Summary
פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.
Abstract
בעת ההפעלה, תאים לשנות במהירות את התוכניות הפונקציונלית שלהם, וכך, פרופיל ביטוי גנטי. מסיבית שינויים בביטוי הגנים להתרחש, לדוגמה, במהלך התמיינות מורפוגנזה, גירוי פונקציונלי (כגון הפעלה של תאים חיסוניים), או לאחר חשיפה תרופות וגורמים אחרים מן הסביבה המקומית. בהתאם לסוג הגירוי ותא, שינויים אלו מתרחשים במהירות, בכל רמה אפשרית של הכונה. הצגת כל התהליכים מולקולרית של תא מגיבה לסוג מסוים של גירוי/סמים היא אחת המשימות הקשה ביותר בביולוגיה מולקולרית. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח בו זמנית של שכבות מרובות של הכונה. אנו משווים, בפרט, גורם שעתוק מחייב (כרומטין-immunoprecipitation-רצף (צ'יפ-seq)), דה נובו שעתוק (4-thiouridine-רצף (4sU-seq)), עיבוד mRNA, ו מחזור, וכן תרגום (ריבוזום יצירת פרופיל). על ידי שילוב שיטות אלה, זה אפשרי להציג קורס מפורט של הגנום כולו של פעולה.
קביעת רצף הרנ א לאחרונה משועתקים מומלצת במיוחד בעת ניתוח במהירות התאמה או שינוי מערכות, מאז זה מתאר את הפעילות תעתיק של כל הגנים בזמן החשיפה 4sU (ללא קשר אם הם למעלה - או downregulated). השימוש קומבינטורית RNA הכולל-seq והגדרת פרופיל ריבוזום בנוסף מאפשר חישוב המחירים מחזור ותרגום RNA. ניתוח Bioinformatic של תפוקה גבוהה רצף תוצאות מאפשר אמצעים רבים עבור ניתוח ופרשנות של הנתונים. הנתונים המופקים גם מאפשר מעקב אחר co-transcriptional ואלטרנטיבית שחבור, רק כדי להזכיר כמה תוצאות אפשריות.
הגישה המשולבת המתוארים כאן יכול להיות מיושם עבור אורגניזמים מודל שונה או סוגי תאים, כולל ראשי תאים. יתר על כן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורט עבור כל שיטת שימוש, כולל פקדים איכות, ולדון בבעיות פוטנציאליות ואת החסרונות.
Introduction
בשנים האחרונות, RNA-רצף (RNA-seq) הפכה להיות הכלי סטנדרטי כדי לנתח כל ביטוי RNAs בתוך תא או של האורגניזם1. עם זאת, כדי להבין את כל התהליך של תאים בהתאמת בתגובה לגירוי/תרופה ספציפית, יש צורך לקבוע באופן מלא כל התהליכים שבבסיס, החל mRNA שעתוק עיבוד, תחלופה של תרגום. שינויים לטווח קצר שעתוק RNA בקושי נמדד על ידי הכולל RNAseq, מאז שינויים של RNA הכולל תלויים גורמים למשל RNA מחצית החיים ופעילות תעתיק, אשר הם תבנית המסכן עבור המשקף את העיבוד של תאים השפעות סביבתיות2,3. ואכן, מגוון רחב של טכניקות רצף חדשות פותחו לאפשר ניתוח של שלבים שונים בתהליך ג'ין תקנה4 בשילוב בצורה נכונה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב כמה טכניקות רצף די בקלות החלים המאפשרים מעקב אחר ברגולציה של שכבות חיוני של mRNA באופן השוואתי. ניתוח פעילות גנים ברמת השעתוק, מגוון שיטות תוארו, כגון כובע-אנליזה של ג'ין ביטוי (קייג ')5, התארכות יליד התעתיק רצף (NET-seq)6ו ברמת הגנום הגרעיני שלא נגמרות (GRO-seq)7 , 8, bromouridine-רצף (ברו-seq) וכן 4-thiouridine-רצף (4sU-seq), אשר השתמש מטבוליטים זה משולבים החדש עיבד RNA9,10, רק כדי להזכיר כמה. בעוד כלוב מזהה האתר התחלה שעתוק מדויק, נטו-seq, GRO-seq לספק מידע מדויק יותר על קריאת ההוראות ו- 4sU-seq (שהיא השיטה המתוארת כאן) מזהה רק לאחרונה עיבד RNA. עם זאת, 4sU-seq היא רגישה מאוד, יכול להיות מיושם במסגרות זמן שונות כדי למדוד כמותית פעילות גנים ברמת השעתוק שינוי אקטיבי תאים, כמו גם שינויים כמותיים עיבוד mRNA (וזה קורה בתוך דקות)9, 11,12. יתר על כן, 4sU-seq אידיאלי לשלב עם ה-RNA-seq לחישוב RNA מחזור המחירים עבור גנים9. שעתוק של ה-mRNA מתבצעת על ידי RNA פולימראז II (RNAPII), אשר בתורו מושפע על ידי מספר רב של גורמים, כגון גורמי שעתוק, שינויים היסטון, מפעילים/repressors כללי זה יכול גם להיות חלק תעתיק מורכבות. כדי לבדוק כמה גנים/יזם/משפר אזורים מאוגדים על ידי גורם אחד, צ'יפ-seq פותחה, אשר נקרא כיום השיטה הרגילה למטרה זו, עקב נוגדנים זמינים מסחרית רבים13. עם זאת, למרות ChIPseq נותן מידע ברור על איפה ויסות גורמים bind, זה לא משקף אם זה אכן מוביל לשינויים שעתוק14. לכן, ביצוע שבב-seq עם 4sU-seq הוא השילוב האידיאלי לשאלות כאלה ביולוגי. בקרת גנים יכול להתרחש גם בשלב מאוחר יותר, מאז ה-mRNA ורמות החלבון לא בהכרח מתאימות15,16, המציין תקנה משמעותי פוטנציאלי translational או post-translational רמת, בהתאם להקשר. בשנת 2011, ריבוזום פרופיל היו כבר קודם בשילוב עם ה-RNA-seq והוא עכשיו השיטה של בחירה כדי לכמת את השינויים המתרחשים במהירות חלבון, שכן עדיין יש כמה מגבלות רגישות עם ספקטרומטר מסה17. אכן, תעריפי התרגום המתקבל שיטות כאלה הוכחו לספק הערכה טובה יחסית של שינויים ברמות החלבון (נמדד לפחות ליצירת שינוי ארוך טווח) ולאפשר מבט מפורט אפילו יותר על התהליך של תרגום, למשל הנחישות של תרגום בצד התחלה ואלטרנטיבית מסגרות17. השימוש קומבינטורית בכל ארבעת השיטות ניתן להשתמש במצב יציב, בין סוגי תאים שונים, או בסדרתי זמן הניסוי התא המשתנה במהירות11. שימוש זה מספק סקירה ברמת הגנום של שינויים באיגוד פקטור שעתוק המשפיעים על שעתוק RNA, עיבוד, תרגום.
Protocol
כל השיטות הן בהתאם ותאימות עם המנחים מוסדיים, מדיני ופדראלי הלמהולץ זנטרום מינכן.
1. הכנה
- להכין תוכנית מפורטת של ההתקנה ניסיוני כולל לוח זמנים, מתי להוסיף 4sU המדיום התרבות תאים, ומתי לקצור את התאים. עבור כל אחת מהשיטות. בהתאם השאלה ביולוגי, לשקול היטב את נקודות זמן על הציור לדוגמה, תיוג 4sU זמן, ריכוז (טבלה 1).
הערה: לבדוק את השפעת 4sU על הכדאיות תא, להדגיש תגובה מראש (ראה "אימות תיוג 4sU תנאים אופטימליים" נציג תוצאות, איור 1). מומלץ לבצע בדיקה ראשונית של כל שיטה עם דוגמא אחת לפחות. בדוק אם האיכות והכמות של RNA/DNA מספיקה עבור רצף עמוק (ראה ייעודי חלקים של הפרוטוקול), תרגול מהר אך טיפול עדין של התאים במהלך הניסוי. - לחשב את מספר התאים הדרושים עבור כל נקודת הזמן של כל שיטה (ראו טבלה 2 הערכה גסה בעת השימוש העיקרי T תאים). כמו כן, שקול רצף פחות דגימות של RNA הכולל מזה של 4sU RNA (למשל, רק בשביל שיעורי תרגום נקודת זמן או תחלופת RNA המחירים יש לחשב). כדי לאשר ולאמת את המשמעות של התוצאות (מומלץ), ליצור שכפול ביולוגי אחד לפחות.
הערה: חשוב, עבור כל שיטות ונקודות זמן רצופים, דגימות חייב להיות מאותו מאגר ההתחלתי של תאים. חוקר ייעודי אחד לפחות עבור כל שיטת מומלץ. - להכין את כל הדרוש מראש (למשל, aliquoted 4sU, cycloheximide, מאגר פירוק יונקים ו 1% פורמלדהיד). לאחר תוספת של 4sU, למנוע חשיפת לתאים אור בהיר, משום שזה עלול לגרום crosslinking של התווית על-ידי 4sU RNA ל החלבונים18.
- מאגר כל התאים של עניין אחד את הבקבוק רק לפני הטיפול (איור 2). לספור את התאים (למשל, עם hemocytometer) ולהשתמש הכמות הדרושה עבור הפקד אינו מטופל של כל שיטה (אל תשכחו לתייג גם את הפקד אינו מטופל עבור 4sU-seq עם 4sU). לטפל בתאי שנותרה, מיד לפצל את המספר הנדרש של תאים עבור כל נקודת זמן וכל שיטה. להתמודד עם תאים מהר ככל האפשר כדי למזער את מתח עקב שינויי טמפרטורה או CO2 רמות.
הערה: לדוגמה, דגימות נלקחות h 1, 2 h, 3 שעות לאחר הטיפול, אזי רבע אחד של התאים ישמש לשליטה ללא טיפול, שלושה רבעים משמשים לשליטה שטופלו.
2. 4sU-תיוג
הערה: פרוטוקול זה שונה מ- Rädle, et al. 19 מתייחסים נהלים למידע נוסף אודות תיוג מטבולית עם 4sU. עבור כל שיטות ונקודות זמן רצופים, דגימות חייב מקורן באותה הבריכה ההתחלתי של תאים.
-
התחלה של תיוג
- הפשרה 4sU aliquoted רק לפני השימוש. להוסיף 4sU בכל נקודה בזמן ישירות המדיום המכיל תאים עניין (עיין בטבלה 2 למספרים תא T המומלצת, RNA 60 µg לפחות לכל נקודת זמן), מערבבים בעדינות, ומניחים בחזרה לתוך החממה. השלך שנותרו 4sU (לא להקפיא מחדש).
- בסוף תיוג, לאסוף תאים (למשל, תא במגרדת) צנטריפוגה ב 330 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C צינורות פוליפרופילן (אשר לעמוד בפני כוחות g גבוה). האחות בינונית ומוסיפים ריאגנט לבידוד RNA (≥1 מ"ל לכל 3 x 106 תאים, ראה חומרים עבור המלצה לשימוש) כדי כל שפופרת. Resuspend בגדר (≥1 מ לכל 3 x 106 תאים), תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ומקפיאים באופן מלא דוגמאות ב-20 ° C. דוגמאות ניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס במשך חודש לפחות.
התראה: ריאגנטים המשמש לבידוד RNA הם מאוד מסוכנים כאשר ליצור קשר עם העור או העיניים. להתמודד עם הטיפול ולשקול בהתאם להוראות הבטיחות.
-
רנ א הכנה באמצעות שינוי RNA בידוד פרוטוקול
- מוסיפים כלורופורם 0.2 מ"ל לכל 1 מ ל ריאגנט לבידוד RNA, ומערבבים היטב ע י ניעור בשביל להמשיך ס' 15 כאמור בפרוטוקול תיוג מטבולית (שלב 1-12, 2. רנ א הכנה באמצעות שינוי פרוטוקול trizol) מ- Rädle et al. 19
- למדוד את ריכוז ה-RNA (ראה טבלה של חומרים), על פי הוראות היצרן. השתמש RNA הזה עבור הכולל RNA seq גם כן (ראה שלב 3. סה כ RNA-seq) או לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס במשך חודש לפחות.
-
תיול ספציפי Biotinylation של RNA משועתקים לאחרונה
- להתחיל עם 30-80 µg של RNA סלולרי הכולל. 60 µg RNA אמור להניב כמויות מספיקות של RNA לאחרונה משועתקים.
- להכין את התגובה תיוג. פיפטה לפי הסדר הבא (לכל µg RNA): µL 1 10 x מאגר Biotinylation, 7 µL RNA (המכיל 1 µg RNA מעורבבת עם H ללא נוקלאז2O), ו- µL 2 ביוטין-HPDP (1 mg/mL). מוסיפים ביוטין-HPDP אחרונה ומערבבים מיד על-ידי pipetting. לעטוף את צינורות ברדיד אלומיניום, כדי למנוע חשיפה לאור בהיר. ראו הדיון על אלטרנטיבה ביוטין-HPDP. תקופת דגירה-RT של 1.5 h עם סיבוב.
- צנטריפוגה המתאים mL 2 צינורות (ראה טבלה של חומרים) ב 15,000 g x עבור 2 דק Pipette כל biotinylated ה-RNA לתוך הצינור mL 2 סובב מראש, הוסף אמצעי שווה של כלורופורם, מערבבים היטב. תקופת דגירה של 2-3 דקות עד השלבים להפרדת ובועות מתחילים להיעלם.
- צנטריפוגה ב 15,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C. להעביר בזהירות מימית השלב העליון לתוך צינור חדש.
- חזור על שלבים 2.3.3. 2.3.4. פעם אחת. להוסיף 10% הנפח של NaCl (5 מ') ואמצעי אחסון שווה של אלכוהול איזופרופיל השלב מימית. צנטריפוגה ב 20,000 x g עבור 20 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
- הוסף שאמצעי שווה להתמחויות 75% אתנול. צנטריפוגה-20,000 g x. להשליך תגובת שיקוע, ספין בקצרה, ולהסיר האתנול הנותרים. מלא resuspend 30-100 µL H2O (שימוש 1 µL H2O לכל 1 µg, קלט רנ א מ שלב 2.3.1) על ידי ערבוב פיפטה.
- לוודא תקינות RNA על ידי ניתוח electrophoretic, או לקחת את aliquot וודא מאוחר יותר.
-
הפרדת החדש עיבד (תוויות), המקובץ RNA (ללא תווית)
- הסר פאראמגנטיים חרוזים (ראה טבלה של חומרים) של אחסון 4 ° C, ומשהים לפחות 30 דקות להביא אותם לטמפרטורת החדר. חום 4sU כביסה מאגר (3 מ"ל לכל דגימה) עד 65 ° C.
- הכן 100 מ מ dithiothreitol (DTT) פתרון. שוקל DTT בקנה מידה ultra-בסדר, להוסיף את הכמות הנדרשת של נוקלאז ללא מים. תמיד להכין טרי. השתמש µL 200 עבור דגימה.
- מחממים biotinylated RNA דגימות (µg 1/µL) עד 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות denature ומניחים מיד על קרח. להוסיף 100 חרוזים streptavidin µL biotinylated RNA, דגירה-RT למשך 15 דקות עם סיבוב.
- מקום עמודת המתאים (ראה טבלה של חומרים לקבלת המלצות) לכל אחד לטעום לתוך העמדה מגנטי, מראש equilibrate כל עמודה עם 1 מ"ל בטמפרטורת החדר 4sU כביסה מאגר.
הערה: זה לוקח כ 5-10 דקות. אם אף אחת מהעמודות אל תיזום ניקוז לאחר 5 דקות, לחץ בעדינות על העמודה עם אצבע בכפפות. - שילוב RNA/חרוזים חלות על האמצע של כל עמודה. למחוק את הזרימה דרך, אלא אם כן RNA ללא תווית צריך להיות התאושש. אם כך, לאסוף את הזרימה דרך לפחות לשטוף את הראשון. לבצע את השחזור של RNA כפי שתואר על ידי. Rädle et al. (שלב 1-7, 7. שחזור של RNA ללא תווית, לא מאוגד)19.
- לשטוף שלוש פעמים עם 0.9 mL 4sU כביסה מאגר (טרופה עד 65 ° צלזיוס, משלב 2.4.2.) ומאגר 0.9 מ ל RT 4sU כביסה, בהתאמה.
- השתמש חרוזים פאראמגנטיים לשחזר RNA לאחרונה משועתקים. פיפטה µL 400 של RT מפוזר היטב פאראמגנטיים חרוזי צינור לכל דגימה ומקום מתחת כל עמודה. Elute RNA משועתקים לאחרונה עם 100 µL 100 מ מ DTT. להמתין 3 דקות ולבצע • השני של תנאי עם 100 µL 100 מ מ DTT. (אופציונלי: לבצע • תנאי ושחזור כפי שתואר על ידי. Rädle et al.) 19
- מיקס לאחרונה עיבד RNA/חרוזים ביסודיות על ידי פיפטה ערבוב 10 פעמים והמשך לפי הנחיות היצרן. Elute רנ א ב 11 µL נטולת נוקלאז H2RNA O.Quantify באמצעות fluorometer מתאים (ראה טבלה של חומרים). ניתן לאחסן RNA ב-80 מעלות צלזיוס במשך חודש לפחות.
הערה: לאחרונה עיבד RNA יכול לשמש כדי להתכונן cDNA ספריות הדור הבא רצפי (ראה טבלה של חומרים עבור הצעה לערכה לשימוש) או ניתוחים במורד הזרם. 100 - 500 ng RNA מספיקים עבור רוב ערכות הכנה של הספרייה, (ראה דיון).
3. RNA-Seq הכולל
- סעו ישירות RNA 4sU הנקרא RNA לאחר הכנה RNA באמצעות הכימית ששונה עבור פרוטוקול בידוד RNA RNA הכולל-seq (ראה צעד 2.2.2).
- הכנה ספריה, לדלל aliquot RNA כדי ריכוז סופי של 50-100 ng / µL. להשתמש בערכה זהה עבור ספריית הכנה של RNA לאחרונה משועתקים. 100 - 500 ng RNA מספיקים עבור רוב ערכות הכנה הספרייה.
4. ריבוזום פרופיל
הערה: עבור כל שיטות ונקודות זמן רצופים, דגימות חייב להיות מאותו מאגר ההתחלתי של תאים. לקבלת המלצות לערכה להשתמש, עיין בטבלה של חומרים.
- הכנה ובידוד של ריבוזום מוגן קטעים (RPFs):
- השתמש כמויות מתאימות של תאים עבור כל נקודת זמן (עיין בטבלה 2 למספרים תא T המומלצת). פנקו תאים חסיד עם cycloheximide כמפורט בפרוטוקול של היצרן.
התראה: Cycloheximide הוא רעיל מאוד, עשוי לגרום מוטציות. להימנע במגע עם העור אינהלציה. - לאסוף ובריכת הלא - או למחצה - adherent תאים בכל פעם הצבע לתוך צינור פוליפרופילן אחד ולהתאים את הריכוז הסופי עונה 1 פרק 106 תאים לכל mL של תאים ספציפיים בינונית (למשל, RPMI שהושלם עבור T תאים). להוסיף cycloheximide עם ריכוז סופי של 0.1 mg/mL, לערבב על ידי היפוך צינור פוליפרופילן ותקופת דגירה של דק 1 צנטריפוגה תאים עבור 5 דקות ב g x 330 ב 4 º C. האחות בינוני ולשטוף תאים עם פחות 10 מ"ל PBS בתוספת cycloheximide (הריכוז הסופי של 0.1 mg/mL).
- צנטריפוגה תאים עבור 5 דקות ב g x 330 ב 4 º C. האחות בינונית, להוסיף מאגר פירוק בתרבית של תאים µL 100 לכל 10 x 106 תאים. לערבב על-ידי pipetting, לגרש דרך מחט סטרילית 25 קליבר 22 כדי lyse התאים לחלוטין.
- להעביר את התא lysate צינור precooled 1.5 mL. תקופת דגירה של 10 דקות על הקרח עם היפוכים תקופתיים. צנטריפוגה 10 דקות ב 20,000 g x ב 4 ° C כדי להבהיר את lysate. להעביר את תגובת שיקוע צינור precooled 1.5 mL.
- להכין 1:10 דילול של lysate עם מים ללא נוקלאז הקריאה260רשומת A ספקטרופוטומטרים. כדי להשתמש במים נטולי נוקלאז ריק של 1:10 דילול בתרבית של תאים פירוק מאגר התקנית. לחשב את A260/mL ריכוז lysate לפי המשוואה הבאה:
(260 תא lysate -260 בתרבית של מאגר פירוק) x פקטור 10 דילול = /mL260 - צור aliquots µL 200 של lysate על הקרח והמשך בעזרת נוקלאז טיפול.
הערה: לחלופין, להתכונן µL 100 aliquot RNA הכולל, להוסיף 10 µL 10% למען חברה דמוקרטית ולערבב. לאחסן ב 4 ° C והמשך עם 4.3.2. מומלץ להשתמש RNA הכולל מ- RNA התווית על-ידי 4sU (ראה שלב 3. סה כ RNA-seq).
- השתמש כמויות מתאימות של תאים עבור כל נקודת זמן (עיין בטבלה 2 למספרים תא T המומלצת). פנקו תאים חסיד עם cycloheximide כמפורט בפרוטוקול של היצרן.
- הריבוזום footprinting
- לבצע טיפול נוקלאז מיד ללא מקפיא את lysate. להוסיף יחידות 7.5 של נוקלאז (כלול בערכה המומלצת) עבור כל A260 של lysate. לדוגמה: A 80260/mL lysate x lysate x 7.5 U/A260נוקלאז 0.2 מ"ל = 120 נוקלאז U.
הערה: לחלופין, titrate של נוקלאז לעיכול כפי שתואר על ידי היצרן. - דגירה התגובה נוקלאז למשך 45 דקות ב RT עם ערבוב עדין. הקפאת 200 aliquots µL של lysate עם חנקן נוזלי, לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס, או לעצור את התגובה נוקלאז על-ידי הוספת 15 µL RNase המדכא כל µL 200 aliquot, המשך לשלב 4.3.2.
- לבצע טיפול נוקלאז מיד ללא מקפיא את lysate. להוסיף יחידות 7.5 של נוקלאז (כלול בערכה המומלצת) עבור כל A260 של lysate. לדוגמה: A 80260/mL lysate x lysate x 7.5 U/A260נוקלאז 0.2 מ"ל = 120 נוקלאז U.
- טיהור של RPFs
- הקפאת דוגמא אחת של נוקלאז מתעכל RPFs ולהוסיף 15 µL RNase מעכב. שומרים את הדגימות על קרח.
- לטהר את RPFs לפי הפרוטוקול של היצרן (טיהור טור מומלץ) ולמדוד את ה-RNA התרכזות ספקטרופוטומטרים.
- rRNA דלדול
- השתמש µg 5 של RPFs מטוהרים דלדול rRNA.
- פעלתי לפי הנהלים של היצרן (שלב 1-2, דלדול rRNA ראשי) עבור דלדול rRNA מדד ה-RNA ריכוז rRNA דלה RPFs על ספקטרופוטומטרים.
- דף טיהור של RPFs
- שימוש 500 ננוגרם של rRNA דלה RPFs לטיהור דף.
- היכונו טיהור דף הבקרה RNA, דגימות, סולם. מיקס 5 µL 5 µL denaturing ובקרה RNA ג'ל בטעינת צבע צינור microcentrifuge 0.5 mL. מיקס 10 µL של כל RPF עם 10 µL של denaturing ג'ל טעינה, בהתאמה. להכין סולם aliquot (4 µL 20/100 הסולם, מים ללא נוקלאז 1 µL ו 5 µL denaturing ג'ל בטעינת צבע). . לטעון את זה בין כל מדגם ובקרה כדי למנוע crosscontamination.
- Denature סולם ודוגמאות על ידי המקננת ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומניחים מיד על קרח. לטעון µL 20 של כל דגימה (לחלופין, לטעון 10 µL, להקפיא, שנותרו דגימות ב- 20 ° C) המופרדות באמצעות 10 µL של הסולם מוכן על גבי ג'ל אוריאה-לזיהוי 12% או 15%. לטעון µL 10 של פקד ה-RNA. הפעל את הג'ל עד הלהקה bromophenol הכחול מגיע לתחתית של הג'ל (180 V, ~ 70 דקות) (איור 3).
- מכתים את הג'ל על פי הפרוטוקול של היצרן-4 מעלות צלזיוס. השתמש transilluminator של אפל-שדה הפולטת אור כחול כדי להמחיש את הרנ א. לסלק פרוסות ג'ל עבור כל דגימה המתאים ~ 28 ו- 30 nt אורך. להשתלט RNA כהפניה, לסלק אותה.
הערה: RPFs גלויים בקושי. לסלק פרוסות את הגודל שצוין על-ידי הפקד RNA - המכיל שני oligos של nt 28 ו-30 אורך - אפילו אם הדגימות אינם גלויים. - לנקב חור בתחתית של 0.5 mL microcentrifuge צינורות עם מחט סטרילית 20 גאייג?. העברת כל פרוסה ג'ל לתוך צינור נפרד וצינורות המקום הכתיר צינור 1.5 מ. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב- 12,000 x צנטריפוגה חוזר ג'י אם פרוסות ג'ל לא לגרוס לחלוטין לתוך הצינור 1.5 mL.
- Elute את הרנ א מ ג'ל שיבשו פרוסות עם מים ללא נוקלאז µL 400, µL 40 אמוניום אצטט (5 מ') 2 µL מרחביות (10%) כל לילה ב- 4 מעלות צלזיוס.
- העברה של slurry 1.5 mL מסנן צינורות (מסופק עם הקיט מומלץ) עם טיפ פיפטה 1 מ"ל (wide נשא עצה או עצה 1 מ"ל מתוצרת עצמית עם קצה חיתוך). צנטריפוגה למשך 3 דקות ב g x 2,000 להפריד eluted RNA של ג'ל פרוסות. בעדינות פיפטה תמיסה מימית לתוך צינור 1.5 מ. להוסיף 2 גליקוגן µL (מסופק עם הקיט המומלצת) ו- 700 µL 100% אלכוהול איזופרופיל, חנות ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה.
- צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ב- 13,000 x g... להשליך תגובת שיקוע. לשטוף את גלולה עם אתנול 80% שזה עתה הוכנו מראש צוננת ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות-13,000 x ג להשליך תגובת שיקוע, מילה נהדרת... Resuspend כל מדגם 20 µL והפקד RNA מים נטולי נוקלאז µL 8. לאחסן ב-20 ° C, במידת הצורך.
- פיצול, סוף תיקון, 3' מתאם מצדו, שעתוק במהופך
- בצע את ההליך כמתואר על-ידי הפרוטוקול של היצרן (פיצול ואת הקצה 3' מתאם מצדו, ותיקון, שעתוק במהופך).
- דף טיהור של cDNA
- להכין דגימות, ובקרה RNA הסולם לטיהור דף: מיקס 10 µL של כל מדגם ושליטה RNA עם 10 µL denaturing ג'ל בטעינת צבע, בהתאמה. להכין סולם aliquot (4 µL 20/100 סולם, 1 µL נוקלאז ללא מים, 5 µL denaturing ג'ל טוען צבע). . לטעון את זה בין כל מדגם ובקרה כדי למנוע crosscontamination.
- Denature סולם ודוגמאות על ידי המקננת ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומניחים מיד על קרח. לטעון µL 20 של כל דגימה (לחלופין, לטעון 10 µL, להקפיא, שנותרו דגימות ב- 20 ° C) המופרדות באמצעות 10 µL של הסולם מוכן על 10% לזיהוי/7 - 8 מ' שתנן/TBE ג'ל. לטעון µL 10 של פקד ה-RNA. הפעל את הג'ל עד bromophenol כחולה לגמרי נודד החוצה הג'ל (180 V, ~ 60 דקות).
- מכתים את הג'ל על פי הפרוטוקול של היצרן-4 מעלות צלזיוס. השתמש transilluminator של אפל-שדה הפולטת אור כחול כדי להמחיש את הרנ א לסלק את הפרוסות ג'ל עבור כל דגימה המתאים nt ~ 70-80.
- המשך כמתואר בשלב 4.5.5 - 4.5.8, resuspend כל דגימה של מים נטולי נוקלאז µL 10.
- cDNA Circularization
- להכין תערובת בסיס מספיק circularization כולם תגובות על-ידי שילוב של ריאגנטים הבאות עבור כל דגימה על הקרח: 4.0 µL תערובת התגובה Circularization, 2.0 µL ATP, 2.0 µL MnCl2ו- 2.0 µL ליגאז.
- להוסיף 10 µL של המיקס מאסטר כל דגימה. לערבב בעדינות, צנטריפוגה בקצרה. דגירה דגימות ב 60 מעלות צלזיוס במשך ה 2 מיד מקום דוגמאות על קרח.
- PCR-הגברה
- פעלתי לפי הנהלים של היצרן (שלב 1-3, הגברה PCR) עבור ה-PCR-הגברה השתמש µL 4 של circularized cDNA עבור הגברה עם 9 מחזורים PCR על תאי T הראשי, כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר.
- לטהר ספריות וסמנו התפלגות גודל שלהם, על-פי הפרוטוקול של היצרן (שלב 4-8, PCR הגברה). הגודל הצפוי של הספרייה מוגבר הוא לחץ דם 140-160 (ראה איור 4).
- עבור ספריות רצף, עיין הפרוטוקול של היצרן ואת המתקן רצף להדרכה נוספת.
5. שבב-Seq
הערה: פרוטוקול זה הוא שונה מן בלכר-גונן, ואח. 14 להפנות נהלים לקבלת מידע נוסף לגבי השבב-תת סעיף. עבור כל שיטות ונקודות זמן רצופים, דגימות חייב להיות מאותו מאגר ההתחלתי של תאים.
- Crosslinking קצירת התאים
- Crosslink מספר מתאים של תאים (עיין בטבלה 2 למספרים המומלצת T cell) עבור כל נקודת זמן עם ריכוז סופי של 1% פורמלדהיד במדיום cellspecific (למשל, RPMI שהושלם עבור תאי T) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדין. לעצור את התגובה crosslinking על ידי התוספת של גליצין כדי ריכוז סופי של 0.125 מ'.
- צנטריפוגה תאים ב- g x 330 עבור 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף את התאים ב- PBS קר כקרח. חזור על שלב 5.1.2 פעמיים ומקפיאים תא כדורי ב- 80 ° c כדורי קפואים ניתן לאחסן במשך לפחות 6 חודשים.
- פירוק התא ואת Sonication
הערה: במהלך כל תא פירוק ו sonication השלבים, דוגמאות יש לשמור על הקרח או ב 4 ° C כדי למזער את השפלה היפוך, חלבון crosslink.- Resuspend תא כדורי במאגר 1 מ"ל תא קר כקרח פירוק עם מעכבי פרוטאז טרי נוסף כדי לבודד הגרעינים (להוסיף פוספטאז מעכבי אופציונלי). תקופת דגירה של 10 דקות על קרח, צנטריפוגה ב 2,600 x g למשך 5 דקות ב 4 º C.
- תשאף תגובת שיקוע, resuspend צנפה גרעינים במאגר פירוק גרעיני קרח 1 מ"ל עם מעכבי פרוטאז הוסיף טרי (אופציונלי: להוסיף מעכבי פוספטאז). תקופת דגירה של 10 דקות על קרח. Sonicate את התאים לייצר חלק קטן גודל DNA כלומר 0.2 - 1.0 kb (ראה איור 5).
הערה: Sonication תנאים צריך להיות מותאם על פי סוג התא יותר ויותר תנאים (למשל, מספר הטלפון הנייד, נפח, מאגר). תאי T העיקרי, מומלץ sonication למשך 20-25 מחזורים (ראה חומרי תיאור מפורט). - לקחת µL 20-50 aliquot של כרומטין הוטו, חום למשך 10 דקות ב 95 ° C ו- 1,000 סל ד רועד לבצע crosslink מהר הפוכה ולוודא גודל כרומטין. להוסיף 2-5 µL Proteinase K, תקופת דגירה של 20 דקות ב- 56 ° C ו 1,000 סל ד רועד. בצע חום איון 10 דקות ב 95 ° C ו 1,000 סל ד רועד. לטהר כרומטין עם ערכת המתאים (ראה טבלה של חומרים). לבדוק גודל כרומטין על 1% agarose ג'ל ולהשתמש bp 100 פלוס סמן.
- צנטריפוגה כרומטין הוטו עם ממוצע DNA גודל השבר של 0.2 - kb 1.0 עבור 10 דקות ב20, 000-g ו- 4 ° C כדי הצניפה כרומטין לא מסיסים ופסולת. להעביר את תגובת שיקוע צינור ולשמור על קרח.
- להשאיר 5-10% של כרומטין sonicated כקלט. להקפיא ב-20 ° C (משמש בשלב 5.5.2).
- כמה נוגדנים כדי חרוזים
- נוגדן µg הזוג 10 (למשל, אנטי-RNA Pol II; H3K36me3 אנטי-Histon) ב- 220 µL PBS (עם 0.5% BSA, 0.5% Tween 20) כדי 80 µL פאראמגנטי חרוזים בשילוב לחלבון G (ראה טבלה של חומרים) במשך לפחות שעה בטמפרטורת החדר עם סיבוב.
- במקום הצינורות על מגנט. המתן עד כל חרוזי מאוגדים המגנט ולהסיר את תגובת שיקוע. בלוק נוסף עם 6 µL sonicated זרע סלמון DNA ב- PBS (עם 0.5% BSA, 0.5% Tween 20) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם סיבוב.
- במקום הצינורות על מגנט. המתן עד כל חרוזי מאוגדים המגנט ולהסיר את תגובת שיקוע ברורה. רחץ חרוזים עם צ'יפ IP מאגר שלוש פעמים.
- כרומטין Immunoprecipitation
- לדלל כרומטין 1 מ"ל הכולל אמצעי אחסון במאגר פירוק גרעיני עם מעכבי פרוטאז טרי נוסף (לחלופין, הוסף מעכבי פוספטאז). להוסיף מאגר שבב ה-IP עם מעכבי פרוטאז הוסיף טרי (לחלופין, הוסף מעכבי פוספטאז) באמצעי אחסון הסופי של 3 מ ל. שמור על קרח או ב 4 ° C ואילו נוגדן זה מצמידים את החרוזים.
- הוסף כרומטין מדולל על הנוגדן בשילוב חרוזים מהשלב 5.3.3 דגירה במשך הלילה ב 4 ° C עם סיבוב עדין.
- לשטוף עם המאגרים הבאים (1 מ"ל כל אחת, ראה טבלה של חומרים) בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות עם סיבוב, במקום צינורות בחזרה על המגנט ולהסיר את תגובת שיקוע: שטיפת מאגר אני לשטוף מאגר II, III מאגר לשטוף, 2 x טה pH 8.0 בהתאמה.
- למחוק את תגובת שיקוע, מילה נהדרת. ~ 5 דקות.
- Crosslinking הפוכה
- הסר את דגימות של המגנט. מוסיפים 50 µL • תנאי מאגר ומערבבים על ידי pipetting כדי elute חלבון-DNA קומפלקסים של החרוזים.
- כוללים sample(s) קלט מן זה צעד קדימה. להוסיף • תנאי מאגר קלט sample(s) עבור אמצעי אחסון הסופי של µL 50 (כדי לשמור את הרכב מאגר דומה הדגימות צ'יפ) והתהליך יחד עם הדגימות שבב.
- לערבב 3 µL של המאגר • תנאי ו 2 µL של RNase (DNase חינם). להוסיף 5 µL של המיקס כל דגימה, תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- מיקס 2.5 µL proteinase K, גליקוגן µL 1 ו- 1.5 µL • תנאי מאגר עבור דגימה. להוסיף 5 µL של המיקס כל דגימה (U 1 proteinase K ו- 20 גליקוגן µg עבור דגימה), תקופת דגירה של 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
- דגירה בדגימות ב 65 ° C בלילה (לפחות 4 h) ברעידות לבצע crosslinking הפוכה.
- במקום הצינורות על המגנט לפחות 30 s והעברת תגובת שיקוע על צינור. דוגמאות שיכול להיות קפוא ב-20 ° C עד 12 חודשים.
- טיהור DNA
- להוסיף µL 140 של חרוזים פאראמגנטיים מפוזר היטב µL 60 מדגם (יחס 2.3:1). פיפטה בקפידה לאורך 25 פעמים לערבב ביסודיות. ודא נוזלי כל שפופרת הומוגנית. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 דק המקום הצינורות על המגנט במשך 4 דקות, או עד כל חרוזי הם מאוגדים למגנט, ולמחוק את תגובת שיקוע.
- להשאיר את הצינורות על המגנט ולהוסיף µL 200 של אתנול 70% טריות. דגירה הצינורות ב-30 s מבלי להפריע את החרוזים. למחוק את תגובת שיקוע, חזור על שלב זה פעם נוספת. האחות אתנול לחלוטין ולתת את פאראמגנטיים חרוזים מילה נהדרת במשך 4 דקות.
הערה: אתנול לא שלם עשוי ברצינות להפחית את ה-DNA שחזור וניקוי תשואות. יבש בגדר רק עד יבש. ייבוש יתר בגדר עשויים להפחית את ה-DNA שחזור, תשואות. - הסר את הצינורות של המגנט ולהוסיף µL 20 10 מ מ טריס-HCl (pH 8.0). בעדינות pipette האחסון כולו לאורך 25 פעמים לערבב ביסודיות. תקופת דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר. במקום הצינורות בחזרה על המגנט במשך 4 דקות ולהעביר את תגובת שיקוע צינור אחר.
- למדוד את כמות ה-DNA עם fluorometer מתאימים (ראה טבלה של חומרים).
- ודא שהשבב היה מוצלח על-ידי qPCR (שתדללו µL 1 ב 100 µL H2O ושימוש 2-5 µl עבור qPCR). השתמש תחל ספציפיות חיוביות (אתר קישור הידוע של חלבון עניין), בקרה שלילית (למשל, גן זה שקט ו/או לא מטרה של חלבון עניין).
הערה: הכנת ספריה שניתן לבצע עם 2 ng של ChIP הדנ א בהתאם הערכה (ראה טבלה של חומרים עבור הצעה לערכה לשימוש).
Representative Results
4 סו תיוג: ודא אופטימלית 4 סו-תיוג תנאים (אפופטוזיס, גרעיני מתח, מתח cytoplasmic), זמן, ריכוז: רמות גבוהות של 4sU ניתן לעכב את ייצור ועיבוד של rRNA, לגרום מתח cytoplasmic וכן גרעיני30. לכן, תאים עניין צריך להיבדק 4sU-induced הלחץ, כמו גם אפופטוזיס. תספיג חלבון ניתוח מומלץ להמחשת הצטברות p53, אשר מציין מתח גרעינית, הגדלת רמות פוספו-EIF2a המציגים cytoplasmic מתח, תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) ניתוח של אפופטוזיס. רמות גבוהות של חשיפה ממושכת 4sU או תרופות כמו thapsigargin או arsenite יכול לשמש כדי לגרום מתח סלולארית. כדי לגרום אפופטוזיס או לתא המוות, תאים שטופלו BH3I-1 (500 ng/µL) או הדגירה למשך 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס (חום הלם). Annexin V/7-מ מכתים שימש לקביעת מוות (Annexin V) ותאים מתים (7-מ). תיוג של במבחנה שנוצר העיקרי תאי Th1 עבור h 0.5 עם 500 4sU מיקרומטר (ריכוז סופי) או h 1 עם 200 מיקרומטר 4sU גם מעוררת סימני מצוקה סלולרי ולא אפופטוזיס (איור 1) אבל להוביל ההתאגדות 4sU מספיק.
RNA תיוג זמן גם יכול להתקצר (≤5 דקות) אשר מוביל לעלייה קצרת ימים intronic רצף בהשוואה עוד פעמים תיוג. כדי להמחיש co-transcriptional המחירים splicing, תיוג 4sU פעמים לא יעלה על 30 דקות. לקבלת פרטים נוספים על 4sUlabeling, נא עיין Rädle et al. 19
בקרת איכות: שלמות RNA הוא בעל חשיבות רבה בעת עיבוד ה-RNA. זה הכי נוח לבדוק את איכות ה-RNA של RNA התווית על-ידי 4sU לאחר biotinylation ניתוח electrophoretical (ראה טבלה של חומרים). שקול אימות RNA מבודד מהשלב 2.2.2, במיוחד כאשר משתמשים בו על רצף של RNA הכולל. RNA תקינות מספר (RIN) צריך להיות ≥8 כדי להבטיח שלמות RNA לעיבוד נוסף (איור 3).
ניתוח electrophoretical יכול לשמש גם כדי לוודא שזה עתה משועתקים RNA. שימו לב כי לאחרונה משועתקים RNA מכיל rRNAs באופן משמעותי פחות בוגר לעומת סך RNA עם הלהקות rRNA טיפוסי להיות הרבה פחות בולטים.
ריבוזום פרופיל: PCR הגברה של ספריית cDNA: cDNA הגברה (שלב 4.9.1) הוא שלב קריטי כדי להבטיח תוצאות רצף טוב. לנתח את ספריות מוגבר על-ידי ניתוח electrophoretical. דגימה טובה של ספריות מוגבר מראה לשיא סביב 140-160 bp (איור 4A). עודפות של מתאם הדימרים צריך להיות נמנע (איור 4B) ויש את הדגימות נוסף לטהרו באמצעות ההליך טיהור דף לפי הפרוטוקול של היצרן (דף טיהור של מוצרי ה-PCR). תבנית יותר מדי או מחזורים PCR מדי עלולה להביא הגברה יתר מאופיין על ידי הופעת להקות משקל מולקולרי גבוה מהצפוי, מוצרי ה-PCR מרוח ומוצרים דיימר מתאם (איור 4C). עבור רוב דגימות 1-5 µL של circularized cDNA ומחזורי PCR 9 עבור הגברה בדרך כלל תניב כמויות מספיקות של המוצר הנכון של ה-PCR.
שבב: כרומטין הטיה: חיתוך אופטימאליים צריך להיות מותאם לכל סוג של תא. לקבוע תנאים ההטיה (למשל, מספר מחזורי, כוח גבוה או נמוך) מראש. להשתמש באותו המספר של תאים באותו אמצעי אחסון למטרות, בדיקה מאז צפיפות התאים נמוך מגביר את יעילות ההטיה. נסה להימנע נגמר - או תחת-הטיה כרומטין. שברי כרומטין גדול יכול להשפיע באופן דרמטי על תוצאות שבב על ידי סתימת, הטיית יתר יכול להרוס את epitopes על החלבון של עניין, שמוביל ליעילות נמוכה הכריכה על ידי הנוגדן. בניסוי זה, הושגו התוצאות הטובות ביותר כאשר השבר הראשי של כרומטין הוטו היה בסביבות 1,000 bp או מעט נמוך (איור 5A).
אימות שבב על ידי qPCR: לפני שמתחילים את השבב, מומלץ לבדוק אם הנוגדן בשימוש מתאים שבב (במידת האפשר, השתמש שבב כיתה נוגדנים) על ידי שבב-qPCR. לאמת את השבב עבור רצף על ידי qPCR לפני תחילת הכנת ספריה (ראה שלב 5.6.5). עיצוב תחל זה לאגד אתר יעד ידוע של החלבון עניין. אם אתר היעד המדויק בתוך הגן אינו ידוע, כמה זוגות פריימר יכול לשמש כדי לסרוק את ג'ין ואלמנטים רגולטוריות המשויך. עבור שבב RNAPII של Th1 תאים Ifng, אשר transcriptionally upregulated על גירוי, תחל אקטין יכול לשמש פקד חיובי. Sox9 , אינסולין לשמש פקד שלילי, מאחר הגנים האלה אינם מבוטאים בתאים Th1 (איור 5B). תזכרו לא להשתמש פורש אקסון תחל, אשר משמשים בדרך כלל עבור qPCR של mRNA. פקד IgG יכול לשמש גם כדי להוכיח יחודיות של הנוגדן בשימוש. Immunoprecipitated DNA ניתן למדוד עם fluorometer מתאימים (ראה טבלה של חומרים). כמויות של DNA nonspecifically המאוגד על-ידי הפקד IgG צריכה להיות משמעותית נמוכה לעומת הסכום DNA הנוגדן עניין כבול.
משכפל: הוכחה חשיבות ביולוגית: מומלץ בחום לבצע את הניסוי קינטי עבור כל השיטות החל מאותו מאגר של תאים כדי להבטיח תאים יש זהות זהה עבור כל לא מטופל ומטופל דוגמאות (איור 2). עם זאת, מומלץ לקחת aliquots קטן של נקודות זמן הראשי עבור כל שיטת להשוות בין דגימות שכפול ביולוגי (למשל, על ידי qPCR, ניתוח FACS). דבר זה מאפשר הערכה גסה, אם הטיפול עבור שניהם משכפל לשחזור, אתה יכול להמשיך עם רצף. אימות של משכפל צריכה להתבצע על-ידי ניתוח bioinformatical. הפארמצבטית של תוצאות יכול להידרש מבחינת מתאם בין ערכים FPKM בין משכפל, visualized באמצעות פיזור החלקות (איור 6).
איור 1: אימות של תנאים אופטימליים תיוג 4sU ללא perturbing פיזיולוגיה של התא (איור מ Davari et al. 11)
(א) גילוי של אפופטוזיס תא על-ידי ניתוח FACS: במבחנה שנוצר Th0 תאים שטופלו ריכוזים שונים של 4sU (מסומן בסוגריים) עבור 0.5 h, 1 h 2 h, בהתאמה. טיפול BH3I-1 שימש כדי לגרום אפופטוזיס נקבע על ידי Annexin V, ואילו הלם חום (5 דקות ב 95 ° C) נעשה שימוש כדי לגרום מוות תאי נקבע על ידי 7-מ. (B) תספיג ןועברל p53 של 4sU התייחסו ומופעל תאי T: דגימות הודבקו תוויות עם 200 מיקרומטר 4sU במשך הזמן המצוין של ההפעלה, למעט נקודת זמן 0.5 h זה סומן עם 500 4sU מיקרומטר. (ג) ניתוח תספיג פוספו-EIF2a ו- EIF2a הכולל תאי Th1 מופעל עם תיוג באותם התנאים כמו (B). Thapsigargin שימש פקד חיובי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: סקירה סכמטי של מלכודת קינטי לעקוב אחר שינויים ברמת הגנום
ערכה זו ממחישה את הכיוונון לשילוב 4sU-seq הכולל RNA-seq, פרופיל ריבוזום, צ'יפ-seq ללמוד שינויים ברמת הגנום על טיפול תאי. בריכה תאים, להפריש את המספר הנדרש של תאים עבור פקד ללא טיפול. לטפל בתאי שנותרה ולהתחלק עבור כל נקודה בשיטה וזמן. תווית לא מטופל/מטופלים תאים עבור 4sU-seq עם 4sU כמתואר. נקודות זמן ודוגמאות עבור כל שיטת תלויה השאלה ביולוגי מסוים נבדק. לקחת דגימות עבור כל נקודת זמן ושיטת ופעל החלק הייעודי של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: בקרת איכות של RNA התווית על-ידי 4sU
סה כ RNA ו biotinylated RNA המתקבל ע י תאי Th1 מופעל נותחו על Bioanalyzer. 18S rRNA 28S rRNA מוצגים, RNA תקינות מספר (RIN) ניתנת על ידי המכשיר כדי לקבוע בשלמות הרנ א. רין צריך להיות ≥8 כדי להבטיח שלמות RNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: פרופילים Bioanalyzer של ריבוזום פרופיל ספריות
ספריה טובה (א) A: המדגם מציגה לשיא במטווח הגודל הצפוי (140-160 bp) וכן אין טיהור נוספת נדרשת. (B) דוגמה זו מציגה מוצר מוגבר של דיימר מתאם מוגזמת (120 bp) ביחס המוצר הרצוי (140-160 bp). ספריה זו מחייבת עוד יותר טיהור. (ג) דוגמה יתר מוגבר: פסגות משקל מולקולרי גבוה מהצפוי, מרוח PCR amplicons גלויים (המסומנים על ידי חצים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: גודל אופטימלי כרומטין אחרי הטיית ואימות של שבב על ידי qPCR
(א) Agarose ג'ל התמונה מראה גודל אופטימלי שבר כרומטין הוטו מדגימות שלושה היו לכסנתם מחזורים 25 ב sonicator, מטוהרים כמתואר לפני בפרוטוקול. (B) Q-PCR תוצאות שבב RNAPII הכולל (anti-RNA Pol II, 8WG16, ab817) מיוצג כאחוז של קלט. Ifng ואני אקטין תחל שימשו חיובי ואילו Sox9 , אינסולין שלילי פקדים (שני הגנים אינם מבוטאים בתאים Th1 מופעל). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: השוואה של הביולוגיה משכפל (איור מ. Davari et al. 11)
פיזור נציג מגרש בהשוואת ערכים הביטוי (FPKM) בין משכפל של h RNA 4 משועתקים לאחרונה (4sU) לאחר גירוי תאי Th1 מופעל. הקו הירוק מציין ערכים FPKM שווים ומצוין המתאם דרגה כל מגרש.
| משך תיוג (דקות) | ריכוז 4sU המומלצת (מיקרומטר) |
| 120 | 100 - 200 |
| 60 | 200 - 500 |
| 15 - 30 | 500 - 1000 |
| < 10 | 500 - 2000 |
טבלה 1: מומלץ ריכוזי 4sU (מ- Rädle, et al. 19)
הטווח של ריכוזי 4sU המומלץ הוא הצביע עבור זמנים שונים של תיוג.
| שיטה | מספר הטלפון הנייד | כמות ה-RNA |
| תיוג-4sU | ≥2 x 107 | ≥60µg |
| ריבוזום פרופיל | ≥2 x107 | |
| שבב-seq | ≥2 x 107 - 3 x 107 |
טבלה 2: הכמות הנדרשת של תאי T ראשי
הכמות המינימלית של תאי T העיקרי הנדרש עבור כל אחת מהשיטות. כמויות יכול להיות פחות בעת שימוש סוגי תאים אחרים.
Discussion
ניתוח התהליך כולו של הכונה יש צורך להבין עיבודים הסלולר בתגובה גירוי ספציפי או טיפול. שילוב של RNA הכולל-seq, 4sU-seq ריבוזום פרופיל, צ'יפ-seq בנקודות זמן שונות מוביל ניתוח מקיף של התהליכים העיקריים של הכונה לאורך זמן. הבנה עמוקה של תהליכים ביולוגיים נדרש להגדיר את הגדרת הניסוי, כמו גם נקודות זמן אופטימלי.
מאז שיטות ללמוד הכונה לשפר במהירות, פרוטוקולים אלה ניתן להתאים לשינויים מהירים. למרות זאת, הם מספקים את השיטות הכי חשוב ללמוד ג'ין בסיסי מנגנוני רגולציה בכל סוג של תא. כאן, אנו נדון כמה מלכודות ו עובדות צריך לשקול בעת שימוש בשיטות אלה.
תאים: התאים חייבים להיות מאוד מעשית, אם משתמש ראשי תאים מבודדים, הטוהר של אוכלוסיות תאים יש להבטיח (למשל, FACS ןועברל העיקרי T תאים). התאים ואפילו מעט לחוץ יכול להשפיע על התוצאות של שיטות אלה רצף רגיש מאוד להפחית את כמות לאחרונה משועתקים או מתורגמת RNA ו להוביל המפרט לא רצויים של תגובת המתח בתוצאות רצף. מהירות צנטריפוגה המוזכרים בפרוטוקול זה כדי הצניפה תאים ממוטב העיקרי בתאי T. לפיכך, להתאים את המהירות בהתאם לסוג התא.
4 סו השפעות על פיזיולוגיה של התא: בנוסף האפשרויות הנ עבור אימות של ההפרעות מינימלי כדי פיסיולוגיה תאית על תוספת 4sU, ניתוח נוסף ו/או נוספים ניתן לבצע, במיוחד כאשר מספרי הטלפון הנייד מוגבלים. השפעות על התפשטות תאים יכולים להיבדק על-ידי אימות זמן הכפלה של תאים על-ידי רק לספור תאים עם תוויות ללא תווית. אינדוקציה nucleolar מתח יכול להיבדק גם על ידי ניתוח תא מורפולוגיה ויה immunofluorescence מכתים של nucleolin ואת הגרעינים. כדי להמשיך ולאמת את ההשפעה של 4sU, ביטוי גנים הכללית שינו ניתן למדוד על-ידי התאמת לקרוא ספירות שכותרתו RNA הכולל ל RNA הכולל ללא תווית.
תא מספרים: עבור במבחנה שנוצר בתאי T, אנו ממליצים החל לפחות את כמות התאים המצוין בטבלה 2. לבחור נאותה מספרים לפי שיטת בהתאם לסוג של תאים. מאז תאי T יש פחות הציטופלסמה ו- RNA לעומת תאים אחרים, ככל הנראה כמויות נמוכות של תאים אחרים יהיה הולם. עבור שבב-seq, מספרי הטלפון הנייד תלויים מאד הנוגדן בשימוש ואת רמת ביטוי של החלבון עניין בתוך התאים. היסטון או שבב RNAPII, תאים fewe יכול לשמש, ואילו מספרי הטלפון הנייד צריך להיות מוגברת כאשר משתמשים גורמי שעתוק, במיוחד אם הם באים לידי ביטוי ברמות נמוכות.
4 סו-תיוג ו RNA biotinylation: בעת שימוש תאים חסיד, תיוג 4sU ויכולה להיות מכוונת כפי שתואר על ידי Rädle et al. 19 מאז תאים 4sU לשלב במהירות רבה, זה ניתן להוסיף ישירות אל המדיום של השעיה, מחסידי או תאים חסיד למחצה.
מומלץ להתחיל את biotinylation עם 60-80 µg של RNA. ובכל זאת, כמויות נמוכות של RNA יכול לשמש, למרות שאנחנו לא האם בדק עבור פחות מ-30 µg. מוסיפים את coprecipitant של (למשל, GlycoBlue) כאשר מאיצים RNA אם בגדר קשה לראות. דאפי. et al. הראו גם את ביוטין מופעל methylthiosulfonate (MTS-ביוטין) בצורה יעילה יותר מגיב עם התווית על-ידי 4sU RNA מאשר HPDP-ביוטין31. לפיכך, ייתכן שווה לשקול מעבר MTS-ביוטין, במיוחד, עבור ההתאוששות של RNAs קטן, אשר נוטים להיות פחות משקעים uridine (עיין פרוטוקול biotinylation שהוזכרו על ידי דאפי ואח; ראה טיהור של התווית על-ידי 4sU RNA, נהלים ניסויית).
עבור ההתאוששות של RNA לאחרונה משועתקים, זה אפשרי להשתמש פאראמגנטיים חרוזים או RNA ניקוי חרוזים על פי בחירתך. תמיד לקחת בחשבון ערכות אלה עשויה או לא עשויה לטהר עבור RNAs ספציפיים. לדוגמה, אם אתה מעוניין miRNAs, שקול להשתמש ערכות ספציפי עבור לכידת miRNA ורצף.
כימות של RNA משועתקים החדש: לכמת במדויק RNA לאחרונה משועתקים, מדידה צריכה להתבצע על ידי fluorometer מתאימים (ראה טבלה של חומרים). בתוך h 1 של חשיפה 4sU, שזה עתה משועתקים RNA מייצג כ- 1-4% של RNA הכולל. RNA משועתקים החדש של h 1 שכותרתו, תאי T מופעל מורכב ~ 90-94% של rRNA11.
ריבוזום פרופיל: בעת יצירת השיטה, קבענו כי באמצעות 1.5 x כמות נוקלאז מאשר הציע בפרוטוקול המקורי מבטיח ולעיכול תקין. כמו כן, ללא תופעות לוואי שדווחו עבור כמויות מוגברות של נוקלאז. מאז. זה די קשה כדי overdigest את RPFs בזמן שהם חלק הרנ א מחוייב ribosomal חלבונים, באפשרותך להגדיל עדיין מעט את הסכום titrate עיכול נוקלאז אופטימלית.
אם פחות מ-500 ng של RPF RNA התגלו ב שלב 4.4.2, חזור על דלדול rRNA ובריכת מטוהר RPFs עם עמודות ה-RNA נקיים & רכז-5. לחילופין, טען שני מדגמים זהים אחד לשני על הג'ל (שלב 4.5.3), פרוסות ג'ל בריכת במהלך RNA • תנאי של הג'ל (שלב 4.5.6).
מומלץ לחתוך את RPFs על ג'ל חזק ככל האפשר לחברי הלהקות nt 28, 30. פעולה זו מסייעת בהפחתת שברי לא רצויים rRNAs ו tRNAs, אשר מאוחר יותר להיות חלק מהספריה, להפחית את רצף קריאות עבור RPFs שלך.
מומלץ גם להימנע אור במהלך ג'ל טיהור UV. דבר זה יכול ליצור ניקס מקטעי רנ א, כמו גם הדימרים פירימידין, כי בסופו של דבר יכול להשפיע באופן חמור את ספריית והכנה רצף תוצאות.
ספריית הכנה ורצף של נתונים: ריבוזום פרופיל הפרוטוקול מאפשר ליצור ספריית cDNA מתאים רצף. דגימות שנוצרו על-ידי תיוג 4sU ניתן להשתמש ישירות להכנה ספריה עם כל ערכת רצפי RNA המתאים. מאז RNA לאחרונה משועתקים, במיוחד בעת שימוש קצר תיוג פעמים, עשויים שלא להיות polyadenylated, אין בחירה poly-A יש לבצעו. במקום זאת, אנו ממליצים rRNA דלדול למניעת הפחתת עומק רצף עבור המדגם בפועל. שימוש בתאי T, התחיל עם 400 ננוגרם של RNA לאחרונה משועתקים, סה כ (בהתאם הערכה, ראה חומרים), שבוצעה rRNA דלדול ואנו מופחתת מחזורי עבור הגברה PCR למזער את הטיית ה-PCR. הכנת ספריה יכולה להתבצע עם פחות חומר המוצא. עבור ספריית המורכבות מספר מחזורים PCR צריך להיות מוטבת.
עבור שבב-seq יש גם הרבה ערכות זמינים עבור ספריית הכנה. בספריה הידיים הכנה עבד טוב מתחיל עם 2 ng של ChIP הדנ א (ראה חומרים עבור הצעה לערכה לשימוש). הקפד לבדוק את מדדים איזון צבע במהלך רצף. אנו ממליצים לעומק רצף של ≥40 x 10 קריאות6 , כל עבור 4sU-seq, הכולל RNA-seq, ודוגמאות שבב-seq ולאחר ≥80 x 106 קריאות עבור ריבוזום פרופיל הדגימות. העומק רצף תלוי המדגם וניתוח ביואינפורמטיקה במורד הזרם, ויש להתייחס בזהירות. כדי לנתח את קריאות intronic עבור החדרת cotranscriptional, 100 bp לזווג-קצה רצף צריך להיבחר.
רצף הטיה: רצף הפך תקן זהב בקביעת שינויים כלליים תמלול, תרגום או איגוד פקטור שעתוק. בתוך בשנים האחרונות שיטות קיימות דחפו לגבולות שלהם או טכניקות חדשות פותחו עבור קביעת רצף כמויות קטנות יותר ויותר ההתחלתי של RNA. זה דורש הגברה של cDNA, אשר מציג רעש או הטיה. לאחרונה, מזהים ייחודיים מולקולרית (UMIs) פותחו השפעול לזהות כפילויות לראשונה על ידי ה-PCR. . לאחרונה, זה הוצגה UMIs רק במתינות לשפר כוח רצף ושיעור גילוי שווא על ביטוי גנים דיפרנציאלית32. למרות זאת, שקול להשתמש מזהים ייחודיים מולקולרית (UMIs) עבור כל ספריות רצף לפקד עבור ספריית המורכבות, במיוחד כאשר החל כמויות נמוכות של RNA וכאשר מחזורים PCR רבים נדרשים.
מאגר ופתרונות מניות: חייבים להיות מוכנים כל מאגרים עבור 4sU-seq והגדרת פרופיל ריבוזום בתנאים מחמירים נטולת RNase בעזרת נוקלאז ללא מים. מומלץ לקנות מראש ללא נוקלאז NaCl, טריס-HCl, EDTA, ציטראט נתרן ומים. כדי להבטיח נוקלאז ללא תנאים, ניתן פתרון decontaminating RNase לנקות מדי סוכר או משטחים. כל מאגרים עבור שבב-seq צריך להיות לפחות ללא DNase וניתן לאחסן בטמפרטורת החדר. תמיד להוסיף מעכבי פרוטאז, וכן מעכבי פוספטאז לפני השימוש ולשמור על קרח.
ביואינפורמטיקה: ניתוח של כל הנתונים רצף (קרי, צ'יפ-seq, RNA-seq ו ribsosome פרופיל) כולל בקרת איכות (למשל, באמצעות FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), מתאם זמירה (למשלעם cutadapt20) ולאחר מכן על-ידי מיפוי הגנום הפניה לתאים שנבחנה. עבור נתונים RNA-seq (סה כ והן 4sU-seq), כמו גם ריבוזום פרופיל נתונים, ממפה נקודות spliced RNA-seq נדרש, כגון ContextMap 221. עבור שבב-seq במערכים הנתונים unspliced, באמצעות BWA-מ22 מספיקה. ניתן לחשב ביטוי גנים באמצעות מודל (קורא לכל Kilobase של אקסון לכל למפות קטעים מיליון) ' RPKM '1, לאחר קביעת לקרוא ספירות לכל הגן באמצעות של התוכנית, למשל featureCounts23. שהתקשרת שיא מנתונים שבב-seq, מספר תוכניות זמינות, למשל, מקינטוש24 או פנינה25. בהמשך ניתן לבצע ניתוחים במורד הזרם R26, בפרט באמצעות כלים שסופקו על-ידי project Bioconductor27.
כאן אתגר גדול בשילוב רמות ה-RNA 4sU - וסה ' כ ופעילות translational מן הריבוזום פרופיל זה נורמליזציה. בגישה קלאסית כדי לטפל בבעיה זו היא לנרמל את רמות של משק בית גנים. כדי להפחית את הרעש עקב תנודות אקראיות עבור גנים בודדים משק בית, מומלץ לא רק להשתמש כמה גנים משק בית אבל רמות החציוני עבור קבוצה גדולה, למשל > גנים משק בית 3,000 שגיבש אייזנברג, לבנון28 . עבור חישוב של RNA שיעורי מחזור של יחסי של 4sU-ל ש-RNA הכולל, נורמליזציה מבוסס על מחזור החציוני שיעורי (למשל, בהנחה של RNA half-life של 5 שעות)29. עם זאת, שכן ההנחה היא אין שינויים כוללים בהתאם לדרישה עבור גנים משק בית, אנו ממליצים להשתמש גישות ניתוח עצמאי של נורמליזציה, למשל, המתאם מבוסס-קיבוץ באשכולות של הזמן-סדרת סוגי הנתונים השונים כדי לזהות קבוצות של גנים עם התנהגות ברורים תמלול ותרגום במהלך ההפעלה. לקבלת תיאור מפורט על bioinformatical שילוב של סוגי הנתונים השונים, אנו מכנים הפרסום המקורי11.
ניתוח של אינטגרציה המחירים והנתונים מחזור: מאמר שפורסם לאחרונה33 השוואת מחצית החיים נקבע על-ידי פקד מרובבת ג'ין (MGC) שיטות גלובליות יכול להראות כי מחצית החיים בקורלציה הטוב ביותר עם אלו מתקבל על ידי שיטות תיוג מטבולית, לעומת שיטות אחרות (למשל, כללי עיכוב של תעתוק סמים). עם זאת, יש לציין כי ההבדלים בין מחצית חיים חישובים יכול להיווצר, היה מתואר 15,34. אנחנו מהווים רוב בעיות ההבדלים אשר הציג מאת תגובת המתח עקב חשיפה ממושכת 4sU. לכן, זה הכרחי כדי לא לכלול את תגובת המתח שהוצגו על ידי תיוג 4sU. כדי לתת תוקף נוסף מחזור המחירים, אנו ממליצים על השימוש MGCs.
בנוסף, ערכת נתונים כפי שנוצר כאן יכול לשמש גם עבור אינטגרטיבית יותר נתונים ניתוח (למשל, ויסות זמן אי קידוד RNAs)35,36.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים לארס Dölken לייעוץ להקים 4sU תיוג עבור תאי T הראשי; אליזבת גראף, תומאס Schwarzmayr לעזרה קריטי ב ספריית דורות ורצף; דירק Eick, אנדרו פלטלי על מתן נוגדנים RNAPII ו תא T; (ש ע) הנרייטה Uhlenhaut, פרנציסקה Greulich לעזרה כהכנה ספריית שבב-seq; קרוליין ג פרידל נתמכה על ידי מענקים FR2938/7-1 ו- CRC 1123 (Z2) מ דויטשה פתוח (DFG); אלקה Glasmacher נתמכה על ידי המענק GL 870/1-1 פתוח דויטשה (DFG) וממרכז גרמנית עבור סוכרת מחקר (DZD), מינכן זנטרום הלמהולץ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4sU-labeling | |||
| 4-thiouridine (100 mg) | Carbosynth | 13957-31-8 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at –20°C in aliquots of 50-500 µl; do not refreeze. |
| 1.5 ml safe-lock tubes | Eppendorf | 30121589 | Optional |
| 1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72692005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
| 2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72694005 | Compatible with Dimethylformamide |
| 50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
| Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
| Chloroform | Sigma Aldirch | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.1 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh |
| Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
| EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg) | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4°C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Isopropanol | Merck | 1.09634.1011 | |
| NaCl (5M) | Sigma Aldrich | 71386 | Stock solution |
| nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
| Nuclease-free H2O | Sigma Aldrich | W4502 | Stock solution |
| nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4 | Lonza | 51237 | Stock solution |
| Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml) | 5Prime | 2302830 | Use in step 1.3.4. |
| Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 × g |
| QIAzol Lysis Reagent (200 ml) | Qiagen | 79306 | Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol) |
| Qubit RNA HS assay kit | Life Technologies | Q32852 | Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11 |
| RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Optional; includes Buffer RLT |
| Sodium citrat | Sigma Aldrich | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| µMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store at 4°C, includes µMacs columns used in step 1.4.6. (store at RT) |
| Cell viability and stress assay | |||
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences | 559763 | Optional |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Optional |
| p53 | abcam | ab26 | Optional |
| p-EIF2a (Ser51) | Cell Signaling | 9721 | Optional |
| BH3I-1 | Sigma-Aldrich | B 8809 | Optional |
| Buffers | |||
| 4sU Washing Buffer | store at RT | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O | |
| Biotinylation Buffer (10x) | store at 4 °C | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4°C | |
| RNA precipitation buffer | store at RT | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | |
| Equipment | |||
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10 |
| RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | Optional |
| UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3 |
| High-speed centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Multifuge X3R | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000 × g |
| High-speed rotor | Thermo Scientific | Fiberlite F15-6 x 100y | |
| Adaptors for 15 ml tubes | |||
| Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | Or equivalent. |
| Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 µMacs columns. |
| Ultra-fine scale | Mettler Toledo | ML204T | Or equivalent. |
| E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
| E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |
| DynaMag-2 Magnet-1 each | Life Technologies | 12321D | |
| RNaseZap | Sigma | R2020 | Optional |
| TruSeq stranded total RNA library prep kit | Illumina | RS-122-2201 | Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit |
| Nanodrop | Thermo Scientific | use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration | |
| Ribosome Profiling | |||
| TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPYSC12116 (Yeast) | |
| TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPHMR12126 (Mammalian) | |
| Illustra MicroSpin S-400 HR Columns | GE Healthcare | 27-5140-01 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 kit | Zymo Research | R1017 | |
| RNA Clean & Concentrator-5 kit | Zymo Research | R1015 | |
| Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) | Illumina | MRZG126 or MRZG12324 | |
| (High Sensitivity DNA Kit) | Agilent Technologies | 5067-4626 | Already needed for 4sU-seq |
| All other consumables and equipment are listed in the User guide | !!! | Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels) | |
| ChIP | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) | gereral lab supplier | ||
| 100 bp Plus Marker | Thermo Fisher | SM0323 | |
| 16 % Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | Add to a final concentration of 1 % |
| 70% EtOH | gereral lab supplier | Always prepare fresh | |
| Agarose | gereral lab supplier | ||
| Agencourt RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
| ChIP library preparation kit | KapaBiosystems | KK8504 | Or use the kit of your choice |
| DNA low bind microcentrifuge tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | or equivalent |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use |
| Glycine | gereral lab supplier | Prepare a 2M stock solution | |
| Glycogen | Roche | 10-901-393-001 | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4. |
| Phosphatase Inhibitor (PhosStop) | Roche | 4906837001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
| Power SYBRgreen Master mix | Thermo Fisher | 4367659 | |
| Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer |
| Rnase, DNase free | Roche | 11-119915001 | |
| Salmon sperm (sonicated to around 100bp) | Sigma | D1626 | |
| TE pH 8.0 | gereral lab supplier | ||
| Antibodies (ChIP grade if possible) | |||
| anti-RNA Pol II [8WG16] | abcam | ab817 | |
| anti-Histon H3K36me3 | abcam | ab9050 | |
| or antibody of interest | |||
| Buffers | |||
| Binding/Blocking buffer | Store at RT | PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20 | |
| Cell-Lysis buffer | Store at RT | 5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40 | |
| ChIP IP buffer | Store at RT | 0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7 mM NaCl | |
| Elution buffer | Store at RT up to 6 months | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS | |
| Nuclei-Lysis buffer | Store at RT | 50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS | |
| Wash buffer I | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl | |
| Wash buffer II | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 500 mM NaCl | |
| Wash buffer III | Store at RT | 0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 8.1 | |
| Equipment | |||
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | use this instrument for electrophoretical analysis |
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml | Diagenode | C30010010 | |
| or tubes special for your sonication device | |||
| Bioruptor sonication device or sonication device of your choice | Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 µl each tube) | ||
| Magnetic stand for tubes | |||
| Thermomixer | |||
| Agarose gel electrophoresis | |||
| Qubit Fluorometer | Thermo Scientific | Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA |
References
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Chavez, S., Garcia-Martinez, J., Delgado-Ramos, L., Perez-Ortin, J. E. The importance of controlling mRNA turnover during cell proliferation. Curr Genet. 62 (4), 701-710 (2016).
- Rutkowski, A. J., et al. Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection. Nat Commun. 6, 7126 (2015).
- Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).
- Carninci, P., et al. Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution. Nat Genet. 38 (6), 626-635 (2006).
- Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
- Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).
- Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145 (4), 622-634 (2011).
- Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
- Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67 (1), 45-54 (2014).
- Davari, K., et al. Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses. Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).
- Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. 22 (10), 2031-2042 (2012).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Blecher-Gonen, R., Barnett-Itzhaki, Z., Jaitin, D., Amann-Zalcenstein, D., Lara-Astiaso, D., Amit, I. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302 (2013).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
- Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. J Vis Exp. (78), (2013).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Bonfert, T., Kirner, E., Csaba, G., Zimmer, R., Friedel, C. C. ContextMap 2: fast and accurate context-based RNA-seq mapping. BMC Bioinformatics. 16, 122 (2015).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints. PLoS Comput Biol. 8 (8), e1002638 (2012).
- Team, R. D. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , the R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).
- Huber, W., et al. Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor. Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).
- Eisenberg, E., Levanon, E. Y. Human housekeeping genes, revisited. Trends Genet. 29 (10), 569-574 (2013).
- Friedel, C. C., Dolken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol Biosyst. 5 (11), 1271-1278 (2009).
- Burger, K., et al. 4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response. RNA Biol. 10 (10), 1623-1630 (2013).
- Duffy, E. E., Rutenberg-Schoenberg, M., Stark, C. D., Kitchen, R. R., Gerstein, M. B., Simon, M. D. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Mol Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
- Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq. Sci Rep. 6, 25533 (2016).
- Baudrimont, A., et al. Multiplexed gene control reveals rapid mRNA turnover. Sci Adv. 3 (7), e1700006 (2017).
- Rabani, M., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs. Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).
- Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles. Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).
