Summary
في هذا التقرير، هي أبرز مزايا أورجانوتيبيك الثقافات والثقافات الأولية ينتابها من العقد الجذرية الظهرية المستمدة من الماوس للتحقيق في طائفة واسعة من الآليات المرتبطة بالخلايا العصبية الدبقية التفاعل، أعصاب، نيوروينفلاميشن، واستجابة للعدوى الفيروسية.
Abstract
ويصف هذا البروتوكول نموذجي السابقين فيفو الجذرية الظهرية المستمدة من الماوس ganglia (DRG) explant في المختبر المستمدة من الرسم المشارك الثقافة وينتابها من الخلايا العصبية الحسية والخلايا الدبقية من الأقمار الصناعية. هذه نماذج مفيدة وتنوعاً للتحقيق في مجموعة متنوعة من الاستجابات البيولوجية المرتبطة بالظروف الفسيولوجية والمرضية للنظام العصبي المحيطي (السندات الإذنية) تتراوح من العصبية الدبقية التفاعل، أعصاب، نيوروينفلاميشن، والعدوى الفيروسية. استخدام الرسم اكسبلانت مفيد علمياً مقارنة بنماذج مبسطة الخلايا المفردة لأسباب متعددة. على سبيل المثال، كثقافة أورجانوتيبيك، يسمح DRG explant السابقين فيفو نقل شبكة الخلايا العصبية كاملة بما في ذلك المكروية خارج الخلية التي تلعب دوراً هاما في جميع وظائف الخلايا العصبية والدبقيه. علاوة على ذلك، DRG explants يمكن أيضا الإبقاء على السابقين فيفو لعدة أيام وظروف الثقافة يمكن أن تكون قلق كالمطلوب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن فصل الرسم المقطوع كذلك إلى في المختبر المشارك ثقافة الخلايا العصبية الحسية الأولية والخلايا الدبقية الساتلية للتحقيق في تفاعل الخلايا العصبية الدبقية، نيوريتوجينيسيس، محواري مخروط التفاعل مع الخلية المكروية، وأكثر العامة، أي الجوانب المرتبطة بعملية الأيض العصبية. ولذلك، يوفر نظام DRG-explant قدرا كبيرا من المرونة لدراسة مجموعة واسعة من الأحداث المتصلة بالظروف البيولوجية والفسيولوجية والمرضية بطريقة فعالة من حيث التكلفة.
Introduction
في هذه المخطوطة، يمكننا تقرير أسلوب للحصول على نموذج السابقين فيفو أورجانوتيبيك نظام نموذج الرسم الماوس المستمدة المكروية مثل الأنسجة محفوظة للتحقيق في طائفة واسعة من الاستجابات البيولوجية للشتائم السندات الإذنية التي تتراوح من العصبية الدبقية التفاعل، أعصاب، علامات التحريضية، للعدوى الفيروسية. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن زيادة تطوير بروتوكول لإنشاء ثقافة المشارك الأولية المستمدة من الرسم واحد الخلايا العصبية الحسية والخلايا الأقمار الصناعية.
الرسم الأقمار الصناعية الرمادية-المسألة-وحدات يقع خارج الجهاز العصبي المركزي (CNS) على طول العمود الفقري الجذور الظهرية للأعصاب في العمود الفقري. الرسم، يقع بالقرب من الثقب الفقرية والبيت بسيودونيبولار من الخلايا العصبية الحسية والخلايا الدبقية الأقمار الصناعية. وتتميز الخلايا العصبية بسيودونيبولار نورت واحد أن يقسم إلى عملية طرفية تحمل جسدية والحشوي المدخلات من الأهداف الهامشية لخلايا الجسم، وعملية مركزية التي تقدم المعلومات الحسية من الجسم خلية في الجهاز العصبي المركزي. يعرف كبسولة ضام ويعزل هذه المجموعة الطرفية للخلايا العصبية والخلايا الدبقية من الجهاز العصبي المركزي. قد وصف لا الهجرة خلية بعد الولادة من الرسم أو من أي وقت مضى، ومكانه خلايا الجذعية محلية مسؤولة عن الأحداث العصبية التي تحدث في جميع أنحاء الحياة1. ولذلك، هذا النموذج مناسبة خاصة لدراسة الخلايا الكبار، أكسونوجينيسيس، واستجابة للآفة المؤلمة، وخلية الموت2،3،4،،من56،7 ،،من89 .
في ميدان نيوروريجينيريشن، الرسم المقطوع من فيفو واكسبلانتيد في المختبر يستنسخ axonotmesis، شرط ضرر في محاور عصبية التي هي مقطوعة تماما والجسم الخلايا العصبية مفصول عن الهدف إينيرفاتيد10 ،11. فمن المعروف جيدا أن يمكن أن يسبب إصابات الأعصاب الطرفية التعبير الجيني المنخفض وزيادة في الرسم والعديد من هذه التغييرات نتيجة لعمليات التجدد لكن الكثير قد تكون أيضا نتيجة للاستجابة المناعية أو رد آخر من الخلايا غير العصبية. باستخدام السابقين فيفو هو إزالة النظام من الرسم معزولة، بعض من هذا التعقيد ومسارات ميكانيكية يمكن أن يحقق بسهولة أكبر.
بالإضافة إلى دورها الرئيسي في نقل المدخلات الحسية إلى الجهاز العصبي المركزي، وفرة مستقبلات للعديد من أجهزة الإرسال العصبية، بما في ذلك غابا12،13،،من1415 على مستوى سوما الخلايا العصبية، وكذلك قد تشير أدلة إثارة عبر إينتيرنيورونال أن الرسم مدمجو أولية متطورة من المدخلات الحسية16،17. هذه النتائج الجديدة تضفي على DRG explant خصائص نظام شبكة الخلايا العصبية ميني مشابهة لنماذج أخرى "الدماغ المصغر"، التي محددة النسيج العصبي أورجانويدس المستخدم للحقول التجريبية أوسع نطاقا للتحقيق والعلاجية نهج للأمراض العصبية18،19. هذه الأدلة إلى جانب حقيقة أن الرسم مجموعة منفصلة ومحددة تحديداً جيدا من الأنسجة العصبية محاطة بكبسولة ضام، جعله جهازا مناسباً لزرع الأعضاء السابقين فيفو .
الماوس تثقيف الرسم يمثل خياراً جذاباً متعددة الخلايا نموذج باثوفيسيولوجيس البشرية بسبب التشابه الهيكلي والوراثية بين الأنواع. بالإضافة إلى ذلك، إلى مستودع كبير للسلالات المحورة وراثيا الماوس الغاية تفضي إلى الدراسات الميكانيكية في المستقبل. يتطلب ملحق نورت خلال التنمية، وبعد إصابة ميكانيكية التفاعلات بين النمو مخروط والركيزة20،21. استخدمت ركائز نانو والصغرى منقوشة كأدوات توجيه ثمرة نورت وإثبات قدرتها على الاستجابة للسمات الطوبوغرافية في ميكرونفيرونمينتس بهم. وقد أظهرت الخلايا العصبية للبقاء على قيد الحياة، والالتزام، وترحيل، وتوجيه على محاور عصبية للتنقل بين السمات السطحية مثل الأخاديد في ركائز22،23. ومع ذلك، استخدمت هذه الدراسات عادة إلى خطوط الخلايا المزروعة ومن الصعب التنبؤ بكيفية الخلايا العصبية الأولية سوف تستجيب لمنبهات محددة تحديداً جيدا، والمادية في فيفو أو السابقين فيفو.
يحاكي النموذج explant السابقين فيفو الماوس الرسم المستخدمة لهذا الاقتراح التفاعل الحقيقي خلية خلية والبيوكيميائية العظة المحيطة بمحاور عصبية المتزايد. بين العديد من مختلف نماذج تجريبية تتراوح بين محواري التجدد، إنتاج نيوروسفيري، نيوروينفلاميشن، اكسبلانت الرسم نموذج ما زال بمثابة أداة قيمة للتحقيق الجانب العدوى والكمون الفيروسي داخل الحسية ganglia24،25،،من2627.
بشكل عام الجهاز العصبي (NS) هدفا للعدوى الفيروسية28،،من2930. معظم الفيروسات تصيب سطوح الخلايا الظهارية وبطانية وتشق طريقها من الأنسجة السطحية إلى NS عبر الأعصاب الطرفية الألياف الحسية والحركية. على وجه الخصوص، نوع فيروس الحلأ البسيط 1 (هامبورغ-1) بعد عدوى أولية في الخلايا الظهارية يرسي كمون مدى الحياة في العقد الحسية ويفضل الرسم31،السندات الإذنية32. قدرة نيوروبتروبيك هامبورغ-1 إصابة السندات الإذنية يؤدي في نهاية المطاف إلى33من الأمراض العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الإجراءات بما في ذلك استخدام الحيوانات ببروتوكولات أقرها مجلس المراجعة المؤسساتية (جامعة الغرب الأوسط IACUC).
1-حصاد الرسم من الأجنة الماوس
-
Euthanize الفئران الكبار بأسلوب الخنق (CO2) متبوعاً بقطع الرأس. تشرع فورا في إزالة العمود الفقري جراحيا.
- يعرض العمود الفقري بقطع أسفل طبقة الجلد دورسالي باستخدام مقص جيد. عزل العمود الفقري بالقطع من خلال الضلوع على جانبي العمود وأن عجز فصل العمود الفقري عن بقية الحيوان.
- جبل العمود الفقري (الجانب البطني الأعلى) على حصيرة جراحية باستخدام الإبر/دبابيس.
- استخدام مقص جيد جعل قطع مزدوج على كلا الجانبين من الهيئات بالعمود الفقري لفضح الجانب البطني القناة الفقري.
- تحت مجهر جراحي (تعيين إلى 4 X التكبير)، استخدام مقص لتحرك الحبل الشوكي بلطف على الجانب لكشف جذور العمود الفقري الظهرية contralateral وحدد موقع الرسم، على طول الجذور الظهرية للأعصاب المحيطية. كل العقدة جزئيا مخبأة داخل الثقب الفقرية.
- الحصاد في الرسم، قرصه جذر الظهرية (بين الحبل الشوكي وفي الرسم) مع الملقط واحد وسحب بلطف الرسم من الثقبة الفقرية.
- وضع الملقط الثاني على العصب الشوكي المحيطية للرسم وسحب الرسم إلى جانب العصب الشوكي والجذر الشوكي.
- ضع الرسم التي تم جمعها في 35 مم طبق بتري يحتوي على 3 مل من المصل المثلج وسائل الإعلام الحرة (SFM)34.
- نقل كل الرسم الفردية في زجاج جافة طبق بيتري، تحت مجهر جراحي، تنظيف وتقليم قبالة الزائدة الألياف والنسيج الضام لا تزال تعلق على الرسم استخدام شفرة. الرسم يسهل التعرف عليها كبنية شفافة بولجى على طول جذر العصب الشوكي الأبيض/. وكثيراً ما توجد الأوعية الدموية المحيطة الرسم.
- ضع الرسم تنظيفها في طبق بتري جديدة التي تحتوي على وسائط الإعلام SFM المثلج.
- تمييع خليط البروتين هلامية (انظر الجدول للمواد) في الإدارة المستدامة للغابات المثلج (1:1).
- لوحة الرسم السابقين فيفو في لوحات 12-جيدا قبل المغلفة مع 10/20 ميليلتر من خليط البروتين هلامية ومجموعة منهم داخل الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 30-60 دقيقة.
- بلطف إضافة 1.5-2 مل من الإدارة المستدامة للغابات إلى منظومة الثقافة لتغطية explant كامل والحفاظ على اكسبلانتس في استزراع الشروط (37 درجة مئوية و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون2).
ملاحظة: هذا خطوة حاسمة لأنه يرتكز الرسم إلى أطباق الزجاج فقط بواسطة خليط البروتين هلامية مبلمرة. الوقت البلمرة ومهارات بيبيتينج ذات الأهمية الحاسمة لتجنب العائمة. - تغيير وسيلة متزايدة الرسم كل ح 72 واسمحوا DRG تنمو لطالما دعت الحاجة.
2-عزل وحيد الخلية من الخلايا العصبية من الرسم
- مكان كل الرسم جمعت في أنبوب عقيم 1.5 مل مع 1.2 مل F12 الوسائط التي تحتوي على 1.25 ملغ/مل كولاجيناز الرابع واحتضان أنه في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 45 دقيقة كرر هذه الخطوة لآخر 45 دقيقة بعد الحضانة الأولى.
- علاج اكسبلانتس مع 2 مل F12 الوسائط التي تحتوي على التربسين (0.025 ٪) لمدة 30 دقيقة فورا بعد العلاج كولاجيناز الرابع في شركة 37 درجة مئوية و 5%2.
- احتضان مع 2 مل F12 الوسائط التي تحتوي على المصل البقري الجنين (FBS؛ 33 ٪) في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 15 دقيقة.
- أغسل explants ثلاث مرات مع 2 مل الإعلام F12 والشروع في ميكانيكيا ننأى لهم مع ماصة زجاجية حتى وسائل الإعلام يتحول غائم.
ملاحظة: هذا الإجراء ينطوي على مجموعة من الرسم نظيفة قلص من الحيوان كما هو موضح في المقطع السابق. عند تنفيذ الانفصال الميكانيكية من اكسبلانتس، أن يكون لطيف ولا تستخدم القوة المفرطة نظراً لأنها يمكن أن تؤدي إلى تسرب وفقدان المواد العامل. - تصفية ثقافة الخلية ينتابها من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرون لإزالة أي شوائب والنسيج الضام الزائدة. الطرد المركزي الخلية التي تم تصفيتها في (2,500 س ز) لمدة 2 دقيقة.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر نيوروباسال الوسائط التي تحتوي على الملحق لثقافة العصبية (س 1)، خليط المضادات الحيوية (س 1)، لام-الغلوتامات (0.5 ملم)، والأعصاب عامل النمو (5 ميكروغرام/مل) (انظر الجدول للمواد).
- لوحة الخلايا منفصلان على الشرائح المغلفة laminin الغطاء (50 ميكروغرام/مل؛ انظر الجدول للمواد) في كثافة خلية مفضل. تحديد الخلية كثافة استخدام عداد خلايا.
ملاحظة: نحن مطلي الخلايا في 25,000 الخلايا/غطاء الشريحة. هذا الأسلوب يسمح تفكك الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في الأقمار الصناعية. المكون الدبقية مثقف يشترك مع الخلايا العصبية بسيودونيبولار يلعب دوراً حاسما لبقاء الخلايا العصبية.
3-هامبورغ-1 العدوى DRG Explants والمستمدة من الرسم فصل الخلايا
ملاحظة: هذا العمل بدقة اتباع المتطلبات (BSL-2) 2 مستوى السلامة الأحيائية التي لدينا مختبر مجهز بالكامل بها من قبل لجنة السلامة الأحيائية في جامعة الغرب الأوسط. واستخدمت في هذه الدراسة سلالة كوس من هامبورغ-1. يرجى أخذ القياسات المناسبة واحتياطات السلامة وفقا للمبادئ التوجيهية للمؤسسات المحلية إذا كان يعمل مع سلالات الفيروس.
- تحديد وإعداد الفيروس في تخفيف الصحيح في وسائل الإعلام في الإدارة المستدامة للغابات لتصيب الطراز. وكان الفيروس المستخدمة في هذه الدراسة كوس سلالة من هامبورغ-1. عند العمل مع المستمدة من الرسم فصل الخلايا، استخدم 1 وحدة لتعدد العدوى (وزارة الداخلية) للعدوى، مما يعني أن عدد الفيروس تساوي عدد الخلايا.
- إذا كانت إصابة DRG explants، استخدام عدد فيريونس (مثلاً، فيريونس 10,000) لأنه لا يمكن تحديد رقم دقيق للخلايا في اكسبلانت.
- ضع explant/الخلايا للإصابة بالفيروس في لوحة الخلية العقيمة أو الأنبوبة التي تحتوي على مزيج من وسائل الإعلام في الإدارة المستدامة للغابات، والفيروسات.
ملاحظة: كنا فيريونس 25,000 لتغطية شريحة التي تحتوي على خلايا 25,000 (1 موي). لتصيب اكسبلانت، فإننا نستخدم فيريونس 10,000. - ضع لوحة الخلية أو أنبوب في 37 درجة مئوية للعدوى؛ قد تختلف الوقت التعرض الفيروسية العدوى الفيروسية.
ملاحظة: أكد دخول الفيروسية باستخدام اورثو-نيتروفينيل-β-جالاكتوسيدي (أونبج) و 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-غال) فحوصات26.
4-الفلورة
- إصلاح اكسبلانتس وعينات خلية مفردة في 4% فورمالين أعدت في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). تغسل العينات 3 مرات لكل 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني.
- احتضان العينات مع المطلوب أجسام الأولية (مكافحة-β-tubulin، بيريفيرين المضادة، مكافحة heparan كبريتات (النظام المنسق)، و/أو بروتين سكري المضادة جسم د (gD)؛ انظر الجدول للمواد لتخفيف) المخفف في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني مع 0.3% X تريتون (ببست) و 10 % مصل الماعز العادي. تخزين العينات في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- تغسل العينات 3 مرات لمدة كل 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة ح 1 في جسم الثانوية المناسبة (488 و/أو Cy3؛ انظر الجدول للمواد لتخفيف) المخفف في برنامج تلفزيوني.
- تغسل العينات 3 مرات لمدة كل 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني. احتضان العينات مع صبغ هويشت (1.5 ميكرومتر) في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة قبل الخطوة المتصاعدة.
- تحميل العينات على الشرائح الزجاجية باستخدام fluorescence تصاعد المتوسطة وساترة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن أن يحقق جوانب متعددة من التفاعل أعصاب والعصبية والبيئة باستخدام الرسم ونموذج ثقافة خلية مفردة معزولة. لقد بدأنا الدراسات بعزل explant DRG وخلايا ينتابها المستمدة من الرسم تخطيطياً ممثلة في الشكل 1. يمكن تحليل الأنسجة والخلايا المفردة نماذج باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات الجزيئية مثل لطخة غربية وفحوصات الجينوم، الفلورة وغيرها من التقنيات التحليلية اعتماداً على طبيعة التصميم التجريبي وأهداف. أولاً، كنا نموذجنا explant DRG للتحقيق في تأثير الإشارات البيوكيميائية على النمو محواري (الشكل 2). وتأكدت التعبير التفاضلية من بيريفيرين (الشكل 2 أ، ب؛ الأحمر) و β-tubulin (الشكل 2 أ، ب؛ الأخضر) في الفلورة مزدوجة أو ثلاثية، سواء داخل الهيئات الخلايا العصبية وبراعم نيوريتي الطرفية. وحددت نواة الخلية مع وصمة عار هويشت (الشكل 2A؛ الأزرق). التعبير عن العلامات المذكورة أعلاه تمت مواصلة تحليلها في explant DRG كامل بعد التثبيت في بارافورمالدهيد 4% ومبضع تمزيقها (الشكل 3A). وأكدت النتائج التي توصلنا إليها بشكل انتقائي أعرب بيريفيرين و β-tubulin في الفئات السكانية الفرعية اثنين من الخلايا العصبية جانجليونيك مع بيريفيرين الإعراب عن "الصغيرة والخفيفة" و β-tubulin في الفئات السكانية الفرعية "كبيرة، والظلام" من الخلايا العصبية، على التوالي. إيمونولابيليد نيوريتيس مع علامة أما الخارجة من الخلايا العصبية الحسية عثر على التعقيب من خلال العقدة كاملة قبل أن تخرج في الهامش. وحددت هويشت وصمة عار معظمها موقف الأنوية الدبقية الأقمار الصناعية داخل العقدة. كما هو مبين في الشكل 3 (ب)، يمكن تصور تفاعل الخلايا العصبية-الأقمار الصناعية أفضل بعد تقنية الانفصال من خلية كاملة. وشوهدت نواة الخلية فضائية ملطخة باللون الأزرق المحيطة سوما الخلايا العصبية حسية من β-tubulin-إيجابية ولها نيوريتيس واسعة النطاق.
كما تستخدم الخلايا المستمدة من الرسم فصلها للتحقيق في هامبورغ-1 العدوى وترتبط الاستجابة الالتهابية داخل الخلايا العصبية الحسية (الشكل 4). بعد 1 ساعة فقط بعد الإصابة (بي)، تم الكشف عن دخول هامبورغ-1 باستخدام جسم gD المضادة-هامبورغ-1 في الخلايا الدبقية (الشكل 4A) والخلايا العصبية الرسم (الشكل 4 باء) على حد سواء. وباﻹضافة إلى ذلك، تلطيخ HS كان كذلك نفذت منذ HS ينص مواقع إرساء المرفق الفيروس أو ملزمة للخلية المضيفة. تم المعروفة عنصرا حاسما في المصفوفة خارج الخلية متعددة الوظائف (ECM) النظام المنسق وموثقة على نطاق واسع للعب دور رئيسي في التصاق الخلايا، مما يشير إلى خلية إلى خلية، وإعادة عرض المحتوى أثناء التئام الجروح، التطور الجنيني، والسرطان الغزو، والتليف، وفي نيوروينفلاميشن35،36. من المثير للاهتمام، لاحظنا تلطيخ النظام المنسق في إدارة المحتوى في المؤسسة مما يوحي بدورها المحتمل في المكروية التي تسمح بنمو محواري (الشكل 4). وأخيراً، لتلطيخ β-tubulin نحن كعلامة إيجابية نيوريتيس للتأكد من سلامة الخلايا العصبية.
الشكل 1 . التمثيل التخطيطي DRG التجريبية ووحيد الخلية نماذج الثقافة- الرسم كانت معزولة من الفئران الكبار المعاهد الوطنية للصحة/السويسرية، تنظيفها من النسيج الضام الحافظة المفرطة، وأما اكسبلانتيد السابقين فيفو ك explant أكملها أو فصلها في الثقافات المشارك الرئيسي للخلايا العصبية الحسية والخلايا الأقمار الصناعية. يمكن استخدام كلا النموذجين لمزيد من التحليلات مع تقنيات تحليلية متعددة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . تنمية الثقافة أورجانوتيبيك الرسم كنظام نموذجي للتحقيق محواري النمو. DRG نمت لمدة 6 أيام السابقين فيفو استخدمت للتحقيق نبتت محواري من explant. نظهر الفلورة كيف مختلفة البيوكيميائية ظروف يمكن أن تؤثر على توزيع الألياف براعم: تنمو عشوائياً وغير منظم (أ) مقارنة بطريقة أكثر خطية ومرتبة (ب). تتم تسمية في اكسبلانتس مع مكافحة-β-Tubulin (الأخضر) ومكافحة--بيريفيرين (أحمر). نواة الخلية هي ملطخة هويشت وصمة عار (أزرق). تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . التوصيف الجزيئي لنموذج الثقافة الخلايا العصبية معزولة. وكانت أجزاء من الرسم كله إيمونولابيليد مع الأجسام المضادة ضد بيريفيرين وإظهار التعبير انتقائية من العلمين في الفئات السكانية الفرعية اثنين من الخلايا العصبية جانجليونيك β-tubulin. وأعرب عن بيريفيرين (أحمر) في الخلايا العصبية "الصغيرة والخفيفة" وأعرب عن β-tubulin (الأخضر) في الخلايا العصبية "كبيرة، والظلام". وحددت هويشت وصمة عار معظمها موقف الأنوية الدبقية الأقمار الصناعية ضمن العقدة (A). يمكن تصور تفاعل الخلايا العصبية-الأقمار الصناعية أفضل بعد خلية كاملة تفارق تقنية (ب). هنا نعرض هيئة β-tubulin-إيجابية الخلايا العصبية حسية ونيوريتيس لها محاطة بالخلايا الدبقية الساتلية (هويشت: نوى، الأزرق). تغيير حجم أشرطة، A = 100 ميكرومتر؛ ب = 25 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . التحقيق في هامبورغ-1 إدخال نموذج في المستمدة من الرسم فصل الخلايا. هامبورغ-1 العدوى ينتابها الخلايا الأقمار الصناعية صورت على طول نيوريتيس β-tubulin-إيجابية (الأخضر) كشفت استخدام جسم gD مضادة للفيروسات (أحمر). نويات الخلايا الدبقية الساتلية ملطخة الأزرق مع هويشت (A). ويكشف جسم نفس دخول فيروسية في الخلايا العصبية معزولة مجموعات التشخيص المتماثلة (ب). تكون الخلايا المسماة يشترك مع جسم مضاد ضد كبريتات heparan (HS، الأخضر) أعربت في غشاء الخلية. النظام المنسق هو أيضا عنصر في المصفوفة خارج الخلية (الأخضر)، وتلعب دوراً هاما للنمو محواري (ج). تتم تسمية الخلايا العصبية مع بيريفيرين (أحمر) بينما هويشت الأزرق ويستخدم لتحديد الأنوية الساتلية المحمولة. تغيير حجم أشرطة = 25 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نموذج الرسم السابقين فيفو مفيدة للغاية للتحقيق في طائفة واسعة من الأحداث مثل التفاعل إطلاق العصبية وكذلك أثر المكروية على كلا استقلاب الخلايا العصبية والدبقيه37. علاوة على ذلك، يمكن استخدام الرسم-النموذج كأداة فعالة من حيث التكلفة لمعالجة المسائل ذات الصلة فيما يتعلق بالآلية المسببة للأمراض وما يرتبط بها علامات بوضع ت نظم فيفو للمرحلة الحادة المزمنة والكامنة للإصابة أو في مرض معين. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استغلال مكتبة فرز من الجزيئات الصغيرة في الرسم اكسبلانتس هذا النموذج explant لتطوير الأدوية. نماذج في المختبر ، ولا سيما أنظمة وحيدة الخلية، غالباً ما تكون مبسطة جداً للربط بين الأحداث الفيزيولوجية ذات الصلة؛ بينما تشكل تحديا في فيفو نماذج للتحديد التلاعب، جزئيا بسبب الاستجابة المناعية للإصابة وتندب الدبقية، وتعقيد ECM المحيطة بها جنبا إلى جنب مع المصروفات المالية. وفي المقابل، هو DRG explant بثقافة أورجانوتيبيك التي تسمح السابقين فيفو نقل جهاز كامل مع تعقيد شبكة الخلايا العصبية، بما في ذلك المكروية خارج الخلية التي تلعب دوراً هاما في جميع الخلايا العصبية والدبقيه وظائف. توليد نموذج السابقين فيفو يمكن يشابه فقط ولكن ليس تماما بالمثل جميع الشروط الموجودة في فيفو. اثنين من أوجه القصور الهامة يجب وضعها في الاعتبار عند استخدام هذا النموذج التوقيت وغياب ردود الفعل الجهازية، الذي يمكن أن يكون إلا حقاً ممثلة في فيفو. الوقت المحدود الذي يمكن الإبقاء الرسم الحيوية السابقين فيفو يجعل هذا النموذج أكثر ملاءمة للتحقيق في الحالات الحادة، ومن ثم لا نموذج موثوق به جداً للحالات المزمنة. وبالمثل، النموذج السابقين فيفو ليست مثالية للدراسات التي قد تتأثر بعدم وجود ردود من الأجهزة أو الأنظمة (مثلاً، نظام المناعة) الأخرى.
كنا قادرين على عزل explant السابقين فيفو الرسم من الكبار والجنين في الفئران والجرذان واستخدم هذا النموذج للتحقيق في هامبورغ-1 العدوى وكذلك متعددة الجوانب الأخرى من أعصاب وآثاره على الطب متعدية الجنسيات بنجاح. بغية السماح الألياف الحسية ينمو خارج explant، كانت الكبسولة المحيطة الضام جزئيا إزالة1.
أن ينظر، خليط البروتين هلامية المستخرجة من إيسريتش ساركوم الماوس انجيلبريث-هولم-سرب (EHS) في بروتينات ECM مثل laminin والكولاجين الرابع، الهيبارين سلفات بروتيوجليكانس (هسبج)، وعدد من عوامل النمو38. في هذا البروتوكول، خليط البروتين هلامية المخفف 1:1 مع الثقافة المتوسطة ويسمح بلمرة لمدة 30-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل إضافة وحدة التخزين النهائي للمتوسطة. خليط البروتين هلامية بوليميريزيس في درجة حرارة الغرفة؛ ولذلك، يقترح الخليط في الثلاجة حتى يتم مطلي explants واستخدام تلميحات ماصة الباردة لتوزيع ميليلتر 10-20 قطرات على أطباق 12-جيدا. التوقيت أمر بالغ الأهمية لكفاءة النهائي الداخلي الثقافة وقد تختلف باختلاف نوع (وصناعة) من خليط البروتين هلامية المستخدمة. إذا لم يتم بلمرة خليط البروتين هلامية تماما أو أنه هو توطد فعلا، يمكن explant تطفو أو تجف مما يؤدي إلى نمو غير ناجحة. ونحن نشجع المحققين تجريبيا تحديد درجة الحرارة المناسبة، والوقت، وتمييع خليط البروتين هلامية لنموذج ناجح. وصلنا من كفاءة 55-70 في المائة من النمو الناجح للرسم explants الحفاظ السابقين فيفو لتصل إلى 7-10 أيام. يمكن يمكن فصلها explant كذلك المستمدة من الرسم الأساسي الحسية الخلايا العصبية والخلايا الأقمار الصناعية المشارك الثقافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب لا تمت بصلة للكشف.
Acknowledgments
ونشكر صدق التصوير الأساسية-المرفق في جامعة الغرب الأوسط (مو) والمجموعة من الطلاب [سنغ تشانمولي، كريستوفر ديبولينا، داريل جيامبالفو، وكيسي سيجرسون] لمساهماتها في خلية ثقافة وتصوير العمل. هذا العمل البحثي وأيده Intramural مو منح التمويل لصناديق بدء م. ف. والبحوث V.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
References
- Muratori, L., et al. Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury. Neural Plast. , 860546 (2015).
- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin. J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).
- Devor, M., Govrin-Lippmann, R. Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).
- Farel, P. B., Boyer, A. Transient effects of nerve injury on estimates of sensory neuron number in juvenile bullfrog. J Comp Neurol. 410 (2), 171-177 (1999).
- Geuna, S., Borrione, P., Poncino, A., Giacobini-Robecchi, M. G. Morphological and morphometrical changes in dorsal root ganglion neurons innervating the regenerated lizard tail. Int J Dev Neurosci. 16 (2), 85-95 (1998).
- La Forte, R. A., Melville, S., Chung, K., Coggeshall, R. E. Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells. Somatosens Mot Res. 8 (1), 3-7 (1991).
- Pannese, E. Investigations on the Ultrastructural Changes of the Spinal Ganglion Neurons in the Course of Axon Regeneration and Cell Hypertrophy I. Changes during Axon Regeneration. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 60, 711-740 (1963).
- Popken, G. J., Farel, P. B. Sensory neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods. J Comp Neurol. 386 (1), 8-15 (1997).
- Tandrup, T. Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival. J Neurocytol. 33 (2), 173-192 (2004).
- Sarikcioglu, L., et al. Effect of severe crush injury on axonal regeneration: a functional and ultrastructural study. J Reconstr Microsurg. 23 (3), 143-149 (2007).
- Varejao, A. S., et al. Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J Neurotrauma. 21 (11), 1652-1670 (2004).
- Hanack, C., et al. GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals. Cell. 160 (4), 759-770 (2015).
- Pagadala, P., et al. Loss of NR1 subunit of NMDARs in primary sensory neurons leads to hyperexcitability and pain hypersensitivity: involvement of Ca(2+)-activated small conductance potassium channels. J Neurosci. 33 (33), 13425-13430 (2013).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Y., Lu, S. G., Gold, M. S. Persistent inflammation increases GABA-induced depolarization of rat cutaneous dorsal root ganglion neurons in vitro. Neuroscience. 220, 330-340 (2012).
- Amir, R., Devor, M. Functional cross-excitation between afferent A- and C-neurons in dorsal root ganglia. Neuroscience. 95 (1), 189-195 (2000).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 332-343 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Miller, C., Shanks, H., Witt, A., Rutkowski, G., Mallapragada, S. Oriented Schwann cell growth on micropatterned biodegradable polymer substrates. Biomaterials. 22 (11), 1263-1269 (2001).
- Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: II. Multiple grooved substrata. Development. 108 (4), 635-644 (1990).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis. J Virol. 84 (3), 1504-1512 (2010).
- Holland, D. J., Miranda-Saksena, M., Boadle, R. A., Armati, P., Cunningham, A. L. Anterograde transport of herpes simplex virus proteins in axons of peripheral human fetal neurons: an immunoelectron microscopy study. J Virol. 73 (10), 8503-8511 (1999).
- Sharthiya, H., Seng, C., Van Kuppevelt, T. H., Tiwari, V., Fornaro, M. HSV-1 interaction to 3-O-sulfated heparan sulfate in mouse-derived DRG explant and profiles of inflammatory markers during virus infection. J Neurovirol. 23 (3), 483-491 (2017).
- Zerboni, L., et al. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Koyuncu, O. O., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Virus infections in the nervous system. Cell Host Microbe. 13 (4), 379-393 (2013).
- Swanson, P. A. 2nd, McGavern, D. B. Viral diseases of the central nervous system. Curr Opin Virol. 11, 44-54 (2015).
- Tyler, K. L. Emerging viral infections of the central nervous system: part 2. Arch Neurol. 66 (9), 1065-1074 (2009).
- Preston, C., Efstathiou, S., et al. Ch 33. Human Herpesviruses Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Campadelli-Fiume, G., Arvin, A., Mocarski, E., et al. , Cambridge University Press. (2007).
- Roizman, B., Whitley, R. J. An inquiry into the molecular basis of HSV latency and reactivation. Annu Rev Microbiol. 67, 355-374 (2013).
- Arvin, A., et al. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Fueshko, S., Wray, S. LHRH cells migrate on peripherin fibers in embryonic olfactory explant cultures: an in vitro model for neurophilic neuronal migration. Dev Biol. 166 (1), 331-348 (1994).
- Parish, C. R. The role of heparan sulphate in inflammation. Nat Rev Immunol. 6 (9), 633-643 (2006).
- Zhang, X., Wang, B., Li, J. P. Implications of heparan sulfate and heparanase in neuroinflammation. Matrix Biol. 35, 174-181 (2014).
- Du, X., et al. Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission. J Clin Invest. 127 (5), 1741-1756 (2017).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
