Summary
I denna rapport markerade fördelarna med organotypic kulturer och dissocierade primära kulturer av mus-derived dorsalrotsganglier för att undersöka en rad mekanismer som är associerad med neuron-gliaceller interaktion, neuroplasticity, neuroinflammation och svar på virusinfektion.
Abstract
Det här protokollet beskriver en ex vivo -modell av mus-derived dorsalrotsganglier ganglier (DRG) explant och in vitro- DRG-derived samtidig kultur dissocierade sensoriska neuron och gliaceller satellit. Dessa är användbara och mångsidiga modeller att undersöka en mängd biologiska svar förknippas med fysiologiska och patologiska förhållanden av det perifera nervsystemet (PNS) alltifrån neuron-gliaceller interaktion, neuroplasticity, neuroinflammation och virusinfektion. Användningen av DRG explant är vetenskapligt fördelaktigt jämfört naiv enstaka celler modeller av flera skäl. Till exempel, som en organotypic kultur ger den DRG explant ex vivo överföring av ett helt neuronala nätverk inklusive den extracellulära närmiljön som spelar en betydande roll i alla neuronala och gliaceller funktioner. Ytterligare, DRG bladsticklingar kan också upprätthållas ex vivo för flera dagar och odlingsbetingelserna kan vara orolig som önskas. Dessutom kan den skördade DRG ytterligare särskiljas i en in vitro- samtidig kultur av primära sensoriska nervceller och satellit gliaceller att undersöka neuronala-gliaceller interaktion, neuritogenesis, axonal kon interaktion med den extracellulära närmiljön, och mer allmänt, någon aspekt som är associerad med neuronal metabolism. Därför, DRG-explant systemet erbjuder en stor flexibilitet att studera en rad olika händelser relaterade till biologiska, fysiologiska och patologiska förhållanden på ett kostnadseffektivt sätt.
Introduction
I detta manuskript redovisar vi en metod att få en organotypic ex vivo modell av mus härrör DRG modellsystem som en bevarade vävnad-liknande närmiljön att undersöka en rad biologiska svar till PNS förolämpningar alltifrån neuron-gliaceller interaktion, neuroplasticitet, inflammatoriska markörer, till virusinfektion. Dessutom har vi vidareutvecklat ett protokoll för att skapa en primär samtidig kultur av DRG-derived enda sensoriska nervceller och satellit celler.
DRG är satellit grå-materia-enheter längs de dorsala spinal rötterna av spinal nerver utanför det centrala nervsystemet (CNS). De DRG, ligger i närheten av intervertebral foramina, house Pseudounipolär sensoriska nervceller och satellit gliaceller. Pseudounipolär nervceller har en enda neurite som delas upp i en perifer process som transporterar somatisk och visceral ingångar från perifera mål till cellkroppen och en central process som skickar sensorisk information från cellkroppen i CNS. En bindväv kapsel definierar och isolerar detta perifera kluster av neuron och gliaceller från CNS. Ingen postnatal cellmigration till eller från DRG någonsin har beskrivits och en lokal stamcellsnischen ansvarar för neurogen händelser som inträffar i hela livet1. Denna modell är därför särskilt lämplig att studera adult neurogenes, axonogenesis, svar på posttraumatisk lesion, och cell death2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
I fältet för neuroregeneration, DRG skördas från in vivo och explanterad i vitro återger axonotmesis, en skada villkor i vilka axoner undertrckande fullt och neuronala cellkroppen är frånkopplad från innerverade målet10 ,11. Det är väl känt att perifer nervskada kan orsaka minskade och ökade genuttryck i DRG och många av dessa förändringar är ett resultat av regenerativ processer men många kan också vara ett resultat av immunsvar eller ett annat svar från icke-neuronala celler. Med hjälp av en ex vivo system av isolerade DRG, några av denna komplexitet avlägsnas och mekanistiska vägar kan undersökas mer enkelt.
Förutom sin centrala roll i att förmedla sensoriska input till CNS, överflödet av receptorer för många signalsubstanser inklusive GABA12,13,14,15 i nivå med den neuronala soma samt bevis på interneuronal cross-magnetisering kan antyda att DRG är sofistikerade preliminära integratörer sensoriska input16,17. Dessa nya rön ger till den DRG explant ett mini-neuronala nätverkssystem liknar andra ”mini hjärnan” modeller, som är nervös-vävnad-specifika organoids används för bredare experimentell fält av utredning och terapeutiska egenskaper förhållningssätt till neurologiska sjukdomar18,19. Dessa bevis tillsammans med det faktum att DRG är en diskret och väl definierade kluster av neuronal vävnad omgiven av en bindväv kapsel, gör det ett lämpligt organ för ex vivo transplantation.
Odling mus DRG presenterar ett attraktivt flercelliga alternativ att modellera mänskliga pathophysiologies på grund av strukturella och genetiska likheter mellan arterna. Dessutom är en stor databas av transgena möss stammar mycket gynnsam för framtida mekanistiska studier. Neurite extension både under utveckling och efter skada kräver mekanisk interaktioner mellan tillväxt kon och substrat20,21. Nano - och mikro-mönstrad substrat har använts som verktyg att direkt neurite utväxt och visa sin förmåga att svara på topografiska dragen i sin mikromiljö. Nervceller har visat sig överleva, följa, migrera och orientera sina axoner för att navigera surface-funktioner som grooves i substrat22,23. Dock dessa studier har oftast använt odlade cellinjer och det är svårt att förutsäga hur primär neuronala celler kommer svara på väldefinierade, fysiska ledtrådar i vivo eller ex vivo.
Ex vivo explant modell mus DRG används för detta förslag efterliknar riktiga cell-cell interaktioner och biokemiska signaler kring växande axoner. Bland många olika experimentella paradigm alltifrån axonal regenerering, neurosphere produktion, till neuroinflammation, DRG explant fortsätter modell att fungera som ett värdefullt verktyg för att undersöka den viral infektion och latens aspekten inom sensoriska ganglierna24,25,26,27.
Nervsystemet (NS) är i allmänhet målet för virusinfektioner28,29,30. De flesta virus infekterar epitelial och endothelial cellen ytbehandlar och gör sin väg från surface vävnaden till NS via perifer nerv sensoriska och motoriska fibrer. I synnerhet herpes simplex virus typ 1 (HSV-1) efter en första infektion i epitelceller upprättar en livslång latens i sensoriska ganglier företrädesvis DRG av den PNS31,32. HSV-1 neuroptropic förmåga att infektera PNS ytterst leder till neurologiska sjukdomar33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden inbegripet användning av djuren har godkänts av de institutionella granskning styrelse-godkända protokoll (IACUC-Midwestern University).
1. avverkning DRG från musembryon
-
Avliva de vuxna möss genom kvävning metod (CO2) följt av halshuggning. Genast fortsätta till kirurgiskt avlägsna ryggraden.
- Exponera ryggraden genom att skära ner hudlagret dorsalt med fina sax. Isolera ryggraden genom att skära genom revbenen på vardera sidan av kolumnen och korsbenet separera kotpelare från resten av djuret.
- Montera kotpelaren (ventrala sidan uppåt) på en kirurgisk matta med nålar/pins.
- Använda fina sax gör en dubbel skära på båda sidor av ryggraden organ att exponera den ventrala sidan av ryggradskanalen.
- I kirurgiska Mikroskop (förstoring inställd på 4 X), använda sax att försiktigt flytta ryggmärgen på sida att exponera de kontralaterala dorsala spinal rötterna och att lokalisera DRG, längs dorsala rötterna till de perifera nerverna. Varje ganglion är delvis dold inuti de intervertebral foramina.
- För att skörda DRG, nypa dorsala roten (mellan ryggmärgen och DRG) med en peang och dra försiktigt ut DRG från intervertebral foramen.
- Placera andra tången på spinal nerv perifera till DRG och dra DRG tillsammans med spinal nerv och spinal rot.
- Placera den insamlade DRG i en 35 mm petriskål innehållande 3 mL iskallt serum fria medier (SFM)34.
- Överföra varje enskilda DRG i ett torrt glas petriskål i kirurgiska Mikroskop, rengör och trimma bort överflödigt fibrer och bindväv fortfarande kopplad till den DRG med hjälp av ett blad. DRG är lätt identifierbara som en bulgy transparent struktur längs vita spinal nerv/roten. Blodkärl är ofta hittade kring DRG.
- Placera den rengjorda DRG i en ny petriskål innehållande iskall SFM media.
- Späd blandningen geléartad protein (se Tabell för material) i iskall SFM (1:1).
- Plattan i DRG ex vivo i 12 brunnar pre belagd med 10/20 µL av gelatinös protein blandning och ställa dem inuti inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 för 30-60 min.
- Försiktigt lägga 1,5-2 mL av SFM till kultur systemet att täcka den hela explant och upprätthålla bladsticklingar på odling villkor (37 ° C och 5% CO2).
Obs: Detta är ett kritiskt steg eftersom DRG är förankrad till glas rätter endast av polymeriserat geléartad protein blandningen. Tidpunkten för polymerisation och pipettering färdigheter är avgörande för att undvika flytande. - Ändra medlet av växande DRG varje 72 h och låt den DRG växa för så länge som behövs.
2. Isolera enstaka Cell nervceller från DRG
- Plats alla DRG samlas i ett 1,5 mL sterilt rör med 1,2 mL av F12 media som innehåller 1,25 mg/mL kollagenas IV och inkubera det vid 37 ° C och 5% CO2 för 45 min. Upprepa detta steg för en annan 45 min efter första ruvning.
- Behandla bladsticklingar med 2 mL av F12 media som innehåller trypsin (0,025%) för 30 min direkt efter kollagenas IV behandlingen vid 37 ° C och 5% CO2.
- Inkubera med 2 mL av F12 media som innehåller fetalt bovint serum (FBS; 33%) vid 37 ° C och 5% CO2 för 15 min.
- Tvätta bladsticklingar tre gånger med 2 mL F12 media och fortsätt att mekaniskt separera dem med ett glas pipett tills media blir grumlig.
Obs: Detta förfarande innebär insamling av ren/trimmade DRG från djur som förklaras i föregående avsnitt. När du utför mekaniska dissociation av bladsticklingar, försiktig och Använd inte överdriven kraft eftersom det kan leda till spill och förlust av arbetsmaterial. - Filtrera dissocierade cellkulturen genom ett 0,22 µm filter för att avlägsna orenheter och överflödig bindväv. Centrifugera den filtrerade cellen lysate (2500 x g) i 2 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 500 µL av neurobasal media som innehåller tillägg för neuronal kultur (1 x), antibiotika blandning (1 x), L-glutamat (0,5 mM), och nerv tillväxtfaktor (5 µg/mL) (se Tabell för material).
- Tallrik dissocierade cellerna till laminin-belagd täcka diabilder (50 µg/mL, se Tabell för material) på en rekommenderad cell densiteten. Bestämma cell densiteten med hjälp av en cell-räknare.
Obs: Vi pläterade celler på 25 000 celler/cover bild. Denna teknik tillåter dissociation av både neuron och gliaceller satellit. Komponenten gliaceller Co odlade med Pseudounipolär nervceller spelar en avgörande roll för neuronal överlevnad.
3. HSV-1 infektion av DRG bladsticklingar och DRG-derived dissocierade celler
Obs: Detta arbete utfördes genom att strikt följa de biosäkerhet nivå 2 (BSL-2) krav som vi har ett fullt utrustat laboratorium som är godkänt av Midwestern University Biosäkerhetskommittén. En KOS stam av HSV-1 användes i denna studie. Vänligen ta lämpliga mätningar och säkerhetsföreskrifter enligt lokala institutioner riktlinjer om arbetar med virusstammar.
- Fastställa och förbereda viruset i de rätta utspädningarna i SFM media att infektera modellen. Det virus som används i denna studie var KOS stam av HSV-1. När du arbetar med DRG-derived separerade celler, Använd 1 enhet av multiplicity av infektion (MOI) för infektion, vilket innebär antalet virus lika antalet celler.
- Om smitta DRG explants, använda antalet virioner (t.ex., 10.000 virioner) eftersom ett exakt antal celler i ett explant inte kan fastställas.
- Placera de explant/cellerna infekterade med virus i en steril cell tallrik eller rör som innehåller en blandning av SFM media och virus.
Obs: Vi använde 25.000 virioner för en cover bild som innehåller 25 000 celler (1 MOI). För att infektera en explant, använder vi 10.000 virioner. - Placera cell plattan eller röret vid 37 ° C för infektion skall ske. viral exponeringstid kan variera beroende på viral smittsamhet.
Obs: Viral inträde bekräftades med hjälp av ortho-nitrofenyl-β-galactoside (ONPG) och 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) analyser26.
4. immunofluorescens
- Fixa bladsticklingar och enda cellprover i 4% formalin beredd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tvätta prover 3 gånger för 10 min varje i PBS.
- Inkubera proverna med önskad primära antikroppar (anti-β-tubulin, anti-peripherin, anti-heparansulfat sulfat (HS) och/eller anti glykoprotein D (gD) antikropp; se Tabell av material för utspädningar) utspätt i PBS buffert med 0,3% Triton-X (PBST) och 10 % normala get serum. Lagra prover vid 4 ° C över natten.
- Tvätta proverna 3 gånger för 10 min varje med PBS. Inkubera prover i rumstemperatur i 1 h i den lämpliga sekundära antikroppen (488 eller Cy3; se Tabell av material för utspädningar) utspätt i PBS.
- Tvätta proverna 3 gånger för 10 min varje med PBS. Inkubera proverna med Hoechst färgämne (1,5 µM) i PBS i 20 min innan montering steg.
- Montera proverna på glasskivor med hjälp av fluorescens monteringsmedium och täckglas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flera aspekter neuroplasticitet och neuron-miljö interaktioner kan undersökas med hjälp av DRG och en enda dissocierade cell kultur modell. Vi började studierna genom att isolera en DRG explant och DRG-derived dissocierade celler som schematiskt representerade i figur 1. Både vävnad och enstaka celler modeller kan analyseras med hjälp av en mängd molekylära tekniker såsom immunofluorescens, Western blot, genomiska analyser och andra analytiska tekniker beroende på experimentell design och mål. Först, vi brukade vår DRG explant modell undersöka effekten av biokemiska signaler på axonal tillväxt (figur 2). I dubbel- eller Trebäddsrum immunofluorescens bekräftades differentiell uttryck för peripherin (figur 2A, B; röd) och β-tubulin (figur 2A, B; grön) både inom de neuronala cell organ och perifera neurite skott. Cellkärna identifierades med Hoechst fläck (figur 2A; blå). Uttrycket av de ovannämnda markörerna var ytterligare analyseras i den hela DRG explant efter fixering i 4% PARAFORMALDEHYD och mikrotom-snittning (figur 3A). Våra resultat bekräftade att peripherin och β-tubulin selektivt uttrycks i två subpopulations av ganglieblockerande nervceller med peripherin uttrycks i ”liten, ljus” och β-tubulin i ”stora, mörka” subpopulationsna av nervceller, respektive. Den neuriter immunolabeled med antingen markör framväxande från sensoriska nervceller hittades for genom hela ganglion innan du avslutar i periferin. Hoechst fläcken identifierade mestadels ställning av gliaceller satellit atomkärnor inom ganglion. Som anges i figur 3B, kan neuron-satellit cell interaktionen visualiseras bättre efter full cell dissociation teknik. Blå-färgade satellit cellkärna sågs kring en β-tubulin-positiv sensorisk neuronala soma och dess omfattande neuriter.
Vi har ytterligare utnyttjat DRG-derived differentierade cellerna för att undersöka HSV-1 infektion och associerade inflammatoriska svar inom de sensoriska nervcellerna (figur 4). Efter endast 1 h av post infektion (PI) upptäcktes HSV-1 post med hjälp av anti-HSV-1 gD antikropp i gliacellerna (figur 4A) och DRG nervceller (figur 4B). Dessutom genomfördes HS färgning ytterligare eftersom HS ger en för platser för virus bifogad fil eller bindning till värdcellen. HS har varit känd som en kritisk komponent i den multifunktionella extracellulär matrixen (ECM) och dokumenteras utförligt för att spela en viktig roll i celladhesion, cell-till-cell signalering och ECM remodeling under sårläkning, embryonal utveckling, cancer invasion, fibros, neuroinflammation35,36. Intressant, observerat vi HS färgning i ECM tyder på dess potentiella roll i den närmiljön som möjliggör axonal tillväxt (figur 4 c). Slutligen för β-tubulin färgning använde vi som en positiv markör för neuriter att bekräfta integriteten av nervceller.
Figur 1 . Schematisk representation av den experimentella DRG och enda cell kultur modeller. DRG isolerades från Adult NIH/schweizisk möss, rengöras från överdriven kapsulära bindväv och antingen explanterad ex vivo som en hela explant eller separerat in i primära samtidig kulturer av sensoriska nervceller och satellit celler. Båda modellerna kan användas för ytterligare analyser med flera analysmetoder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Utveckling av DRG organotypic kultur som modellsystem att undersöka axonal tillväxt. DRG odlas för 6 dagar ex vivo användes för att undersöka axonal GRO från explant. Vi visar genom immunofluorescens hur olika biokemiska förhållanden kan påverka fördelningen av fiber groddar: växande slumpmässigt och oorganiserad (A) jämfört med en mer linjär och organiserat sätt (B). Bladsticklingar är märkta med anti-β-Tubulin (grön) och anti-peripherin (röd). Cellkärna färgas med Hoechst fläcken (blå). Skala barer = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 . Molekylär karakterisering av isolerade neuronala kultur modellen. Delar av den hela DRG var immunolabeled med antikroppar mot peripherin och β-tubulin visar selektiv uttrycket av de två markörerna i två subpopulations av ganglieblockerande nervceller. Peripherin (röd) uttrycks i ”liten, ljus” nervceller och β-tubulin (grön) uttrycks i ”stora, mörka” nervceller. Hoechst fläcken identifierade mestadels ställning av gliaceller satellit atomkärnor inom ganglion (A). Neuron-satellit cell interaktionen kan visualiseras bättre efter full cell dissociation teknik (B). Här visar vi en β-tubulin-positiv sensorisk neuronala kropp och dess neuriter omgiven av satellit gliaceller (Hoechst: kärnor, blå). Skala barer, A = 100 µm; B = 25 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 . Utredning av HSV-1 post modell i DRG-derived separerade celler. HSV-1 infektion av dissocierade satellit celler skildras längs β-tubulin-positiva neuriter (grön) avslöjas med en anti-virala gD antikroppen (röd). Satellit gliaceller atomkärnor färgas blå med Hoechst (A). Samma antikropp avslöjar viral inträde i dissocierade DRG nervceller (B). Celler är samtidig märkta med en antikropp mot heparansulfat sulfat (HS, grön) uttrycks på cellmembranet. HS är också en komponent i den extracellulära matrixen (grön) och spelar en viktig roll för axonal tillväxt (C). Nervceller är märkta med peripherin (röd) medan Hoechst blå används för att identifiera satellit cellkärnor. Skala barer = 25 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex vivo DRG modellen är mycket användbart att undersöka ett brett spektrum av händelser såsom neuron-glia interaktion samt effekten av närmiljön på båda neuronala och gliaceller metabolism37. Ytterligare, DRG-modellen skulle kunna användas som ett kostnadseffektivt verktyg för att ta itu med relevanta frågor om patogena mekanismen och associerade markörer genom att utveckla ex vivo system för akut kronisk och latent fas av infektion eller i en viss sjukdom. Dessutom utnyttja ett screening bibliotek av små molekyler i DRG bladsticklingar denna explant modell för läkemedelsutveckling. In vitro -modeller, speciellt encelliga system, är ofta alltför förenklat att korrelera till fysiologiskt relevanta händelser; medan i vivo modeller är en utmaning att just manipulera, delvis på grund av immunsvaret mot skada, gliaceller ärrbildning och komplexiteten i den omgivande ECM tillsammans med den finansiella kostnaden. De DRG explant är däremot en organotypic kultur som tillåter ex vivo överföring av hela organ med komplexiteten i ett neuronala nätverk, inklusive den extracellulära närmiljön som spelar en betydande roll i alla neuronala och gliaceller funktioner. Generering av en ex vivo -modell kan bara likna men inte helt återgälda alla villkor finns i vivo. Två viktiga begränsningar att ha i åtanke när du använder denna modell är timingen och avsaknad av systemisk återkopplingar, som kan bara verkligen vara representerade i vivo. Den begränsade tid som att DRG kan upprätthållas vitala ex vivo gör denna modell mer lämplig för utredning av akuta tillstånd och således inte en mycket pålitlig modell för kroniska tillstånd. På samma sätt, ex vivo modellen inte är idealisk för studier som kan ske genom avsaknad av svar från andra organ eller system (t.ex., immunsystemet).
Vi kunde framgångsrikt isolera den explant ex vivo DRG från både vuxen och embryo möss och råttor och använda denna modell för att undersöka HSV-1 infektion samt flera andra aspekter av neuroplasticitet och dess effekter på translationell medicin. För att möjliggöra sensoriska fibrer att växa utanför explant, var bindväv omgivande kapseln delvis borttagna1.
Att vara ansett, geléartad protein blandningen utvinns ur Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus sarcom isrich i ECM proteiner som laminin, kollagen IV, heparin sulfat proteoglykaner (HSPG) och ett antal tillväxtfaktorer38. I detta protokoll, geléartad protein blandningen är utspädd 1:1 med odlingsmedium och tillåtna för att polymerisera under 30-60 minuter vid 37 ° C innan du lägger till den slutliga volymen av medium. Geléartad protein blandningen polymerizes i rumstemperatur; Därför föreslås det för att kyla blandningen tills bladsticklingar är klädd och att använda kalla pipettspetsar för att fördela 10-20 µL ramlar de 12-väl rätterna. Timing är avgörande för slutliga effektiviteten i förfarandet för kultur och kan variera beroende på typ (och tillverkning) av gelatinös protein blandningen används. Om geléartad protein blandningen inte är fullständigt polymeriserat eller det är redan stelnat, kan explant flyta eller torka ut leder till misslyckade tillväxt. Vi uppmuntrar utredarna att empiriskt fastställa lämplig temperatur, tid och geléartad protein blandning utspädning för en framgångsrik modell. Vi nådde en 55-70% effektivitet av framgångsrik tillväxt av DRG bladsticklingar upprätthålls ex vivo upp till 7-10 dagar. Explant kan särskiljas ytterligare i DRG-derived primära sensoriska nervceller och satellit celler samtidig kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att utlämnande.
Acknowledgments
Vi tackar Imaging core-anläggningen på Midwestern University (Arbetskraftsenhet) och gruppen av studenter [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo och Casey Sigerson] för deras bidrag i cellkultur och imaging arbete. Detta forskningsarbete stöddes av Arbetskraftsenhet Intramural bidragsfinansiering att M.F. och forskning start-up medel till VT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
References
- Muratori, L., et al. Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury. Neural Plast. , 860546 (2015).
- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin. J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).
- Devor, M., Govrin-Lippmann, R. Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).
- Farel, P. B., Boyer, A. Transient effects of nerve injury on estimates of sensory neuron number in juvenile bullfrog. J Comp Neurol. 410 (2), 171-177 (1999).
- Geuna, S., Borrione, P., Poncino, A., Giacobini-Robecchi, M. G. Morphological and morphometrical changes in dorsal root ganglion neurons innervating the regenerated lizard tail. Int J Dev Neurosci. 16 (2), 85-95 (1998).
- La Forte, R. A., Melville, S., Chung, K., Coggeshall, R. E. Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells. Somatosens Mot Res. 8 (1), 3-7 (1991).
- Pannese, E. Investigations on the Ultrastructural Changes of the Spinal Ganglion Neurons in the Course of Axon Regeneration and Cell Hypertrophy I. Changes during Axon Regeneration. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 60, 711-740 (1963).
- Popken, G. J., Farel, P. B. Sensory neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods. J Comp Neurol. 386 (1), 8-15 (1997).
- Tandrup, T. Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival. J Neurocytol. 33 (2), 173-192 (2004).
- Sarikcioglu, L., et al. Effect of severe crush injury on axonal regeneration: a functional and ultrastructural study. J Reconstr Microsurg. 23 (3), 143-149 (2007).
- Varejao, A. S., et al. Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J Neurotrauma. 21 (11), 1652-1670 (2004).
- Hanack, C., et al. GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals. Cell. 160 (4), 759-770 (2015).
- Pagadala, P., et al. Loss of NR1 subunit of NMDARs in primary sensory neurons leads to hyperexcitability and pain hypersensitivity: involvement of Ca(2+)-activated small conductance potassium channels. J Neurosci. 33 (33), 13425-13430 (2013).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Y., Lu, S. G., Gold, M. S. Persistent inflammation increases GABA-induced depolarization of rat cutaneous dorsal root ganglion neurons in vitro. Neuroscience. 220, 330-340 (2012).
- Amir, R., Devor, M. Functional cross-excitation between afferent A- and C-neurons in dorsal root ganglia. Neuroscience. 95 (1), 189-195 (2000).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 332-343 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Miller, C., Shanks, H., Witt, A., Rutkowski, G., Mallapragada, S. Oriented Schwann cell growth on micropatterned biodegradable polymer substrates. Biomaterials. 22 (11), 1263-1269 (2001).
- Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: II. Multiple grooved substrata. Development. 108 (4), 635-644 (1990).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis. J Virol. 84 (3), 1504-1512 (2010).
- Holland, D. J., Miranda-Saksena, M., Boadle, R. A., Armati, P., Cunningham, A. L. Anterograde transport of herpes simplex virus proteins in axons of peripheral human fetal neurons: an immunoelectron microscopy study. J Virol. 73 (10), 8503-8511 (1999).
- Sharthiya, H., Seng, C., Van Kuppevelt, T. H., Tiwari, V., Fornaro, M. HSV-1 interaction to 3-O-sulfated heparan sulfate in mouse-derived DRG explant and profiles of inflammatory markers during virus infection. J Neurovirol. 23 (3), 483-491 (2017).
- Zerboni, L., et al. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Koyuncu, O. O., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Virus infections in the nervous system. Cell Host Microbe. 13 (4), 379-393 (2013).
- Swanson, P. A. 2nd, McGavern, D. B. Viral diseases of the central nervous system. Curr Opin Virol. 11, 44-54 (2015).
- Tyler, K. L. Emerging viral infections of the central nervous system: part 2. Arch Neurol. 66 (9), 1065-1074 (2009).
- Preston, C., Efstathiou, S., et al. Ch 33. Human Herpesviruses Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Campadelli-Fiume, G., Arvin, A., Mocarski, E., et al. , Cambridge University Press. (2007).
- Roizman, B., Whitley, R. J. An inquiry into the molecular basis of HSV latency and reactivation. Annu Rev Microbiol. 67, 355-374 (2013).
- Arvin, A., et al. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Fueshko, S., Wray, S. LHRH cells migrate on peripherin fibers in embryonic olfactory explant cultures: an in vitro model for neurophilic neuronal migration. Dev Biol. 166 (1), 331-348 (1994).
- Parish, C. R. The role of heparan sulphate in inflammation. Nat Rev Immunol. 6 (9), 633-643 (2006).
- Zhang, X., Wang, B., Li, J. P. Implications of heparan sulfate and heparanase in neuroinflammation. Matrix Biol. 35, 174-181 (2014).
- Du, X., et al. Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission. J Clin Invest. 127 (5), 1741-1756 (2017).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
