Summary
I denne betænkning, er fordelene ved organotypic kulturer og dissocierede primære kulturer af mus-afledte dorsalrodsganglier fremhævet for at undersøge en række mekanismer forbundet med neuron-glial interaktion, neuroplasticitet, neuroinflammation, og svar på viral infektion.
Abstract
Denne protokol beskriver en ex vivo model af mus-afledte dorsalrodsganglier (DRG) eksplantat og in vitro- DRG-afledte Co kultur af dissocierede sensoriske neuroner og gliaceller satellit. Disse er nyttige og alsidig modeller til at undersøge en række biologiske reaktioner forbundet med fysiologiske og patologiske forhold i det perifere nervesystem (PNS) spænder fra neuron-glial interaktion, neuroplasticitet, neuroinflammation, og viral infektion. Anvendelse af DRG eksplantat er videnskabeligt fordelagtigt i forhold til forsimplede enkelt celler modeller af flere grunde. For eksempel, som en organotypic kultur tillader DRG eksplantat ex vivo overførsel af et helt neuronal netværk herunder den ekstracellulære mikromiljø, der spiller en væsentlig rolle i alle de neuronal og glial funktioner. Yderligere, DRG explants kan også opretholdes ex vivo for flere dage og dyrkningsbetingelserne kan blive rystet som ønsket. Derudover kan høstede DRG yderligere adskilles i en in vitro- co kultur af primære sensoriske neuroner og satellit glial celler at undersøge neuronal-glial interaktion, neuritogenesis, cytoskeletale kegle samspil med det ekstracellulære mikromiljø, og mere generelt, alle aspekter forbundet med neuronal stofskiftet. Derfor, DRG-eksplantat system tilbyder stor fleksibilitet til at studere en bred vifte af begivenheder relateret til biologiske, fysiologiske og patologiske forhold på en omkostningseffektiv måde.
Introduction
I dette manuskript rapporterer vi en metode til at opnå en organotypic ex vivo model af en mus afledt DRG modelsystem som en bevaret væv-lignende mikromiljø at undersøge en bred vifte af biologiske svar til PNS fornærmelser spænder fra neuron-glial interaktion, neuroplasticity, inflammatoriske markører, virusinfektion. Desuden har vi yderligere udviklet en protokol for at oprette en primær Co kultur af DRG-afledte enkelt sensoriske neuroner og satellit celler.
DRG er satellit grå-sagen-enheder er beliggende uden for det centrale nervesystem (CNS) langs de dorsale spinale rødder af spinal nerver. DRG, beliggende i nærhed af intervertebral foramina, house pseudounipolar sensoriske neuroner og satellit glial celler. De pseudounipolar neuroner har en enkelt neurite, der opdeler i en perifer transporterer somatiske og visceralt input fra perifere mål til cellen kroppen, og en central proces, der sender sensorisk information fra cellen organ i CNS. En bindevævs kapsel definerer og isolerer denne perifere klynge af neuroner og gliaceller fra CNS. Ingen postnatal celle migration til eller fra DRG er nogensinde blevet beskrevet og en lokal stamcelle niche er ansvarlig for neurogen begivenheder gennem hele livet1. Derfor, denne model er særligt velegnet til at studere voksen neurogenese, axonogenesis, reaktion på traumatiske læsioner, og celle død2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
Inden for neuroregeneration DRG høstet fra in vivo og eksplanterede in vitro- gengiver axonotmesis, en skade tilstand i hvilken axoner er fuldt afskåret og neuronal cellen kroppen er afbrudt fra innerverede målet10 ,11. Det er velkendt at perifer nerveskade kan forårsage nedsat og øget genekspression i DRG og mange af disse ændringer skyldes af regenerative processer, men mange kan også være et resultat af immunrespons eller et andet svar fra ikke-neuronale celler. Ved hjælp af en ex vivo system af isolerede DRG, nogle af denne kompleksitet er fjernet og mekanistiske veje kan undersøges mere let.
Udover sin centrale rolle i at formidle sensoriske input til CNS, overfloden af receptorer for mange neurotransmittere, herunder GABA12,13,14,15 på samme niveau som den neuronale soma samt dokumentation af interneuronal Kors-excitation kan tyde på at DRG er sofistikeret foreløbige integratorer sensoriske input16,17. Disse nye fund giver til DRG eksplantat Karakteristik af en mini-neuronal netværkssystem svarer til andre "mini hjerne" modeller, som er nervøs-væv-specifikke organoids anvendes til bredere forsøgsmarker undersøgelse og terapeutiske tilgang til neurologiske sygdomme18,19. Disse beviser sammen med, at DRG er en diskret og veldefinerede klynge af neuronal væv omgivet af et bindevæv kapsel, laver det en egnet organ for ex vivo transplantation.
Dyrkningsbaserede mus DRG præsenterer flercellede tiltrækkende model menneskelige pathophysiologies som følge af strukturelle og genetiske ligheder mellem arterne. Derudover er et stort lager af Transgene mus stammer yderst befordrende for fremtidige Mekanistiske undersøgelser. Neurite udvidelse både under udvikling og efter skade kræver mekanisk interaktioner mellem vækst kegle og substrat20,21. Nano - og mikro-mønstrede underlag har været brugt som værktøjer til direkte neurite udvækst og vise deres evne til at reagere på topografiske egenskaber i deres microenvironments. Neuroner har vist sig at overleve, overholde, flytte og orientere deres axoner til at navigere overflade funktioner såsom riller i substrater22,23. Men disse undersøgelser har typisk udnyttet kulturperler cellelinjer og det er vanskeligt at forudsige, hvordan primære neuronale celler vil reagere på veldefinerede, fysiske stikord i vivo eller ex vivo.
Ex vivo eksplantat model af musen DRG anvendes til dette forslag efterligner den virkelige celle-celle interaktion og biokemiske stikord omkring voksende axoner. Blandt mange forskellige eksperimentelle paradigmer spænder fra cytoskeletale regenerering, neurosphere produktion, til neuroinflammation, DRG explant fortsætter model med at fungere som et værdifuldt redskab til at undersøge den viral infektion og latency aspekt inden for sensorisk ganglier24,25,26,27.
Nervesystem (NS) er generelt mål for virusinfektioner28,29,30. De fleste virus inficere epitel og endotel celle overflader og gøre deres vej fra den overflade væv til NS via perifer nerve sensoriske og motoriske fibre. Især herpes simplex virus type 1 (HSV-1) efter en indledende infektion i epitelceller etablerer en livslang ventetid i de sensoriske ganglier helst, DRG PNS31,32. HSV-1 neuroptropic kapacitet for at inficere PNS i sidste ende fører til neurologiske sygdomme33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de procedurer, herunder brugen af dyrene er blevet godkendt af institutionelle review board-godkendte protokoller (IACUC-Midwestern Universitet).
1. høst DRG fra mus embryoner
-
Aflive de voksne mus ved kvælning metode (CO2) efterfulgt af halshugning. Straks videre til kirurgisk fjerne rygsøjlen.
- Udsætte rygsøjlen ved at skære ned den hud lag dorsalt ved hjælp af fine sakse. Isolere rygsøjlen ved at skære gennem ribben på hver side af kolonnen og korsbenet adskille rygsøjlen fra resten af dyret.
- Montere rygsøjlen (ventrale side op) på en kirurgisk måtten ved hjælp af nåle/stifter.
- Ved hjælp af fine saks gøre en dobbelt skær på begge sider af vertebrale organer til at udsætte den ventrale side af rygmarvskanalen.
- Under en kirurgisk mikroskop (forstørrelse sat til 4 X), skal du bruge saks forsigtigt flytte rygmarven på side at eksponere de kontralaterale dorsale spinale rødder og at finde DRG, langs de dorsale rødderne af de perifere nerver. Hver ganglion er delvist skjult inde de intervertebral foramina.
- For at høste DRG, knivspids dorsalrods (mellem rygmarven og DRG) med en pincet og træk forsigtigt ud DRG fra intervertebrale foramen.
- Placer den anden pincet på spinal nerve perifere til DRG og trække DRG sammen med spinal nerve og spinal rod.
- Placer de indsamlede DRG i en 35 mm petriskål indeholdende 3 mL iskold serum frie medier (SFM)34.
- Overføre hver enkelte DRG i et tørt glas petriskål, og under en kirurgisk mikroskop, rense og trim off overskydende fibre og bindevæv, der stadig er knyttet til DRG ved hjælp af en vinge. DRG er let kan identificeres som en bulgy gennemsigtig struktur langs de hvide spinal nerve/root. Blodkar, der er ofte fundet omkring DRG.
- Placer den rensede DRG i en ny petriskål indeholdende iskold SFM medier.
- Fortynd gelatinøse protein blanding (Se Tabel af materialer) i iskold SFM (1:1).
- Plade i DRG ex vivo i 12-godt plader overfladebelagt med 10/20 µL af geléagtige protein blanding og sæt dem inde i varmeskab ved 37 ° C og 5% CO2 i 30-60 min.
- Forsigtigt tilføje 1,5-2 mL af SFM for kultur-systemet til at dække det hele eksplantat og vedligeholde explants på dyrkning betingelser (37 ° C og 5% CO2).
Bemærk: Dette er et kritisk skridt fordi DRG er forankret til glas retter kun af polymeriseret gelatinøse protein blanding. Polymerisering og pipettering færdigheder er afgørende for at undgå flydende. - Ændre medium af voksende DRG hver 72 h og lad DRG vokse så længe som nødvendigt.
2. isolering af enkelt celle neuroner fra DRG
- Sted alle DRG indsamlet i en 1,5 mL sterilt tube med 1,2 mL af F12 medier indeholdende 1,25 mg/mL af collagenase IV og der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 45 min. Gentag dette trin for en anden 45 min efter den første inkubation.
- Behandling af explants med 2 mL af F12 medier indeholdende trypsin (0.025%) i 30 min umiddelbart efter collagenase IV behandling ved 37 ° C og 5% CO2.
- Der inkuberes med 2 mL af F12 medier indeholdende føtal bovint serum (FBS; 33%) ved 37 ° C og 5% CO2 for 15 min.
- Vask explants tre gange med 2 mL af F12 medier og gå videre til mekanisk adskille dem med et glas pipette, indtil medierne bliver overskyet.
Bemærk: Denne procedure indebærer indsamling af ren/trimmet DRG fra dyr, som forklaret i de forudgående afsnit. Når du udfører mekaniske dissociation af explants, være blid og brug ikke overdreven kraft, da det kan føre til spild og tab af arbejde materiale. - Filtrere de dissocierede cellekultur gennem et 0,22 µm filter til at fjerne alle urenheder og overskydende bindevæv. Centrifugeres den filtrerede celle lysate på (2.500 x g) i 2 min.
- Fjern supernatanten og resuspenderes celle i 500 µL af neurobasal medier indeholdende tillæg for neuronal kultur (1 x), antibiotika blanding (1 x), L-glutamat (0,5 mM), og nerve vækstfaktor (5 µg/mL) (Se Tabel af materialer).
- Plade de dissocierede celler på laminin-belagt dække dias (50 µg/mL, se Tabel af materialer) på en foretrukken celle tæthed. Bestemme den celle tæthed ved hjælp af en celle counter.
Bemærk: Vi forgyldt celler på 25.000 celler/cover dias. Denne teknik giver dissociation af neuroner og gliaceller satellit. Komponenten glial Co kulturperler med de pseudounipolar neuroner spiller en afgørende rolle for neuronal overlevelse.
3. HSV-1 infektion af DRG Explants og DRG-afledte dissocierede celler
Bemærk: Dette arbejde blev udført af strengt efter biosikkerhed niveau 2 (BSL-2) krav som vi har et fuldt udstyret laboratorium, der er godkendt af den midtvestlige Universitet biosikkerhed. En KOS stamme af HSV-1 blev brugt i denne undersøgelse. Vær relevante målinger og sikkerhedsforanstaltninger som pr lokale institutioner retningslinjer, hvis arbejder med virusstammer.
- Fastlægge og forberede virussen i de korrekte fortyndinger i SFM medier at inficere modellen. Den virus, som benyttes i denne undersøgelse var KOS stamme af HSV-1. Når arbejdet med DRG-afledte dissocieres celler, skal du bruge 1 enhed i mangfoldighed af infektion (MOI) for infektion, hvilket betyder, at antallet af virus lige antallet celler.
- Hvis inficerer DRG explants, skal du bruge antallet af virioner (fx, 10.000 virioner), fordi en nøjagtige antal celler i et eksplantat ikke kan bestemmes.
- Placer eksplantat/celler inficeret med virus i en steril celle plade eller rør indeholdende en blanding af SFM medier og virus.
Bemærk: Vi brugte 25.000 virioner til et cover dias med 25.000 celler (1 MOI). For at inficere en eksplantat, bruger vi 10.000 virioner. - Placer den celle plade eller rør ved 37 ° C i infektion skal finde sted; tidspunktet for viral eksponering kan variere afhængigt af viral infektivitet.
Bemærk: Viral entry blev bekræftet ved hjælp af ortho-nitrophenylfosfat-β-galactoside (ONPG) og 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) assays26.
4. immunfluorescens
- Lave explants og enkelt celle prøver i 4% formalin forberedt i fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Vask prøver 3 gange i 10 min i PBS.
- Inkuber prøver med ønskede primære antistoffer (anti-β-tubulin, anti-peripherin, anti-heparan-sulfat (HS), og/eller anti-glycoprotein D (gD) antistof, se Tabel af materialer for fortyndinger) fortyndes i PBS buffer med 0,3% Triton-X (PBST) og 10 % normal ged serum. Opbevare prøver ved 4 ° C natten over.
- Vask prøver 3 gange i 10 min med PBS. Inkuber prøverne ved stuetemperatur i 1 time i den passende sekundær antistof (488 og/eller Cy3; Se Tabel af materialer for fortyndinger) fortyndes i PBS.
- Vask prøver 3 gange i 10 min med PBS. Inkuber prøver med Hoechst farvning (1,5 µM) i PBS i 20 min før montering trin.
- Montere prøverne på glas dias ved hjælp af et fluorescens montering medium og coverslip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flere aspekter af neuroplasticitet og neuron-miljø interaktion kan undersøges ved hjælp af DRG og en enkelt dissocierede celle kultur model. Vi begyndte at undersøgelser ved at isolere en DRG eksplantat og DRG-afledte dissocierede celler som skematisk repræsenteret i figur 1. Både væv og enkelt celler modeller kan analyseres ved hjælp af en række molekylærbiologiske teknikker såsom immunofluorescens, vestlige skamplet, genomisk assays og andre analytiske teknikker afhængigt af arten af forsøgsdesign og mål. Først, vi brugte vores DRG eksplantat model til at undersøge effekten af biokemiske stikord på cytoskeletale vækst (figur 2). I dobbelt eller tredobbelt immunofluorescens, det differentierede udtryk af peripherin (figur 2A, B, red) og β-tubulin (figur 2A, B, grøn) blev bekræftet både inden for de neuronale celle organer og perifere neurite spirer. Cellekerner blev identificeret med Hoechst plet (figur 2A, blå). Udtryk for de ovennævnte markører blev yderligere analyseres i den hele DRG eksplantat efter fiksering i 4% PARAFORMALDEHYD og mikrotom-skæring (figur 3A). Vores resultater bekræftede, at peripherin og β-tubulin selektivt udtrykkes i to delpopulationer af ganglionære neuroner med peripherin udtrykkes i de "små, lette" og β-tubulin i de "store, mørke" delpopulationer af neuroner, henholdsvis. Neurites immunolabeled med enten markør emerging fra de sensoriske neuroner fandtes løbe gennem hele ganglion før du afslutter i periferien. Hoechst pletten identificeret det meste placeringen af glial satellit kerner inden for ganglion. Som anført i figur 3B, kan neuron-satellit celle interaktion visualiseres bedre efter fuld celle dissociation teknik. Blå-farvede satellit cellekerner blev set omkring en β-tubulin-positive sensoriske neuronal soma og sin omfattende neurites.
Vi yderligere udnyttet de DRG-afledte dissocieres celler for at undersøge HSV-1 infektion og tilknyttede inflammatorisk respons inden for de sensoriske neuroner (figur 4). Efter kun 1 h efter infektion (PI), der blev adgang til HSV-1 fundet ved hjælp af anti-HSV-1 gD-antistof både i glial celler (figur 4A) og DRG neuroner (figur 4B). Derudover blev HS farvning yderligere udført siden HS indeholder en docking-websteder for virus hengivenhed eller binding til vært celle. HS er blevet kendt som et afgørende element i den multi-funktionelle ekstracellulære matrix (ECM) og omfattende dokumenteret for at spille en større rolle i celle vedhæftning, celle-til-celle signalering, og ECM remodeling under sårheling, embryonale udvikling, kræft invasion, fibrose, og i neuroinflammation35,36. Interessant, observeret vi HS farvning i ECM tyder på dets mulige rolle i det mikromiljø, der giver mulighed for cytoskeletale vækst (figur 4 c). Endelig, for β-tubulin farvning brugte vi som positive markør for neurites at bekræfte integriteten af neuroner.
Figur 1 . Skematisk fremstilling af den eksperimentelle DRG og enkelt celle kultur modeller. DRG blev isoleret fra voksen NIH/SWISS mus, renset fra overdreven kapsulær bindevæv, og enten eksplanterede ex vivo som et hele eksplantat eller adskilles i primære Co kulturer af sensoriske neuroner og satellit celler. Begge modeller kan anvendes til yderligere analyser med flere analytiske teknikker. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Udvikling af DRG organotypic kultur som et modelsystem til at undersøge cytoskeletale vækst. DRG vokset til 6 dage ex vivo blev brugt til at undersøge cytoskeletale spiring fra eksplantat. Vi viser ved immunfluorescens hvordan forskellige biokemiske forhold kan påvirke fordelingen af fiber spirer: vokser tilfældigt og uorganiseret (A) i forhold til en mere lineær og organiseret mode (B). Explants er mærket med anti-β-Tubulin (grøn) og anti-peripherin (rød). Cellekerner farves med Hoechst pletter (blå). Skalere barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Molekylær karakterisering af isolerede neuronal kultur model. Dele af hele DRG var immunolabeled med antistoffer mod peripherin og β-tubulin viser selektiv udtryk for de to markører i to delpopulationer af ganglionære neuroner. Peripherin (rød) er udtrykt i de "små, lette" neuroner og β-tubulin (grøn) er udtrykt i de "store, mørke" neuroner. Hoechst pletten identificeret det meste placeringen af glial satellit kerner inden for ganglion (A). Neuron-satellit celle interaktion kan visualiseres bedre efter fuld celle dissociation teknik (B). Her viser vi en β-tubulin-positive sensoriske neuronal krop og dens neurites, omgivet af satellit glial celler (Hoechst: kerner, blå). Skalere barer, A = 100 µm; B = 25 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Undersøgelse for HSV-1 indrejse model i DRG-afledte dissocieres celler. HSV-1 infektion af dissocierede satellit celler afbildet langs β-tubulin-positive neurites (grøn) er afsløret ved hjælp af en anti-virale gD-antistof (rød). Satellit gliaceller cellekerner farves blå med Hoechst (A). Den samme antistof afslører viral entry i dissocierede DRG neuroner (B). Celler er co mærket med et antistof mod heparan sulfat (HS, grønne) udtrykte på cellemembranen. HS er også en del af den ekstracellulære matrix (grøn) og spiller en vigtig rolle for cytoskeletale vækst (C). Neuroner er mærket med peripherin (rød), mens Hoechst blå bruges til at identificere satellit cellekerner. Skalere barer = 25 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex vivo DRG model er yderst nyttigt at undersøge et bredt spektrum af begivenheder såsom neuron-glia interaktion og påvirkning af mikromiljø begge neuronal og glial stofskifte37. Yderligere, DRG-modellen kunne anvendes som et omkostningseffektivt redskab til at behandle relevante spørgsmål vedrørende sygdomsfremkaldende mekanisme og associeret markører ved at udvikle ex vivo systemer for akut kronisk og latente fase af infektion eller i en given sygdom. Derudover kunne en screening bibliotek af små molekyler i DRG explants udnytte denne eksplantat model for udvikling af lægemidler. In vitro modeller, især encellede systemer, er ofte alt for forenklet at korrelere til fysiologisk relevante begivenheder; mens i vivo modeller udfordrende at netop manipulere delvist på grund af immunrespons til skade, glial ardannelse og kompleksiteten af de omkringliggende ECM sammen med den finansielle udgift. Derimod er DRG-eksplantat en organotypic kultur, der tillader ex vivo overførsel af hele organ med kompleksiteten af et neuronal netværk, herunder den ekstracellulære mikromiljø, der spiller en væsentlig rolle i alle neuronal og glial funktioner. Generation af en ex vivo -model kan kun ligner men ikke fuldt gengælde alle de betingelser, der er fundet in vivo. To vigtige begrænsninger at huske på, når du bruger denne model er timingen og fravær af systemiske feedbacks, som kan kun virkelig være repræsenteret in vivo. Den begrænsede tid, DRG kan bevares vitale ex vivo gør denne model mere egnet til undersøgelse af akutte tilstande og dermed ikke en meget pålidelig model for kroniske sygdomme. Modellens ex vivo er heller ikke ideel til undersøgelser, der foretages af manglen på svar fra andre organer eller systemer (f.eks., immunsystemet).
Vi var købedygtig med held isolere eksplantat ex vivo DRG fra både voksen og embryo mus og rotter og bruge denne model til at undersøge HSV-1 infektion samt flere andre aspekter af neuroplasticitet og dens virkninger på translationel medicin. For at tillade sensoriske fibre til at vokse uden for eksplantat, var de omkringliggende bindevæv kapsel delvist fjernet1.
For at blive betragtet, gelatinøse protein blandingen udvundet af Engelbreth-Holm-sværm (EHS) mus sarkom isrich i ECM proteiner som laminin, kollagen IV, heparin sulfat proteoglycaner (HSPG) og en række vækstfaktorer38. I denne protokol, gelatinøse protein blandingen er fortyndet 1:1 med substratet og lov til at polymerisere for 30-60 minutter ved 37 ° C før du tilføjer den endelige mængden af medium. De gelatinøse protein blanding polymeriserer ved stuetemperatur; Det foreslås derfor, for at nedkøle blandingen, indtil explants er belagte og for at bruge koldt pipette tips til at distribuere 10-20 µL dråber på 12-godt retter. Timing er afgørende for den endelige effektiviteten af proceduren for kultur og kan variere afhængigt af den type (og fremstilling) gelatinøse protein blanding anvendes. Hvis gelatinøse protein blandingen ikke er fuldt polymeriserede eller det allerede er størknet, kan eksplantat flyde eller tørre ud fører til mislykket vækst. Vi opfordrer efterforskere empirisk fastlægge passende temperatur, tid og gelatinøse protein blanding fortynding for en vellykket model. Vi nåede en 55-70% effektivitet af succesfulde vækst af DRG explants vedligeholdes ex vivo til op til 7-10 dage. Eksplantat kan adskilles yderligere i DRG-afledte primære sensoriske neuroner og satellit celler fælles kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet til offentliggørelse.
Acknowledgments
Vi takker Imaging core-facilitet på Midwestern Universitet (Mae) og gruppen af studerende [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo og Casey Sigerson] for deres bidrag i cellekultur og billedbehandling arbejde. Denne forskningsarbejde blev støttet af Mae Intramural tilskud til MF og forskning start-up midler til V.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
References
- Muratori, L., et al. Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury. Neural Plast. , 860546 (2015).
- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin. J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).
- Devor, M., Govrin-Lippmann, R. Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).
- Farel, P. B., Boyer, A. Transient effects of nerve injury on estimates of sensory neuron number in juvenile bullfrog. J Comp Neurol. 410 (2), 171-177 (1999).
- Geuna, S., Borrione, P., Poncino, A., Giacobini-Robecchi, M. G. Morphological and morphometrical changes in dorsal root ganglion neurons innervating the regenerated lizard tail. Int J Dev Neurosci. 16 (2), 85-95 (1998).
- La Forte, R. A., Melville, S., Chung, K., Coggeshall, R. E. Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells. Somatosens Mot Res. 8 (1), 3-7 (1991).
- Pannese, E. Investigations on the Ultrastructural Changes of the Spinal Ganglion Neurons in the Course of Axon Regeneration and Cell Hypertrophy I. Changes during Axon Regeneration. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 60, 711-740 (1963).
- Popken, G. J., Farel, P. B. Sensory neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods. J Comp Neurol. 386 (1), 8-15 (1997).
- Tandrup, T. Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival. J Neurocytol. 33 (2), 173-192 (2004).
- Sarikcioglu, L., et al. Effect of severe crush injury on axonal regeneration: a functional and ultrastructural study. J Reconstr Microsurg. 23 (3), 143-149 (2007).
- Varejao, A. S., et al. Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J Neurotrauma. 21 (11), 1652-1670 (2004).
- Hanack, C., et al. GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals. Cell. 160 (4), 759-770 (2015).
- Pagadala, P., et al. Loss of NR1 subunit of NMDARs in primary sensory neurons leads to hyperexcitability and pain hypersensitivity: involvement of Ca(2+)-activated small conductance potassium channels. J Neurosci. 33 (33), 13425-13430 (2013).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Y., Lu, S. G., Gold, M. S. Persistent inflammation increases GABA-induced depolarization of rat cutaneous dorsal root ganglion neurons in vitro. Neuroscience. 220, 330-340 (2012).
- Amir, R., Devor, M. Functional cross-excitation between afferent A- and C-neurons in dorsal root ganglia. Neuroscience. 95 (1), 189-195 (2000).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 332-343 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Miller, C., Shanks, H., Witt, A., Rutkowski, G., Mallapragada, S. Oriented Schwann cell growth on micropatterned biodegradable polymer substrates. Biomaterials. 22 (11), 1263-1269 (2001).
- Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: II. Multiple grooved substrata. Development. 108 (4), 635-644 (1990).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis. J Virol. 84 (3), 1504-1512 (2010).
- Holland, D. J., Miranda-Saksena, M., Boadle, R. A., Armati, P., Cunningham, A. L. Anterograde transport of herpes simplex virus proteins in axons of peripheral human fetal neurons: an immunoelectron microscopy study. J Virol. 73 (10), 8503-8511 (1999).
- Sharthiya, H., Seng, C., Van Kuppevelt, T. H., Tiwari, V., Fornaro, M. HSV-1 interaction to 3-O-sulfated heparan sulfate in mouse-derived DRG explant and profiles of inflammatory markers during virus infection. J Neurovirol. 23 (3), 483-491 (2017).
- Zerboni, L., et al. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Koyuncu, O. O., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Virus infections in the nervous system. Cell Host Microbe. 13 (4), 379-393 (2013).
- Swanson, P. A. 2nd, McGavern, D. B. Viral diseases of the central nervous system. Curr Opin Virol. 11, 44-54 (2015).
- Tyler, K. L. Emerging viral infections of the central nervous system: part 2. Arch Neurol. 66 (9), 1065-1074 (2009).
- Preston, C., Efstathiou, S., et al. Ch 33. Human Herpesviruses Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Campadelli-Fiume, G., Arvin, A., Mocarski, E., et al. , Cambridge University Press. (2007).
- Roizman, B., Whitley, R. J. An inquiry into the molecular basis of HSV latency and reactivation. Annu Rev Microbiol. 67, 355-374 (2013).
- Arvin, A., et al. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Fueshko, S., Wray, S. LHRH cells migrate on peripherin fibers in embryonic olfactory explant cultures: an in vitro model for neurophilic neuronal migration. Dev Biol. 166 (1), 331-348 (1994).
- Parish, C. R. The role of heparan sulphate in inflammation. Nat Rev Immunol. 6 (9), 633-643 (2006).
- Zhang, X., Wang, B., Li, J. P. Implications of heparan sulfate and heparanase in neuroinflammation. Matrix Biol. 35, 174-181 (2014).
- Du, X., et al. Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission. J Clin Invest. 127 (5), 1741-1756 (2017).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
