Summary
Bu raporda, organotypic ve fare kaynaklı dorsal kök gangliyon Disosiye birincil kültürler avantajları ile nöron gliyal etkileşim, nöroplastisite ilişkili mekanizmaları geniş bir araştırmaya vurgulanır, neuroinflammation ve viral enfeksiyon yanıt.
Abstract
Bu iletişim kuralı bir ex vivo modeli fare kaynaklı dorsal kök gangliyon (DRG) explant ve vitro DRG kaynaklı ortak kültür Disosiye duyusal sinir hücreleri ve gliyal uydu hücre açıklar. Bunlar biyolojik yanıt periferik sinir sistemi (PNS) nöron gliyal müdahalesini nöroplastisite değişen fizyolojik ve patolojik şartlar ile ilişkili çeşitli araştırmak için yararlı ve çok yönlü modellerdir, neuroinflammation ve viral enfeksiyon. DRG explant kullanımı için birden çok nedeni basit tek hücreleri modellerle karşılaştırıldığında bilimsel olarak avantajlıdır. Örneğin, bir organotypic kültür olarak DRG explant tüm nöronal ve gliyal işlevlerin önemli bir rol oynamaktadır ekstraselüler microenvironment de dahil olmak üzere tüm nöronal ağa ex vivo transferini sağlar. Ayrıca, DRG explants da ex vivo birkaç gün ve kültür koşulları olarak tedirgin için istenen korunabilir. Buna ek olarak, hasat DRG daha fazla birincil duyusal sinir hücreleri ve uydu gliyal hücreler gliyal nöronal etkileşim, neuritogenesis, hücre dışı etkileşim aksonal koni araştırmak için bir vitro ortak kültür içine ayrışmış microenvironment ve daha fazla genel, nöronal metabolizma ile ilişkili herhangi bir yönü. Bu nedenle, DRG-explant sistemi büyük bir maliyet-etkin bir şekilde biyolojik, fizyolojik ve patolojik koşulları için ilgili olayların geniş bir dizi çalışma için esneklik sağlar.
Introduction
Bu makale, biz biyolojik yanıt nöron-gliyal gelen değişen PNS hakaret için geniş bir araştırmaya korunmuş bir doku gibi microenvironment olarak türetilmiş fare DRG modeli sistemi bir organotypic ex vivo modeli elde etmek için bir yöntem raporu etkileşim, nöroplastisite, inflamatuar işaretlere, viral enfeksiyon. Buna ek olarak, biz daha DRG elde edilen tek duyusal sinir hücreleri ve uydu hücreleri birincil co kültürünü oluşturmak için bir protokol tarafından geliştirilmiştir.
DRG uydu gri-madde-birimler merkezi sinir sistemi (MSS) dışında spinal sinirlerin dorsal omurga kökleri yer alan bulunmaktadır. İntervertebral foramina, ev pseudounipolar duyusal sinir hücreleri ve uydu gliyal hücrelerini yakınlığı bulunan DRG. Pseudounipolar nöronlar çevresel hedefler somatik ve viseral girişlerden hücre vücuda taşıyan bir periferik süreci ve MSS hücre vücuttan duyusal bilgileri gönderir bir merkezi işlem böler tek bir neurite sahiptir. Bir bağ kapsül tanımlar ve bu periferik kümeden nöronlar ve gliyal hücreler MSS izole ediyor. DRG bilgisayardan veya doğum sonrası hücre geçiş yoktur şimdiye kadar açıklanan ve bir yerel kök hücre niş yaşam1gerçekleşen Nörojenik olayların sorumludur. Bu nedenle, bu model yetişkin neurogenesis, axonogenesis, travmatik lezyonu ve hücre ölüm2,3,4,5,6,7 yanıt çalışmak özellikle uygundur ,8,9 .
Neuroregeneration alanında, DRG vivo içinde --dan hasat ve explanted vitro axonotmesis üretir, bir yaralanma durumu hangi aksonlar tamamen kopmuş ve nöronal hücre vücut innervated hedef10 kesilir ,11. Iyi periferik sinir yaralanma azalan ve artan gen ekspresyonu DRG neden olabilir ve bu değişiklikleri birçok Rejeneratif işlemler sonucu ama çoğu da bağışıklık yanıtı veya başka bir yanıt nöronal olmayan hücrelerden bir sonucu olabilir bilinmektedir. Bir ex vivo kullanarak bu karmaşıklığı bazılarına izole DRG sistemi kaldırılır ve mekanik yollar daha kolay soruşturma olmaktır.
MSS, bereket için nöronal soma düzeyde GABA12,13,14,15 de dahil olmak üzere birçok nörotransmitter reseptörlerinin duyusal girdilerin taşıma merkezi rolü yanı sıra yanı sıra kanıt interneuronal çapraz-uyarma DRG sofistike ön entegratörleri duyusal girdiler16,17olduğunu önerebilir miyim? Bu yeni bulgular DRG explant için bir mini-nöronal ağ sistemi sinir doku özel organoids daha geniş deneysel araştırma alanları için kullanılan diğer "Mini beyin" modelleri, benzer ve tedavi edici özellikleri görüşmek. nörolojik hastalıklar18,19yaklaşım. Bu delillerin DRG ayrık ve iyi tanımlanmış küme nöronal doku bağ bir kapsül tarafından çevrili olması ile birlikte uygun bir organ ex vivo nakli için yapmak.
Kodlamayla fare DRG türler arasında yapısal ve genetik benzerlikler nedeniyle insan pathophysiologies model çekici çok hücreli seçeneğini sunar. Ayrıca, büyük bir depo transgenik fare suşlarının gelecekteki mekanik çalışmaları için son derece elverişli. Neurite uzantısı geliştirme sırasında ve yaralanma sonra büyüme koni ve substrat20,21arasındaki mekanik etkileşim gerektirir. Nano ve mikro desenli yüzeyler araçları olarak neurite çıkıntı yönlendirmek ve onların microenvironments topografik özellikleri yanıt kapasitelerini göstermek için kullanılmıştır. Nöronlar hayatta, uygun, göç ve yüzey şekil öyle aynı derecede yiv yüzeylerde22,23içinde gezinmek için onların aksonlar şark gösterilmiştir. Ancak, bu çalışmalar genellikle kültürlü hücre hatları kullanılan ve nasıl olacak birincil nöronal hücre tahmin etmek zordur iyi tanımlanmış, fiziksel ipuçları vivo içinde veya ex vivoyanıt.
Fare bu öneri için kullanılan DRG ex vivo explant modelinin gerçek hücre-hücre etkileşim ve biyokimyasal ipuçları büyüyen aksonlar çevreleyen taklit eder. Çok deneysel paradigmalar aksonal rejenerasyon, neurosphere üretim, neuroinflammation için değişen DRG explant farklı arasında modeli içinde duyusal viral enfeksiyon ve gecikme yönüdür araştırmak için değerli bir araç olarak hizmet vermeye devam etmektedir gangliyon24,25,26,27.
Sinir sistemi (NS) genel olarak viral enfeksiyonlar28,29,30için hedeftir. Virüslerin çoğu epitel ve endotel hücre yüzeyleri bulaştırmak ve duyusal ve motor lifler NS periferik sinirleri ile yüzey dokusundan onların yol yapmak. Özellikle, herpes simpleks virüsü tip 1 (HSV-1) ilk enfeksiyon epitel hücrelerdeki yaşam boyu süren bir gecikme süresi tercihen, duyusal gangliyon kurar sonra PNS31,32DRG. PNS bulaşmasını HSV-1 neuroptropic yeteneği sonuçta nörolojik hastalıklar33' e yol açar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlar dahil olmak üzere tüm yordamlar (IACUC-Midwestern Üniversitesi) Yönetim Kurulu tarafından onaylanan kurumsal inceleme protokolleri tarafından onaylanmıştır.
1. hasat DRG fare embriyo üzerinden
-
İşten çıkarma tarafından takip yetişkin fareler boğulma yöntemi (CO2) tarafından ötenazi. Hemen cerrahi olarak vertebral sütun kaldırmak için devam edin.
- Vertebral sütunun dorsally iyi makas kullanarak cilt katman aşağı kesim tarafından ortaya çıkarmak. Vertebral sütunun sütun her iki tarafında kaburgalar ve vertebral sütunun hayvan geri kalanından ayıran sakrum keserek izole et.
- Vertebral sütunun (ventral tarafı yukarı) bir cerrahi hasır iğne/iğne kullanarak bağlayın.
- İyi makas yapmak kullanarak bir çift vertebra cesetleri vertebral kanalın ventral tarafına ortaya çıkarmak için her iki tarafta kesti.
- Cerrahi mikroskop altında (set 4 X büyütme), makas yavaşça kontralateral dorsal omurga kökleri göstermek için ve çevresel sinirlere dorsal kökleri boyunca DRG bulmak için tarafında omurilik taşımak için kullanın. Her sinir düğümü kısmen intervertebral foramina içinde gizlidir.
- DRG hasat için dorsal kök (spinal kord ve DRG arasında) bir Forseps ile pinch ve yavaşça DRG intervertebral deliği üzerinden dışarı çekin.
- İkinci forseps omurilik biyopsisi DRG periferik yerleştirin ve omurilik biyopsisi ve omurilik kök ile birlikte DRG çekin.
- Toplanan DRG bir 35 mm buz gibi serum boş ortam (SFM)343 mL içeren Petri kabına yerleştirin.
- Tek tek her DRG kuru cam Petri kabına aktarmak ve, cerrahi mikroskop altında temiz ve aşırı kıl ve bağ dokusu hala bir bıçak kullanarak DRG bağlı kapalı döşeme. DRG kolayca şişkin şeffaf yapısı boyunca beyaz omurilik biyopsisi/root olarak tanımlanabilir. Kan damarları genellikle DRG çevreleyen bulunur.
- Temizlenmiş DRG bir yeni buz gibi SFM ortamı içeren kabında yerleştirin.
- Jelatinimsi protein karışımı seyreltik ( Tablo malzemelerigörmek) içinde buz gibi SFM (1:1).
- Plaka 12-şey tabak içinde DRG ex vivo jelatinimsi protein karışımı 10/20 µL ile ön kaplamalı ve 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka makinesi 30-60 dakika içinde bunları.
- Yavaşça SFM 1.5-2 mL kültür sistemi tüm explant kapak ve koşullar (37 ° C ve % 5 CO2) kültür, explants korumak için ekleyin.
Not: DRG cam yemekleri sadece polimerli jelatinimsi protein karışımı tarafından demirlemiş olan önemli bir adım olmasıdır. Polimerizasyon ve pipetting becerileri zaman yüzen önlemek için kritiktir. - DRG her 72 h büyüyen orta değiştirin ve büyümek için gerekli sürece DRG izin.
2. tek hücre Neurons DRG yalıtma
- Tüm DRG 1.25 mg/mL collagenase IV içeren F12 medya 1.2 mL ile 1,5 mL steril tüp içinde toplanan ve 37 ° C ve %5 CO2 45 dakika süreyle kuluçkaya yer ilk kuluçka sonra başka bir 45 dakika için bu adımı yineleyin.
- Explants 2 mL tripsin (% 0,025) 30 dk için hemen sonra 37 ° C ve % 5 CO2collagenase IV tedavi içeren F12 medya ile tedavi.
- 2 mL fetal sığır serum (FBS; % 33) içeren F12 medya ile 37 ° C ve % 5 CO2 15dk için kuluçkaya.
- Explants 2 mL F12 medya ile üç kez yıkayın ve mekanik olarak onları ayırmak cam pipet ile medya bulutlu yaşına gelene kadar devam edin.
Not: Bu yordam temiz/kesilmiş DRG önceki bölümünde açıklandığı gibi hayvan topluluğu içerir. Explants mekanik ayrışma gerçekleştirirken, nazik ol ve dökülme ve çalışma malzeme kaybı yol açabilir beri aşırı güç kullanmayın. - Disosiye hücre kültürü herhangi bir yabancı maddeleri ve aşırı bağ dokusu kaldırmak için 0,22 µm filtre ile filtre. Filtre uygulanan hücre (2500 x g) lysate santrifüj kapasitesi 2 dk için.
- Süpernatant kaldırmak ve neurobasal medya için nöronal kültür (1 x), antibiyotik karışımı (1 x), L-Glutamat (0.5 mM), ek içeren 500 µL hücre Pelet resuspend ve sinir büyüme faktörü (5 µg/mL) ( Tablo malzemelerigörmek).
- Disosiye hücreleri laminin kaplı kapak slayta (50 µg/mL; bkz: Malzemeler tablo) tercih edilen hücre yoğunluğu plaka. Bir hücre sayaç kullanarak hücre yoğunluğu belirlemek.
Not: 25.000 hücreler/kapak slayt hücreleri kaplama. Bu teknik ayrılma nöronlar ve gliyal uydu hücre sağlar. Pseudounipolar nöronlar ile birlikte kültürlü gliyal bileşen nöronal hayatta kalmak için kritik bir rol oynamaktadır.
3. DRG Explants ve Disosiye hücreleri DRG kaynaklı HSV-1 enfeksiyonu
Not: Bu iş kesinlikle Midwestern Üniversitesi Biyogüvenlik Komitesi tarafından onaylanmış bir tam donanımlı laboratuvar bizde Biyogüvenlik seviye-2 (BSL-2) gereksinimleri takip ederek yapıldı. HSV-1 KOS suşu bu çalışmada kullanılmıştır. Lütfen uygun ölçüleri ve güvenlik önlemleri yerel kurumlar yönergelere göre eğer virüs suşları ile çalışma alın.
- Belirlemek ve model bulaştırmak için SFM medya doğru dilutions virüsü hazırlayın. Bu çalışmada kullanılan virüs KOS zorlanma HSV-1 oldu. Hücreleri DRG kaynaklı ile çalışma ilişkisini, enfeksiyon (MOI) çokluğu 1 adet virüs eşit hücre sayısı sayısı anlamına gelir enfeksiyon için kullanın.
- DRG bulaşmasını explants, bir explant hücrelerde tam bir sayısını tespit edilemez çünkü virions (örneğin, 10.000 virions) numarasını kullanabilirsiniz.
- Explant/hücre steril hücre plaka veya SFM medya ve virüs içeren tüp virüs ile enfekte koyun.
Not: 25.000 hücreleri (1 MOI) içeren bir kapak slayt için 25.000 virions kullandık. Bir explant bulaştırmak için 10.000 virions kullanın. - Hücre plaka veya tüp enfeksiyon gerçekleşmesi için 37 ° C'de yer; viral pozlama süresi viral infektivite bağlı olarak değişebilir.
Not: Viral giriş ortho-nitrophenyl-β-galactoside (ONPG) ve 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (X-gal) deneyleri26kullanılarak doğrulandı.
4. ayirt
- Explants ve tek hücre örnekleri fosfat tamponlu tuz (PBS) hazırlanan % 4 formalin düzeltin. Örnekleri 10 min için 3 kez PBS içinde yıkayın.
- PBS arabelleği % 0,3 ile seyreltilmiş istenen birincil antikorlar (anti-β-tübülin, anti-peripherin, anti-heparan sülfat (HS) ve/veya anti-glikoprotein D (gD) antikor; dilutions için bkz: Tablo reçetesi ) örnekleriyle kuluçkaya Triton-X (PBST) ve 10 % normal keçi serum. Gecede örnekleri 4 ° C'de depolayın.
- Örnekleri 3 kez için 10 min her PBS ile yıkayın. Örnekler uygun ikincil antikor 1 h için oda sıcaklığında kuluçkaya (488 ve/veya Malzemeleri tablo için dilutions görmek Cy3;) PBS içinde seyreltilmiş.
- Örnekleri 3 kez için 10 min her PBS ile yıkayın. Höchst boya (1,5 µM) örnekleriyle PBS içinde 20 dk önce montaj adım için kuluçkaya.
- Örnekleri cam slaytlara bir floresan montaj orta ve coverslip kullanarak bağlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Birden çok nöroplastisite ve nöron-çevre etkileşimi yönlerini DRG ve bir tek Disosiye hücre kültür modeli kullanarak soruşturma olmaktır. Biz çalışmalar DRG explant ve Disosiye hücreleri DRG kaynaklı şematik olarak şekil 1' de gösterilen izole ederek başladı. Doku ve tek hücre modelleri ayirt, Western blot, genomik deneyleri ve deneysel tasarım ve amaçları niteliğine bağlı olarak diğer analitik teknikler gibi moleküler teknikler kullanılarak çözümlenebilir. İlk olarak, bizim DRG explant modeli aksonal büyüme (Şekil 2) biyokimyasal cues etkisi araştırmak için kullanılır. İkili ya da üçlü ayirt içinde peripherin (şekil 2A, B; kırmızı) ve β-tübülin (şekil 2A, B; yeşil) fark ifade doğruladı hem nöronal hücre gövdeleri ve periferik neurite Brüksel lahanası içinde. Hücre çekirdeği tespit edildi Höchst leke (şekil 2A; mavi) ile. Yukarıda belirtilen veri işaretleyicilerini ifade daha fazla %4 paraformaldehyde ve microtome (şekil 3A) kesit fiksasyonu sonra tüm DRG explant analiz. Bizim sonuçları peripherin ve β-tübülin seçerek ganglionic nöronlar iki altgrupları "küçük, hafif" ve β-tübülin nöronlar, "büyük, karanlık" altgrupları içinde sırasıyla ifade peripherin ile ifade edilir olduğunu doğruladı. Neurites immunolabeled ile duyusal neurons ortaya çıkan herhangi bir işaretleyicisinin çevre çıkmadan önce tüm sinir düğümü akan bulunmuştur. Höchst leke çoğunlukla gliyal uydu çekirdeği ganglion içindeki konumunu tespit edilmiştir. Nöron-uydu hücre etkileşim daha iyi şekil 3B' belirtildiği gibi tam hücre ayrılma tekniği sonra görüntülenmeyecektir. Mavi lekeli uydu hücre çekirdeği çevreleyen bir β tübülin pozitif duyusal nöronal soma ve onun geniş neurites görüldü.
Biz daha fazla HSV-1 enfeksiyonu araştırmaya DRG kaynaklı ayrışmış hücreleri kullanılmaktadır ve duyusal sinir hücreleri (şekil 4) içinde inflamatuar yanıt ilişkili. Sonrası enfeksiyon (özel dedektif) sadece 1 saat sonra anti-HSV-1 gD antikor gliyal hücreler (şekil 4A) ve DRG nöronlar (şekil 4B) hem de kullanarak HSV-1 giriş tespit edildi. HS virüs eki veya ana bilgisayar cep bağlama için bir yerleştirme siteleri sağlar beri Ayrıca, HS boyama daha fazla gerçekleştirilmiştir. HS çok fonksiyonlu hücre dışı Matriks (ECM) kritik bir bileşeni olarak bilinen ve hücre adezyon, hücre hücre sinyallemesi ve ECM remodeling yara iyileşmesi, embriyonik gelişim, kanser sırasında önemli bir rol oynamak için kapsamlı bir şekilde belgelenen işgal, fibrozis ve neuroinflammation35,36. İlginçtir, aksonlar büyüme (şekil 4 c) sağlar microenvironment potansiyel rolü düşündüren ECM HS boyama görülmektedir. Son olarak, β-tübülin boyama için biz neurites için olumlu bir işaret olarak nöronlar bütünlüğünü doğrulamak için kullanılır.
Resim 1 . Şematik gösterim deneysel DRG ve tek hücre kültür modelleri. DRG yetişkin NIH/İsviçre fareler, aşırı kapsüler bağ dokusu ve ex vivo explanted ya bir bütün explant olarak temizlenmeli veya birincil ortak kültürü duyusal sinir hücreleri ve uydu hücrelerin ayrışmış yalıtılmış. Her iki model de birden çok analitik tekniklerle daha fazla analizler için kullanılabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . DRG organotypic kültür gelişimi aksonal büyüme araştırmak için bir model sistem olarak. 6 gün ex vivo için yetiştirilen DRG aksonal explant çimlenme araştırmak için kullanılmıştır. Ayirt tarafından ne kadar farklı gösterdiğimiz biyokimyasal koşulları fiber lahanası dağıtımını etkileyebilir: rastgele büyüyen ve (A) dağınık bir daha doğrusal ve organize moda (B) göre. Explants anti-β-tübülin (yeşil) ve anti-peripherin (kırmızı) ile etiketlenmiştir. Hücre çekirdeği Höchst ile lekeli (mavi) leke. Ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . İzole nöronal kültür modeli moleküler karakterizasyonu. Bütün DRG bölümlerini immunolabeled peripherin ve β-tübülin iki işaretleri seçici ifade ganglionic nöronlar iki altgrupları gösterilen karşı antikorlar ile vardı. Peripherin (kırmızı) "küçük, hafif" nöronlarda ifade edilir ve β-tübülin (yeşil) "büyük, karanlık" nöronlarda ifade edilir. Höchst leke çoğunlukla gliyal uydu çekirdeği gangliyon (A) içinde konumunu tespit edilmiştir. Nöron-uydu hücre etkileşim daha iyi tam hücre ayrılma tekniği (B) sonra görüntülenmeyecektir. İşte bir β tübülin pozitif duyusal nöronal beden ve onun neurites uydu gliyal hücrelerle çevrili göstermektedir (Höchst: hücre çekirdeği, mavi). Ölçek çubukları, A = 100 µm; B 25 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . HSV-1 giriş modeli DRG kaynaklı incelenmesi ayrışmış hücreleri. β-tübülin pozitif neurites (yeşil) tasvir Disosiye uydu hücrelerin HSV-1 enfeksiyon Anti-yayılmacı bir gD antikor (kırmızı) kullanarak ortaya çıkıyor. Uydu gliyal hücreler çekirdek Höchst (A) ile mavi lekeli. Aynı antikor Disosiye DRG nöronlar (B) viral girdisinde ortaya koymaktadır. Hücre membran üzerinde ifade bir antikor heparan sülfat (HS, yeşil) karşı ile birlikte etiketli hücrelerdir. HS da hücre dışı Matriks (yeşil) bileşenidir ve aksonal büyüme (C) için önemli bir rol oynar. Höchst mavi uydu hücrenin çekirdeği tanımlamak için kullanıldığı gibi nöronlar ile peripherin (kırmızı) etiketlenir. Ölçek çubukları 25 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex vivo DRG modeli geniş bir spektrum nöron-glia etkileşim gibi olayların yanı sıra her iki nöronal ve gliyal metabolizma37microenvironment etkisini araştırmak son derece yararlıdır. Ayrıca, DRG modelinin maliyet-etkin bir araç olarak patojenik mekanizması ile ilgili olarak ve enfeksiyon veya belirli bir hastalık akut kronik ve gizli faz için ex vivo sistemleri geliştirerek imleyicileri ilişkili ilgili soruları gidermek kullanılabilir. Buna ek olarak, tarama kitaplığa DRG explants küçük moleküllerin ilaç geliştirme için bu explant model yararlanabilir. Vitro modelleri, özellikle tek hücreli sistemler, çoğu kez fizyolojik ilgili olaylarıyla çok basit; vivo modelleri için tam olarak zorlu iken, kısmen bağışıklık yanıtı yaralanma, gliyal skarlasma ve mali gider birlikte çevredeki ECM karmaşıklığı nedeniyle işlemek. Buna ek olarak, DRG explant tüm nöronal ve gliyal içinde önemli bir rol oynamaktadır ekstraselüler microenvironment de dahil olmak üzere bir nöron ağının karmaşıklığı ile tüm organ ex vivo transferini sağlayan bir organotypic kültürdür fonksiyonlar. Ancak, bir ex vivo model nesil sadece benzer ama tam olarak karşılık tüm koşulları içinde vivobulundu. Bu model kullanırken akılda tutulması gereken iki önemli kısıtlama zamanlama ve sadece gerçekten olabilir sistemik yorumlarından yokluğu içinde vivogösterilir. DRG hayati ex vivo korunabilir sınırlı bir zaman bu model soruşturma akut koşullar ve böylece Kronik koşulları için değil çok güvenilir bir model için daha uygundur. Benzer şekilde, ex vivo modeli yanıt-e doğru diğer organ ve sistemleri (örneğin, bağışıklık sistemi) yokluğunda tarafından etkilenen çalışmaları için ideal değildir.
Biz başarıyla explant ex vivo DRG yetişkin ve embriyo fareler ve sıçanlar yalıtmak ve HSV-1 enfeksiyonu yanı sıra birden çok diğer yönleri nöroplastisite ve çevirim tıp üzerindeki etkilerini araştırmak için bu modeli kullanmak başardık. Duyusal lifler explant dışında büyümeye izin vermek için kısmen kaldırıldı1bağ çevreleyen kapsülü idi.
Kabul, Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarcom isrich ECM proteinlerde laminin, kollajen IV, heparin sülfat Proteoglikanlar (HSPG) ve büyüme faktörleri38bir dizi gibi çıkarılan jelatinimsi protein karışımı. Bu iletişim kuralı, jelatinimsi protein karışımı kültür orta ile seyreltilmiş 1: 1'dir ve orta son hacim eklemeden önce 30-60 dk 37 ° C'de polimerize için izin. Jelatinimsi protein karışımı oda sıcaklığında polymerizes; Bu nedenle, bu karışımı explants kaplama ve 10-20 µL dağıtmak için soğuk pipet ipuçları kullanmak için 12-iyi yemekleri damla kadar soğutmak için önerilmektedir. Zamanlama kültür yordamı son verimlilik için önemlidir ve türü (ve üretim) jelatinimsi protein karışımı bağlı olarak kullanılan değişebilir. Jelatinimsi protein karışımı değil tamamen polimerli veya zaten katılaşmış, explant float veya başarısız büyüme için önde gelen dışarı kuru. Müfettişler ampirik olarak uygun sıcaklık, zaman ve jelatinimsi protein karışımı seyreltme başarılı bir model için belirlemek için teşvik ediyoruz. 7-10 gün için ex vivo tutulan DRG explants başarılı büyüme % 55-70 verimliliğini ulaştık. Explant daha fazla DRG kaynaklı birincil duyusal sinir hücreleri ve uydu hücreleri co kültürünü ayrışmış.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar açığa çıkmasına gerek yok.
Acknowledgments
Biz içtenlikle görüntüleme çekirdek-tesis Midwestern Üniversitesi (MWU) ve öğrencilerin [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo ve Casey Sigerson] grup hücre kültürü ve iş Imaging katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Bu araştırma çalışmaları MWU'ın Intramural grant V.T. M.F. ve araştırma başlangıç fonlar için finansman tarafından desteklenen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
References
- Muratori, L., et al. Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury. Neural Plast. , 860546 (2015).
- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin. J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).
- Devor, M., Govrin-Lippmann, R. Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).
- Farel, P. B., Boyer, A. Transient effects of nerve injury on estimates of sensory neuron number in juvenile bullfrog. J Comp Neurol. 410 (2), 171-177 (1999).
- Geuna, S., Borrione, P., Poncino, A., Giacobini-Robecchi, M. G. Morphological and morphometrical changes in dorsal root ganglion neurons innervating the regenerated lizard tail. Int J Dev Neurosci. 16 (2), 85-95 (1998).
- La Forte, R. A., Melville, S., Chung, K., Coggeshall, R. E. Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells. Somatosens Mot Res. 8 (1), 3-7 (1991).
- Pannese, E. Investigations on the Ultrastructural Changes of the Spinal Ganglion Neurons in the Course of Axon Regeneration and Cell Hypertrophy I. Changes during Axon Regeneration. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 60, 711-740 (1963).
- Popken, G. J., Farel, P. B. Sensory neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods. J Comp Neurol. 386 (1), 8-15 (1997).
- Tandrup, T. Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival. J Neurocytol. 33 (2), 173-192 (2004).
- Sarikcioglu, L., et al. Effect of severe crush injury on axonal regeneration: a functional and ultrastructural study. J Reconstr Microsurg. 23 (3), 143-149 (2007).
- Varejao, A. S., et al. Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J Neurotrauma. 21 (11), 1652-1670 (2004).
- Hanack, C., et al. GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals. Cell. 160 (4), 759-770 (2015).
- Pagadala, P., et al. Loss of NR1 subunit of NMDARs in primary sensory neurons leads to hyperexcitability and pain hypersensitivity: involvement of Ca(2+)-activated small conductance potassium channels. J Neurosci. 33 (33), 13425-13430 (2013).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Y., Lu, S. G., Gold, M. S. Persistent inflammation increases GABA-induced depolarization of rat cutaneous dorsal root ganglion neurons in vitro. Neuroscience. 220, 330-340 (2012).
- Amir, R., Devor, M. Functional cross-excitation between afferent A- and C-neurons in dorsal root ganglia. Neuroscience. 95 (1), 189-195 (2000).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 332-343 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Miller, C., Shanks, H., Witt, A., Rutkowski, G., Mallapragada, S. Oriented Schwann cell growth on micropatterned biodegradable polymer substrates. Biomaterials. 22 (11), 1263-1269 (2001).
- Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: II. Multiple grooved substrata. Development. 108 (4), 635-644 (1990).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis. J Virol. 84 (3), 1504-1512 (2010).
- Holland, D. J., Miranda-Saksena, M., Boadle, R. A., Armati, P., Cunningham, A. L. Anterograde transport of herpes simplex virus proteins in axons of peripheral human fetal neurons: an immunoelectron microscopy study. J Virol. 73 (10), 8503-8511 (1999).
- Sharthiya, H., Seng, C., Van Kuppevelt, T. H., Tiwari, V., Fornaro, M. HSV-1 interaction to 3-O-sulfated heparan sulfate in mouse-derived DRG explant and profiles of inflammatory markers during virus infection. J Neurovirol. 23 (3), 483-491 (2017).
- Zerboni, L., et al. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Koyuncu, O. O., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Virus infections in the nervous system. Cell Host Microbe. 13 (4), 379-393 (2013).
- Swanson, P. A. 2nd, McGavern, D. B. Viral diseases of the central nervous system. Curr Opin Virol. 11, 44-54 (2015).
- Tyler, K. L. Emerging viral infections of the central nervous system: part 2. Arch Neurol. 66 (9), 1065-1074 (2009).
- Preston, C., Efstathiou, S., et al. Ch 33. Human Herpesviruses Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Campadelli-Fiume, G., Arvin, A., Mocarski, E., et al. , Cambridge University Press. (2007).
- Roizman, B., Whitley, R. J. An inquiry into the molecular basis of HSV latency and reactivation. Annu Rev Microbiol. 67, 355-374 (2013).
- Arvin, A., et al. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Fueshko, S., Wray, S. LHRH cells migrate on peripherin fibers in embryonic olfactory explant cultures: an in vitro model for neurophilic neuronal migration. Dev Biol. 166 (1), 331-348 (1994).
- Parish, C. R. The role of heparan sulphate in inflammation. Nat Rev Immunol. 6 (9), 633-643 (2006).
- Zhang, X., Wang, B., Li, J. P. Implications of heparan sulfate and heparanase in neuroinflammation. Matrix Biol. 35, 174-181 (2014).
- Du, X., et al. Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission. J Clin Invest. 127 (5), 1741-1756 (2017).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
