Summary
In dit verslag zijn de voordelen van organotypic culturen en gedissocieerde primaire culturen van muis-afgeleide dorsal root ganglia gemarkeerd om te onderzoeken van een breed scala van mechanismen die zijn gekoppeld aan neuron-gliale interactie, Neuroplasticiteit, neuroinflammation, en reactie op virale infectie.
Abstract
Dit protocol beschrijft een ex vivo -model van de muis afkomstige dorsal root ganglia (DRG) explant en in vitro DRG afkomstige co cultuur van gedissocieerde sensorische zenuwcellen en gliacellen satelliet. Dit zijn handige en veelzijdige modellen te onderzoeken van een verscheidenheid van biologische reacties fysiologische en pathologische omstandigheden van het perifere zenuwstelsel (PNS) variërend van neuron-gliale interactie, Neuroplasticiteit, gekoppeld neuroinflammation en virale infectie. Het gebruik van de DRG explant is wetenschappelijk voordelig in vergelijking met simplistische afzonderlijke cellen modellen om meerdere redenen. Bijvoorbeeld, als een organotypic cultuur kunt de DRG explant ex vivo overdracht van een gehele neuronale netwerk, met inbegrip van de extracellulaire communicatie die een belangrijke rol in alle functies voor de neuronale en gliale. Verder, DRG explantaten kunnen ook worden gehandhaafd ex vivo voor enkele dagen en de kweekomstandigheden kunnen worden verstoord als gewenst. Bovendien, kan de geoogste DRG in een in vitro co cultuur van primaire sensorische zenuwcellen en gliacellen satelliet te onderzoeken neuronale-gliale interactie, neuritogenesis, axonale kegel interactie met de extracellulaire verder worden losgekoppeld communicatie, en meer in het algemeen, de diverse aspecten die zijn gekoppeld aan de neuronale metabolisme. Dus biedt het systeem van de DRG-explant een grote mate van flexibiliteit te bestuderen van een breed scala aan gebeurtenissen met betrekking tot de biologische, fysiologische en pathologische omstandigheden op een kosteneffectieve manier.
Introduction
In dit manuscript rapporteren we een methode voor het verkrijgen van een organotypic ex vivo model van een muis afgeleid DRG modelsysteem als een bewaarde weefsel-achtige communicatie te onderzoeken van een breed scala aan biologische reacties op PNS beledigingen variërend van neuron-gliale interactie, Neuroplasticiteit, inflammatoire merkers, virale infectie. Daarnaast ontwikkelden we verder een protocol wilt maken van een primaire co cultuur van DRG-afgeleide één sensorische neuronen en satelliet cellen.
De DRG zijn grijs-zaak-eenheden van de satelliet langs de dorsale wervelkolom wortels van spinale zenuwen buiten het centrale zenuwstelsel (CNS) gelegen. De Deutsche Reichsbahn, gelegen in de nabijheid van lat. foramen, huis pseudounipolar sensorische neuronen en satelliet gliacellen. De pseudounipolar neuronen zijn voorzien van een enkele neurite die splitst in een perifere proces uitvoeren van somatische en viscerale ingangen van perifere doelstellingen aan de cel lichaam, en een centrale proces waarmee sensorische informatie van de cel lichaam in het centraal zenuwstelsel. Een bindweefsel capsule definieert en isoleert van deze perifere cluster van zenuwcellen en gliacellen van de CNS. Geen postnatale cel migratie naar of van de DRG ooit is beschreven en een lokale stamcel niche is verantwoordelijk voor neurogene gebeurtenissen in de gehele leven1. Dus, dit model is bijzonder geschikt om te studeren volwassen neurogenesis, axonogenesis, reageren op traumatische laesie, en cel dood2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
Op het gebied van neuroregeneration, de DRG geoogst van in vivo en reproduceert transplanteren in vitro axonotmesis, een voorwaarde van de schade in welke axonen zijn volledig verbroken en de neuronale cel lichaam wordt losgekoppeld van het bezenuwde doel10 ,11. Het is algemeen bekend dat perifere zenuw letsel leiden verminderde en verhoogde genexpressie in de DRG tot kan en veel van deze veranderingen het gevolg van regeneratieve processen zijn maar velen kunnen ook een resultaat van immune reactie of een andere reactie van de non-neuronale cellen. Met behulp van een ex vivo systeem van geïsoleerde DRG, sommige van deze complexiteit is verwijderd en mechanistische trajecten kunnen gemakkelijker worden onderzocht.
Naast haar centrale rol bij het overbrengen van sensorische input voor de CNS, de overvloed van receptoren voor vele neurotransmitters, met inbegrip van GABA12,13,14,15 op het niveau van de neuronale soma, evenals bewijs van interneuronal cross-excitatie kan suggereren dat DRG zijn geavanceerde voorlopige integrators van sensorische input16,17. Deze nieuwe bevindingen verlenen naar de DRG explant de kenmerken van een mini-neuronale netwerksysteem vergelijkbaar met andere "mini brein" modellen, die nerveus-weefsel-specifieke organoids gebruikt voor bredere proefvelden van onderzoek en therapeutische benadering van neurologische ziekten18,19. Deze bewijzen samen met het feit dat de DRG een discrete en welomschreven cluster van neuronale weefsel daaromheen een bindweefsel capsule is, maken het een geschikt orgaan voor transplantatie- ex vivo .
Kweken muis DRG presenteert een aantrekkelijk meercellige optie model van menselijke pathophysiologies als gevolg van structurele en genetische gelijkenissen tussen de soorten. Een grote opslagplaats van transgene muis stammen is bovendien zeer bevorderlijk voor toekomstige mechanistische studies. Neurite uitbreiding zowel tijdens de ontwikkeling en na blessure vereist mechanische interacties tussen groei kegel en substraat20,-21. Nano - en micro-patroon substraten zijn gebruikt als instrumenten om direct uitvloeisel van de neurite en hun capaciteit om te reageren op topografische kenmerken in hun microenvironments aan te tonen. Neuronen hebben aangetoond dat overleven, houden, migreren en hun axonen ga oppervlaktekenmerken zoals groeven in substraten22,23te oriënteren. Echter, deze studies hebben typisch gekweekte cellijnen gebruikt en het is moeilijk te voorspellen hoe de primaire neuronale cellen zal reageren op welomschreven, fysieke signalen in vivo of ex vivo.
De ex vivo explant model van muis DRG gebruikt voor dit voorstel bootst de echte cel-cel interactie en biochemische signalen rond groeiende axonen. Van de vele verschillende experimentele paradigma's variërend van axonale regeneratie, neurosphere productie, tot neuroinflammation, de DRG explant blijft model om te dienen als een waardevol instrument te onderzoeken van de virale infectie en latentie aspect binnen sensorische ganglia24,25,26,27.
Het zenuwstelsel (NS) is in het algemeen doel voor virale infecties28,29,30. De meeste virussen infecteren epitheliale en endothelial cel oppervlakken en maken hun weg uit de oppervlakte weefsel aan de NS via perifere zenuwen sensorische en motorische vezels. In het bijzonder het herpes simplexvirus type 1 (HSV-1) na een eerste infectie in epitheliale cellen een levenslang latentie bij voorkeur in de sensorische ganglia vestigt de DRG de PNS31,32. HSV-1 neuroptropic vermogen van het infecteren van de PNS leidt uiteindelijk tot neurologische ziekten33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met inbegrip van het gebruik van de dieren zijn goedgekeurd door de institutionele beoordeling bestuur goedgekeurde protocollen (IACUC-Midwesten University).
1. oogsten DRG van muis embryo 's
-
De volwassen muizen door verstikking methode (CO2) gevolgd door onthoofding euthanaseren. Onmiddellijk overgaan tot het operatief verwijderen van de wervelkolom.
- De wervelkolom bloot door het kappen van de huidlaag dorsally met fijne schaar. Het isoleren van de wervelkolom door te snijden door middel van de ribben aan weerszijden van de kolom en het heiligbeen scheiden van de wervelkolom van de rest van het dier.
- Monteer de wervelkolom (ventrale kant naar boven) op een chirurgische mat met behulp van naalden/spelden.
- Met behulp van fijn schaar maken een double snijd aan beide zijden van de wervel lichamen aan de ventrale zijde van de gracht vertebral bloot.
- Onder een chirurgische Microscoop (vergroting ingesteld op 4 X), schaar voorzichtig hiermee kunt het ruggenmerg aan de kant om de contralaterale spinale dorsale wortels bloot te stellen en om te vinden van de Deutsche Reichsbahn, langs de dorsale wortels van de perifere zenuwen. Elke ganglion is gedeeltelijk verborgen in de lat. foramen.
- Verkrijgen van de Deutsche Reichsbahn, knijpen de achterwortelganglia (tussen het ruggenmerg en de DRG) met een pincet en trek voorzichtig uit de DRG uit de lat. foramen.
- Plaats de tweede verlostang op de spinale zenuw perifere aan de Deutsche Reichsbahn en trek de DRG samen met de spinale zenuw en spinale wortel.
- Plaats de verzamelde DRG in een 35 mm petrischaal met 3 mL ijskoud serum mediagroep (SFM)34.
- Overdracht van elke individuele DRG in een droog glas petrischaal onder een chirurgische Microscoop, schoon en trim uit overtollige vezels en bindweefsel nog steeds verbonden met de DRG met behulp van een mes. De DRG is herkenbaar als een uitpuilend transparante structuur langs de witte spinale zenuw/root. Bloedvaten worden vaak gevonden rond de Deutsche Reichsbahn.
- Plaats de schoongemaakte DRG in een nieuwe petrischaal met ijskoude SFM media.
- Verdun het mengsel van de gelatine-achtige eiwit (Zie Tabel van materialen) in ijskoude SFM (1:1).
- Plaat de DRG ex vivo in 12-Wells-platen vooraf bedekt met 10/20 µL van het mengsel van de gelatine-achtige eiwitten en zet ze in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 voor 30-60 min.
- Voeg voorzichtig 1.5-2 mL SFM aan het systeem van de cultuur te dekken van de gehele explant en handhaven de explantaten op het kweken van voorwaarden (37 ° C en 5% CO2).
Opmerking: Dit is een belangrijke stap, omdat de DRG wordt verankerd aan het glas-gerechten alleen door het mengsel gepolymeriseerde gelatine-achtige eiwitten. Tijd van polymerisatie en pipetting vaardigheden zijn cruciaal voor het voorkomen van drijvende. - Het medium van de groeiende DRG elke 72 h wijzigen en laat de DRG groeien voor zo lang als nodig.
2. het isoleren van eencellige neuronen van DRG
- Plaats alle de DRG verzameld in een 1,5 mL steriele buis met 1,2 mL F12 media met 1,25 mg/mL collagenase IV en het Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 voor 45 min. Herhaal deze stap voor een andere 45 min na de eerste incubatie.
- Behandelen explantaten met 2 mL F12 media trypsine (0,025%) voor 30 min met onmiddellijk na de behandeling collagenase IV bij 37 ° C en 5% CO2.
- Incubeer met F12 media foetale runderserum (FBS; 33%) met 2 mL bij 37 ° C en 5% CO2 voor 15 min.
- Wassen explantaten driemaal met 2 mL F12 media en overgaan tot het mechanisch te distantiëren met een glazen pipet totdat de media bewolkt verandert.
Opmerking: Deze procedure betrekt collectie van schoon/getrimd DRG van het dier zoals uiteengezet in de voorafgaande sectie. Bij het uitvoeren van mechanische dissociatie van explantaten, zacht en gebruik geen overmatige kracht aangezien het tot morsen en verlies van werkende materiaal leiden kan. - Filtreer de gedissocieerde celcultuur door een 0,22 µm filter te verwijderen alle onzuiverheden en overtollig bindweefsel. Centrifugeer de gefilterde cel lysate (2.500 x g) gedurende 2 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 500 µL van neurobasal media met supplement voor neuronale cultuur (1 x), antibiotica mengsel (1 x), L-glutamaat (0.5 mM), en zenuwen groeifactor (5 µg/mL) (Zie Tabel van materialen).
- Plaat de gedissocieerde cellen in laminin beklede cover dia's (50 µg/mL; Zie Tabel van materialen) op een voorkeur celdichtheid. Het bepalen van de celdichtheid met behulp van een cel counter.
Opmerking: We vergulde cellen op 25.000 cellen/cover dia. Deze techniek maakt het mogelijk dissociatie van neuronen zowel satelliet gliacellen. Het gliale onderdeel samen met de pseudounipolar neuronen gekweekte speelt een cruciale rol voor neuronale overleven.
3. HSV-1 infectie DRG explantaten of DRG-afgeleide gedissocieerde cellen
Nota: Dit werk werd gedaan door de bioveiligheid niveau 2 (BSL-2) eisen waaraan we hebben een volledig uitgeruste laboratorium dat is erkend door het Midwesten Universiteit bioveiligheid Comité strikt te volgen. Een KOS stam van HSV-1 werd gebruikt in deze studie. Neem passende metingen en veiligheidsmaatregelen volgens plaatselijke instellingen richtsnoeren als werken met virusstammen.
- Bepalen en voor te bereiden van het virus in de juiste verdunningen in SFM media te infecteren het model. Het virus wordt gebruikt in deze studie was KOS stam van HSV-1. Als werken met DRG afkomstige losgekoppeld cellen, gebruikt u 1 eenheid van multipliciteit van infectie (MOI) voor infectie, wat betekent dat het aantal virus gelijke het aantal cellen.
- Als het infecteren van de Deutsche Reichsbahn explants, gebruiken het aantal virionen (b.v., 10.000 virionen) omdat een exact aantal cellen in een explant kan niet worden bepaald.
- Plaats de explant/cellen worden besmet met het virus in een steriele cel plaat of buis met een mengsel van SFM media en virus.
Opmerking: Wij 25.000 virionen gebruikt voor een cover dia met 25.000 cellen (1 MOI). We gebruiken om te infecteren een explant, 10.000 virionen. - Plaats van de cel plaat of buis bij 37 ° C gedurende infectie plaatsvinden; tijdstip van de viral blootstelling kan variëren afhankelijk van virale infectiviteit.
Opmerking: Virale binnenkomst werd bevestigd met behulp van de ortho-nitrofenyl-β-galactoside (ONPG) en 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) testen26.
4. immunofluorescentie
- Corrigeer de explantaten en eencellige monsters in 4% formaline bereid in een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Wassen monsters 3 keer voor elke 10 min in PBS.
- Incubeer de monsters met de gewenste primaire antilichamen (anti-β-tubuline, anti-peripherin, anti-heparan sulfaat (HS), en/of anti-glycoproteïne D (gD) antilichaam; Zie Tabel van materialen voor verdunningen) verdund in PBS buffer met 0,3% Triton-X (PBST) en 10 % normale geit serum. Opslaan monsters bij 4 ° C's nachts.
- Wassen van de monsters 3 keer voor elke 10 min met PBS. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in de passende secundair antilichaam (488 en/of Cy3; Zie Tabel van materialen voor verdunningen) verdund in PBS.
- Wassen van de monsters 3 keer voor elke 10 min met PBS. Incubeer de monsters met Hoechst kleurstof (1,5 µM) in PBS gedurende 20 min vóór montage stap.
- Monteer de monsters op glas dia's met behulp van een fluorescentie montage medium en dekglaasje aan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Meerdere aspecten van Neuroplasticiteit en neuron-omgeving interactie kunnen worden onderzocht met behulp van de Deutsche Reichsbahn en een gedissocieerde eencellige cultuur model. We begonnen de studies door het isoleren van een DRG explant en DRG-afgeleide gedissocieerde cellen zo schematisch weergegeven in Figuur 1. Zowel weefsel en afzonderlijke cellen modellen kunnen worden geanalyseerd met behulp van een verscheidenheid van moleculaire technieken zoals immunofluorescentie, westelijke vlek, genomic testen en andere analytische technieken afhankelijk van de aard van de proefopzet en doelstellingen. Ten eerste, we gewend onze DRG explant model onderzoeken van het effect van biochemische signalen op axonale groei (Figuur 2). In dubbele of driedubbele immunofluorescentie, werden de differentiële expressie van peripherin (figuur 2A, B; rood) en β-tubuline (figuur 2A, B; groen) zowel binnen de neuronale cel organen en de spruiten van de perifere neurite bevestigd. Celkernen werden geïdentificeerd met Hoechst vlek (figuur 2A; blauw). De uitdrukking van de bovenvermelde markeringen werd verder geanalyseerd in de gehele DRG explant na fixatie in 4% paraformaldehyde en microtoom-segmenteren (figuur 3A). Onze resultaten bevestigd dat peripherin en β-tubuline worden selectief uitgedrukt in twee subpopulaties van ganglionaire neuronen met peripherin worden uitgedrukt in de "kleine, lichte" en β-tubuline in de "grote, donkere" subpopulaties van neuronen, respectievelijk. De immunolabeled van de neurites met beide marker die voortkomen uit de sensorische neuronen zijn gevonden dwars door de hele ganglion voordat u afsluit in de periferie. Hoechst vlek geïdentificeerd meestal de positie van de kernen van gliale satelliet binnen de ganglion. Zoals aangegeven in figuur 3B, kan de neuron-satelliet cel interactie beter na de volledige cel dissociatie techniek worden gevisualiseerd. Satelliet celkernen blauw gebeitste werden gezien rond een zintuiglijke neuronale soma β-tubuline-positief en de uitgebreide neurites.
We verder gebruikt de DRG-afgeleide losgekoppeld cellen om te onderzoeken van HSV-1 infectie en geassocieerde inflammatoire respons binnen de sensorische neuronen (Figuur 4). Na slechts 1 uur van post-infectie (p.i.) werd vermelding HSV-1 opgespoord door middel van anti-HSV-1 gD antilichaam zowel in gliale cellen (figuur 4A) en de Deutsche Reichsbahn neuronen (figuur 4B). Daarnaast werd HS kleuring verder uitgevoerd aangezien HS een docking sites voor virus bijlage of binding aan de gastheercel biedt. HS is bekend als een essentieel onderdeel van de multi-functionele extracellulaire matrix (ECM) en uitgebreid gedocumenteerd te spelen een belangrijke rol in cel adhesie, cel-naar-cel signalering en ECM remodelleren tijdens de wondgenezing, embryonale ontwikkeling, kanker invasie, fibrose, en met neuroinflammation35,36. Interessant is dat waargenomen we HS vlekken in de ECM suggereert haar potentiële rol in de communicatie waarmee axonale groei (figuur 4C). Tot slot voor β-tubuline kleuring gebruiken we als een positieve marker voor de neurites te bevestigen de integriteit van de neuronen.
Figuur 1 . Schematische weergave van de experimentele DRG en single cell cultuur modellen. Deutsche Reichsbahn werden geïsoleerd van volwassen NIH/Zwitserse muizen, gereinigd van overmatige kapselvorming bindweefsel, en beide transplanteren ex vivo als een hele explant of losgekoppeld in primaire co culturen van de sensorische neuronen en satelliet cellen. Beide modellen kunnen worden gebruikt voor verdere analyses met meerdere analytische technieken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Ontwikkeling van de Deutsche Reichsbahn organotypic cultuur als een modelsysteem te onderzoeken axonale groei. DRG gekweekt voor 6 dagen ex vivo werden gebruikt om te onderzoeken axonale kiemen uit de explant. Laten we met immunofluorescentie hoe verschillende biochemische voorwaarden kunnen invloed hebben op de verdeling van de vezel spruiten: groeiende willekeurig en ongeorganiseerd (A) in vergelijking met een meer lineaire en georganiseerde wijze (B). De explantaten worden aangeduid met anti-β-tubuline (groen) en anti-peripherin (rood). Celkernen worden gekleurd met Hoechst vlek (blauw). Schaal bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Moleculaire karakterisering van het model van de geïsoleerde cultuur van neuronale. Secties van de hele DRG waren immunolabeled met antilichamen tegen peripherin en β-tubuline selectieve expressie van de twee markers in twee subpopulaties van ganglionaire neuronen tonen. Peripherin (rood) wordt uitgedrukt in de "kleine, lichte" neuronen en β-tubuline (groen) wordt uitgedrukt in de "grote, donkere" neuronen. Hoechst vlek geïdentificeerd meestal de positie van de kernen van gliale satelliet binnen de ganglion (A). De neuron-satelliet cel interactie kan beter gevisualiseerd worden na volledige cel dissociatie techniek (B). Hier laten we zien een β-tubuline-positieve zintuiglijke neuronale lichaam en zijn omgeven door de gliacellen satelliet neurites (Hoechst: kernen, blauw). Schaal van bars, A = 100 µm; B = 25 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Onderzoek van HSV-1 instapmodel in de DRG-afgeleide cellen losgekoppeld. HSV-1 infectie van gedissocieerde satelliet cellen afgebeeld langs β-tubuline-positieve neurites (groen) wordt geopenbaard met behulp van een anti-virale gD antilichaam (rood). Satelliet gliacellen kernen zijn met Hoechst (A) blauw gekleurd. Het dezelfde antilichaam onthult virale vermelding in gedissocieerde DRG neuronen (B). Cellen zijn samen met een label met een antilichaam tegen heparan sulfaat (HS, groene) uitgedrukt op het celmembraan. HS is ook een onderdeel van de extracellulaire matrix (groen) en speelt een belangrijke rol voor axonale groei (C). Neuronen worden aangeduid met peripherin (rood) terwijl Hoechst blauw wordt gebruikt ter identificatie van de satelliet celkernen. Schaal bars = 25 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ex vivo DRG model is uiterst nuttig om te onderzoeken van een breed scala aan evenementen zoals neuron-glia interactie en het effect van de communicatie op beide neuronale en gliale metabolisme37. Verder, de DRG-model kan worden gebruikt als een rendabele tool inspelen op relevante vragen betreffende pathogeen mechanisme en bijbehorende markeringen door het ontwikkelen van ex vivo systemen voor chronische en latente acute fase van infectie of in een bepaalde ziekte. Bovendien, misbruiken een bibliotheek van de screening van kleine molecules in DRG explantaten dit explant model voor Geneesmiddelenontwikkeling. In vitro modellen, met name eencellige systemen, zijn vaak te simplistisch om te correleren aan fysiologisch relevante gebeurtenissen; terwijl in vivo modellen zijn juist uitdagend om te manipuleren, gedeeltelijk als gevolg van de immune reactie op schade, gliale littekens en de complexiteit van de omliggende ECM samen met de financiële kosten. In tegenstelling, is de DRG explant een organotypic cultuur waarmee ex vivo overdracht van een gehele orgaan met de complexiteit van een neuronale netwerk, met inbegrip van de extracellulaire communicatie die een belangrijke rol in alle neuronale en gliale speelt functies. De generatie van een ex vivo -model kan alleen lijken echter alle voorwaarden gevonden in vivoniet volledig te vergelden. Twee belangrijke beperkingen in gedachten te houden bij het gebruik van dit model zijn de timing en de afwezigheid van systemische reacties, die alleen echt kunnen zijn vertegenwoordigd in vivo. De beperkte tijd dat de DRG kan worden gehandhaafd vitale ex vivo maakt dit model meer geschikt voor onderzoek naar acute voorwaarden en dus niet een zeer betrouwbaar model voor chronische aandoeningen. Ook is de ex vivo -model niet ideaal voor studies die door het ontbreken van reacties van andere organen of systemen (b.v., het immuunsysteem geschieden kunnen).
We konden met succes isoleren de explant ex vivo DRG van zowel volwassene als embryo muizen en ratten en dit model gebruiken onderzoeken HSV-1 infectie alsook meerdere andere aspecten van Neuroplasticiteit en de gevolgen ervan voor translationeel geneeskunde. Zodat de sensorische vezels te groeien buiten de explant, was de bindweefsel omliggende capsule gedeeltelijk verwijderd1.
Om te worden beschouwd, het mengsel van de gelatine-achtige eiwitten gewonnen uit de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muis sarcom isrich in ECM eiwitten zoals laminin, collageen IV heparine sulfaat proteoglycans (HSPG) en een aantal factoren die de groei38. In dit protocol, het mengsel van de gelatine-achtige eiwitten is 1:1 verdunde met kweekmedium en toegestaan om het polymeriseren gedurende 30-60 minuten bij 37 ° C alvorens toe te voegen het eindvolume van medium. Het mengsel van de gelatine-achtige eiwitten polymerizes bij kamertemperatuur; Daarom wordt voorgesteld om het mengsel koelt tot explantaten zijn vergulde en voor het gebruik van koude Pipetteer tips voor het distribueren van 10-20 µL druppels op de 12-well-gerechten. Timing is van cruciaal belang voor het uiteindelijke rendement van de procedure van de cultuur en kan variëren afhankelijk van het type (en productie) van het mengsel van de gelatine-achtige eiwitten gebruikt. Als het mengsel van de gelatine-achtige eiwitten is niet volledig polymeervorm of het al is verhard, kan de explant zweven of leiden tot mislukte groei uitdrogen. Wij moedigen de onderzoekers op de juiste temperatuur en tijd gelatine-achtige eiwitten mengsel verwatering voor een succesvol model empirisch te bepalen. We bereikten een 55-70% rendement van succesvolle groei van DRG explantaten onderhouden ex vivo maximaal 7-10 dagen. De explant los, verder kan worden gezien in de DRG-afgeleide primaire sensorische neuronen en satelliet cellen co cultuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te openbaarmaking.
Acknowledgments
We bedanken de Imaging core-faciliteit in het Midwesten Universiteit (MWU) en de groep studenten [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo en Casey Sigerson] voor hun bijdragen in celkweek en imaging werk. Dit onderzoekswerk werd gesteund door de de MWU Intramural subsidiefinanciering M.F. en onderzoek start-up fondsen aan V.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
References
- Muratori, L., et al. Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury. Neural Plast. , 860546 (2015).
- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin. J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).
- Devor, M., Govrin-Lippmann, R. Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).
- Farel, P. B., Boyer, A. Transient effects of nerve injury on estimates of sensory neuron number in juvenile bullfrog. J Comp Neurol. 410 (2), 171-177 (1999).
- Geuna, S., Borrione, P., Poncino, A., Giacobini-Robecchi, M. G. Morphological and morphometrical changes in dorsal root ganglion neurons innervating the regenerated lizard tail. Int J Dev Neurosci. 16 (2), 85-95 (1998).
- La Forte, R. A., Melville, S., Chung, K., Coggeshall, R. E. Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells. Somatosens Mot Res. 8 (1), 3-7 (1991).
- Pannese, E. Investigations on the Ultrastructural Changes of the Spinal Ganglion Neurons in the Course of Axon Regeneration and Cell Hypertrophy I. Changes during Axon Regeneration. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 60, 711-740 (1963).
- Popken, G. J., Farel, P. B. Sensory neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods. J Comp Neurol. 386 (1), 8-15 (1997).
- Tandrup, T. Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival. J Neurocytol. 33 (2), 173-192 (2004).
- Sarikcioglu, L., et al. Effect of severe crush injury on axonal regeneration: a functional and ultrastructural study. J Reconstr Microsurg. 23 (3), 143-149 (2007).
- Varejao, A. S., et al. Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J Neurotrauma. 21 (11), 1652-1670 (2004).
- Hanack, C., et al. GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals. Cell. 160 (4), 759-770 (2015).
- Pagadala, P., et al. Loss of NR1 subunit of NMDARs in primary sensory neurons leads to hyperexcitability and pain hypersensitivity: involvement of Ca(2+)-activated small conductance potassium channels. J Neurosci. 33 (33), 13425-13430 (2013).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Y., Lu, S. G., Gold, M. S. Persistent inflammation increases GABA-induced depolarization of rat cutaneous dorsal root ganglion neurons in vitro. Neuroscience. 220, 330-340 (2012).
- Amir, R., Devor, M. Functional cross-excitation between afferent A- and C-neurons in dorsal root ganglia. Neuroscience. 95 (1), 189-195 (2000).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 332-343 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Miller, C., Shanks, H., Witt, A., Rutkowski, G., Mallapragada, S. Oriented Schwann cell growth on micropatterned biodegradable polymer substrates. Biomaterials. 22 (11), 1263-1269 (2001).
- Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: II. Multiple grooved substrata. Development. 108 (4), 635-644 (1990).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis. J Virol. 84 (3), 1504-1512 (2010).
- Holland, D. J., Miranda-Saksena, M., Boadle, R. A., Armati, P., Cunningham, A. L. Anterograde transport of herpes simplex virus proteins in axons of peripheral human fetal neurons: an immunoelectron microscopy study. J Virol. 73 (10), 8503-8511 (1999).
- Sharthiya, H., Seng, C., Van Kuppevelt, T. H., Tiwari, V., Fornaro, M. HSV-1 interaction to 3-O-sulfated heparan sulfate in mouse-derived DRG explant and profiles of inflammatory markers during virus infection. J Neurovirol. 23 (3), 483-491 (2017).
- Zerboni, L., et al. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Koyuncu, O. O., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Virus infections in the nervous system. Cell Host Microbe. 13 (4), 379-393 (2013).
- Swanson, P. A. 2nd, McGavern, D. B. Viral diseases of the central nervous system. Curr Opin Virol. 11, 44-54 (2015).
- Tyler, K. L. Emerging viral infections of the central nervous system: part 2. Arch Neurol. 66 (9), 1065-1074 (2009).
- Preston, C., Efstathiou, S., et al. Ch 33. Human Herpesviruses Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Campadelli-Fiume, G., Arvin, A., Mocarski, E., et al. , Cambridge University Press. (2007).
- Roizman, B., Whitley, R. J. An inquiry into the molecular basis of HSV latency and reactivation. Annu Rev Microbiol. 67, 355-374 (2013).
- Arvin, A., et al. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Fueshko, S., Wray, S. LHRH cells migrate on peripherin fibers in embryonic olfactory explant cultures: an in vitro model for neurophilic neuronal migration. Dev Biol. 166 (1), 331-348 (1994).
- Parish, C. R. The role of heparan sulphate in inflammation. Nat Rev Immunol. 6 (9), 633-643 (2006).
- Zhang, X., Wang, B., Li, J. P. Implications of heparan sulfate and heparanase in neuroinflammation. Matrix Biol. 35, 174-181 (2014).
- Du, X., et al. Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission. J Clin Invest. 127 (5), 1741-1756 (2017).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
