Summary
该协议描述了芯片序列的组合使用, 4 的 su 序列, 总 RNA 序列, 和核糖体分析的细胞系和主细胞。它能够跟踪转录因子绑定、从头转录、RNA 处理、营业额和翻译的变化, 并在激活和/或快速变化的细胞中显示事件的总体过程。
Abstract
激活后, 细胞迅速改变其功能程序, 从而, 他们的基因表达谱。基因表达的巨大变化, 例如, 在细胞分化, 形态发生, 功能刺激 (如激活免疫细胞), 或在接触到药物和其他因素的地方环境。根据刺激和细胞类型, 这些变化迅速发生, 并在任何可能的基因调控水平。将应答细胞的所有分子过程显示给某种刺激/药物是分子生物学中最困难的任务之一。在这里, 我们描述了一个协议, 可以同时分析多层次的基因调控。我们比较, 特别是转录因子结合 (染色质-免疫沉淀排序 (芯片序列)), de从头转录 (4-thiouridine 序列 (4 su)), mRNA 处理和营业额以及翻译 (核糖体分析)。通过结合这些方法, 可以显示一个详细的和全基因组范围的行动过程。
在分析快速适应或改变系统时, 特别推荐测序新转录 RNA, 因为这描述了4sU 暴露期间所有基因的转录活动 (不管它们是 downregulated 的还是不确定的)。总 rna 序列和核糖体分析的组合使用另外允许计算 rna 营业额和翻译率。对高通量测序结果的生物信息学分析, 可以为数据的分析和解释提供多种方法。生成的数据还可以跟踪联合转录和替代拼接, 只是提到一些可能的结果。
这里描述的组合方法可以适用于不同的模型有机体或细胞类型, 包括主要细胞。此外, 我们为每个使用的方法提供详细的协议, 包括质量控制, 并讨论潜在的问题和隐患。
Introduction
近年来, rna 测序 (rna 序列) 已成为分析细胞或生物体内所有表达 rna 的标准工具1。然而, 为了了解适应特定刺激/药物的细胞的整个过程, 有必要充分确定所有的基础过程, 从 mRNA 转录到加工、更替和翻译。rna 转录的短期变化几乎不能用总 RNAseq 来衡量, 因为总 rna 的变化取决于因素例如rna 半衰期和转录活动, 这是一个不良的模板, 以反映细胞的适应环境影响2,3。事实上, 已经制定了各种新的测序技术, 允许对基因调节过程中的不同步骤进行分析,4当以正确的方式组合时。该协议描述了如何结合一些相当容易应用的排序技术, 以比较的方式跟踪对 mRNA 的基本层的调节。为了分析转录活动, 我们描述了多种方法, 如基因表达式的 Cap 分析 (笼)5, 本机伸长率转录序列 (净序)6, 以及全基因组的核运行 (的序列)7,8, 以及 bromouridine 序列 (老兄) 和 4-thiouridine 序列 (4 su), 它使用在新转录的 RNA9,10中合并的代谢产物, 仅举几个。当笼子识别准确的转录起始点时, 网络序列和增加序列提供了关于阅读方向的更准确的信息, 4 的 su 序列 (这里描述的方法) 只检测新转录的 RNA。然而, 4 的 su 序列是高度敏感的, 可以应用于不同的时间框架来测量积极变化细胞中的定量转录活性, 以及 mRNA 处理的数量变化 (在几分钟内发生)9, 11,12。此外, 4 su 是理想的结合 rna 序列计算 rna 更替率的基因9。mRNA 的转录是由 RNA 聚合酶 II (RNAPII) 进行的, 这反过来受到多种因素的影响, 如转录因子、组蛋白修饰和一般的激活剂/阻遏, 甚至可以是转录的一部分。复杂.为了测试有多少基因/启动子/增强器区域受一个因素的约束, 芯片序列已被开发, 这是现在的标准方法为此目的, 由于许多商业上可用的抗体13。但是, 尽管 ChIPseq 提供了有关调节因素绑定的明确信息, 但它并不反映它是否确实导致了转录14的变化。因此, 用4的 su 序列进行芯片序列是这类生物问题的理想组合。基因表达调控也可能在以后的阶段发生, 因为 mRNA 和蛋白质水平不一定关联15,16, 表明有可能对平移或后转化的重要调节级别, 具体取决于上下文。在 2011, 核糖体的分析首先与 RNA 序列结合, 现在是选择的方法来量化迅速发生的蛋白质变化, 因为仍然有一些敏感性限制与质谱17。事实上, 从这些方法获得的笔译率已证明对蛋白质水平的变化 (至少是长期变化的衡量) 提供了相对较好的估计, 并允许对翻译过程有更详细的看法,例如确定起始端和可选翻译框架17。所有四方法的组合使用可以在稳定状态、不同单元格类型之间或在快速变化的单元格11的时间序列实验中使用。这一用途提供了一个全基因组范围内的变化转录因子结合影响 RNA 转录, 处理和翻译。
Protocol
所有方法都符合和符合亥姆霍兹姆霍兹慕尼黑机构, 州和联邦准则。
1. 准备
- 制定详细的实验设置计划, 包括时间安排, 何时将4sU 添加到细胞培养基中, 以及何时收获每个方法的细胞。根据生物学问题, 仔细考虑样本绘制的时间点、4的 su 标记时间和浓度 (表 1)。
注: 验证4sU 对细胞活力和压力响应的影响 (请参阅代表性结果和图 1中的 "验证最佳 4 su 标记条件")。建议使用至少一个样本对每个方法进行初步测试。验证 RNA/DNA 的质量和数量是否足以进行深度测序 (参见协议的专用部分), 并在实验过程中快速而温和地处理细胞。 - 计算每个方法的每个时间点所需的单元格数 (请参见表 2 , 以便在使用主 T 单元格时进行粗略估计)。另外, 考虑序列化总 rna 的样本比仅仅是 4sU rna (例如) 要少, 只需要计算时间点的平移率或 rna 周转率。确认并验证结果的重要性 (推荐), 至少创建一个生物复制。
注意: 重要的是, 对于所有方法和连续的时间点, 样本必须来自相同的起始池单元格。建议对每个方法至少有一个专用研究员。 - 预先准备所有必要的东西 (例如、aliquoted 4sU、放线菌酮、哺乳动物裂解缓冲液和1% 甲醛)。添加4sU 后, 避免将细胞暴露在明亮的光线下, 因为这可能导致将4个 su 标记的 RNA 交联到细胞蛋白18。
- 在处理前将所有感兴趣的单元格池放在一个烧瓶中 (图 2)。用 hemocytometer 计算单元格 (例如), 并使用所需的量来处理每种方法的未经处理的控制 (不要忘记还要将未处理的控制标记为 4 su 和 4sU)。对剩余的单元格进行处理, 并立即拆分每个时间点和方法所需的单元格数。尽可能快地处理单元格, 以尽量减少由于温度或 CO2级别的变化而引起的压力。
注: 例如, 在治疗后服用1小时、2小时和3小时的样品, 然后将一季度的细胞用于未经治疗的控制, 三个处所用于治疗控制。
2. 4 su 标签
注意: 此协议是从 Rädle ( et al) 修改的。19参考其协议以了解有关4sU 的新陈代谢标记的进一步信息。对于所有方法和连续的时间点, 样本必须来自相同的起始池单元格。
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标签开始
- 在使用前先解冻 aliquoted 4sU。在每个时间点添加 4sU, 直接指向包含感兴趣单元格的介质 (请参阅表 2中推荐的 T 细胞数, 每时间点至少60µg RNA), 轻轻混合, 然后放回孵化器。释放剩余的 4sU (不要冻结)。
- 在标记结束时, 收集单元格 (例如、单元刮板) 和离心机在 330 x g 5 分钟在4°c 在聚丙烯管子 (抵抗高 g 力量)。吸入培养基和添加试剂为 RNA 隔离 (≥1毫升每 3 x 106细胞, 看见材料为推荐使用) 对每管。完全并用重悬颗粒 (≥1毫升每 3 x10 6 细胞), 在室温下孵育5分钟, 并在-20 摄氏度处冻结样品。样品可以保存在-20 °c 至少1月。
警告:用于 RNA 分离的试剂在接触皮肤或眼睛时非常危险。小心处理这些操作, 并考虑安全说明.
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用改进的 rna 隔离协议制备 rna
- 添加0.2 毫升氯仿每1毫升试剂为 RNA 隔离, 并彻底混合通过摇晃十五年代. 按照新陈代谢标签协议 (步骤 1-12, 2) 进行操作。使用修改后的 trizol 协议的 RNA 准备) 从 Rädle et al。19
- 根据制造商的说明, 测量 RNA 浓度 (参见材料表)。使用此 rna 的总 rna 序列以及 (见步骤3。总 RNA 序列) 或存储在-80 °c 至少1月。
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新转录 RNA 的硫醇特异 Biotinylation
- 从 30-80 µg 的总细胞 RNA 开始。60µg rna 应产生足够数量的新转录 rna。
- 准备标签反应。吸管按以下顺序 (每µg RNA): 1 µL 10x Biotinylation 缓冲器, 7 µL rna (包含1µg rna 稀释在核酸酶无 H 2 O) 和2µL 生物素-HPDP (1 毫克/毫升).添加生物素-HPDP 最后, 并立即混合吹打。用铝箔包裹管子以避免暴露在明亮的光线下。请参见关于生物素-HPDP 替代品的讨论。旋转时在 RT 上孵育1.5 小时。
- 离心机适当的2毫升管 (参见材料表) 在 1.5万 x g 为 2 min. 将所有的生物素化 RNA 放入预纺2毫升管中, 加入等量的氯仿, 搅拌均匀。孵化 2-3 分钟, 直到阶段开始分离, 气泡开始消失。
- 离心机在 1.5万 x g 15 分钟在4摄氏度。小心地将上水相转移到新管中。
- 重复步骤2.3.3。和2.3.4。一旦.添加10% 的氯化钠 (5 米) 和相同数量的异丙醇的水相。离心机在 2万 x g 20 分钟在4摄氏度。放弃上清。
- 添加一个相同的体积新鲜准备的75% 乙醇。离心机在 2万 x g. 丢弃上清, 简单旋转, 除去剩余的乙醇。完全并用重悬在 30-100 µLH2 o (使用1µLH2 o 每1µg 输入 RNA 从步 2.3.1) 通过吸管混合。
- 通过电泳分析验证 RNA 完整性, 或进行整除, 稍后验证。
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新转录 (标记) 和现存 (未标记) RNA 的分离
- 除去顺磁珠 (参见材料表) 从4°c 存贮并且让它站立至少30分钟使他们到室温。热4sU 洗涤缓冲器 (每样品3毫升) 到65°c。
- 准备100毫米 dithiothreitol (德勤) 解决方案。在超细的刻度上对核酸酶进行称量, 并添加所需的无水量。总是准备新鲜。每个样品使用200µL。
- 热生物素化 RNA 样品 (1 µg/µL) 到65°c 10 分钟到变性并且立刻放置在冰上。添加100µL 链亲和素珠生物素化 RNA 和孵化在 RT 15 分钟旋转。
- 放置一个适当的列 (请参见材料表以供推荐) 进入磁性支架, 并预先平衡每列1毫升室温4sU 洗涤缓冲器。
注: 这将需要大约 5-10 分钟。如果任何一列没有开始排水后5分钟, 用戴手套的手指轻轻地在柱子顶部按压。 - 将 RNA/珠子混合在每一列的中间。放弃流程, 除非未标记的 RNA 需要恢复。如果是这样, 收集流动和至少第一次清洗。执行 Rädle et . 所述的 RNA 恢复。(步骤 1-7, 7。恢复未标记、未绑定的 RNA)19。
- 清洗三次与0.9 毫升4sU 洗涤缓冲器 (预热到65°c 从步骤 2.4.2.) 和0.9 毫升 RT 4sU 洗涤缓冲, 分别。
- 用顺磁珠恢复新转录的 RNA。吸管400µL 的良好分散的 RT 顺磁珠在每样管和放置在每一列下方。洗脱新转录 RNA 与100µL 100 毫米。等待3分钟, 并执行第二次洗脱与100µL 100 毫米的德勤。(可选: 执行 Rädle et等所述的洗脱和恢复)19
- 混合新转录的 RNA/珠子完全由吸管混合10倍, 并根据制造商的指导方针。洗脱 rna 在11µL 无核酸酶H2 o 使用适当的荧光计量化 rna (参见材料表)。RNA 可以保存在-80 °c 至少1月。
注意: 新转录的 RNA 可用于为下一代测序准备 cDNA 库 (请参阅材料表, 以了解要使用的工具包的建议) 或进一步的下游分析。100-500 ng RNA 为大多数图书馆准备套件是充足的 (参见讨论)。
3. 总 RNA 序列
- 利用改进的 rna 分离协议试剂 (见步骤 2.2.2), 在 rna 制备后直接从4sU 标记 rna 中提取 rna。
- 为图书馆准备, 稀释一个 RNA 整除到最后浓度的 50-100 ng/µL. 使用与库中新转录 RNA 的准备相同的套件。100-500 ng RNA 为大多数图书馆准备包是充足的。
4. 核糖体分析
注意: 对于所有方法和连续的时间点, 样本必须来自相同的起始池单元格。有关使用哪个工具包的建议, 请参阅材料表。
- 核糖体保护片段的制备与分离 (RPFs):
- 为每个时间点使用适当的单元格数量 (请参阅表 2中推荐的 T 单元格号)。按照制造商协议中描述的放线菌酮处理粘附单元格。
注意: 放线菌酮剧毒, 可能导致突变。避免皮肤接触和吸入。 - 收集和池中的非或半黏附细胞从每个时间点成一个聚丙烯管, 并调整最终浓度为 1 x 106细胞每毫升细胞特定培养基 (例如, 补充 RPMI T 细胞)。添加放线菌酮的最终浓度为0.1 毫克/毫升, 混合通过反转聚丙烯管, 并孵化1分钟离心细胞5分钟在 330 x g 在4摄氏度。吸入培养基和洗涤细胞至少10毫升 PBS 补充放线菌酮 (最终浓度为0.1 毫克/毫升)。
- 离心细胞为5分钟在 330 x g 在4°c。吸入培养基, 并添加100µL 哺乳动物细胞裂解缓冲液每 10 x 106单元格。混合通过吹打和驱逐通过一个无菌的 22 25 口径的针, 以溶解细胞完全。
- 将细胞裂解液转移到预换热器1.5 毫升管中。在冰上孵育10分钟, 周期性反转。离心机为10分钟在 2万 x g 在4°c 澄清裂解。将上清液转移到预换热器1.5 毫升管上。
- 用无核酸酶的水准备1:10 稀释的裂解液, 用分光光度计记录一个260读数.使用无核酸酶水作为空白和1:10 稀释的哺乳动物细胞裂解缓冲作为标准。根据以下公式计算裂解物的260/毫升浓度:
(260细胞裂解-260哺乳动物裂解缓冲器) x 10 稀释因子 =260/毫升 - 在冰上创建200µL 整除数的裂解液, 并进行核酸酶处理。
注: 可选, 为总 RNA 准备100µL 整除, 添加10µL 10% SDS 和混合。贮存在4摄氏度, 并进行4.3.2。建议使用来自4个 su 标记 rna 的总 rna (参见步骤3。总 RNA 序列)。
- 为每个时间点使用适当的单元格数量 (请参阅表 2中推荐的 T 单元格号)。按照制造商协议中描述的放线菌酮处理粘附单元格。
- 核糖体足迹
- 立即进行核酸酶治疗, 不冻结裂解液。为每个裂解的260添加7.5 个核酸酶单元 (包括在推荐套件中)。例如:80 A260/毫升裂解 x 0.2 毫升裂解 x 7.5 U/A260核酸酶 = 120 U 核酸酶。
注: 可选, 滴定制造商描述的消化核酸酶。 - 用温和的混合培养45分钟的核酸酶反应。冷冻200µL 整除数的裂解液氮和贮存在-80 摄氏度, 或停止核酸酶反应通过增加15µL RNase 抑制剂, 以每200µL 整除, 并继续步骤4.3.2。
- 立即进行核酸酶治疗, 不冻结裂解液。为每个裂解的260添加7.5 个核酸酶单元 (包括在推荐套件中)。例如:80 A260/毫升裂解 x 0.2 毫升裂解 x 7.5 U/A260核酸酶 = 120 U 核酸酶。
- RPFs 的纯化
- 解冻一个核酸酶消化 RPFs 的样品, 并添加15µL RNase 抑制剂。把样品放在冰上。
- 根据制造商的协议 (推荐柱纯化) 纯化 RPFs, 并测量分光光度计的 RNA 浓度。
- rRNA 损耗
- 用5µg 的纯化 RPFs 进行 rRNA 损耗。
- 按照制造商的协议 (步骤 1-2, 主要 rRNA 损耗) 进行 rRNA 损耗。测定分光光度计中 rRNA 耗尽 RPFs 的 RNA 浓度。
- RPFs 的页面纯化
- 使用 500 rRNA 耗尽的 RPFs 页净化。
- 为页面纯化准备 RNA 控制, 样品和梯子。混合5µL RNA 控制和5µL 变性凝胶加载染料在0.5 毫升离心管。混合10µL 的每一个爱国阵线与10µL 变性凝胶加载, 分别。准备梯子整除 (4 µL 20/100 梯, 1 µL 核酸酶水, 5 µL 变性凝胶加载染料)。在每个示例和控件之间加载它以防止 crosscontamination。
- 变性样品和梯子的孵化在95°c 5 分钟, 并立即放置在冰上。装载20µL 每个样品 (可选, 装载10µL 和冻结剩余的样品在20°c) 由10µL 被准备的梯子分离到12% 或15% 尿素聚丙烯酰胺凝胶。负载10µL 的 RNA 控制。运行凝胶, 直到溴酚蓝带达到凝胶的底部 (180 V, ~ 70 分钟) (图3)。
- 根据制造商的协议, 在摄氏4摄氏度染色凝胶。使用暗场 transilluminator, 发出蓝光以可视化 RNA。每样样品的消费的凝胶切片长度为28和 30 nt。以 RNA 控制作为参考和消费它。
注意: RPFs 几乎看不见。在 RNA 控制所指示的大小 (包括两个寡核苷酸的长度为28和 30 nt) 的情况下, 即使样本不可见。 - 用不育的20口径针在0.5 毫升离心管底部穿刺一个孔。将每个凝胶切片转移到一个单独的管中, 并在1.5 毫升管中放置管。离心机为2分钟在 1.2万 x g. 重复离心, 如果凝胶切片没有完全切成1.5 毫升管。
- 洗脱的 RNA 从中断的凝胶切片与400µL 核酸酶无水, 40 µL 醋酸铵 (5 M) 和2µL SDS (10%) 每隔夜在4°c。
- 将浆料转移到1.5 毫升过滤管 (提供推荐试剂盒) 与1毫升吸管尖端 (宽口径尖端或自制1毫升尖端与切割结束)。离心机3分钟在 2000 x g 分离洗脱 RNA 从凝胶切片。轻轻地将水溶液注入1.5 毫升管。添加2µL 糖原 (提供推荐试剂盒) 和700µL 100% 异丙醇, 并贮存在-20 °c 至少1小时。
- 离心机在4°c 为20分钟, 在 1.3万 x g. 废弃上清。用预冷的新制备的80% 乙醇以4摄氏度清洗颗粒, 在 1.3万 x g 上进行10分钟的洗净。并用重悬每个样品在20µL 和 RNA 控制在8µL 无核酸酶水。如果需要, 存储在-20 摄氏度。
- 破碎, 末端修理, 3 ' 适配器结扎, 反向转录
- 按照制造商协议 (碎片和端修复、3 ' 适配器结扎和反向转录) 的描述执行过程。
- cDNA 的页面纯化
- 准备样品, rna 控制和阶梯为页纯化: 混合10µL 的每个样品和 RNA 控制与10µL 变性凝胶装载染料, 分别。准备梯子整除 (4 µL 20/100 梯, 1 µL 核酸酶水, 5 µL 变性凝胶加载染料)。在每个示例和控件之间加载它以防止 crosscontamination。
- 变性样品和梯子的孵化在95°c 5 分钟, 并立即放置在冰上。装载20µL 每个样品 (可选, 装载10µL 和冻结剩余的样品在20°c) 由10µL 被准备的梯子分离了到 10% polyacrylamide/7-8 M 尿素或胶凝体。负载10µL 的 RNA 控制。运行凝胶, 直到溴酚蓝色完全迁移出的凝胶 (180 V, ~ 60 分钟)。
- 根据制造商的协议, 在摄氏4摄氏度染色凝胶。使用暗场 transilluminator, 发出蓝光可视化 RNA, 并为每个样品的凝胶切片提供相应的 70-80 nt。
- 按照步骤 4.5.5 4.5.8 和并用重悬10µL 核酸酶水中的每个样品进行描述。
- cDNA Circularization
- 为所有的反应准备足够的 circularization 主混合, 通过结合以下试剂为每个样品在冰: 4.0 µL circularization 反应混合物, 2.0 µL ATP, 2.0 µL MnCl2和2.0 µL 连接酶。
- 将主混合的10µL 添加到每个示例中。轻轻地拌匀离心机。孵育样品在60°c 2 小时, 立即将样品放在冰上。
- PCR 扩增
- 按照制造商的协议 (步骤 1-3, pcr 放大) 的 pcr 放大。使用4µL 发送 cDNA 扩增与 9 PCR 周期的初级 T 细胞, 以达到最佳效果。
- 根据制造商的协议 (步骤 4-8, PCR 放大), 净化图书馆并检查它们的大小分布。放大库的预期大小为 140-160 bp (请参见图 4)。
- 对于排序库, 请参阅制造商的协议和排序工具以进行进一步的指导。
5. 芯片序列号
注意: 此协议是从 Blecher Gonen ( et al) 修改的。14参考其协议以了解有关芯片的进一步信息对于所有方法和连续的时间点, 样本必须来自同一个单元格的起始池。
- 交联和收获细胞
- 交联适当数量的单元格 (参考表 2以推荐 T 细胞数) 为每个时间点以最后集中1% 甲醛在 cellspecific 媒介 (例如, 补充 RPMI 为 T 细胞) 在室温下10分钟温柔的摇摆。用甘氨酸加入 0.125 m 的最终浓度, 停止交联反应。
- 离心细胞在 330 x g 5 分钟在4摄氏度。丢弃上清液, 在冰冷的 PBS 中冲洗细胞。重复步骤5.1.2 两次, 冷冻细胞颗粒在-80 摄氏度。冷冻颗粒可贮存至少6月。
- 细胞裂解与超声波
注意: 在所有细胞裂解和超声波步骤中, 样品必须保持在冰或4°c, 以尽量减少交联逆转和蛋白质降解。- 并用重悬细胞颗粒在1毫升冰冷细胞裂解缓冲与新添加的蛋白酶抑制剂, 以分离细胞核 (可选择添加磷酸酶抑制剂)。在冰上孵育10分钟, 离心机在 2600 x g 处孵化5分钟, 4 摄氏度。
- 用新添加的蛋白酶抑制剂 (可选: 添加磷酸酶抑制剂) 在1毫升冰冷核裂解缓冲液中吸入上清和并用重悬核颗粒。在冰上孵化10分钟。油脂实验细胞生成的平均 DNA 大小分数为 0.2-1.0 kb (请参见图5)。
注意: 超声波条件需要根据单元类型和进一步条件 (例如、单元格号、卷和缓冲区) 进行优化。对于初级 T 细胞, 建议使用 20-25 周期的超声波 (参见材料进行详细描述)。 - 采取 20-50 µL 整除的剪切染色质和热10分钟在95°c 和 1000 rpm 晃动, 以执行快速反向交联和验证染色质大小。添加 2-5 µL 蛋白酶 K 和孵育20分钟在56°c 和 1000 rpm 颤抖。在95摄氏度和 1000 rpm 晃动时执行热失活10分钟。用适当的工具包纯化染色质 (请参阅材料表)。检查1% 琼脂糖凝胶的染色质大小, 并使用 100 bp 加标记。
- 离心机剪切染色质的平均 DNA 大小分数为 0.2-1.0 kb 10 分钟在 2万 x g 和4°c, 以颗粒不溶性染色质和碎片。将上清液转移到新的管子上, 并保持冰。
- 保持 5-10% 的微气泡染色质作为输入。冻结在-20 摄氏度 (用于步骤 5.5.2)。
- 夫妇抗体对珠子
- 一对10µg 抗体 (例如, 反 RNA II; 抗 Histon H3K36me3) 在220µL PBS (与 0.5% BSA 和0.5% 吐温 20) 到80µL 超顺磁性珠被结合到蛋白质 g (参见材料表) 为至少 1 h 在室温下以自转。
- 把管子放在磁铁上。等待, 直到所有的珠子绑定到磁铁, 并删除上清。进一步阻拦与6µL 微气泡鲑鱼精子脱氧核糖核酸在 PBS (与 0.5% BSA 和0.5% 吐温 20) 为30分钟在室温下以自转。
- 把管子放在磁铁上。等待, 直到所有的珠子绑定到磁铁, 并清除清上清。用芯片 IP 缓冲器清洗珠子三次。
- 染色质免疫沉淀
- 用新添加的蛋白酶抑制剂 (可选的, 添加磷酸酶抑制剂) 稀释染色质, 使核溶解缓冲液中的总容积1毫升。添加芯片 IP 缓冲与新添加的蛋白酶抑制剂 (可选, 增加磷酸酶抑制剂) 到最终体积的3毫升。保持在冰或4摄氏度, 而抗体是耦合到珠子。
- 添加稀释染色质的抗体耦合珠从步骤5.3.3 和孵化过夜4°c 与温和的旋转。
- 用下列缓冲器 (每1毫升, 见材料表) 在室温下用旋转, 将管子放回磁铁上, 移除上清液: 洗涤缓冲器 I, 洗涤缓冲液 II, 洗涤缓冲液 III, 和2x 特 pH 8.0 分别。
- 弃上清, 风干5分钟。
- 反向交联
- 从磁铁中取出样品。添加50µL 洗脱缓冲器, 并由吹打混合, 洗脱蛋白-DNA 复合物从珠子。
- 从这一步中包含输入示例。将洗脱缓冲器添加到输入样品中, 用于最终体积为50µL (以保持缓冲成分类似于芯片样品), 并与芯片样品一起加工。
- 混合3µL 洗脱缓冲器和2µL RNase (DNase 免费)。添加5µL 的混合到每个样本和孵化30分钟, 在37摄氏度。
- 混合2.5 µL 蛋白酶 K, 1 µL 糖原和1.5 µL 洗脱缓冲每个样品。添加5µL 的混合到每个样品 (1 U 蛋白酶 K 和20µg 糖原每个样本) 和孵化2小时在37摄氏度。
- 将样品在65°c 过夜 (至少4小时) 以震动进行反向交联。
- 将管子放在磁铁上至少三十年代, 将上清液转移到新管上。样品可以冻结在-20 摄氏度, 长达12月。
- DNA 纯化
- 将140µL 分散的顺磁珠添加到60µL 的样品中 (2.3: 1 比)。小心吸管上下25次, 彻底混合。确保每管中的液体是均匀的。在室温下孵育2分钟. 把管子放在磁铁上4分钟, 或者直到所有的珠子都绑在磁铁上, 然后丢弃上清。
- 把管子放在磁铁上, 加入200µL 新鲜制备的70% 乙醇。在三十年代孵化管子而不干扰珠子。放弃上清, 再重复这一步。完全吸干乙醇, 让顺磁珠风干4分钟。
注: 不完全乙醇去除可能会严重降低 DNA 的回收率和产量。将颗粒干燥直到干燥。过度干燥的颗粒可能会降低 DNA 的回收率和产量。 - 从磁铁中取出管子, 加入20µL 10 毫米三盐酸 (pH 8.0)。轻轻地将整个音量调低25倍, 彻底混合。室温下孵育2分钟。将管子放回磁铁上4分钟, 然后将上清液转移到另一管上。
- 用合适的荧光计测量 DNA 的数量 (请参阅材料表)。
- 验证芯片是否成功通过 qPCR (稀释1µL 在100µL H2O 和使用 2-5 µL 为 qPCR)。使用特定的底漆为阳性 (已知的蛋白质结合部位) 和阴性对照 (例如, 一个沉默和/或不感兴趣的蛋白质目标的基因)。
注意: 可以根据套件 (参见材料表) 对要使用的工具包的建议执行库准备工作, 并可进行2的芯片 DNA 处理。
Representative Results
4sU 标记: 验证最佳4sU 标记条件 (凋亡、核应力、胞浆应力)、时间和浓度:高水平的4sU 可以抑制 rRNA 的生产和加工, 诱导细胞质以及核应力30。因此, 需要对细胞的4诱导应力和细胞凋亡进行检测。建议采用西方印迹分析方法可视化 p53 积累, 表明核应力, 增加 phospho-EIF2a 水平, 显示胞浆应力和荧光活化细胞分类 () 对细胞凋亡的分析。高浓度和长时间接触4sU 或药物, 如 thapsigargin 或亚砷酸可用于诱发细胞压力。为诱导凋亡或细胞死亡, 细胞以 BH3I-1 (500 ng/µL) 治疗, 或在95摄氏度 (热休克) 中孵化5分钟。蛋白 V/7-AAD 染色用于测定凋亡 (蛋白 V) 和死亡 (7) 细胞。标记体外生成的主 Th1 细胞为0.5 小时, 500 µM 4sU (最终浓度) 或 1 h, 200 µM 4sU 既不诱发细胞压力或凋亡的迹象 (图 1), 但导致足够的4sU 合并。
RNA 标记时间也可以缩短 (≤5分钟), 这导致短寿命的内含子序列的增加比更长的标记时间。为了可视化共转录拼接率, 4 su 标记时间不应超过30分钟。有关4sUlabeling 的详细信息, 请参阅 Rädle et。19
质量控制:rna 完整性在处理 rna 时是非常重要的。通过 electrophoretical 分析检查4个 biotinylation 标记 rna 的 rna 质量是最方便的 (参见材料表)。考虑从步骤2.2.2 中验证分离的 rna, 特别是在使用它进行总 RNA 序列排序时。rna 完整性编号 (≥8) 应被确认, 以确保 rna 完整性, 以便进一步处理 (图 3)。
Electrophoretical 分析也可以用来验证新转录的 RNA。要知道, 新转录的 rna 含有明显较不成熟的 rRNAs 与总 RNA 相比, 典型的 rRNA 带是不太突出。
核糖体分析: cdna 文库的 PCR 扩增: cdna 放大 (步骤 4.9.1) 是确保良好测序结果的关键步骤。通过 electrophoretical 分析对放大后的库进行分析。一个好的放大库示例显示了大约 140-160 bp (图 4A) 的峰值。应避免使用过多的适配器脂肪酸 (图 4B), 并应根据制造商的协议 (PCR 产品的页面纯化) 进一步纯化这些样品。过多的模板或太多的 PCR 周期会导致过度放大, 其特征是高于预期的分子量带、涂抹的 PCR 产品和适配器二聚体产品 (图 4C)。对于大多数样本 1-5 µL 的发送 cDNA 和 9 PCR 周期的扩增, 通常会产生足够数量的正确的 PCR 产品。
芯片: 染色质剪切:每种类型的细胞都需要调整最佳的剪切条件。预先确定剪切条件 (例如、周期数、高或低功耗)。使用相同数量的细胞和相同体积的测试目的, 因为较低的细胞密度增加剪切效率。尽量避免过度或不受剪切的染色质。大的染色质碎片可以通过堵塞来显著地影响芯片的结果, 过度剪切可以破坏兴趣蛋白上的表位, 导致抗体的结合效率降低。在本实验中, 当剪切染色质的主要分数约为 1000 bp 或稍低 (图 5A) 时, 取得了最佳效果。
通过 qPCR 验证芯片:在启动芯片之前, 最好测试使用的抗体是否适合芯片 (如果可能的话, 使用芯片级抗体) 的芯片 qPCR。在启动库准备之前, 验证芯片是否按 qPCR 排序 (请参见步骤 5.6.5)。设计引物, 绑定到已知的兴趣蛋白质的目标站点。如果一个基因中的确切靶点是未知的, 几个引物对可以用来扫描基因和相关的调控元素。对于 Th1 单元格的 RNAPII 芯片Ifng, 该在刺激时转录上调, 肌动蛋白引物可用作正向控制。Sox9和胰岛素作为一个负控制, 因为这些基因不是在 Th1 细胞中表达的 (图 5B)。记住不要使用外显子-跨越引物, 这通常用于 qPCR 的 mRNA。IgG 控制也可用于证明所用抗体的特异性。Immunoprecipitated DNA 可以用合适的荧光计来测量 (参见材料表)。免疫球蛋白控制的 nonspecifically 绑定 dna 的数量应该大大降低, 与 DNA 的数量绑定的抗体的利益。
复制: 生物学意义的证明:强烈建议对从同一池中开始的所有方法执行动力学实验, 以确保单元格对所有未经处理和治疗的样本具有相同的标识 (图 2)。然而, 建议采取小整除数的主要时间点为每个方法比较样本与生物复制 (例如, 通过 qPCR, 资产管制分析).这允许粗略估计, 如果两个复制的治疗是可重现的, 你可以进行排序。复制的验证应通过 bioinformatical 分析进行。结果的重现性可以用散布图 (图 6) 来评估复制和可视化之间的 FPKM 值之间的相关性。
图 1: 验证无扰动细胞生理学的最佳 4 su 标记条件 (从 Davari et al.11)
(A) 通过资产管制分析法检测细胞凋亡:体外生成的 Th0 细胞以不同浓度的 4sU (括号内表示) 分别治疗0.5 小时、1小时和2小时。BH3I-1 治疗诱导蛋白 V 的凋亡, 而热休克 (5 分钟95摄氏度) 被用来诱导细胞死亡, 由7。(B) 对4sU 治疗和活化 T 细胞 p53 的西方印迹分析: 样品被标记为200µM 4sU, 显示激活时间, 但标记为500µM 4sU 的 0.5 h 时间点除外。(C) 在具有相同标记条件 (B) 的激活 Th1 细胞中 phospho-EIF2a 和总 EIF2a 的西方印迹分析。Thapsigargin 被用来作为一个积极的控制。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 用于跟踪全基因组变化的动力学设置示意图
该方案说明了将4的 su 序列、总 RNA 序列、核糖体剖面和芯片序结合在细胞治疗上研究全基因组变化的设置。池单元格, 并预留所需的单元格数以进行未经处理的控制。为每个方法和时间点处理剩余的单元格和拆分。标签未经处理的/治疗的细胞为4苏序列与4sU 如所述。每个方法的时间点和样本取决于所检查的特定生物学问题。为每个时间点和方法抽取样本, 并遵循协议的专用部分。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 4 个 su 标记 RNA 的质量控制
Bioanalyzer 对活化 Th1 细胞的总 rna 和生物素化 rna 进行了分析。18S rRNA 和 28S rRNA 显示, 并且 rna 完整性数字 (玲) 由仪器给确定 rna 的完整性。应≥8, 以确保 RNA 的完整性。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 核糖体分析库的 Bioanalyzer 配置文件
(A) 一个好的库: 该示例显示了预期大小范围 (140-160 bp) 的峰值, 不需要进一步纯化。(B) 本示例显示了相对于所需产品 (140-160 bp) 的过多适配器二聚体放大产品 (120 bp)。这个图书馆需要进一步的净化。(C) 过度放大的样本: 高于预期的分子量峰值和涂抹的 PCR amplicons 是可见的 (由箭头表示)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: qPCR 剪切和验证芯片后的最佳染色质尺寸
(A) 琼脂糖凝胶图片显示被剪切的染色质的最佳片段大小从三个样品被剪切了25个周期在 sonicator 和纯化如在协议之前描述。(B) 总 RNAPII 芯片 (反 RNA II、8WG16、ab817) 的 Q PCR 结果表示为输入的百分比。Ifng和肌动蛋白引物用作阳性, 而Sox9和胰岛素为负控制 (两种基因均未在活化 Th1 细胞中表达)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 生物复制的比较 (来自 Davari et ) 的数字。11)
在激活 Th1 细胞刺激后, 新转录 (4sU) RNA 4 h 复制之间的表达值 (FPKM) 的代表性散点图比较。绿线表示相等的 FPKM 值和秩相关在每个情节被表明。
| 标签持续时间 (分钟) | 推荐的4sU 浓度 (µM) |
| 120 | 100-200 |
| 60 | 200-500 |
| 15-30 | 500-1000 |
| < 10 | 500-2000 |
表 1: 推荐的4sU 浓度 (从 Rädle, et al.19)
推荐的4sU 浓度的范围是指不同的标签时间。
| 方法 | 单元格编号 | RNA 数量 |
| 4 su 标记 | ≥2 x 107 | ≥60µg |
| 核糖体分析 | ≥2 x107 | |
| 芯片序列 | ≥2 x 107 -3 x 107 |
表 2: 所需的初级 T 细胞数量
每个方法所需的主要 T 单元格的最小数量。使用其他单元格类型时, 金额可以减少。
Discussion
分析基因调控的整个过程是必要的, 以充分理解细胞适应反应特定的刺激或治疗。结合总 RNA 序列, 4 的 su 序列, 核糖体剖面和芯片序列在不同的时间点导致全面分析的主要过程中的基因调控的时间。对生物过程的深刻理解需要定义实验设置和最佳时间点。
由于研究基因调控的方法迅速改善, 这些协议可以适应快速变化。然而, 它们为研究任何类型细胞的基本基因调控机制提供了最重要的方法。在这里, 我们讨论在使用这些方法时必须考虑的一些缺陷和事实。
单元格:细胞必须是高度可行的, 如果使用主隔离细胞, 必须保证细胞数量的纯度 (例如, 主要 T 细胞的资产管制分析)。即使是轻微的压力细胞也会影响这些非常敏感的测序方法的结果, 并降低新转录或翻译的 RNA 的数量, 并导致在测序结果中不需要的应力响应读数。本协议中提到的离心速度对原 T 细胞进行了优化。因此, 根据细胞类型调整速度。
4sU 对细胞生理学的影响:除了上述的选择, 以验证最小摄动的细胞生理学后, 4sU 增加, 进一步和/或额外的分析可以执行, 特别是当细胞数是有限的。对细胞增殖的影响可以通过简单计数标记和未标记的细胞来验证细胞的加倍时间来测试。核仁应力诱导也可以通过免疫荧光染色 nucleolin 和核的细胞形态学来进行测试。为了进一步验证4sU 的影响, 可以通过将从标记的总 rna 到未标记的总 rna 的读计数关联来测量改变的全球基因表达。
单元格编号:对于体外生成的 T 单元格, 建议至少从Table 2中指示的单元格数量开始。根据单元格类型选择每个方法的适当编号。由于 T 细胞的细胞质和 RNA 比其他细胞少, 很可能是其他细胞数量的减少将是足够的。对于芯片序列, 细胞数高度依赖于所使用的抗体和细胞内感兴趣蛋白质的表达水平。对于组蛋白或 RNAPII 芯片, fewe 细胞可以使用, 而细胞数需要增加时, 转录因子的使用, 特别是如果他们是在低级别表达。
4sU 标记和 RNA biotinylation:使用粘附单元格时, 4sU 标记可以按 Rädle et al所描述的那样定向。19由于单元格非常快速地合并了 4sU, 所以可以直接添加到悬浮液、黏附剂或半黏附细胞的培养基中。
建议用 60-80 µg 的 RNA 开始 biotinylation。然而, 虽然我们没有测试少于30µg, 但可以使用较低数量的 rna. 添加一个 coprecipitant (例如, GlycoBlue), 如果颗粒很难看到, 在沉淀 RNA。达菲et也表明, methylthiosulfonate 活化生物素 (MTS-生物素) 比 HPDP-生物素31更有效地与 4 su 标记 RNA 反应。因此, 也许值得考虑改用 MTS-生物素, 特别是用于恢复小 rna, 后者往往有较少的苷残留 (参照达菲的 biotinylation 协议;参见纯化4个 su 标记的 RNA,实验程序)。
为了恢复新转录的 RNA, 有可能使用顺磁性珠或 RNA 清除珠的选择。总是考虑到这些套件可能或可能不会净化特定 rna。例如, 如果您对 miRNAs 感兴趣, 请考虑使用特定的工具包进行 miRNA 捕获和排序。
对新转录的 RNA 进行量化:要准确量化新转录的 RNA, 测量应由适当的荧光计执行 (请参阅材料表)。在1小时的4sU 曝光, 新转录 rna 代表约 1-4% 的总 RNA。新转录的 1 h 标记的 RNA, 活化 T 细胞由 ~ 90-94% rRNA11组成。
核糖体分析:在建立该方法时, 我们确定使用1.5x 的核酸酶量比原始协议中的建议保证了正确的消化。此外, 没有报告的不良影响, 增加了数量的核酸酶。由于 overdigest 的 RPFs 是相当困难的, 而它们是核糖体蛋白所束缚的 RNA 的一部分, 你仍然可以稍微增加滴定最佳核酸酶消化量。
如果在步进4.4.2 中恢复了不到500的爱国阵线 rna, 重复 rRNA 耗尽和池纯化 RPFs 与 rna 清洁 & Concentrator-5 柱。或者, 在胶体 (步骤 4.5.6) 的 RNA 洗脱过程中, 在凝胶 (步骤 4.5.3) 和池凝胶切片上分别加载两个相同的样本。
我们建议把 RPFs 上的凝胶尽可能紧密地切割到28和 30 nt 波段。这有助于从 rRNAs 和 tRNAs 中消除不需要的片段, 随后将成为库的一部分, 并减少对 RPFs 的排序读取。
还建议在凝胶纯化过程中避免紫外线照射。这会造成 RNA 片段中的缺口, 以及嘧啶脂肪酸, 最终会严重影响到图书馆的准备和测序结果。
库的准备和数据排序:核糖体分析协议能够生成适合于排序的 cDNA 文库。4 su 标签生成的样本可以直接用于图书馆准备与任何适当的 RNA 排序套件。由于新转录的 RNA, 特别是当使用短的标记时间, 可能还没有 polyadenylated, 不应进行聚一选择。相反, 我们强烈建议 rRNA 损耗, 以防止减少实际样品的测序深度。使用 T 细胞, 我们开始与 400 ng 新转录和总 RNA (取决于试剂盒, 见材料), 执行 rRNA 耗尽和减少周期 pcr 扩增, 以减少 pcr 偏倚。图书馆的准备工作可以用较少的起始材料进行。要考虑到库的复杂性, 应优化 PCR 循环的数量。
对于芯片序列, 还有许多工具包可供图书馆准备。在我们的手图书馆准备工作很好从 2 ng 芯片脱氧核糖核酸开始 (参见材料为建议在哪个套件使用)。确保在排序过程中检查颜色平衡的索引。我们建议≥40 x 106的测序深度分别读取4个 su 序列、总 RNA 序列和切屑样本, ≥80 x 106读取核糖体分析样本。测序深度取决于样品和下游生物信息学分析, 应慎重考虑。为了分析 cotranscriptional 拼接的内含子读数, 需要选择 100 bp 配对端测序。
排序偏差:在确定转录、翻译或转录因子结合的全球变化时, 测序已成为黄金标准。近年来, 现有的方法被推向极限, 或者开发出新的技术来测序越来越小的 RNA 起始量。这需要扩增 cDNA, 引入噪声或偏倚。最近, 开发了独特的分子标记 (UMIs), 以实验确定 PCR 引入的重复性。最近, 人们发现, UMIs 只是轻微地提高排序能力和错误发现率的差异基因表达式32。不过, 考虑使用独特的分子标识符 (UMIs) 来控制库的复杂性, 特别是从低数量的 RNA 开始, 以及当需要许多 PCR 周期时。
缓冲区和库存解决方案:所有4个 su 序列和核糖体剖面的缓冲器必须在严格的无 RNase 条件下使用核酸酶水来制备。建议购买预先制作的无核酸酶氯化钠, 三盐酸, EDTA, 柠檬酸钠和水。为确保核酸酶的条件, RNase 净化解决方案可用于清洁吸管或表面。所有芯片序列的缓冲器都需要至少 DNase, 并且可以在室温下存储。在使用和保持冰之前, 总是添加蛋白酶抑制剂, 或者是磷酸酶抑制剂。
生物信息学:分析所有测序数据 (即、芯片序列、RNA 序列和 ribsosome 分析) 涉及质量控制 (例如, 使用 FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), 适配器修整 (例如, 与cutadapt20), 然后映射到研究中的细胞的参考基因组。对于 rna 序列数据 (总共和4个 su 序列) 以及核糖体分析数据, 需要一个拼接的 RNA 序列映射器, 如 ContextMap 221。对于芯片序列数据 unspliced 对齐, 使用 BWA22是足够的。基因表达式可以使用 RPKM 模型 (每百万片段映射的外显子 Kilobase 读取)1, 在确定每个基因的读计数后使用一个程序,例如featureCounts23来计算。对于来自芯片序列数据的峰值调用, 有许多程序可用,例如、mac24或 GEM25。可以在 R26中执行进一步的下游分析, 特别是使用由 Bioconductor 项目27提供的工具。
在这里, 从核糖体分析中集成 4sU-和总 RNA 水平和平移活动的一个主要挑战是规范化的。解决这个问题的一个经典方法是规范化到保持家庭基因的水平。为了减少由于个体饲养基因随机波动而产生的噪音, 建议不要只使用少量的保留基因, 而是要在较大的集合中中位数,例如由艾森伯格和莱瓦诺编写的 > 3000 家保留基因28.对于从4sU 到总 rna 的比率计算 rna 更替率, 规范化是基于中位更替率 (例如, 假设 rna 半衰期为 5h)29。然而, 由于这不假设对保留基因的整体变化, 我们建议使用独立于规范化的分析方法,例如, 基于关联的不同数据类型的时间序列的聚类, 以确定基因组在激活过程中具有明显的转录和翻译行为。有关不同数据类型的 bioinformatical 集成的详细说明, 请参阅原始发布11。
营业额率和数据集成分析:最近发表的一篇论文33将多路复用基因控制 (MGC) 确定的半衰期与全球方法进行比较, 可以表明半衰期与其他方法 (如) 相比, 与代谢标记法获得的寿命最佳。药物转录的一般抑制)。但是, 应该指出, 半衰期计算之间的差异可能会出现, 并且已被描述为15、34。我们解释了由于长时间4sU 暴露引起的压力反应所引入的大多数问题和差异。因此, 排除 4 su 标记引入的应力响应是必不可少的。为了进一步验证周转率, 我们建议使用 MGCs。
此外, 此处生成的数据集还可用于更综合的数据分析 (例如, 对长的非编码 rna 的调节)35,36。
Disclosures
作者声明他们没有竞争的财政利益。
Acknowledgments
我们感谢拉斯 Dölken 为初级 T 细胞建立4sU 标记的建议;伊丽莎白. 格拉夫和托马斯 Schwarzmayr 在图书馆代和测序方面提供重要帮助;德克 Eick 和安德鲁弗拉特利提供 RNAPII 和 T 细胞抗体;n. 亨利埃特 Uhlenhaut 和 Franziska Greulich 帮助图书馆准备芯片序列;卡罗琳 c. 弗里德尔得到德意志 Forschungsgemeinschaft (DFG) 赠款 FR2938/7-1 和 CRC 1123 (Z2) 的支持;Elke Glasmacher 由德意志 Forschungsgemeinschaft (DFG) 和德国糖尿病研究中心 (DZD)、亥姆霍兹姆霍兹慕尼黑的赠款 GL 870/1-1 支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4sU-labeling | |||
| 4-thiouridine (100 mg) | Carbosynth | 13957-31-8 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at –20°C in aliquots of 50-500 µl; do not refreeze. |
| 1.5 ml safe-lock tubes | Eppendorf | 30121589 | Optional |
| 1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72692005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
| 2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72694005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
| Chloroform | Sigma Aldirch | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.1 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh |
| Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
| EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg) | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4°C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Isopropanol | Merck | 1.09634.1011 | |
| NaCl (5M) | Sigma Aldrich | 71386 | Stock solution |
| nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
| Nuclease-free H2O | Sigma Aldrich | W4502 | Stock solution |
| nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4 | Lonza | 51237 | Stock solution |
| Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml) | 5Prime | 2302830 | Use in step 1.3.4. |
| Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 × g |
| QIAzol Lysis Reagent (200 ml) | Qiagen | 79306 | Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol) |
| Qubit RNA HS assay kit | Life Technologies | Q32852 | Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11 |
| RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Optional; includes Buffer RLT |
| Sodium citrat | Sigma Aldrich | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| µMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store at 4°C, includes µMacs columns used in step 1.4.6. (store at RT) |
| Cell viability and stress assay | |||
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences | 559763 | Optional |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Optional |
| p53 | abcam | ab26 | Optional |
| p-EIF2a (Ser51) | Cell Signaling | 9721 | Optional |
| BH3I-1 | Sigma-Aldrich | B 8809 | Optional |
| Buffers | |||
| 4sU Washing Buffer | store at RT | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O | |
| Biotinylation Buffer (10x) | store at 4 °C | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4°C | |
| RNA precipitation buffer | store at RT | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | |
| Equipment | |||
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10 |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | Optional |
| UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3 |
| High-speed centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Multifuge X3R | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000 × g |
| High-speed rotor | Thermo Scientific | Fiberlite F15-6 x 100y | |
| Adaptors for 15 ml tubes | |||
| Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | Or equivalent. |
| Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 µMacs columns. |
| Ultra-fine scale | Mettler Toledo | ML204T | Or equivalent. |
| E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
| E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |
| DynaMag-2 Magnet-1 each | Life Technologies | 12321D | |
| RNaseZap | Sigma | R2020 | Optional |
| TruSeq stranded total RNA library prep kit | Illumina | RS-122-2201 | Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit |
| Nanodrop | Thermo Scientific | use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration | |
| Ribosome Profiling | |||
| TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPYSC12116 (Yeast) | |
| TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPHMR12126 (Mammalian) | |
| Illustra MicroSpin S-400 HR Columns | GE Healthcare | 27-5140-01 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 kit | Zymo Research | R1017 | |
| RNA Clean & Concentrator-5 kit | Zymo Research | R1015 | |
| Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) | Illumina | MRZG126 or MRZG12324 | |
| (High Sensitivity DNA Kit) | Agilent Technologies | 5067-4626 | Already needed for 4sU-seq |
| All other consumables and equipment are listed in the User guide | !!! | Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels) | |
| ChIP | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) | gereral lab supplier | ||
| 100 bp Plus Marker | Thermo Fisher | SM0323 | |
| 16 % Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | Add to a final concentration of 1 % |
| 70% EtOH | gereral lab supplier | Always prepare fresh | |
| Agarose | gereral lab supplier | ||
| Agencourt RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
| ChIP library preparation kit | KapaBiosystems | KK8504 | Or use the kit of your choice |
| DNA low bind microcentrifuge tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | or equivalent |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use |
| Glycine | gereral lab supplier | Prepare a 2M stock solution | |
| Glycogen | Roche | 10-901-393-001 | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4. |
| Phosphatase Inhibitor (PhosStop) | Roche | 4906837001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
| Power SYBRgreen Master mix | Thermo Fisher | 4367659 | |
| Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer |
| Rnase, DNase free | Roche | 11-119915001 | |
| Salmon sperm (sonicated to around 100bp) | Sigma | D1626 | |
| TE pH 8.0 | gereral lab supplier | ||
| Antibodies (ChIP grade if possible) | |||
| anti-RNA Pol II [8WG16] | abcam | ab817 | |
| anti-Histon H3K36me3 | abcam | ab9050 | |
| or antibody of interest | |||
| Buffers | |||
| Binding/Blocking buffer | Store at RT | PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20 | |
| Cell-Lysis buffer | Store at RT | 5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40 | |
| ChIP IP buffer | Store at RT | 0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7 mM NaCl | |
| Elution buffer | Store at RT up to 6 months | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS | |
| Nuclei-Lysis buffer | Store at RT | 50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS | |
| Wash buffer I | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl | |
| Wash buffer II | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 500 mM NaCl | |
| Wash buffer III | Store at RT | 0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 8.1 | |
| Equipment | |||
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | use this instrument for electrophoretical analysis |
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml | Diagenode | C30010010 | |
| or tubes special for your sonication device | |||
| Bioruptor sonication device or sonication device of your choice | Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 µl each tube) | ||
| Magnetic stand for tubes | |||
| Thermomixer | |||
| Agarose gel electrophoresis | |||
| Qubit Fluorometer | Thermo Scientific | Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA |
References
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