Summary
Dans le présent rapport, les avantages de culture organotypique et dissocié des cultures primaires des ganglions rachidiens provenant de souris sont mises en évidence afin d’étudier un large éventail de mécanismes associés aux interactions neurone-gliales, neuroplasticité, neuroinflammation et réponse à l’infection virale.
Abstract
Ce protocole décrit un modèle ex vivo de souris-dérivé de la racine dorsale ganglions (GRD) explant et in vitro dérivées de DRG co-culture de dissocié des neurones sensoriels et les cellules gliales par satellite. Ce sont des modèles pour étudier diverses réactions biologiques associés à des troubles physiologiques et pathologiques du système nerveux périphérique (PNS) allant des interactions neurone-gliales, neuroplasticité, utiles et polyvalents neuro-inflammation et infection virale. L’utilisation de l’explant DRG est scientifiquement avantageuse par rapport aux modèles de cellules individuelles simpliste pour de multiples raisons. Par exemple, comme une culture organotypique, l’explant DRG permet aux ex vivo le transfert d’un réseau neuronal entier, y compris le microenvironnement extracellulaire qui jouent un rôle important dans toutes les fonctions neuronales et gliales. En outre, DRG explants peuvent également être maintenus ex vivo pour plusieurs jours et les conditions de culture peuvent être perturbées comme vous le souhaitez. En outre, le PMSI récolté peut être dissocié de plus dans une culture mixte in vitro de neurones sensitifs primaires et de cellules gliales par satellite pour étudier les interactions neuronales et gliales, neuritogenesis, interaction cône axonal avec l’extracellulaire microenvironnement et plus généralement, tout aspect lié au métabolisme neuronal. Par conséquent, le système DRG-explant offre une grande flexibilité pour étudier un large éventail d’événements liés à des conditions biologiques, physiologiques et pathologiques de manière rentable.
Introduction
Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode pour obtenir un modèle ex vivo d’organotypique d’un système de modèle DRG souris dérivé comme un micro-environnement tissu préservé pour enquêter sur un large éventail de réactions biologiques aux insultes PNS allant de neurone-gliales interaction, neuroplasticité, marqueurs de l’inflammation, d’infection virale. En outre, nous avons développé plus loin un protocole visant à créer une co-culture primaire de neurones sensoriels unique DRG-dérivés et de cellules satellites.
La DRG sont gris-matière-unités satellites situés à l’extérieur du système nerveux central (CNS) le long des racines spinales dorsales des nerfs rachidiens. Le PMSI, situé à proximité du foramen intervertébral, neurones sensoriels neurone de maison et les cellules gliales par satellite. Les neurone neurones comportent une neurite unique qui se divise en un processus périphérique transportant des apports somatiques et viscérales des périphériques cibles au corps cellulaire et un processus central qui soumet des informations sensorielles du corps cellulaire dans le SNC. Une capsule conjonctive définit et isole ce périphérique cluster des neurones et les cellules gliales du SNC. Aucune migration cellulaire postnatal vers ou à partir de la DRG n’a jamais été décrite et une niche de cellules souches locales est responsable de neurogènes événements qui ont lieu tout au long de la vie1. Par conséquent, ce modèle est particulièrement adapté pour étudier la neurogenèse adulte, axonogénèse, réponse à une lésion traumatique et cellule mort2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
Dans le domaine de la neurogenèse, le PMSI récoltées en vivo et explantés in vitro reproduit axonotmésis, une condition de blessures dans les axones sont entièrement rompus et le corps cellulaire neuronal est déconnectée de la cible innervée10 ,11. Il est bien connu que les lésions du nerf périphérique peuvent provoquer l’expression des gènes une diminution et une augmentation dans le PMSI et bon nombre de ces changements sont le résultat de processus de régénération mais beaucoup peuvent aussi être le résultat de la réponse immunitaire ou un autre des cellules non neuronales. En utilisant un ex vivo système de DRG isolé, certaines de cette complexité est retiré et voies mécanistiques puissent être étudiés plus facilement.
En plus de son rôle central dans la transmission des influx sensitifs à la CNS, l’abondance des récepteurs de nombreux neurotransmetteurs dont GABA12,13,14,15 au niveau du soma neuronal ainsi que preuve d’excitation croisée interneuronales peut suggèrent que les DRG sont sophistiqués intégrateurs préliminaires des inputs sensoriels16,17. Ces nouveaux résultats confèrent à l’explant DRG les caractéristiques d’un système de réseau neuronal-mini semblable à d’autres modèles de « mini-cerveau », qui sont organoïdes nerveux-tissu-spécifique utilisé pour des champs expérimentaux plus larges enquête et thérapeutique approche de maladies neurologiques18,19. Ces témoignages ainsi que le fait que le PMSI est un groupe discret et bien défini du tissu neuronal entouré par une capsule conjonctive, en font un organe approprié pour ex vivo de transplantation.
Culture souris DRG présente une option attrayante multicellulaire pour modéliser les pathophysiologies humaines en raison de similitudes structurales et génétiques entre les espèces. En outre, un grand dépôt de lignées de souris transgéniques est très propice à futures études mécanistes. Extension de neurites fois au cours du développement et après une lésion nécessite des interactions mécaniques entre croissance cône et substrat de20,21. Nano et micro-aux motifs de substrats ont servi d’outils pour diriger la croissance neuritique et démontrer leur capacité à répondre à des caractéristiques topographiques dans leurs biocénoses. Les neurones ont démontré que survivre, adhérer, migrer et orienter leurs axones pour naviguer dans les caractéristiques de surface tels que les rainures dans les substrats22,23. Toutefois, ces études ont utilisé généralement de lignées de cellules cultivées et il est difficile de prédire comment les cellules primaires neuronale volonté répondre aux repères bien définis, physique in vivo ou ex vivo.
Le modèle ex vivo explant de souris DRG utilisée pour cette proposition imite l’interaction cellule-cellule réelle et les signaux biochimiques qui entourent les axones croissantes. Parmi beaucoup d’autres paradigmes expérimentaux, allant de la régénération axonale, Neurosphère production, à la neuro-inflammation, le PMSI explantation modèle continue à servir comme un outil précieux pour étudier l’aspect viral infection et latence dans sensorielle les ganglions24,25,26,27.
Le système nerveux (NS) est en général de cible pour les infections virales28,29,30. La plupart des virus infectent la surface des cellules épithéliales et endothéliales et font leur chemin dans les tissus de surface à la NS par l’intermédiaire de nerf périphérique des fibres sensorielles et motrices. En particulier, le virus de l’herpès simplex type 1 (HSV-1) après une infection initiale dans les cellules épithéliales établit un temps de latence long de la vie dans les ganglions sensitifs de préférence, le PMSI du PNS31,32. HSV-1 neuroptropic capacité d’infecter le PNS conduit finalement à des maladies neurologiques,33.
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Protocol
Toutes les procédures y compris l’utilisation des animaux ont été approuvés par l’examen de l’établissement approuvé par le Conseil des protocoles (IACUC-Midwestern University).
1. récolte DRG embryons de souris
-
Euthanasier les souris adultes par méthode d’asphyxie (CO2) suivis par décapitation. Procéder immédiatement à enlever chirurgicalement la colonne vertébrale.
- Exposer la colonne vertébrale en réduisant la couche de peau sur le dos à l’aide des ciseaux. Isoler la colonne vertébrale en coupe par le biais des côtes de chaque côté de la colonne et le sacrum qui la sépare de la colonne vertébrale du reste de l’animal.
- Monter la colonne vertébrale (face ventrale vers le haut) sur un tapis chirurgical à l’aide d’aiguilles/pins.
- Un double à l’aide des ciseaux faire coupe des deux côtés des corps vertébraux à exposer la face ventrale du canal vertébral.
- Sous un microscope chirurgical (grossissement 4 X la valeur), utiliser des ciseaux pour déplacer doucement la moelle épinière du côté d’exposer les racines spinales dorsales controlatérales et de localiser le PMSI, le long des racines dorsales des nerfs périphériques. Chaque ganglion est partiellement cachée dans le foramen intervertébral.
- Pour récolter le PMSI, pincer la racine dorsale (entre la moelle épinière et la DRG) avec une pince et tirer doucement sur le PMSI depuis le foramen intervertébral.
- Placez la deuxième pince sur le nerf rachidien périphériques à la DRG et tirez la DRG avec le nerf spinal et les racines spinales.
- Placez le PMSI collecté dans une boîte de Pétri contenant 3 mL de sérum glacé médias libres (SFM)34de 35 mm.
- Transférer chaque DRG individuel dans un verre sec Pétri et, sous un microscope chirurgical, nettoyer et couper les fibres de l’excès et du tissu conjonctif encore attaché à la DRG à l’aide d’une lame. Le PMSI est facilement identifiable comme une structure transparente bulgy le long du nerf rachidien/racine blanche. Les vaisseaux sanguins sont souvent trouvés entourant le PMSI.
- Placer la DRG nettoyée dans un nouvelle boîte de Pétri contenant glacee médias de GDF.
- Diluer le mélange de protéines gélatineux (voir Table des matières) dans la GFD glacée (1:1).
- Plaque le DRG ex vivo dans 12 plats revêtus avec 10/20 µL du mélange de protéine gélatineux et mettez-les à l’intérieur de l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 30 à 60 min.
- Ajouter doucement 1,5 à 2 mL de l’AFD pour le système de culture pour couvrir l’explant ensemble et maintenir les explants à (37 ° C et 5 % CO2) des conditions de culture.
NOTE : Ceci est une étape cruciale car le PMSI est ancré à la vaisselle en verre que par le mélange de protéines gélatineux polymérisé. Temps de polymérisation et de pipetage compétences sont essentiels pour éviter le flottant. - Changer le support de plus en plus de DRG toutes les 72 h et laissez la DRG pousse pendant aussi longtemps que nécessaire.
2. isoler les neurones monocellulaire de DRG
- Place tous la DRG recueilli dans un tube stérile de 1,5 mL à 1,2 mL de F12 médias contenant 1,25 mg/mL de collagénase IV et il incuber à 37 ° C et 5 % CO2 pendant 45 min. Répétez cette étape pour un autre 45 min après la première incubation.
- Traiter les explants avec 2 mL de F12 médias contenant de la trypsine (0,025 %) pendant 30 min immédiatement après le traitement de la collagénase IV à 37 ° C et 5 % de CO2.
- Incuber avec 2 mL de F12 milieux contenant du sérum de veau fœtal (SVF ; 33 %) à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 15 min.
- Laver les explants trois fois avec 2 mL de médias F12 et procéder à leur désolidariser mécaniquement avec une pipette de verre jusqu'à ce que les médias devient trouble.
Remarque : Cette procédure comprend la collecte de DRG nettoyer/piqûre de l’animal, comme expliqué dans la section précédente. Lorsque vous effectuez une dissociation mécanique des explants, Soyez doux et ne pas utiliser une force excessive car elle peut conduire à des débordements et perte de matériel de travail. - La culture de cellules dissociées filtrer sur un filtre de 0,22 µm pour éliminer les impuretés et excès de tissu conjonctif. Centrifuger la cellule filtrée lysate à (2 500 x g) pendant 2 min.
- Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 500 µL de milieux neurobasal contenant du supplément pour culture neuronale (1 x), mélange antibiotique (1 x), L-glutamate (0,5 mM) et le facteur de croissance (5 µg/mL) de nerf (voir Table des matières).
- Plaque des cellules dissociées sur glissières laminin-enduit couverture (50 µg/mL ; voir Table des matières) à une densité cellulaire préféré. Déterminer la densité des cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
NOTE : Nous avons plaqué cellules à 25 000 diapositives de cellules/couvercle. Cette technique permet la dissociation des neurones et de cellules gliales de satellite. Le composant glial cultivé conjointement avec les neurone neurones joue un rôle essentiel pour la survie des neurones.
3. le HSV-1 Infection des Explants DRG et DRG dérivées des cellules dissociées
NOTE : Ce travail a été effectué en suivant strictement les biosécurité niveau 2 (BSL-2) exigences auxquelles nous avons un laboratoire entièrement équipé qui est approuvé par le Comité de biosécurité Midwestern University. Une souche de KOS de HSV-1 a été utilisée dans cette étude. Veuillez prendre les mesures appropriées et des mesures de sécurité selon les directives des institutions locales si vous travaillez avec des souches de virus.
- Déterminer et préparer le virus dans les dilutions correctes dans les médias de GDF pour infecter le modèle. Le virus utilisé dans cette étude était KOS souche de HSV-1. Lors de l’utilisation des dérivés de DRG dissociées des cellules, utilisez 1 unité de la multiplicité d’infection (MOI) pour l’infection, ce qui signifie que le nombre de virus égale le nombre de cellules.
- Si infectant DRG des explants, utilisez le numéro des virions (p. ex., 10 000 virions) parce que le nombre exact de cellules dans un explant ne peut pas être déterminé.
- Placer les explants/cellules infectées par le virus dans une plaque de cellules stérile ou un tube contenant un mélange de médias de gestion durable des forêts et de virus.
NOTE : Nous avons utilisé des virions 25 000 pour une diapositive de couverture contenant 25 000 cellules (1 MOI). Pour infecter un explant, nous utilisons des virions 10 000. - Placer la plaque cellulaire ou du tube à 37 ° C pour l’infection se dérouler ; temps d’exposition virale peut varier selon l’infectivité virale.
NOTE : L’entrée virale a été confirmée en utilisant ortho-nitrophényl-β-galactoside (ONPG) et 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) essais26.
4. immunofluorescence
- Difficulté des explants et des échantillons de cellule unique à 4 % de formol préparé dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Laver les échantillons 3 fois pendant 10 min chacun dans du PBS.
- Incuber les échantillons avec des anticorps primaires désirés (anti-β-tubuline, anti-périphérine, anticorps d’anti-héparane sulfate (HS), et/ou anti-glycoprotéine de D (gD) ; Voir Table des matières pour les dilutions) dilués dans un tampon PBS contenant 0,3 % Triton-X (PBST) et 10 % de sérum de chèvre normal. Conserver les échantillons à 4 ° C durant la nuit.
- Laver les échantillons 3 fois pendant 10 min chacun avec du PBS. Incuber les échantillons à la température ambiante pendant 1 h dans l’anticorps secondaire approprié (488 et/ou Cy3 ; voir Table des matières pour les dilutions) dilué dans du PBS.
- Laver les échantillons 3 fois pendant 10 min chacun avec du PBS. Incuber les échantillons avec un colorant Hoechst (1,5 µM) dans du PBS pendant 20 min avant l’étape de montage.
- Monter les échantillons sur lames de verre à l’aide d’un milieu de montage de fluorescence et de la lamelle couvre-objet.
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Representative Results
Plusieurs aspects de la neuroplasticité et neurone-environment interaction peuvent être étudiées à l’aide de DRG et un modèle de culture de cellules dissociées du même. Nous avons commencé les études en isolant un explant DRG et DRG dérivées des cellules dissociées comme schématiquement représentées dans la Figure 1. Les tissus et modèles de cellules individuelles peuvent être analysés en utilisant une variété de techniques moléculaires tels que l’immunofluorescence, Western blot, analyses génomiques et autres techniques d’analyse selon la nature du dispositif expérimental et objectifs. Tout d’abord, nous avons utilisé notre modèle d’explant DRG pour étudier l’effet des signaux biochimiques sur la croissance axonale (Figure 2). En immunofluorescence double ou triple, l’expression différentielle de la périphérine (Figure 2 a, B ; rouge) et β-tubuline (Figure 2 a, B ; vert) ont été confirmés tant dans le corps des cellules neuronal et les choux de neurites périphériques. Noyaux cellulaires ont été identifiés avec la tache de Hoechst (Figure 2 a; bleu). L’expression des marqueurs susmentionnés a été analysé dans l’explant DRG ensemble après fixation de paraformaldéhyde à 4 % et coupes microtome (Figure 3 a). Nos résultats confirment que périphérine et β-tubuline sont sélectivement exprimées en deux sous-populations de neurones ganglionnaires avec périphérine étant exprimée dans le « petit, léger » et β-tubuline dans les « grandes et sombres » sous-populations de neurones, respectivement. L’immunomarquées de neurites avec un marqueur qui sortent d’un les neurones sensoriels trouvées traversant le ganglion en entier avant de repartir dans la périphérie. Tache de Hoechst identifiés pour la plupart la position des noyaux dans le ganglion satellite gliales. Comme indiqué dans la Figure 3 b, l’interaction de cellules de neurone par satellite peut être visualisée mieux après la technique de dissociation cellulaire complet. Noyaux cellulaires de satellite teinté bleu ont été vus entourant un soma neuronal sensoriel de β-tubuline positives et ses vastes neurites.
Nous encore utilisé les cellules dérivées de DRG dissocié afin d’étudier l’infection HSV-1 et associés à une réponse inflammatoire dans les neurones sensoriels (Figure 4). Après seulement 1 h après l’infection (p.i.), entrée du HSV-1 a été détectée par l’utilisation d’un anticorps anti-HSV-1 gD aussi bien dans les cellules gliales (Figure 4 a) et les neurones DRG (Figure 4 b). En outre, HS coloration a été encore réalisée car HS offre un sites d’accueil pour fixation de virus ou de liaison à la cellule hôte. HS a été connu comme un élément essentiel de la matrice extracellulaire multifonctionnel (ECM) et largement documenté pour jouer un rôle majeur dans l’adhésion cellulaire, cellule-cellule signalisation et ECM remodelage pendant la cicatrisation, le développement embryonnaire, cancer invasion, fibrose et neuro-inflammation35,,36. Fait intéressant, nous avons observé HS coloration dans l’ECM suggérant son rôle potentiel dans le microenvironnement qui permet la croissance axonale (Figure 4). Enfin, pour la coloration de la β-tubuline nous avons utilisé comme marqueur positif pour les neurites pour confirmer l’intégrité des neurones.
Figure 1 . Représentation schématique de la DRG expérimentale et seul cell cultures modèles. DRG ont été isolés chez des souris adultes NIH/suisse, nettoyé de capsulaire excessif du tissu conjonctif et soit explantés ex vivo comme un explant entier ou dissociés en co des cultures primaires de neurones sensoriels et des cellules satellites. Les deux modèles peuvent être utilisés pour approfondir les analyses avec plusieurs techniques d’analyse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Développement de la culture organotypique DRG comme système modèle pour étudier la croissance axonale. DRG cultivé pendant 6 jours ex vivo ont utilisé pour étudier la repousse axonale de l’explant. Nous montrons par immunofluorescence comment différentes conditions biochimiques peuvent influer sur la répartition des germes de fibre : de plus en plus au hasard et désorganisé (A) par rapport à un mode plus linéaire et organisée (B). Les explants sont étiquetés avec anti-β-tubuline (vert) et anti-périphérine (rouge). Noyaux cellulaires sont souillées avec Hoechst tacher (bleu). Barreaux de l’échelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Caractérisation moléculaire du modèle culture de neurones isolés. Sections de la DRG entier ont été immunomarquées avec des anticorps contre la périphérine et β-tubuline montrant une expression sélective des deux marqueurs en deux sous-populations de neurones ganglionnaires. Périphérine (rouge) est exprimé dans les neurones « petits, légers » et β-tubuline (vert) est exprimée dans les neurones « grands et sombres ». Tache de Hoechst identifiés pour la plupart la position des noyaux gliales par satellite dans le ganglion (A). L’interaction de cellules de neurone par satellite peut être mieux visualisée après technique de dissociation cellulaire complet (B). Ici, nous montrons un corps neuronaux sensoriel de β-tubuline positives et ses neurites entourées de cellules gliales par satellite (Hoechst : noyaux, bleus). Échelle des barres, A = 100 µm ; B = 25 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Enquête du modèle d’entrée de HSV-1 dans le dérivé de DRG dissocié cellules. HSV-1 infection des cellules dissociées de satellite dépeint le long de la β-tubuline positives neurites (vert) se révèle à l’aide d’un anticorps antiviral de gD (rouge). Les noyaux de cellules gliales par satellite sont colorées en bleus avec Hoechst (A). Le même anticorps révèle l’entrée virale dans les neurones dissociées de la DRG (B). Les cellules sont étiquetées conjointement avec un anticorps contre l’héparane sulfate (HS, vert) exprimé sur la membrane cellulaire. HS est également un composant de la matrice extracellulaire (vert) et joue un rôle important pour la croissance axonale (C). Les neurones sont étiquetés avec la périphérine (rouges) tandis que Hoechst bleu est utilisé pour identifier les noyaux de la cellule satellite. Barreaux de l’échelle = 25 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le modèle DRG ex vivo est extrêmement utile d’examiner un large éventail d’événements comme des interactions neurone-glie, ainsi que l’effet du microenvironnement sur ces deux métabolismes neuronales et gliales37. En outre, le DRG-modèle pourrait servir comme un outil économique pour répondre à des questions pertinentes en ce qui concerne le mécanisme pathogène et associés des marqueurs en développant ex vivo des systèmes pour la phase chronique et latente aiguë de l’infection ou à une maladie donnée. En outre, une bibliothèque de dépistage des petites molécules des explants de DRG pourrait exploiter ce modèle explant pour le développement de médicaments. In vitro les modèles, notamment les systèmes de cellules individuelles, sont souvent trop simplistes pour corréler aux événements physiologiquement pertinents ; tandis que in vivo modèles sont précisément difficiles à manipuler, partiellement en raison de la réponse immunitaire à la blessure, cicatrice gliale et la complexité de l’ECM environnant ainsi que les frais financiers. En revanche, l’explant DRG est une culture organotypique qui permet le transfert ex vivo d’un organe entier avec la complexité d’un réseau neuronal, y compris le microenvironnement extracellulaire qui joue un rôle important dans tous les neuronales et gliales fonctions. Cependant, la génération d’un modèle ex vivo peut seulement ressemblent mais pareille pas pleinement toutes les conditions in vivo. Deux limitations importantes à garder à l’esprit lors de l’utilisation de ce modèle sont le timing et l’absence de réactions systémiques, qui peut être seulement vraiment représenté in vivo. Le temps limité que le PMSI peut être maintenu vital ex vivo rend ce modèle plus adapté pour l’étude des affections aiguës et donc pas un modèle très fiable pour les maladies chroniques. De même, le modèle ex vivo n’est pas idéal pour les études qui peuvent être exécutés par l’absence de réponses provenant d’autres organes ou systèmes (par exemple, le système immunitaire).
Nous avons pu isoler l’explant vivo ex DRG de rats et de souris adultes et embryon et utilisez ce modèle pour enquêter sur l’infection par HSV-1 ainsi que plusieurs autres aspects de la plasticité synaptique et ses effets sur la médecine translationnelle avec succès. Afin de permettre des fibres sensitives à croître à l’extérieur de l’explant, la capsule conjonctive environnante a été partiellement enlevé1.
Pour être considéré, le mélange gélatineux protéine extrait de l’isrich de sarcom Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) souris en protéines ECM comme la laminine, collagène IV, héparine sulfate protéoglycanes (HSPG) et un certain nombre de facteurs de croissance,38. Dans ce protocole, le mélange de protéines gélatineux est dilué 1:1 avec milieu de culture et autorisés à polymériser pendant 30-60 min à 37 ° C avant d’ajouter le volume final du milieu. Le mélange de protéines gélatineux se polymérise à température ambiante ; Il est donc proposé du pour réfrigérer le mélange jusqu'à ce que les explants sont plaqués et pour utiliser des pointes de pipette froid à distribuer 10-20 µL tombe sur les plats de 12 puits. Timing est critique pour l’efficacité finale de la mise en culture et peut-être varier selon le type (et fabrication) du mélange gélatineux protéine utilisée. Si le mélange de protéines gélatineux n’est pas entièrement polymérisé ou il est déjà solidifiée, l’explant peut flotter ou dessèchent conduisant à la croissance sans succès. Nous encourageons les chercheurs à déterminer empiriquement la bonne température, temps et dilution mélange protéine gélatineux pour un modèle de réussite. Nous avons atteint un rendement de 55 à 70 % de succès de la croissance des explants DRG maintenu ex vivo jusqu'à 7-10 jours. L’explant peut être plus dissocié en dérivés de DRG primaire sensoriel les neurones et les cellules satellites co-culture.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à la divulgation.
Acknowledgments
Nous remercions sincèrement le laboratoire central de l’imagerie à Midwestern University (SM) et le groupe d’étudiants [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo et Casey Sigerson] pour leurs contributions en culture cellulaire et le travail d’imagerie. Ce travail de recherche a été financé par de la SM intra-muros subvention des fonds de démarrage M.F. et recherche de V.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
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