Summary
Neste relatório, destacam-se as vantagens de organotypic culturas e culturas primárias dissociadas dos gânglios das raízes de dorsais do mouse-derivado para investigar uma ampla gama de mecanismos associados a interação neurônio-glia, neuroplasticidade, neuroinflammation e resposta à infecção viral.
Abstract
Este protocolo descreve um modelo ex vivo de rato-derivado de raiz de dorsal gânglio (DRG) explante e in vitro DRG-derivado co-cultura de neurônios sensoriais dissociados e células gliais do satélite. Estes são modelos útil e versátil para investigar uma variedade de respostas biológicas, associados a condições fisiológicas e patológicas do sistema nervoso periférico (SNP) variando de interação neurônio-glia, neuroplasticidade, neuroinflammation e infecção viral. O uso de explant DRG é cientificamente vantajoso em relação aos modelos de células únicas simplista, por várias razões. Por exemplo, como uma cultura de organotypic, o explante DRG permite transferência ex vivo de toda uma rede neuronal incluindo o microambiente extracelular que desempenham um papel significativo em todas as funções neuronais e gliais. Além disso, DRG explantes também podem ser mantidas ex vivo por vários dias e as condições de cultura podem ser perturbadas como desejado. Além disso, a DRG colhido pode ser dissociado ainda mais em uma em vitro co-cultura de neurônios sensoriais primários e células gliais satélites para investigar a interação neuronal-gliais, neuritogenesis, interação de cone axonal com o extracelular microambiente e mais geral, qualquer aspecto associado com o metabolismo neuronal. Portanto, o sistema de DRG-explante oferece uma grande flexibilidade para estudar uma grande variedade de eventos relacionados às condições biológicas, fisiológicas e patológicas em uma maneira cost-effective.
Introduction
Neste manuscrito, relatamos um método para obter um modelo ex vivo de organotypic de um sistema de modelo DRG rato derivado como um microambiente de tecido-como preservado para investigar uma ampla gama de respostas biológicas aos insultos PNS variando de neurônio-glia interação, neuroplasticidade, marcadores inflamatórios, a infecção viral. Além disso, temos desenvolvido um protocolo para criar uma cultura co primária de neurônios sensoriais único DRG-derivado e células satélites.
A DRG são cinza-matéria-unidades-satélites localizadas fora do sistema nervoso central (CNS) junto as raízes na espinha dorsais dos nervos espinhais. A DRG, localizado nas proximidades do Forame intervertebral, casa pseudounipolar neurônios sensoriais e por satélite células gliais. Os neurônios pseudounipolar apresentam um único axônio que se divide em um processo periférico transportando insumos somáticos e viscerais de alvos periféricos para o corpo celular e um processo central que envia informações sensoriais do corpo celular para o CNS. Uma cápsula Conectiva define e isola este aglomerado periférico de neurônios e células gliais do SNC. Sem migração celular pós-natal para ou a partir da DRG já foi descrita e um nicho de células-tronco local é responsável por neurogênicos eventos que ocorrem ao longo da vida1. Portanto, este modelo é particularmente adequado para estudar a neurogénese adulta, axonogênese, resposta a lesão traumática e célula morte2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
No campo das Epilepsias, DRG colhidos na vivo e explantados em vitro reproduz axoniotmese, uma condição de lesão na quais axônios são totalmente cortados e o corpo celular neuronal é desconectada o alvo inervado10 ,11. É sabido que lesão de nervo periférico pode causar aumento e diminuição da expressao em DRG e muitas destas alterações são resultado de processos regenerativos, mas muitos também podem ser um resultado da resposta imune ou outra resposta de células não-neuronais. Usando um ex vivo sistema de DRG isolada, um pouco dessa complexidade é removido e vias mecanicistas podem ser investigadas mais facilmente.
Além de seu papel central na transmissão de entradas sensoriais ao SNC, a abundância de receptores para muitos neurotransmissores incluindo GABA12,13,14,15 a nível do soma neuronal, bem como provas de interneuronal Cruz-excitação podem sugerir que DRG são sofisticados integradores preliminares de entradas sensoriais16,17. Estas novas descobertas conferem ao explante DRG as características de um sistema de rede mini-neuronal semelhante a outros modelos de "mini cérebro", que são organoids nervoso-tecido-específica usada para campos experimentais mais amplos de investigação e terapêutica abordagem de doenças neurológicas18,19. Estas evidências juntamente com o facto do DRG um cluster discreto e bem definido de tecido neuronal, rodeado por uma cápsula conectiva, torná-lo um órgão apropriado para transplante ex vivo .
Rato de cultivo DRG apresenta uma opção atraente multicelular para modelar pathophysiologies humanos devido às similaridades estruturais e genéticas entre as espécies. Além disso, um grande repositório de cepas de rato transgénico é muito propício para futuros estudos mecanicistas. Extensão do axônio tanto durante o desenvolvimento e após lesão requer interações mecânicas entre crescimento cone e substrato20,21. Substratos nano e microcom estampas têm sido usados como ferramentas para direcionar a consequência natural do axônio e demonstrar a sua capacidade para responder às características topográficas no seu microambiente. Os neurônios foram mostrados para sobreviver, aderir, migrar e orientar seus axônios para navegar características de superfície tais como sulcos em substratos22,23. No entanto, estes estudos utilizaram tipicamente linhas de células cultivadas e é difícil prever como neuronal primária as células irá responder às sugestões bem definidas e física na vivo ou ex vivo.
O modelo ex vivo explante de rato DRG usado para esta proposta imita a interação célula-célula real e bioquímicas sugestões em torno de axônios crescentes. Entre muitos diferentes paradigmas experimentais variando de regeneração axonal, produção de neurosphere, a neuroinflammation, a DRG explant modelo continua a servir como uma valiosa ferramenta para investigar o aspecto de latência e infecção viral dentro sensorial gânglios24,25,26,27.
Sistema nervoso (NS) em geral é alvo para infecções virais28,29,30. A maioria dos vírus infectam superfícies de células epiteliais e endoteliais e fazer o seu caminho desde a superfície do tecido para o NS através de nervo periférico fibras sensoriais e motoras. Em particular, o vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) após uma infecção inicial nas células epiteliais estabelece uma latência ao longo da vida nos gânglios sensoriais, de preferência, a DRG da PNS31,32. HSV-1 neuroptropic capacidade de infectar o PNS acaba por conduzir a doenças neurológicas33.
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Protocol
Todos os procedimentos, incluindo o uso dos animais foram aprovados pelos protocolos de aprovado Conselho de revisão institucional (IACUC-Midwestern University).
1. colheita DRG de embriões do rato
-
Eutanásia de ratos adultos pelo método de asfixia (CO2) seguidos por decapitação. Seguir para a coluna vertebral de remover cirurgicamente.
- Expor a coluna vertebral, reduzindo a camada de pele dorsalmente, usando tesouras bem. Isole a coluna vertebral, cortando através das costelas de cada lado da coluna e Sacro separando a coluna vertebral do resto do animal.
- Monte a coluna vertebral (lado ventral para cima) para uma esteira cirúrgica usando agulhas/pinos.
- Usando uma tesoura fina faça um duplo corte em ambos os lados dos corpos vertebrais para expor o lado ventral do canal vertebral.
- Sob um microscópio cirúrgico (ampliação definido como 4 X), use a tesoura para mover suavemente a medula espinhal do lado para expor as raízes na espinha dorsais contralaterais e localize o DRG, junto as raízes dorsais dos nervos periféricos. Cada gânglio é parcialmente escondido dentro do Forame intervertebral.
- Para colher o DRG, comprima a raiz dorsal (entre a medula espinhal e o DRG) com uma pinça e puxe delicadamente para fora o DRG do Forame intervertebral.
- Coloque a segunda pinça no nervo espinhal periféricas para o DRG e puxe o DRG juntamente com o nervo espinhal e a raiz da coluna vertebral.
- Coloque o DRG coletado em uma placa de Petri contendo 3 mL de soro gelado mídia livre (SFM)34de 35 mm.
- Transferir cada DRG individual em um vidro seco de Petri e, sob um microscópio cirúrgico, limpe e retire as fibras em excesso e ainda ligado ao DRG usando uma lâmina de tecido conjuntivo. A DRG é facilmente identificável como uma barrigudo estrutura transparente ao longo da nervo espinhal/raiz branca. Os vasos sanguíneos muitas vezes encontram-se em torno da DRG.
- Coloque o DRG limpo em uma nova placa de Petri contendo mídia gelada de SFM.
- Dilua a mistura gelatinosa de proteína (ver Tabela de materiais) em gelada SFM (1:1).
- Placa da DRG ex vivo em placas boas 12 pré-revestido com 10/20 µ l de mistura gelatinosa da proteína e defini-las dentro da incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 por 30-60 min.
- Delicadamente adicione 1,5-2 mL de SFM no sistema de cultura para cobrir o explante inteiro e manter os explantes em cultivo condições (37 ° C e 5% CO2).
Nota: Este é um passo crítico porque DRG é ancorado para os pratos de vidro apenas pela mistura polimerizada proteína gelatinoso. Tempo de polimerização e pipetagem habilidades são essenciais para evitar flutuação. - Alterar o meio de cultivo DRG cada 72 h e deixar o DRG crescer para contanto que precisava.
2. isolar neurônios única célula de DRG
- Lugar o DRG todos coletados em um tubo estéril de 1,5 mL com 1,2 mL de F12 mídia contendo 1,25 mg/mL de colagenase IV e -incubar a 37 ° C e 5% de CO2 por 45 min. Repita este passo para mais 45 minutos após a primeira incubação.
- Trate de explantes com 2 mL de F12 mídia contendo tripsina (0.025%) durante 30 minutos imediatamente após o tratamento de colagenase IV em 37 ° C e 5% de CO2.
- Incube com 2 mL de F12 mídia contendo soro bovino fetal (FBS; 33%) a 37 ° C e 5% CO2 por 15 min.
- Lave explantes três vezes com 2 mL de mídia F12 e prossiga para dissociar--los mecanicamente com uma pipeta de vidro até que a mídia se transforma nublada.
Nota: Este procedimento envolve a coleta de DRG limpar/aparada do animal como explicado na seção anterior. Ao executar a dissociação mecânica de explantes, seja gentil e não exerça força excessiva, uma vez que pode levar a derrames e perda de material de trabalho. - A cultura de células dissociadas do filtro através de um filtro de 0,22 µm para remover quaisquer impurezas e o excesso de tecido conjuntivo. Centrifugue o filtrado celular lisado a (2.500 x g) por 2 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 500 µ l de neurobasal mídia que contém o suplemento para cultura neuronal (1x), mistura de antibiótica (1x), L-glutamato (0,5 mM) e fator de crescimento (5 µ g/mL) do nervo (ver Tabela de materiais).
- As células dissociadas em slides capa laminina-revestido (50 µ g/mL; ver Tabela de materiais) da placa em uma densidade de celular preferido. Determine a densidade de células usando um contador de célula.
Nota: Nós chapeado células no slide de células/tampa 25.000. Esta técnica permite a dissociação de neurônios e células gliais do satélite. O componente glial co cultivado com os neurônios pseudounipolar desempenha um papel crítico para a sobrevivência neuronal.
3. HSV-1 infecção de explantes DRG e DRG-derivado de células dissociadas
Nota: Este trabalho foi feito seguindo estritamente os requisitos de (BSL-2) de nível 2 de biossegurança a que nós temos um laboratório totalmente equipado que é aprovado pelo Comitê de biossegurança Midwestern University. Neste estudo, utilizou-se uma estirpe de KOS de HSV-1. Por favor tome medidas adequadas e precauções de segurança, conforme orientações de instituições locais se trabalhando com estirpes de vírus.
- Determinar e preparar o vírus nas diluições em meios SFM infectar o modelo corretos. O vírus utilizado neste estudo foi KOS estirpe de HSV-1. Quando trabalhando com derivados de DRG dissociada de células, use 1 unidade da multiplicidade de infecção (MOI) para a infecção, o que significa o número de vírus igual o número de células.
- Se infectar DRG explants, use o número de virions (por exemplo, 10.000 virions) porque não é possível determinar um número exato de células em um explante.
- Coloque as explante/células infectadas com o vírus em uma placa de células estéreis ou tubo contendo uma mistura de SFM media e vírus.
Nota: Usamos 25.000 virions para um slide de capa contendo 25.000 células (1 MOI). Para infectar um explante, usamos 10.000 virions. - Coloque a placa de células ou o tubo a 37 ° C para a infecção ocorrer; tempo de exposição viral pode variar dependendo da infectividade viral.
Nota: Entrada Viral foi confirmada usando orto-nitrofenil-β-galactoside (ONPG) e 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) ensaios26.
4. imunofluorescência
- Corrigi os explantes e única célula amostras em formol 4%, preparado em tampão fosfato soro fisiológico (PBS). Lave as amostras por 10 min cada por 3 vezes em PBS.
- Incubar as amostras com anticorpos primários desejados (anti-β-tubulina, anti-peripherin, anti-heparan sulfato (HS), e/ou antiglicoproteína anticorpos de D (gD); ver Tabela de materiais para as diluições) diluídos em tampão PBS com 0,3% Triton-X (PBST) e 10 % de soro de cabra normal. Armazenar as amostras em 4 ° C durante a noite.
- Lave as amostras por 10 min cada com PBS por 3 vezes. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 1 h em anticorpo secundário apropriado (488 e/ou Cy3; consulte Tabela de materiais para as diluições) diluído em PBS.
- Lave as amostras por 10 min cada com PBS por 3 vezes. Incube as amostras com corante Hoechst (1,5 µM) em PBS por 20 min antes da etapa de montagem.
- Monte as amostras em lâminas de vidro usando um meio de montagem de fluorescência e lamela.
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Representative Results
Múltiplos aspectos da interação neuroplasticidade e neurônio-ambiente podem ser investigados usando DRG e um modelo de cultura única célula dissociada. Começamos os estudos isolando um explante DRG e células dissociadas DRG-derivado, como esquematicamente representadas na Figura 1. Ambos os tecidos e modelos de células únicas podem ser analisados usando uma variedade de técnicas moleculares, tais como a imunofluorescência, Western blot, ensaios de genômicos e outras técnicas analíticas, dependendo da natureza do projeto experimental e objectivos. Primeiro, usamos o nosso modelo de explant DRG para investigar o efeito de sinais bioquímicos em crescimento axonal (Figura 2). Na imunofluorescência dupla ou tripla, a expressão diferencial de peripherin (Figura 2A, B; vermelho) e β-tubulina (Figura 2A, B; verde) confirmaram-se tanto dentro de corpos celulares neuronais e os brotos de axônio periférico. Núcleo de células foram identificado com mancha de Hoechst (Figura 2A; azul). A expressão dos marcadores acima mencionados foi ainda analisado no explante DRG inteiro após a fixação em paraformaldeído 4% e micrótomo-seccionamento (Figura 3A). Nossos resultados confirmaram que peripherin e β-tubulina são seletivamente expressos em duas subpopulações de neurônios ganglionar com peripherin sendo expressa no "pequena luz" e β-tubulina nas "grandes e escuras" subpopulações de neurônios, respectivamente. O immunolabeled de neuritos com qualquer marcador emergindo os neurônios sensoriais foram encontrados percorrendo o gânglio inteiro antes de sair para a periferia. Mancha de Hoechst identificado principalmente a posição dos núcleos gliais satélite dentro do gânglio. Como indicado na Figura 3B, a interação de células neurônio-satélite pode ser visualizada melhor após a técnica de dissociação celular completo. Núcleo de células manchadas de azul do satélite foram visto em torno de uma soma neuronal sensorial de β-tubulina-positivo e sua extensivo neuritos.
Nós mais utilizados as células DRG-derivado dissociada para investigar a infecção HSV-1 e associada a resposta inflamatória dentro os neurônios sensoriais (Figura 4). Após apenas 1 h de infecção post (p.i.), entrada de HSV-1 foi detectada usando anticorpo de gD anti-HSV-1 em células gliais (Figura 4A) e neurônios DRG (Figura 4B). Além disso, HS coloração foi realizada novas desde que HS fornece uma base de ligação para sites quebradas ou acessório do vírus a célula hospedeira. HS tem sido conhecido como um componente fundamental da matriz extracelular (ECM) multi-funcional e extensivamente documentado para desempenhar um papel importante na adesão celular, sinalização de célula para célula e ECM remodelação durante a cicatrização de feridas, desenvolvimento embrionário, câncer invasão, fibrose e em neuroinflammation35,36. Curiosamente, observamos que HS coloração em ECM sugerindo seu papel potencial no microambiente que permite o crescimento axonal (Figura 4). Finalmente, para a coloração de β-tubulina usamos como um marcador positivo para os neuritos para confirmar a integridade dos neurônios.
Figura 1 . Representação esquemática da RDG experimental e simples modelos de cultura de células. DRG foram isoladas de ratos adultos NIH/Suíça, limpo de capsular excessivo do tecido conjuntivo e qualquer explantados ex vivo como um todo explante ou dissociado em culturas primárias de co de neurônios sensoriais e células satélites. Ambos os modelos podem ser usados para mais análises com várias técnicas analíticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Desenvolvimento de DRG organotypic cultura como um sistema modelo para investigar o crescimento axonal. DRG cresceu para 6 dias ex vivo foram usados para investigar axonal brotando do explante. Nós mostramos por imunofluorescência como diferentes condições bioquímicas podem afetar a distribuição de brotos de fibra: crescendo aleatoriamente e desorganizado (A) em comparação com uma forma mais linear e organizada (B). Os explantes são rotulados com anti-β-tubulina (verde) e anti-peripherin (vermelho). Núcleo de células é corado com Hoechst mancha (azul). Barras de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Caracterização molecular do modelo isolado cultura neuronal. Seções da RDG todo foram immunolabeled com anticorpos contra peripherin e β-tubulina, mostrando a expressão seletiva dos marcadores de duas em duas subpopulações de neurônios ganglionar. Peripherin (vermelho) é expressa nos neurônios "pequenos, luz" e β-tubulina (verde) é expressa nos neurônios "grandes, escuros". Mancha de Hoechst identificado principalmente a posição dos núcleos gliais satélite dentro do gânglio (A). A interação de células neurônio-satélite pode ser melhor visualizada após a técnica de dissociação de célula cheia (B). Aqui nós mostramos um corpo neuronal sensorial de β-tubulina-positivo e sua neuritos rodeado por células gliais satélite (Hoechst: núcleos, azuis). Bares, A de escala = 100 µm; B = 25 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Investigação do modelo de entrada de HSV-1 em DRG-derivado dissociado células. Infecção de HSV-1 de células dissociadas de satélites retratada ao longo da β-tubulina-positivo neuritos (verde) é revelada usando um anticorpo anti-viral do gD (vermelho). Núcleos de células gliais do satélite são manchados de azuis com a Hoechst (A). O mesmo anticorpo revela entrada viral nos neurônios DRG dissociadas (B). As células são co rotuladas com um anticorpo contra heparan sulfato (HS, verde), expressado na membrana celular. HS é também um componente da matriz extracelular (verde) e desempenha um papel importante para o crescimento axonal (C). Os neurônios são rotulados com peripherin (vermelhos) e Hoechst azul é usado para identificar os núcleos da célula satélite. Escala de barras = 25 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O modelo ex vivo DRG é extremamente útil para investigar um amplo espectro de eventos tais como interação neurônio-glia, bem como o efeito do microambiente em ambos do metabolismo neuronal e glial37. Além disso, a DRG-modelo poderia ser usado como uma ferramenta de baixo custo para abordar questões relevantes referentes ao mecanismo de patogenicidade e associado a marcadores desenvolvendo ex vivo sistemas para fase aguda de crônica e latente da infecção, ou em uma determinada doença. Além disso, uma biblioteca de rastreio de pequenas moléculas em explantes DRG pode explorar este modelo de explante para desenvolvimento de drogas. Modelos in vitro , especialmente sistemas de célula única, são muitas vezes demasiado simplistas correlacionar eventos fisiologicamente relevantes; enquanto na vivo modelos estão desafiando a precisamente manipule, parcialmente devido a resposta imune à lesão, cicatriz glial e a complexidade do ECM circundante juntamente com a despesa financeira. Em contraste, o explante DRG é uma cultura de organotypic que permite a transferência ex vivo de um órgão inteiro com a complexidade de uma rede neuronal, incluindo o microambiente extracelular que desempenha um papel significativo em todos os neurônios e glia funções. A geração de um modelo ex vivo pode apenas assemelham-se porém, não totalmente retribuir todas as condições encontradas em vivo. Duas limitações importantes a ter em mente ao usar este modelo são o tempo e a ausência de feedbacks sistêmicas, que realmente só pode ser representado em vivo. O tempo limitado que o DRG pode ser mantida vital ex vivo torna este modelo mais adequado para a investigação de condições agudas e, portanto, não é um modelo muito fiável para condições crônicas. Da mesma forma, o modelo ex vivo não é ideal para estudos que podem efectuar-se pela ausência de respostas de outros órgãos ou sistemas (por exemplo, o sistema imunológico).
Fomos capazes de isolar o explante ex vivo DRG de ambos adultos e embriões de camundongos e ratos e use este modelo para investigar a infecção HSV-1, bem como vários outros aspectos da neuroplasticidade e seus efeitos na medicina translacional com êxito. Para permitir fibras sensoriais a crescer fora do explante, cápsula do conjuntivo circundante foi parcialmente removida1.
Para ser considerado, a mistura de proteína gelatinoso extraída o enxame-Engelbreth-Holm (EHS) rato sarcom isrich em proteínas de ECM como laminina, colágeno IV, proteoglicanos de sulfato de heparina (HSPG) e um número de fatores de crescimento38. Neste protocolo, a mistura de proteína gelatinosa é diluído 1:1 com meio de cultura e permissão para polimerizar por 30-60 min a 37 ° C antes de adicionar o volume final do meio. A mistura de proteína gelatinosa se polimeriza em temperatura ambiente; Portanto, é aconselhável para refrigerar a mistura até explantes são banhados e usar pontas de pipetas frio para distribuir 10-20 µ l cai sobre os pratos de 12 poços. Timing é fundamental para a eficiência final do processo de cultura e pode variar dependendo do tipo (e manufatura) da mistura de proteína gelatinoso usado. Se a mistura de proteína gelatinosa não é totalmente polimerizada ou já está solidificada, o explante pode flutuar ou seco levando ao crescimento sem sucesso. Nós encorajamos os investigadores para determinar empiricamente a temperatura apropriada, tempo e diluição de mistura gelatinosa de proteína para um modelo de sucesso. Chegamos a uma eficiência de 55-70% de crescimento bem sucedida de explantes DRG mantida ex vivo para até 7-10 dias. O explante pode ser ainda mais dissociado em DRG-derivado sensorial neurônios e células satélites co cultura primária.
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Disclosures
Os autores não têm nada de divulgação.
Acknowledgments
Agradecemos sinceramente o Imaging-facilidade do núcleo na Universidade do centro-oeste (UTH) e o grupo de estudantes [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo e Casey Sigerson] por suas contribuições no trabalho de imagem e cultura de células. Este trabalho de pesquisa foi apoiado pelo UTH intramuros conceder financiamento para fundos de start-up M.F. e pesquisa para V.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
References
- Muratori, L., et al. Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury. Neural Plast. , 860546 (2015).
- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin. J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).
- Devor, M., Govrin-Lippmann, R. Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).
- Farel, P. B., Boyer, A. Transient effects of nerve injury on estimates of sensory neuron number in juvenile bullfrog. J Comp Neurol. 410 (2), 171-177 (1999).
- Geuna, S., Borrione, P., Poncino, A., Giacobini-Robecchi, M. G. Morphological and morphometrical changes in dorsal root ganglion neurons innervating the regenerated lizard tail. Int J Dev Neurosci. 16 (2), 85-95 (1998).
- La Forte, R. A., Melville, S., Chung, K., Coggeshall, R. E. Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells. Somatosens Mot Res. 8 (1), 3-7 (1991).
- Pannese, E. Investigations on the Ultrastructural Changes of the Spinal Ganglion Neurons in the Course of Axon Regeneration and Cell Hypertrophy I. Changes during Axon Regeneration. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 60, 711-740 (1963).
- Popken, G. J., Farel, P. B. Sensory neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods. J Comp Neurol. 386 (1), 8-15 (1997).
- Tandrup, T. Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival. J Neurocytol. 33 (2), 173-192 (2004).
- Sarikcioglu, L., et al. Effect of severe crush injury on axonal regeneration: a functional and ultrastructural study. J Reconstr Microsurg. 23 (3), 143-149 (2007).
- Varejao, A. S., et al. Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J Neurotrauma. 21 (11), 1652-1670 (2004).
- Hanack, C., et al. GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals. Cell. 160 (4), 759-770 (2015).
- Pagadala, P., et al. Loss of NR1 subunit of NMDARs in primary sensory neurons leads to hyperexcitability and pain hypersensitivity: involvement of Ca(2+)-activated small conductance potassium channels. J Neurosci. 33 (33), 13425-13430 (2013).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Y., Lu, S. G., Gold, M. S. Persistent inflammation increases GABA-induced depolarization of rat cutaneous dorsal root ganglion neurons in vitro. Neuroscience. 220, 330-340 (2012).
- Amir, R., Devor, M. Functional cross-excitation between afferent A- and C-neurons in dorsal root ganglia. Neuroscience. 95 (1), 189-195 (2000).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 332-343 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Miller, C., Shanks, H., Witt, A., Rutkowski, G., Mallapragada, S. Oriented Schwann cell growth on micropatterned biodegradable polymer substrates. Biomaterials. 22 (11), 1263-1269 (2001).
- Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: II. Multiple grooved substrata. Development. 108 (4), 635-644 (1990).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis. J Virol. 84 (3), 1504-1512 (2010).
- Holland, D. J., Miranda-Saksena, M., Boadle, R. A., Armati, P., Cunningham, A. L. Anterograde transport of herpes simplex virus proteins in axons of peripheral human fetal neurons: an immunoelectron microscopy study. J Virol. 73 (10), 8503-8511 (1999).
- Sharthiya, H., Seng, C., Van Kuppevelt, T. H., Tiwari, V., Fornaro, M. HSV-1 interaction to 3-O-sulfated heparan sulfate in mouse-derived DRG explant and profiles of inflammatory markers during virus infection. J Neurovirol. 23 (3), 483-491 (2017).
- Zerboni, L., et al. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Koyuncu, O. O., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Virus infections in the nervous system. Cell Host Microbe. 13 (4), 379-393 (2013).
- Swanson, P. A. 2nd, McGavern, D. B. Viral diseases of the central nervous system. Curr Opin Virol. 11, 44-54 (2015).
- Tyler, K. L. Emerging viral infections of the central nervous system: part 2. Arch Neurol. 66 (9), 1065-1074 (2009).
- Preston, C., Efstathiou, S., et al. Ch 33. Human Herpesviruses Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Campadelli-Fiume, G., Arvin, A., Mocarski, E., et al. , Cambridge University Press. (2007).
- Roizman, B., Whitley, R. J. An inquiry into the molecular basis of HSV latency and reactivation. Annu Rev Microbiol. 67, 355-374 (2013).
- Arvin, A., et al. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Fueshko, S., Wray, S. LHRH cells migrate on peripherin fibers in embryonic olfactory explant cultures: an in vitro model for neurophilic neuronal migration. Dev Biol. 166 (1), 331-348 (1994).
- Parish, C. R. The role of heparan sulphate in inflammation. Nat Rev Immunol. 6 (9), 633-643 (2006).
- Zhang, X., Wang, B., Li, J. P. Implications of heparan sulfate and heparanase in neuroinflammation. Matrix Biol. 35, 174-181 (2014).
- Du, X., et al. Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission. J Clin Invest. 127 (5), 1741-1756 (2017).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
