由し、室温で保存することができます。プロテアーゼ阻害剤を常に追加し、必要に応じて、ホスファターゼの抑制剤使用前に右し氷の上を保ちます。
バイオインフォマティクス:すべてのシーケンス データ (すなわち、チップ seq、RNA シーケンス、および ribsosome プロファイリング) の分析が含まれていますには (例えばFastQC を使用して http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)、アダプター トリミング (例えばでcutadapt20) は調査の下のセルの参照ゲノムにマッピングに続きます。RNA シーケンス データ (合計と 4sU seq) としてプロファイル データ リボソーム、スプライシング RNA seq マッパー ContextMap 221など、必要です。チップ seq データ, 線形、BWA MEM22を使用して十分です。遺伝子発現は、読みのプログラム、例えばfeatureCounts23を用いた遺伝子ごとの数を決定する後 RPKM モデル (エクソン プラスミド百万フラグメント マップあたりあたりヒット)1を使用して計算できます。チップ seq データからピーク通話のためのプログラムの数があります、例えば、MAC24または宝石25。さらに下流の分析は R26、特に Bioconductor プロジェクト27によって提供されるツールを使用して実行できます。
ここでは、4sU と総 RNA レベルとリボソームのプロファイリングから並進の活動を統合する主要な課題は、正規化です。この問題に対処するための古典的なアプローチは、家事の遺伝子のレベルにノーマライズします。個々 の家は維持遺伝子のランダム変動によるノイズを除去するだけでなく例えばより大きいセットの中央のレベルがいくつかの家は維持遺伝子を使用する勧めします > アイゼンバーグと28 を待ってによってコンパイルされた 3,000 の家は維持遺伝子.比 4sU-に平均売り上げ高に基づいて、正規化の総 RNA からの RNA 離職率の計算 (例えばRNA の半減期には 5 h と仮定すると)29 を料金します。ただし、以来、これは家事の遺伝子のための全体的な変更を一切、正規化、例えば相関に基づく遺伝子のグループを識別するためにデータ型の異なる時系列クラスタ リングの独立した分析方法を使用して転写と翻訳活性化中に明確な行動。基づく統合のさまざまなデータ型の詳細については、我々 は、元文書11を参照してください。
売り上げ高レートとデータ統合の分析:グローバル メソッドと多重遺伝子制御 (MGC) によって決定される半減を比較する最近公開されたペーパー33半減相関 (はなど、他の方法と比べて代謝分類方法により得られた最高のしていることを示すことができます。薬によって転写の一般的な抑制)。しかし半減期の計算間違いが生じるし、説明15,34をされている言及する必要があります。我々 は長期 4sU 暴露によるストレス反応によって導入される相違と問題のほとんどを占めています。したがって、4sU ラベルによって導入されたストレス反応を除外するのには欠かせません。離職率をさらに検証するため、MGCs の使用をお勧めします。
また、ここで生成されるデータ セットはより統合的データ分析 (例えば、長い非コード Rna のレギュレーション)35,36も使用できます。
Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
我々 は 4sU が主な T 細胞の分類を確立するアドバイスの Lars Dölken に感謝します。エリーザベト ・ グラーフとライブラリの世代と配列の重要な助けのためのトーマス ・ シュワルツマイヤーDirk Eick とアンドリュー ・ フラットレイの RNAPII と T 細胞の抗体を提供するため(名) アンリエット Uhlenhaut とフランツィスカ グロイリッヒ ライブラリに備えてチップ seq; ヘルプキャロライン C. フリーデルは FR2938/7-1 と CRC 1123 (Z2) ドイツ研究振興協会 (DFG) からの助成金によって支えられました。エルケ Glasmacher からの助成金 GL 870/1-1 ドイツ研究振興協会 (DFG) とドイツ語センター糖尿病研究 (DZD)、ヘルムホルツ ツェントルム ミュンヘンのによって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4sU-labeling | |||
| 4-thiouridine (100 mg) | Carbosynth | 13957-31-8 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at –20°C in aliquots of 50-500 µl; do not refreeze. |
| 1.5 ml safe-lock tubes | Eppendorf | 30121589 | Optional |
| 1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72692005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
| 2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72694005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
| Chloroform | Sigma Aldirch | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.1 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh |
| Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
| EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg) | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4°C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Isopropanol | Merck | 1.09634.1011 | |
| NaCl (5M) | Sigma Aldrich | 71386 | Stock solution |
| nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
| Nuclease-free H2O | Sigma Aldrich | W4502 | Stock solution |
| nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4 | Lonza | 51237 | Stock solution |
| Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml) | 5Prime | 2302830 | Use in step 1.3.4. |
| Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 × g |
| QIAzol Lysis Reagent (200 ml) | Qiagen | 79306 | Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol) |
| Qubit RNA HS assay kit | Life Technologies | Q32852 | Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11 |
| RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Optional; includes Buffer RLT |
| Sodium citrat | Sigma Aldrich | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| µMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store at 4°C, includes µMacs columns used in step 1.4.6. (store at RT) |
| Cell viability and stress assay | |||
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences | 559763 | Optional |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Optional |
| p53 | abcam | ab26 | Optional |
| p-EIF2a (Ser51) | Cell Signaling | 9721 | Optional |
| BH3I-1 | Sigma-Aldrich | B 8809 | Optional |
| Buffers | |||
| 4sU Washing Buffer | store at RT | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O | |
| Biotinylation Buffer (10x) | store at 4 °C | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4°C | |
| RNA precipitation buffer | store at RT | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | |
| Equipment | |||
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10 |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | Optional |
| UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3 |
| High-speed centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Multifuge X3R | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000 × g |
| High-speed rotor | Thermo Scientific | Fiberlite F15-6 x 100y | |
| Adaptors for 15 ml tubes | |||
| Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | Or equivalent. |
| Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 µMacs columns. |
| Ultra-fine scale | Mettler Toledo | ML204T | Or equivalent. |
| E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
| E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |
| DynaMag-2 Magnet-1 each | Life Technologies | 12321D | |
| RNaseZap | Sigma | R2020 | Optional |
| TruSeq stranded total RNA library prep kit | Illumina | RS-122-2201 | Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit |
| Nanodrop | Thermo Scientific | use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration | |
| Ribosome Profiling | |||
| TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPYSC12116 (Yeast) | |
| TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPHMR12126 (Mammalian) | |
| Illustra MicroSpin S-400 HR Columns | GE Healthcare | 27-5140-01 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 kit | Zymo Research | R1017 | |
| RNA Clean & Concentrator-5 kit | Zymo Research | R1015 | |
| Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) | Illumina | MRZG126 or MRZG12324 | |
| (High Sensitivity DNA Kit) | Agilent Technologies | 5067-4626 | Already needed for 4sU-seq |
| All other consumables and equipment are listed in the User guide | !!! | Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels) | |
| ChIP | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) | gereral lab supplier | ||
| 100 bp Plus Marker | Thermo Fisher | SM0323 | |
| 16 % Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | Add to a final concentration of 1 % |
| 70% EtOH | gereral lab supplier | Always prepare fresh | |
| Agarose | gereral lab supplier | ||
| Agencourt RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
| ChIP library preparation kit | KapaBiosystems | KK8504 | Or use the kit of your choice |
| DNA low bind microcentrifuge tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | or equivalent |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use |
| Glycine | gereral lab supplier | Prepare a 2M stock solution | |
| Glycogen | Roche | 10-901-393-001 | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4. |
| Phosphatase Inhibitor (PhosStop) | Roche | 4906837001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
| Power SYBRgreen Master mix | Thermo Fisher | 4367659 | |
| Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer |
| Rnase, DNase free | Roche | 11-119915001 | |
| Salmon sperm (sonicated to around 100bp) | Sigma | D1626 | |
| TE pH 8.0 | gereral lab supplier | ||
| Antibodies (ChIP grade if possible) | |||
| anti-RNA Pol II [8WG16] | abcam | ab817 | |
| anti-Histon H3K36me3 | abcam | ab9050 | |
| or antibody of interest | |||
| Buffers | |||
| Binding/Blocking buffer | Store at RT | PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20 | |
| Cell-Lysis buffer | Store at RT | 5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40 | |
| ChIP IP buffer | Store at RT | 0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7 mM NaCl | |
| Elution buffer | Store at RT up to 6 months | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS | |
| Nuclei-Lysis buffer | Store at RT | 50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS | |
| Wash buffer I | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl | |
| Wash buffer II | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 500 mM NaCl | |
| Wash buffer III | Store at RT | 0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 8.1 | |
| Equipment | |||
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | use this instrument for electrophoretical analysis |
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml | Diagenode | C30010010 | |
| or tubes special for your sonication device | |||
| Bioruptor sonication device or sonication device of your choice | Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 µl each tube) | ||
| Magnetic stand for tubes | |||
| Thermomixer | |||
| Agarose gel electrophoresis | |||
| Qubit Fluorometer | Thermo Scientific | Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA |
References
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