Summary
ニューロン-グリア相互作用、神経可塑性、関連付けのメカニズムの広い範囲を調査するこのレポートで切片培養、マウス由来後根神経節細胞の初代培養の解離の利点が強調表示されます。neuroinflammation、およびウイルス感染への応答。
Abstract
このプロトコルでは、マウス由来の後根神経節 (DRG) 植と体外後根神経節由来培養の解離の感覚ニューロンとグリアの衛星細胞の前のヴィヴォモデルについて説明します。これらは様々 なニューロン-グリア相互作用、神経可塑性に至る末梢神経系 (PNS) の生理学的および病理学的条件に関連する生体の反応を調査するための便利で多機能なモデルです。neuroinflammation、およびウイルス感染。DRG 植の使い方は、複数の理由から単純な単一細胞モデルと比較して科学的に有利です。例えば、として、培養 DRG 植によりすべての神経細胞およびグリア細胞の機能に重要な役割を果たす細胞外微小環境を含む全体の神経ネットワークの転送前のヴィヴォ。さらに、DRG 植も維持できる前のヴィヴォとしてすることができますは、数日と培養条件の希望します。さらに、収穫の DRG がさらの第一次感覚ニューロンと神経細胞とグリア相互作用、神経突起形成、細胞と軸索のコーンの相互作用を調査するため衛星グリア細胞の生体外で共培養に解離することができます。微小環境、そしてより一般的な神経の代謝に関連するあらゆる側面。したがって、DRG 植システムは、多大なコスト効率の高い方法で生物学、生理学、病理学的条件に関連するイベントの広い配列を研究する柔軟性を提供します。
Introduction
本稿で報告するニューロン-グリアに至る PNS 侮辱に対する生体の応答の広い範囲を調査する保存の組織のような微小環境として派生したマウス後根神経節のモデル システムの切片ex vivoモデルを取得する方法相互作用、神経可塑性、ウイルス感染、炎症のマーカー。さらに、我々 はさらに後根神経節から派生した単一ニューロンと衛星細胞の共培養を作成するプロトコルを開発しました。
DRG は、衛星グレー-問題-単位脊髄神経の背側脊髄神経根に沿って中枢神経系 (CNS) の外側に位置します。DRG、椎間孔、家 pseudounipolar 感覚ニューロンと衛星細胞の近くに位置します。Pseudounipolar ニューロン細胞体へ周辺ターゲットから体性および内臓の入力を運ぶ末梢プロセスと中枢神経系に細胞体から感覚の情報を送信する中央のプロセスに分割単一の神経突起を備えています。結合カプセルを定義し、中枢神経系のニューロンとグリア細胞のこの周辺のクラスターを分離します。ローカルの幹細胞ニッチ、ライフ1で発生する神経因性のイベントを担当して生後細胞移動したり、DRG からこれまで説明されています。したがって、このモデルは成体、axonogenesis、咬合性外傷、および細胞死2,3,4,5,6,7 への応答の研究に特に適して ,8,9 。
再生に関する分野で体内から採取した DRG と explanted体外axonotmesis を再現、どの軸索が完全に切断された神経細胞の細胞体の損傷状態が神経ターゲット10 から切断されました。 ,11。末梢神経損傷は、DRG の減少と増加の遺伝子発現を引き起こす可能性が、これらの変更の多くは、再生プロセスの結果が免疫応答の非神経細胞から別の応答可能性がありますも多く知られています。前のヴィヴォを使用して孤立した後根神経節で、この複雑さのいくつかのシステムが削除され、生成経路をより簡単に調べることができます。
ほかに中枢神経系の GABA12,13,14,15神経相馬のレベルを含む多くの神経伝達物質の受容体の豊かさへの感覚入力を伝える上で中心的な役割と同様介在ニューロン間励起の証拠は、DRG が感覚入力16,17の洗練された予備的インテグレーターであることを提案するかもしれない。これらの新しい発見を与える DRG 植にミニ神経ネットワーク システム神経組織特異オルガノイドの調査のより広範な実験的フィールドの使用は、他の「ミニ脳」モデルと同様治療の特性神経疾患18,19へのアプローチ。DRG は神経組織に囲まれて結合カプセルの離散と明確に定義されたクラスターであるという事実と共にこれらの証拠はそれ前のヴィヴォ移植のために臓器を作る。
培養マウス後根神経節には、種の間の構造および遺伝の類似のため人間病態生理を持ってモデル化する魅力的な多細胞オプションが表示されます。さらに、トランスジェニック マウス系統の大規模なリポジトリは将来解明に非常に助長します。開発時および損傷後の神経突起の伸展成長円錐形、基板20,21力学的相互作用が必要です。ナノ-マイクロ パターン基板は、神経突起伸長を指示し、微小の地形に対応する能力を発揮するツールとして使用されています。ニューロンは、生き残るため、付着、移行、および基板22,23溝などの表面機能を操作する軸索の方向に示されています。しかし、これらの研究は、培養細胞を利用した通常、プライマリ神経細胞の意志を予測することは困難だ明確に定義された、物理的なキュー体内または体外への対応します。
マウス後根神経節この提案の使用の前のヴィヴォ植モデルは、実質細胞間相互作用と成長軸索を取り巻く生化学的手がかりを模倣します。多くの異なった実験パラダイムに至る軸索再生、neurosphere 生産 neuroinflammation、DRG 外植片の間でモデルは引き続き感覚内ウイルス感染と待ち時間の側面を調査するための貴重なツールとして大脳基底核24,25,26,27。
神経系 (NS) は、一般的にウイルス感染症28,29,30のターゲットです。ほとんどのウイルスは上皮と内皮細胞表面に感染し、感覚と運動線維末梢神経を介して NS に表面の組織から彼らの方法を作る。単純ヘルペス ウイルス タイプ 1 (HSV-1) 上皮細胞に初期感染は好ましくは、知覚神経節に生涯潜伏を確立後 PNS31,32の DRG。PNS に感染した HSV-1 neuroptropic 機能は、最終的に神経疾患33に します。
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Protocol
動物の使用を含むすべての手順は、倫理委員会承認プロトコル (IACUC 中西部大学) によって承認されています。
1. マウス胚から後根神経節の収穫
-
斬首に続いて窒息法 (CO2) による成体を安楽死させます。すぐに手術、脊柱を削除に進みます。
- 背高級はさみを使用して皮膚の層を切断することによって、脊柱を公開します。列の両側に肋骨と脊柱を動物の残りの部分から分離する仙骨を通して切断することによって、脊柱を分離します。
- 針・ ピンを用いた手術マットの上に脊柱 (を腹側) をマウントします。
- ダブル高級はさみを使用して脊柱管の腹側を公開するため椎体の両側にカット。
- 手術顕微鏡 (倍率を 4 倍に設定)、[側と対側の背側脊髄根を公開しに末梢神経の後根に沿って、DRG を見つける脊髄をゆっくり移動するのにはさみを使用します。各神経節は部分的に椎間孔内に隠されます。
- DRG を収穫するには、1 つの鉗子 (脊髄の後根神経節間) 後根をピンチし、椎間孔から DRG をそっと引き出します。
- DRG に末梢の脊髄神経に 2 番目の鉗子を配置し、脊髄神経と脊髄後根神経節を引きます。
- 35 mm シャーレ冷たい血清の自由なメディア (SFM) の34の 3 mL を含む収集した DRG を配置します。
- 乾燥ガラス シャーレにそれぞれ個々 の DRG を転送、手術顕微鏡下できれいし、過剰な線維と結合組織の刃を使用して DRG にまだ接続されているを切り落とします。DRG、白い脊髄神経/ルートに沿って隆起した透明な構造として容易に識別できます。血管は、しばしば周囲の DRG を発見されています。
- 冷たい SFM メディアを含む新しいペトリ皿に掃除の DRG を配置します。
- ゼラチンのタンパク質混合物を希薄化 (材料の表を参照してください) 冷たい SFM (1:1) で。
- 後根神経節前のヴィヴォ12 ウェルのプレートはゼラチン状の蛋白質の混合物の 10/20 μ L でプレコートし、37 ° C、5% CO2で 30-60 分の孵化器の中それらを設定します。
- 優しく全体の外植体をカバーし、維持、分化培養条件 (37 ° C、5% CO2) 培養系に SFM の 1.5-2 mL を追加します。
注: これは DRG は重合ゼラチン質蛋白質の混合物によってのみガラス皿に固定されているためにの重要なステップです。重合とピペッティング スキルの時は、浮動を回避にとって重要です。 - すべて 72 h DRG を成長媒体を変更し、限り必要に応じて成長後根神経節を聞かせてください。
2. 単一のセル後根神経節からニューロンの分離
- 場所すべての DRG IV コラゲナーゼの 1.25 mg/mL を含む F12 メディアの 1.2 mL と 1.5 mL の生殖不能の管に収集し、37 ° C と 5% CO2 45 分インキュベートは最初のインキュベーション後別の 45 分のこの手順を繰り返します。
- 2 ml 37 ° C、5% CO2でコラゲナーゼ IV 治療後すぐに 30 分のトリプシン (0.025%) を含む F12 メディアの外植体を扱います。
- 15 分の CO2を 37 ° C、5% ウシ胎児血清 (FBS; 33%) を含む F12 メディアの 2 mL で孵化させなさい。
- F12 メディアの 2 mL で 3 回外植体を洗うし、メディアに曇った回るまで機械的にガラス ピペットでそれらを分離するに進みます。
注: この手順には、きれいにトリミング前のセクションで説明したように動物から後根神経節のコレクションが含まれます。外植片の機械的解離を実行すると、穏やかな、それは流出と作業材料の損失につながることができますので、過度の力を使用しないでください。 - 任意の不純物や余分な結合組織除去する 0.22 μ m のフィルターを通して解離細胞の培養をフィルターします。遠心分離機のフィルターが適用されたセル (2,500 x g) にて 2 分間。
- 上澄みを除去し、神経文化 (1 x)、抗生の混合物 (1 x)、L-グルタミン酸 (0.5 mM) のためのサプリメントを含む neurobasal メディアを 500 μ l 添加で細胞ペレットを再懸濁し、神経の成長因子 (5 μ g/mL) (材料の表を参照してください)。
- 最寄りの細胞密度でラミニン コート カバー スライド (50 μ G/ml; 参照テーブルの材料) 解離細胞をプレートします。細胞カウンターを使用してセル密度を決定します。
注: 我々 は 25,000 セル/カバー スライドでセルをメッキしました。この手法では、ニューロンとグリアの衛星細胞解離をことができます。Pseudounipolar ニューロンとグリアのコンポーネントは、神経細胞の生存に重要な役割を果たしています。
3. 後根神経節および後根神経節細胞解離 HSV-1 感染症
注: この作業は、中西部大学バイオ セーフティ委員会によって承認されている設備の整ったラボを持って我々 をバイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) の要件に厳密に従うことによって行われました。HSV - 1 コスのひずみは、この研究で使用されました。ウイルスを使用して場合は、適切な測定や地方機関のガイドラインに従って安全対策がください。
- 判断し、SFM モデルに感染するメディアの正しい希釈でウイルスを準備します。本研究で使用されているウイルスは、HSV - 1 コスひずみです。後根神経節由来の操作は、細胞解離場合、ウイルス等しいセルの数の数を意味する感染症の感染 (MOI) の多様性の 1 単位を使用します。
- 後根神経節に感染外植片する場合、植のセルの正確な数を特定できないため (例えば、10,000 ウイルス粒子) はウイルス粒子の数を使用します。
- 滅菌のセル板や SFM メディアとウイルスの混合物を含んでいる管にウイルスに感染して植/セルを配置します。
注意: 25,000 セル (1 MOI) を含むカバー スライドの 25,000 の粒子を使用しています。感染、植を 10,000 ウイルス粒子を使用します。 - 開催; 感染症 37 ° C でセル板やチューブを配置します。ウイルス暴露の時間は、ウイルス感染によって異なる場合があります。
注: ウイルスのエントリは、オルト-ニトロフェニル-β-ガラクトシド (ONPG) と 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) 試金26を使用して確認されました。
4. 蛍光抗体法
- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で作製した 4% ホルマリンで植と単一細胞サンプルを修正します。3 回 10 分ずつのサンプルを PBS で洗浄します。
- 目的の一次抗体 (抗ヘパラン硫酸 (HS)、および/または抗糖 D (gD) 抗体、抗 peripherin 抗 β-チューブリン; 希釈液の材料表参照) 0.3% と PBS バッファーで希釈したサンプルをインキュベート トリトン X (pbst;) と 10% ヤギ血清。一晩で 4 ° C のサンプルを格納します。
- 3 回 PBS で 10 分ずつのサンプルを洗います。適切な二次抗体 1 時間室温でサンプルをインキュベート (488 や希釈液の材料表を参照してください; Cy3) PBS で希釈しました。
- 3 回 PBS で 10 分ずつのサンプルを洗います。取付工程の前に 20 分の PBS のヘキスト染料 (1.5 μ M) でサンプルをインキュベートします。
- スライド ガラス蛍光メディアをマウントして coverslip のサンプルをマウントします。
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Representative Results
神経可塑性と神経環境相互作用の複数の側面は、後根神経節と 1 つの解離細胞培養モデルを使用して調べることができます。DRG 植と模式的に図 1に表される後根神経節由来の解離細胞を分離することによって研究を始めました。組織と単一細胞モデルの両方は、さまざまな蛍光、西部のしみ、ゲノムの試金、実験的なデザインと目的の性質によっては他の分析手法など分子技術を使用して分析できます。まず、軸索の成長 (図 2) の生化学的手がかりの効果を調べるため、DRG 植モデルを使用しました。ダブルまたはトリプルの蛍光は神経細胞の細胞体と末梢神経突起もやしの両方で peripherin (図 2 aB; 赤) と β-チューブリン (図 2 aB; グリーン) の発現を認めた.細胞核が識別されたヘキスト染色 (図 2 a; 青)。上記のマーカーの発現がさらにミクロトーム切片 (図 3 a) 4% パラホルムアルデヒドで固定後全体の DRG 植で分析します。我々 の結果は、神経節ニューロンの 2 つの集団で peripherin と β-チューブリンが「小さい、軽い"と"大きい、暗い"ニューロン集団の β-チューブリンにそれぞれ表記されている peripherin と表現選択的に確認しました。感覚ニューロンから新興いずれかのマーカーと神経突起カルビンディン抗体が周囲に終了する前に全体の神経節を通って走ることが見つかりました。ヘキスト染色主神経節内グリア衛星の核の位置を識別します。図 3 bに示されている、セル解離法後ニューロン衛星細胞間相互作用をよりよく視覚化できます。青染色衛星細胞の核周囲の β-チューブリン-陽性の感覚神経相馬とその広範な神経突起が見られました。
さらに HSV 感染を調査する後根神経節由来の解離細胞、ニューロン (図 4) 内炎症性応答を関連付けられています。ポスト感染 (探偵) のだけ 1 時間後抗 HSV 1 gD 抗体グリア細胞 (図 4 a) および後根神経節ニューロン (図 4 b) の両方を使用して、HSV 1 エントリが検出されました。さらに、HS 染色さらに行った HS ウイルスが添付または宿主細胞へのバインディングにドッキング サイトを説明しますので。HS を多機能の細胞外マトリックス (ECM) の重要なコンポーネントとして知られているされており、細胞接着、細胞間シグナリング、創傷治癒、萌芽期の開発、がんの間に改造する ECM の主要な役割を再生する広範囲にわたるドキュメント浸潤, 線維症, と neuroinflammation35,36。興味深いことに、HS の軸索の成長 (図 4) では、微小環境における潜在的な役割を示唆している ECM の汚損を見ました。最後に、β-チューブリンの汚損のため我々 はニューロンの整合性を確認する神経突起の陽性マーカーとして使用。
図 1.模式図実験的後根神経節と単一細胞培養モデル。DRG は成人 NIH/スイス マウス、過度の被膜の結合組織、およびどちらか explanted ex vivo全植としてから掃除したり、感覚ニューロンと衛星細胞の共培養を主に解離から分離されました。両方のモデルは、さらなる分析の複数の分析手法を使用できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.軸索の成長を調査するためのモデル システムとしての後根神経節培養の開発。DRG の 6 日前のヴィヴォの成長は外植体からの軸索の発芽を調査に使用されました。どのように異なる蛍光抗体法により示す生化学的条件は繊維芽の分布に影響を与える: ランダムに成長し、(A)、無秩序より線形な組織化の方法 (B) と比較して。外植片は反-β-チューブリン (緑) と反 peripherin (レッド) が付いています。細胞核、ヘキスト染色染色 (青)。スケール バー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.分離神経細胞培養モデルの分子特性。全体の DRG のセクションはだった peripherin と神経節ニューロンの 2 つの集団の 2 つのマーカーの選択的な発現を示す β-チューブリン抗体とカルビンディン抗体です。Peripherin (赤) は「小さい、軽い"ニューロンで表現され、β-チューブリン (緑)、「大きな、暗い」ニューロンで表されます。ヘキスト染色主グリア衛星核内神経節 (A) の位置を識別します。ニューロン衛星細胞間相互作用は、セル解離手法 (B) 後より良い視覚化できます。ここで紹介は β-チューブリン-陽性の感覚神経細胞体とその突起を衛星グリア細胞に囲まれています (ヘキスト: 核, 青)。スケール バーは、A = 100 μ m;B = 25 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.後根神経節由来の HSV-1 エントリ モデルの検討解離細胞。Β-チューブリン-陽性神経突起 (緑) に沿って描かれている解離の衛星細胞の HSV-1 感染症は抗ウイルス gD 抗体 (赤) を使用して明らかにしました。衛星グリア細胞の核は、ヘキスト (A) とブルーが染色します。同じ抗体解離の DRG ニューロン (B) ウイルス エントリを明らかにします。細胞には細胞膜に発現するヘパラン硫酸 (HS、緑) に、抗体と共同ラベルです。HS はまた、細胞外のマトリックス (緑) のコンポーネントと軸索の成長 (C) の重要な役割を果たしています。ヘキスト ・ ブルーは衛星細胞の核を識別するために使用されますがニューロンは (赤) peripherin が付いています。スケール バー = 25 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
前のヴィヴォDRG モデルは、ニューロン ・ グリア相互作用などのイベントの広い範囲と同様、両方の神経細胞およびグリア代謝37の制御の効果を調査するため非常に便利です。さらに、DRG モデルをコスト効果の高いツールとして使用して、発症機序、関連マーカーの特定の疾患、感染症の急性の慢性および潜在期の ex vivoシステム開発に関連する質問に対処可能性があります。また、DRG 植の小分子のスクリーニング ライブラリ創この植モデルを悪用しました。In vitroモデル、特に単一細胞システムは、生理学的に関連するイベントに対応する単純化されすぎて生体モデルに正確に挑戦している間操作、部分的損傷、グリア瘢痕および金融費用と共に周囲の ECM の複雑さに対する免疫応答による。一方、DRG 植は転送が可能前のヴィヴォの臓器全体の重要な役割を果たしているすべての神経細胞およびグリア細胞外微小環境を含む神経細胞ネットワークの複雑さを培養関数。しかし前のヴィヴォモデルの生成することができますだけのように、 in vivoを発見したすべての条件を完全にはお返し。このモデルを使用する場合に留意すべき 2 つの重要な制限は、タイミング、全身のフィードバックすることができます唯一の真の不在は、 in vivoを表されます。限られた時間の重要な前のヴィヴォDRG を維持できることは、急性期病棟と従って慢性の条件の非常に信頼性の高いモデルではなく調査に適してこのモデルを作る。同様に前のヴィヴォモデルは他の臓器やシステム (例えば、免疫システム) からの応答の不在によってもたらされるかもしれない研究に最適ではありません。
正常に、植前のヴィヴォDRG 大人および胚のマウスおよびラットから分離し、HSV-1 感染症として神経可塑性とトランスレーショナル医学への影響の他の複数の側面を調査するこのモデルを使用することができました。感覚線維外植体外に成長するために、結合の周囲のカプセルは部分的に削除された1だった
考慮するには、ラミニン、コラーゲン IV、ヘパリン硫酸プロテオグリカン (HSPG) 成長因子38の数などの ECM 蛋白質の Engelbreth ・ ホルム群れ (EHS) マウス sarcom isrich から抽出したゼラチン質の蛋白質の混合物。このプロトコルではゼラチンのタンパク質混合物培養培地で希釈 1:1、37 ° C で 30-60 分の中の最終的なボリュームを追加する前に重合できます。ゼラチンのタンパク質混合物; 常温重合します。したがって、外植体をメッキし、12 ウェル料理ドロップの 10-20 μ L を配布する冷たいピペット チップを使用するまで、混合物を冷蔵することをお勧めします。タイミングおよび文化処理の最終的な効率性にとって不可欠ですゼラチンのタンパク質混合物使用の種類 (および製造) によって異なります。ゼラチンのタンパク質混合物が完全に重合しない場合、それは既に固化は外植体がフロートにしたり、失敗した成長につながる乾燥できます。調査官に適切な温度、時間、およびゼラチンのタンパク質混合希釈成功モデルの経験的判断をお勧めします。我々 は DRG 植まで 7-10 日間前のヴィヴォ維持の成功した成長の 55 〜 70% の効率に達した。外植体は後根神経節由来一次感覚ニューロンと衛星細胞共培養にさらに解離することができます。
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Disclosures
著者が何も情報開示にありません。
Acknowledgments
我々 は、細胞培養およびイメージングワークの彼らの貢献のため中西部大学 (MWU) と [Chanmoly ハンセン、クリストファー ・ Dipollina、ダリル ジャンバルヴォ ・ ケーシー シガーソン] 学生のグループでイメージングの中核施設を心から感謝します。この研究は私に m. f. や研究のスタートアップ資金を MWU の学内助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
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