Summary
En este informe, se destacan las ventajas de las culturas organotypic y disociadas cultivos primarios de ganglios de raíz dorsal derivadas de ratón para investigar una amplia gama de mecanismos asociados a la interacción neuronal-glial, neuroplasticidad, neuroinflamación y la respuesta a la infección viral.
Abstract
Este protocolo describe un modelo ex vivo de raíz dorsal de ratón derivados ganglios (DRG) explante y en vitro derivados de DRG Co cultura de disociado de las neuronas sensoriales y las células glial satélite. Estos son modelos versátiles y útiles para investigar una variedad de respuestas biológicas asociadas con condiciones fisiológicas y patológicas del sistema nervioso periférico (PNS) que van desde la interacción neuronal-glial, neuroplasticidad, neuroinflamación y la infección viral. El uso de explantes de DRG es científicamente ventajoso en comparación con las células simples modelos por múltiples razones. Por ejemplo, como una cultura organotypic, explante GRD permite a transferencia ex vivo de toda una red neuronal como el microambiente extracelular que juegan un papel significativo en todas las funciones neuronales y gliales. Además, DRG explantes pueden también mantener ex vivo para varios días y las condiciones de cultivo pueden ser perturbadas como deseado. Además, el DRG cosechado puede ser disociado más en una cultura Co en vitro de neuronas sensoriales primarias y células glial satélite para investigar la interacción neuronal-glial, neuritogenesis, cono axonal interacción con el medio extracelular microambiente y más general, cualquier aspecto asociado con el metabolismo neuronal. Por lo tanto, el sistema de DRG-explante ofrece una gran flexibilidad para estudiar una amplia gama de eventos relacionados con las condiciones biológicas, fisiológicas y patológicas de una manera rentable.
Introduction
En este manuscrito, se presenta un método para obtener un modelo ex vivo de organotypic de un sistema de modelo de ratón derivado DRG como un microambiente como tejido conservado para investigar una amplia gama de respuestas biológicas a los insultos PNS desde neuronal-glial interacción, neuroplasticidad, marcadores inflamatorios, infección viral. Además, hemos desarrollado un protocolo para crear una cultura co primaria de derivados de DRG solo neuronas sensoriales y las células satélite.
El DRG son gris-materia-unidades satélite situadas fuera de sistema nervioso central (SNC) a lo largo de las raíces espinales dorsales de los nervios espinales. El DRG, situado en la proximidad de los agujeros intervertebrales, las neuronas sensoriales pseudounipolares casa y células gliales por satélite. Las neuronas pseudounipolares tienen una sola neurita que se divide en un proceso periférico lleva entradas somáticas y viscerales de objetivos periféricos al cuerpo de la célula y un proceso central que envía información sensorial del cuerpo celular en el SNC. Una cápsula de tejido conectiva define y aísla esta agrupación periférica de neuronas y células gliales del SNC. Sin migración celular postnatal desde el DRG o nunca se ha descrito y un nicho de células madre local es responsable de eventos neurógeno, que ocurre a lo largo de la vida1. Por lo tanto, este modelo es particularmente adecuado para el estudio de la neurogénesis adulta, axonogenesis, respuesta a la lesión traumática y la célula muerte2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
En el campo de Neurorregeneración, el DRG extraídas en vivo y explantado en vitro reproduce axonotmesis, una condición de la lesión en que axones son totalmente roto y el cuerpo neuronal de la célula está desconectada del destino inervados10 ,11. Es bien sabido que lesión periférica del nervio puede causar expresión génica disminución y aumento en el DRG y muchos de estos cambios son el resultado de procesos regenerativos pero muchos también pueden ser el resultado de la respuesta inmune u otra respuesta de las células no neuronales. Mediante el uso de un ex vivo sistema de DRG aislado, algunos de esta complejidad se elimina y vías mecanicistas pueden investigarse más fácilmente.
Además de su papel central en transporte entradas sensoriales al SNC, la abundancia de receptores para muchos neurotransmisores como GABA12,13,14,15 a nivel del soma neuronal, así como evidencia de excitación de Cruz interneuronal puede sugerir que DRG son sofisticados integradores preliminares de entradas sensoriales16,17. Estos nuevos hallazgos confieren al explante DRG las características de un sistema de red mini-neuronal similar a otros modelos "mini cerebro", que son específicos de tejido nervioso organitas utilizado para campos experimentales más amplio de investigación y terapéutica enfoque a enfermedades neurológicas18,19. Estas evidencias junto con el hecho de que el GRD es un grupo discreto y bien definido de tejido neuronal rodeado por una cápsula de tejido conectiva, hacen que sea un órgano adecuado para el trasplante de vivo ex .
Cultivo ratón DRG presenta una opción atractiva multicelular modelo pathophysiologies humanas debido a las similitudes estructurales y genéticas entre las especies. Además, un gran repositorio de cepas de ratón transgénico es muy propicio para futuros estudios mecanicistas. Extensión del neurite tanto durante el desarrollo y después de la lesión requiere interacciones mecánicas entre crecimiento cono y sustrato20,21. Nano - y micro-patrón sustratos se han utilizado como herramientas para dirigir la consecuencia del neurite y demostrar su capacidad para responder a las características topográficas en sus microambientes. Han demostrado las neuronas para sobrevivir, se adhieren, migran y orientar sus axones para navegar características superficiales como surcos en sustratos,,2223. Sin embargo, estos estudios han utilizado típicamente líneas de cultivo de células y es difícil predecir cómo primarios neuronales células voluntad responde a pautas bien definidas, física en vivo o ex vivo.
El modelo de explante ex vivo del ratón DRG utilizado para esta propuesta imita la interacción célula-célula real y señales bioquímicas que rodea los axones creciente. Entre muchos diferentes paradigmas experimentales que van desde la regeneración axonal, desarrolló la producción, neuroinflamación, el DRG explante modelo continúa sirviendo como una herramienta valiosa para investigar el aspecto de la infección y la latencia viral en sensorial los ganglios24,25,26,27.
El sistema nervioso (NS) en general es blanco para infecciones virales28,29,30. Mayoría de los virus infecta las superficies de células epiteliales y endoteliales y hace su camino desde la superficie del tejido a NS a través de nervios periféricos las fibras sensoriales y motoras. En particular, el virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) después de una infección inicial en las células epiteliales establece un estado de vida latente en los ganglios sensoriales preferiblemente, el DRG del PNS31,32. HSV-1 neuroptropic capacidad de infectar el PNS en último término conduce a enfermedades neurológicas33.
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Protocol
Todos los procedimientos incluyendo el uso de los animales han sido aprobados por los protocolos de aprobado por la Junta de revisión institucional (IACUC Midwestern University).
1. recolección de DRG de embriones de ratón
-
Eutanasia a los ratones adultos por método de asfixia (CO2) seguidos de la decapitación. Inmediatamente proceder a extirpar quirúrgicamente de la columna vertebral.
- Exponer la columna vertebral por el corte hacia abajo de la capa de la piel dorsal con unas tijeras finas. Aislar la columna vertebral por el corte a través de las costillas a ambos lados de la columna y el sacro separar la columna vertebral del resto de los animales.
- Monte la columna vertebral (ventral hacia arriba) sobre una colchoneta quirúrgica utilizando agujas/alfileres.
- Con tijeras finas hacen un doble corte en ambos lados de los cuerpos vertebrales para exponer el lado ventral del canal vertebral.
- Microscopio quirúrgico (ampliación a 4 X), use tijeras para mover suavemente la médula espinal en el lado para exponer las raíces espinales dorsales contralaterales y localizar el DRG, a lo largo de las raíces dorsales de los nervios periféricos. Cada ganglio está parcialmente escondido dentro de los agujeros intervertebrales.
- Para cosechar el DRG, pellizcar la raíz dorsal (entre la médula espinal y el DRG) con una pinza y tire suavemente hacia fuera del DRG del agujero intervertebral.
- Coloque la segunda pinza en el nervio espinal periférico para el DRG y tire el DRG junto con el nervio espinal y la raíz espinal.
- Coloque el DRG recogido en una placa de Petri que contiene 3 mL de suero helado libre media (MFS)34de 35 mm.
- Transferir cada DRG individual en un vaso seco de Petri, microscopio quirúrgico, limpieza y recorte el exceso fibras y tejido conectivo fijados al DRG usando una hoja de. El DRG es fácilmente identificable como una estructura transparente abultada a lo largo de la raíz de nervio espinal blanco. Los vasos sanguíneos a menudo se encuentran alrededor del DRG.
- Coloque el DRG limpio en una nueva placa de Petri que contiene medios SFM helados.
- Diluir la mezcla de proteína gelatinosa (véase Tabla de materiales) en SFM helada (1:1).
- El DRG ex vivo en placas de 12 pocillos había cubierto primero con 10/20 μl de mezcla de proteína gelatinosa y establecer dentro de la incubadora a 37 ° C y 5% de CO2 durante 30-60 minutos.
- Suavemente agregar 1.5-2 mL de SFM para el sistema de cultivo cubre el explante entero y mantener los explantes en el cultivo de las condiciones (37 ° C y 5% CO2).
Nota: Este es un paso crítico ya que el DRG está anclado a los platos de vidrio solamente por la mezcla de proteína gelatinosa polimerizado. Tiempo de polimerización y pipeteo habilidades son fundamentales para evitar la flotación. - Cambiar el medio de cultivo DRG cada 72 h y dejar que el DRG a crecer para siempre y cuando sea necesario.
2. aislar las neuronas unicelular de DRG
- Lugar el DRG recoger en un tubo estéril de 1.5 mL con 1,2 mL de medio de F12 que contiene 1,25 mg/mL de colagenasa IV e incubar a 37 ° C y 5% CO2 para 45 min Repita este paso para otro 45 min después de la primera incubación.
- Tratamiento de explantes con 2 mL de medio de F12 que contiene tripsina (0.025%) durante 30 minutos inmediatamente después del tratamiento de la colagenasa IV a 37 ° C y 5% CO2.
- Incubar con 2 mL de medio de F12 que contenga suero fetal bovino (FBS; 33%) a 37 ° C y 5% de CO2 durante 15 minutos.
- Lavar los explantes tres veces con 2 mL de medio de F12 y proceder mecánicamente saldarse con una pipeta de vidrio hasta que los medios de comunicación se vuelve turbia.
Nota: Este procedimiento implica la colección de DRG limpiar/recortado del animal como se explica en la sección anterior. Al realizar la disociación mecánica de explantes, ser suave y no use fuerza excesiva ya que puede conducir a derrames y la pérdida de material de trabajo. - Filtrar el cultivo de células disociadas a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar cualquier impurezas y exceso de tejido conectivo. Centrifugar el filtrado celular lysate (2.500 x g) durante 2 minutos.
- Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 500 μl de neurobasal medios que contenga suplemento para cultivo neuronal (1 x), mezcla antibiótica (1 x), L-glutamato (0,5 mM) y nervio del factor de crecimiento (5 μg/mL) (véase Tabla de materiales).
- Las células disociadas en diapositivas cubierta revestida de laminina (50 μg/mL; véase Tabla de materiales) de la placa a una densidad celular preferido. Determinar la densidad celular usando un contador de células.
Nota: Nos plateó las células de 25.000 diapositivas de las células de la cubierta. Esta técnica permite la disociación de las neuronas y células glial satélite. El componente glial cultivado conjuntamente con las neuronas pseudounipolares juega un papel fundamental para la supervivencia neuronal.
3. HSV-1 infección de explantes DRG y las células disociadas derivadas de DRG
Nota: Este trabajo se realizó siguiendo estrictamente los bioseguridad nivel 2 (BSL-2) requisitos a los que tenemos un laboratorio totalmente equipado que es aprobado por el Comité de bioseguridad Midwestern University. En este estudio se usó una cepa KOS de HSV-1. Por favor tome medidas apropiadas de seguridad y según las directrices de las instituciones locales si se trabaja con cepas de virus.
- Determinar y preparar el virus en las diluciones correctas en medio SFM para infectar al modelo. Los virus utilizados en este estudio fue cepa KOS de HSV-1. Cuando trabajo con derivados de DRG disocia células, utilizar 1 unidad de la multiplicidad de infección (MOI) para la infección, lo que significa el número de virus igual el número de células.
- Si infección DRG explantes, utilice el número de viriones (p. ej., 10.000 viriones) porque no se puede determinar un número exacto de las células en un explante.
- Coloque el explante/células infectadas con el virus en una placa celular estéril o tubo que contiene una mezcla de medios SFM y virus.
Nota: Se utilizaron 25.000 viriones para una diapositiva de cubierta que contiene 25.000 células (1 MOI). Para infectar un explante, usamos 10.000 viriones. - Coloque la placa de la célula o el tubo a 37 º C para infección ocurrir; tiempo de exposición viral puede variar dependiendo de la infectividad viral.
Nota: Entrada Viral fue confirmada utilizando Orto-nitrofenil-β-galactósido (ONPG) y 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) ensayos26.
4. inmunofluorescencia
- Fijar los explantes y unicelular muestras en formol al 4% preparado en tampón fosfato salino (PBS). Lavar las muestras durante 10 minutos 3 veces en PBS.
- Incubar las muestras con anticuerpos primarios deseados (anti-β-tubulina, anti-peripherin, anticuerpos de anti-heparán sulfato (HS), o contra la glicoproteína D (gD); véase Tabla de materiales para las diluciones) diluidos en tampón PBS con 0.3% Triton-X (SAFT) y 10 % de suero normal de cabra. Almacenar las muestras a 4 ° C durante la noche.
- Lavar las muestras durante 10 minutos con PBS 3 veces. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 1 hora en el correspondiente anticuerpo secundario (488 o Cy3; véase Tabla de materiales para las diluciones) diluido en PBS.
- Lavar las muestras durante 10 minutos con PBS 3 veces. Incubar las muestras con colorante Hoechst (1,5 μm) en PBS durante 20 minutos antes del paso de montaje.
- Montar las muestras en portaobjetos de vidrio con un medio de montaje de fluorescencia y un cubreobjetos.
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Representative Results
Múltiples aspectos de la interacción de la neuroplasticidad y la neurona y el medio ambiente se pueden investigar mediante DRG y un modelo de cultura de célula disociados. Comenzamos los estudios aislando un explante de GRD y las células disociadas derivadas de DRG como esquemáticamente representadas en la figura 1. Modelos de células y tejidos pueden ser analizados usando una variedad de técnicas moleculares como la inmunofluorescencia, Western blot, ensayos de genómicos y otras técnicas analíticas dependiendo de la naturaleza del diseño experimental y los objetivos. En primer lugar, utilizamos nuestro modelo de explante DRG para investigar el efecto de señales bioquímicas en crecimiento axonal (figura 2). En inmunofluorescencia doble o triple, la expresión diferencial de peripherin (figura 2A, B; rojo) y β-tubulina (figura 2A, B; verde) fueron confirmados en los cuerpos celulares neuronales y los brotes de neurite periférica. Se identificaron núcleos celulares con tinción de Hoechst (figura 2A; azul). La expresión de los marcadores mencionados era más futuro analizado en el explante DRG todo después de la fijación en paraformaldehído al 4% y el seccionamiento de microtomo (Figura 3A). Nuestros resultados confirman que peripherin y β-tubulina selectivamente se expresan en dos subpoblaciones de neuronas ganglionares con peripherin se expresa en la "pequeña luz" y β-tubulina en las subpoblaciones "grandes y oscuras" de las neuronas, respectivamente. La neuritas immunolabeled con cualquier marcador de las neuronas sensoriales se encontraron cursando a través del ganglio entero antes de salir a la periferia. Tinción de Hoechst había identificado sobre todo la posición de los núcleos glial satélite dentro del ganglio. Como se indica en la figura 3B, la interacción de la célula neurona por satélite puede visualizarse mejor después de la técnica de disociación celular completo. Los núcleos de célula satélite teñido de azul fueron vistos alrededor de un soma neuronal sensorial de la β-tubulina-positivo y su extensa neurites.
Más utilizadas las células derivadas de DRG disociado para investigar infección por HSV-1 y asociados a respuesta inflamatoria dentro de las neuronas sensoriales (figura 4). Después de sólo 1 h de post infección (p.i.), entrada de HSV-1 fue detectada utilizando anticuerpos de gD anti-HSV-1 en células gliales (Figura 4A) y las neuronas DRG (Figura 4B). Además, capítulo de tinción más realizó desde capítulo proporciona sitios de atraque para virus apego o unión a la célula huésped. Capítulo ha sido conocido como un componente crítico de la multifuncional matriz extracelular (ECM) y ampliamente documentado para jugar un papel importante en la adhesión celular, las señales de célula a célula y ECM remodelación durante la cicatrización de heridas, desarrollo embrionario, cáncer invasión, fibrosis y en neuroinflamación35,36. Curiosamente, observamos HS coloración en el ECM, sugiriendo su papel potencial en el microambiente que permite el crecimiento axonal (figura 4). Finalmente, para la tinción de la β-tubulina se utilizó como un marcador positivo para los neurites para confirmar la integridad de las neuronas.
Figura 1 . Representación esquemática del DRG experimental y única célula modelos cultura. DRG fueron aislados de ratones adultos NIH/Suiza, limpia y excesiva del tejido conectivo capsular o explanted ex vivo como un explante entero o disociado en co-cultivos primarias de neuronas sensoriales y las células satélite. Ambos modelos pueden utilizarse para otros análisis con múltiples técnicas analíticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Desarrollo de la cultura organotypic DRG como sistema modelo para investigar el crecimiento axonal. DRG crecido para 6 días ex vivo se utilizaron para investigar el brote axonal de explante. Mostramos por inmunofluorescencia diferentes condiciones bioquímicas pueden afectar la distribución de los brotes de la fibra: crecimiento al azar y desorganizado (A) en comparación con una forma más lineal y organizada (B). Los explantes están marcados con anti-β-tubulina (verde) y anti-peripherin (rojo). Núcleos celulares se tiñen con Hoechst tinción (azul). Barras de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Caracterización molecular del modelo neuronal aislado de la cultura. Secciones de la DRG todo immunolabeled con anticuerpos contra peripherin y β-tubulina mostrando expresión selectiva de los dos marcadores en dos subpoblaciones de neuronas ganglionares. Peripherin (rojo) se expresa en las neuronas "pequeñas y ligeras" y β-tubulina (verde) se expresa en las neuronas "grandes y oscuras". Tinción de Hoechst había identificado sobre todo la posición de los núcleos glial satélite dentro del ganglio (A). La interacción de la célula neurona por satélite puede visualizarse mejor después de la técnica de disociación celular completo (B). A continuación os mostramos un cuerpo neuronal sensorial de β-tubulina-positivos y sus neuritas rodeados de células glial satélite (Hoechst: núcleos, azul). Bares, A la escala = 100 μm; B = 25 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Investigación del modelo de entrada de HSV-1 en derivados de DRG disocia células. Infección por HSV-1 de disociado células satélite representado por β-tubulina-positive neuritas (verde) se revela con un anticuerpo antiviral de gD (rojo). Núcleos de las células glial satélite se tiñen de azules con Hoechst (A). El mismo anticuerpo revela entrada viral en neuronas disociadas de DRG (B). Las células son co marcadas con un anticuerpo contra heparán sulfato (HS, verde) expresado en la membrana celular. Es también un componente de la matriz extracelular (verde) y desempeña un papel importante para el crecimiento axonal (C). Las neuronas están marcadas con peripherin (rojo) mientras que Hoechst azul se utiliza para identificar los núcleos de las células satélite. Barras de escala = 25 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El modelo ex vivo DRG es muy útil para investigar una amplia gama de eventos como interacción neurona-glia, así como el efecto del microambiente en ambos el metabolismo neuronal y glial37. Además, el DRG-modelo podría utilizarse como una herramienta rentable para abordar preguntas relevantes sobre el mecanismo patogénico y asociado marcadores desarrollando ex vivo sistemas para fase aguda crónica y latente de la infección o de una determinada enfermedad. Además, una biblioteca de la proyección de pequeñas moléculas en explantes DRG podría aprovechar este modelo de explante para desarrollo de fármacos. Modelos in vitro , especialmente sistemas unicelulares, son a menudo demasiado simplistas para correlacionar eventos fisiológicamente relevantes; mientras que en vivo modelos son precisamente difícil manipular, parcialmente debido a la respuesta inmune a las lesiones, marcar con una cicatriz glial y la complejidad de la ECM circundante junto con los gastos financieros. En contraste, el explante DRG es una cultura organotypic que permite a ex vivo la transferencia de un órgano entero con la complejidad de una red neuronal, como el microambiente extracelular que juega un papel importante en todas las neuronales y gliales funciones. La generación de un modelo ex vivo puede sólo se asemejan pero no corresponder todas las condiciones in vivo. Dos limitaciones importantes a tener en cuenta cuando se utiliza este modelo son el tiempo y la ausencia de reacciones sistémicas, que sólo puede ser representada en vivo. El tiempo limitado que el DRG puede mantenerse vital ex vivo hace este modelo más conveniente para la investigación de las condiciones agudas y por lo tanto no es un modelo muy fiable para condiciones crónicas. Del mismo modo, el modelo ex vivo no es ideal para los estudios que pueden realizarse por la ausencia de respuestas de otros órganos o sistemas (por ejemplo, el sistema inmunológico).
Hemos sido capaces de aislar el explante vivo ex DRG de tanto de adultos como de embriones de ratones y ratas y usar este modelo para investigar infección por HSV-1, así como varios otros aspectos de la neuroplasticidad y sus efectos en medicina traslacional con éxito. Para permitir que las fibras sensoriales a crecer fuera de explante, la cápsula circundante conectiva fue parcialmente eliminado1.
Para ser considerado, la mezcla de proteína gelatinosa extraída de la isrich de sarcom ratón de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) en proteínas ECM como laminina, colágeno IV, heparina sulfato proteoglicanos (HSPG) y un número de factores de crecimiento de38. En el presente Protocolo, la mezcla de proteína gelatinosa es diluido 1:1 con medio de cultivo y permite que polimerice durante 30-60 min a 37 ° C antes de agregar el volumen final del medio. La mezcla de proteína gelatinosa se polimeriza a temperatura ambiente; por lo tanto, se recomienda refrigerar la mezcla hasta que los explantes se platean y usar puntas de pipeta frío para distribuir μl 10-20 gotas en los platos de 12 pozos. Tiempo es crítico para la eficacia final del procedimiento de la cultura y puede variar dependiendo del tipo (y fabricación) de la mezcla de proteína gelatinosa. Si la mezcla de proteína gelatinosa no es completamente polimerizada o ya está solidificado, el explante puede flotar o seca que conduce a crecimiento sin éxito. Animamos a los investigadores a determinar empíricamente la temperatura adecuada, el tiempo y la dilución de proteína gelatinosa mezcla para un modelo de éxito. Llegamos a un 55-70% de eficiencia de exitoso crecimiento de explantes DRG mantenido ex vivo durante 7-10 días. Explante puede disociar más en DRG deriva sensorial neuronas y células satélite co cultivo primario.
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Disclosures
Los autores no tienen nada a la divulgación.
Acknowledgments
Agradecemos sinceramente las instalaciones centrales de la proyección de imagen en Midwestern Universidad (Uth) y el grupo de estudiantes [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo y Casey Sigerson] por sus contribuciones en cultivo celular y trabajo de imagen. Este trabajo de investigación fue apoyado por donaciones de la Uth Intramural fondos fondos de puesta en marcha M.F. e investigación a V.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
References
- Muratori, L., et al. Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury. Neural Plast. , 860546 (2015).
- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin. J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).
- Devor, M., Govrin-Lippmann, R. Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).
- Farel, P. B., Boyer, A. Transient effects of nerve injury on estimates of sensory neuron number in juvenile bullfrog. J Comp Neurol. 410 (2), 171-177 (1999).
- Geuna, S., Borrione, P., Poncino, A., Giacobini-Robecchi, M. G. Morphological and morphometrical changes in dorsal root ganglion neurons innervating the regenerated lizard tail. Int J Dev Neurosci. 16 (2), 85-95 (1998).
- La Forte, R. A., Melville, S., Chung, K., Coggeshall, R. E. Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells. Somatosens Mot Res. 8 (1), 3-7 (1991).
- Pannese, E. Investigations on the Ultrastructural Changes of the Spinal Ganglion Neurons in the Course of Axon Regeneration and Cell Hypertrophy I. Changes during Axon Regeneration. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 60, 711-740 (1963).
- Popken, G. J., Farel, P. B. Sensory neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods. J Comp Neurol. 386 (1), 8-15 (1997).
- Tandrup, T. Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival. J Neurocytol. 33 (2), 173-192 (2004).
- Sarikcioglu, L., et al. Effect of severe crush injury on axonal regeneration: a functional and ultrastructural study. J Reconstr Microsurg. 23 (3), 143-149 (2007).
- Varejao, A. S., et al. Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J Neurotrauma. 21 (11), 1652-1670 (2004).
- Hanack, C., et al. GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals. Cell. 160 (4), 759-770 (2015).
- Pagadala, P., et al. Loss of NR1 subunit of NMDARs in primary sensory neurons leads to hyperexcitability and pain hypersensitivity: involvement of Ca(2+)-activated small conductance potassium channels. J Neurosci. 33 (33), 13425-13430 (2013).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Y., Lu, S. G., Gold, M. S. Persistent inflammation increases GABA-induced depolarization of rat cutaneous dorsal root ganglion neurons in vitro. Neuroscience. 220, 330-340 (2012).
- Amir, R., Devor, M. Functional cross-excitation between afferent A- and C-neurons in dorsal root ganglia. Neuroscience. 95 (1), 189-195 (2000).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 332-343 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Miller, C., Shanks, H., Witt, A., Rutkowski, G., Mallapragada, S. Oriented Schwann cell growth on micropatterned biodegradable polymer substrates. Biomaterials. 22 (11), 1263-1269 (2001).
- Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: II. Multiple grooved substrata. Development. 108 (4), 635-644 (1990).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis. J Virol. 84 (3), 1504-1512 (2010).
- Holland, D. J., Miranda-Saksena, M., Boadle, R. A., Armati, P., Cunningham, A. L. Anterograde transport of herpes simplex virus proteins in axons of peripheral human fetal neurons: an immunoelectron microscopy study. J Virol. 73 (10), 8503-8511 (1999).
- Sharthiya, H., Seng, C., Van Kuppevelt, T. H., Tiwari, V., Fornaro, M. HSV-1 interaction to 3-O-sulfated heparan sulfate in mouse-derived DRG explant and profiles of inflammatory markers during virus infection. J Neurovirol. 23 (3), 483-491 (2017).
- Zerboni, L., et al. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Koyuncu, O. O., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Virus infections in the nervous system. Cell Host Microbe. 13 (4), 379-393 (2013).
- Swanson, P. A. 2nd, McGavern, D. B. Viral diseases of the central nervous system. Curr Opin Virol. 11, 44-54 (2015).
- Tyler, K. L. Emerging viral infections of the central nervous system: part 2. Arch Neurol. 66 (9), 1065-1074 (2009).
- Preston, C., Efstathiou, S., et al. Ch 33. Human Herpesviruses Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Campadelli-Fiume, G., Arvin, A., Mocarski, E., et al. , Cambridge University Press. (2007).
- Roizman, B., Whitley, R. J. An inquiry into the molecular basis of HSV latency and reactivation. Annu Rev Microbiol. 67, 355-374 (2013).
- Arvin, A., et al. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Fueshko, S., Wray, S. LHRH cells migrate on peripherin fibers in embryonic olfactory explant cultures: an in vitro model for neurophilic neuronal migration. Dev Biol. 166 (1), 331-348 (1994).
- Parish, C. R. The role of heparan sulphate in inflammation. Nat Rev Immunol. 6 (9), 633-643 (2006).
- Zhang, X., Wang, B., Li, J. P. Implications of heparan sulfate and heparanase in neuroinflammation. Matrix Biol. 35, 174-181 (2014).
- Du, X., et al. Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission. J Clin Invest. 127 (5), 1741-1756 (2017).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
