Summary
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتحديد الخلايا العصبية الحركية فرنك في الفئران بعد التسليم المؤدية من fluorophore مترافق الكوليرا السمية الوحيدات بيتا. تتم مقارنة اثنين من التقنيات لحقن التجويف الجنبي: ترانسديافراجماتيك مقابل النهج عبر الصدر.
Abstract
فرينيك الخلايا العصبية الحركية هي سرطان عنق الرحم من الخلايا العصبية الحركية مصدرها C3 إلى مستويات C6 في معظم الثدييات. إسقاطات محواري تتلاقى في الأعصاب فرينيك إينيرفاتينج الغشاء الرئوي. في الحبل الشوكي الشرائح، لا يمكن تحديد الخلايا العصبية الحركية فرنك من سائر الخلايا العصبية الحركية في المعايير المورفولوجية أو البيوكيميائية. نحن نقدم وصفاً للإجراءات لتصور فرينيك العصبون خلية الهيئات في الفئران، التالية المؤدية حقن الكوليرا السمية الوحيدات بيتا (الحظر) مترافق فلوروفوري. هذا التتبع نيورواناتوميكال نيون لديه القدرة على أن المحاصرين في الوصلات العصبية العضلية الحجاب الحاجز، ويتم ريتروجراديلي على طول محاور عصبية فرنك والتوصل إلى الهيئات الخلية فرنك. المقارنة بين هذين النهجين المنهجية المؤدية التسليم الحظر الشامل للتجارب: ترانسديافراجماتيك مقابل حقن عبر الصدر. كلا النهجين بالنجاح وتسفر عن عدد مماثل من الحظر الشامل للتجارب المسماة الخلايا العصبية الحركية فرنك. وفي الختام، يمكن تطبيق هذه التقنيات تصور أو تحديد حجم الخلايا العصبية الحركية في مختلف الدراسات التجريبية مثل تلك التي تركز على الدوائر حجاب فرنك فرنك.
Introduction
الهدف من هذه الدراسة تقديم طريقة موثوقة لتحديد فرنك من الخلايا العصبية الحركية (فمن) في أقسام النخاع الشوكي الماوس. حقن التتبع نيورواناتوميكال الفلورية في التجويف الجنبي اختير كأسلوب التسليم للتوصل إلى الإسقاطات العضلية فرينيك على الحجاب الحاجز واستخدام وسائل النقل إلى الوراء على طول محاور عصبية فرينيك لتسمية فرينيك خلية الهيئات. يتم وصف الأساليب اثنين من التسليم المؤدية: ترانسديافراجماتيك مقابل عبر الصدر.
الخلايا العصبية الحركية فرنك هي خلايا العمود الفقري ترحيل محاور عصبية التي تتلاقى في الأعصاب فرنك، الذي يعصب الحجاب الحاجز في نهاية المطاف. هذه هي أقل من الخلايا العصبية الحركية تلقي محرك الأقراص الشهيقيه من المراكز التنفسية الصلبية وترحيل فإن الوصلات العصبية العضلية الحجاب الحاجز (NMJ). صممت بحيث فمن إلى عمودين موتور، واحد لكل هيميكورد، يعمل على طول العمود الفقري منتصف عنق الرحم. في معظم أنواع الثدييات بما فيها البشر، انتشار الأعمدة موتور فرنك من مستويات C3 إلى C61،،من23. وأكد نحن والآخرين أن فمن تتركز في مستويات C3 C5 في الفئران والفأر الحبل الشوكي4،5،6،،من78. توزيع الخلايا فرينيك الطبوغرافية ليست بشكل عشوائي؛ يتم توزيع الخلايا العصبية الحركية إينيرفاتينج الجزء القصية من الحجاب الحاجز أكثر كثافة في الجزء الجمجمة تجمع السيارات فرينيك (C3)، في حين الخلايا العصبية الحركية إينيرفاتينج الجزء المغبنية والذيلية أكثر (C5)9. وعلاوة على ذلك، تتجمع فمن طرق مختلفة في القرن البطني الرمادية. مستوى C3، تكمن مجموعات الخلايا فرينيك أفقياً، ثم التحول في اتجاه فينترولاتيرال، وتم العثور على فينتروميديالي في معظم والذيلية مستويات10،11.
نظراً لدورها الحيوي خلال الإلهام، أهمية قصوى دقة تحديد فمن في الحبل الشوكي سليمة ولكن أيضا متابعة مصيرهم خلال الحالات المرضية، مثل الأمراض التنكسية أو الإصابات الرضية للحبل الشوكي. منذ فمن ولا تختلف شكلياً عن سائر الخلايا العصبية الحركية عنق الرحم، تحديد فمن يعتمد على التنفيذ الهادف لتتبع نيورواناتوميكال أما على مستوى مراكز التنفس الأولية8، أو الحجاب الحاجز NMJ7 أو في العصب فرنك4. التتبع هو تناول الألياف العصبية والتي تصل إلى الهيئات فرينيك بخلية في العمود الفقري العنقي، حيث أنه يمكن تصور استخدام نظم الكشف المباشر أو غير المباشر. الوراء أو تتبع anterograde متوفرة تجارياً مع طائفة واسعة من يصرف. الجدير بالذكر، هبت كل التتبع مع لا، قدرات عالية أو منخفضة للتتبع عبر متشابك.
في الدراسة الحالية، واخترنا الوحيدات بيتا من سموم الكوليرا (الحظر) فونكتيوناليزيد مع أليكسا فلور 555 (يشار إليها من الآن فصاعدا الحظر الشامل للتجارب-fluorophore) كتسمية فلورسنت، مما يتيح تصور مباشرة من فمن على أقسام النخاع الشوكي المجمدة. الحظر الشامل للتجارب يوصف عادة تتبع مونوسينابتيك على الرغم من أن البيانات التجريبية وتميل إلى إظهار مرور ترانسنيورونال12. الحظر الشامل للتجارب لديه القدرة على ربط جانجليوسيدي GM1 في غشاء البلازما لإنهاء العصب. الحظر الشامل للتجارب متغللة عبر الآليات ويهرب من خلال شبكة ترانس-غولجي تعتمد على كلاثرين أو-مستقلة في هيولى في13،أزياء الوراء14. الاستيعاب والنقل إلى الوراء يبدو أن تعتمد على ال15،سيتوسكيليتون أكتين16 فضلا عن شبكة ميكروتوبولي17.
وتم تسليم fluorophore الحظر الشامل للتجارب لإثبات جدوى الحظر الشامل للتجارب الراسم نيورواناتوميكال إلى الوراء وسم الدوائر الحجاب الحاجز-فمن، إينترابليورالي. الحظر الشامل للتجارب كانت تدار باستخدام تقنيات اثنين: الأول المدرجة فتح البطن وحقن ترانسديافراجماتيك متعددة؛ ثانية واحدة، أقل الغازية، تستخدم حقن عبر الصدر فريدة من نوعها. أربعة أيام تم قياس كمية فمنس في وقت لاحق، المسمى فلوريسسينتلي في الحبل الشوكي عنق الرحم من كلا من سليم ومن جرح سبينالي الحيوانات (C4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
البروتوكول التجريبي أجرى امتثالا "توجيهات مجلس الجماعات الأوروبية" "التجربة الحيوانية" (2010/63/الاتحاد الأوروبي، 86/609/EEC و 87-848/EEC) وأقر "الحيوان الأخلاقيات اللجنة للجامعة من نامور" (أخلاقيات المشروع n ° 17-284 ). ويصور الشكل 1 النهجين كل منهما: ترانسديافراجماتيك أو حقن عبر الصدر. استخدام C57bl/6J الفئران الذكور (ن = 18)، والذين تتراوح أعمارهم بين 3 إلى 4 أشهر في الدراسة.
1-إعداد الحل الحظر الشامل للتجارب
- للحقن ترانسديافراجماتيك:
- حل قوة الحظر الشامل للتجارب في الماء المعقم بتركيز 0.2% (w/v).
- تحميل ميليلتر 7.5 حل الحظر الشامل للتجارب (0.2% w/v) في معقم 10-ميليلتر-ميكروسيرينجي مع إبرة 33-قياس مرفقة (مجسم مشطوف الحواف حادة أو قصيرة) لكل الماوس.
- لحقن عبر الصدر:
- حل قوة الحظر الشامل للتجارب في الماء المعقم لتركيز 0.1% (w/v).
- تحميل 20 ميليلتر من حل الحظر الشامل للتجارب (0.1% w/v) في حقنه الأنسولين-500-ميليلتر عقيمة بإبرة 27-قياس مشطوف الحواف لكل الماوس.
ملاحظة: تأكد من استخدام الماء المقطر والمعقم ويحل المسحوق الحظر الشامل للتجارب بشكل صحيح. يمكن أن تظل الحل عند 4 درجة مئوية لمدة شهر (عدم تجميد). قد تشكل متسرعا بعد أيام قليلة. تحقيق الحل لدرجة حرارة الغرفة وتخلط جيدا باستخدام ماصة قبل الاستخدام.
2-إعداد قبل الحقن المؤدية
- تعقيم الأدوات الجراحية قبل الجراحة، استخدام معقم اﻷوتوكﻻف أو حبة الزجاج. إعداد معطف مقاعد البدلاء نظيفة للقيام بعملية جراحية، والتصرف في الأدوات الجراحية.
ملاحظة: يجب أن يكون أي المواد المستخدمة أثناء العملية الجراحية العقيمة. الصكوك التي لا يمكن تعقيمها مثل ميكروسيرينجي يجب أن تزول إلى أسفل مع مطهر (الكلورهكسيدين) أو ينبغي أن تستخدم مرة واحدة فقط. الجراح يجب غسل الأيدي حقه بمطهر (فرك الكلورهكسيدين) قبل بداية عملية جراحية. الجراح يجب ارتداء قفازات معقمة وفاسيماسك ثوب نظيف. - وزن الحيوان، وإدارة جرعة مناسبة من التخدير: حقن داخل مخدر كوكتيل (مثل الكيتامين 100 مغ/كغ وإكسيلازيني 5 مغ/كغ).
- قرصه إصبع القدم و/أو التحقق من فقدان المنعكس بالبيبرال تحديد ما إذا كان يتم تخديره الماوس بشكل صحيح. تطبيق مرهم التعليم والتدريب المهني لحماية القرنية.
- يحلق بعناية الجلد البطني (لإجراء ترانسديافراجماتيك) أو حق من جانب الصدر الجلد (للإجراء عبر الصدر)، باستخدام مقص الشعر الكهربائية. يحلق جيدا وواسع ما يكفي للحيلولة دون الدخول في ميدان جراحة الشعر.
- ضمان ظروف معقمة بتطبيق موضعي للحل اليود 10% في منطقة حلق. فرك الموقع الجراحي مع الحل اليود، مع الحرص على فرك من مركز الموقع تجاه المحيط الخارجي.
- استخدام لوحة هوميوثيرميك طوال عملية جراحية للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان.
3-المؤدية الحقن باستخدام نهج ترانسديافراجماتيك
- تقع أسفل الماوس أنيسثيتيزيد في موقف ضعيف على وسادة تدفئة. ضع وسادة شاش تدحرجت تحت رقبة الحيوان. لماوس الكبار، استخدام وسادة شاش تدحرجت من 0.5 بوصة في السمك. الشريط هذه اللوحة إلى المجلس عملية جراحية لتجنب حركة إذا أي.
- استخدام شفرة المبضع، جداً الجلد البطني على طول خط الوسط: جعل شق من عملية الرهابه إلى منطقة السرة بينما تمتد الجلد جانبياً باليد الأخرى لجعل الجلد مشدود. لا يتم تطبيق الكثير من الضغط على شفرة لتجنب إتلاف الأجهزة الأساسية.
- بعناية باستخدام مقص صغير، فصل الجلد من عضلات البطن حول الشق. وسيساعد هذا الإجراء في خياطة العضلات والجلد عن بعضها البعض في نهاية الجراحة.
- القيام بفتح البطن باستخدام مقص صغير. فتح التجويف البطني عن طريق إجراء شق بوتونهولي على مستوى السرة. جداً في عضلات البطن على طول الخط الأبيض ("لينيا ألبا") تصل إلى عملية الرهابه.
- من أجل تصور سطح البطن من الحجاب الحاجز، سحب عضلات البطن باستخدام الكامشات تجارية أو محلية الصنع.
ملاحظة: يمكن إجراء هذه الكامشات من ميدي-حجم الورق مقاطع تتشكل في هوك ل19. - تمتد على كلا الجانبين لفتح البطن، والشريط إلى أسفل الكامشات إلى معطف مقاعد البدلاء. تحسين الإضاءة من مجال الرؤية حتى لا يكون لا أكثر في غبش السطح البطني للحجاب الحاجز. جهاز إضاءة أقوى لهذا الغرض مصباح LED مع شعاع ضوء أورينتابل.
- استخدام الملقط لينة في يد واحدة، رفع الملحق إكسيفويد وهدم الفصوص الجانبية للكبد (الشكل 2A). باستخدام مقص صغير في اليد الأخرى، بعناية قطع في الرباط سوسبينسوري، دون إلحاق الضرر بالمرارة أو الحجاب الحاجز (الشكل 2).
- استخدام الملقط لينة في يد واحدة، رفع الملحق إكسيفويد. فهم المحاقن هاملتون في اليد الأخرى. استهداف المواقع الثلاثة للحقن في هيميديافراجم الصحيح تغطي على التوالي القصية، الآنسي والمناطق المغبنية (الشكل 3 ألف، اقحم في الشكل 3).
- كما سمك الغشاء حوالي 0.37 ملم في الفئران7، إدراج مم إبرة لا يزيد عن 1 أو 2 بعد ورقة الحجاب الحاجز لمنع الأضرار الرئة أثناء التنفس. تسليم 2.5 ميليلتر من الحظر الشامل للتجارب الحل (0.2% w/v) عن طريق الحجاب الحاجز الحق في كل موقع (الشكل 4 باء). تحقيق الاستقرار للحجاب الحاجز غير مطلوب.
- كرر هذا الإجراء لثلاثة مواقع عن الحقن (الشكل 1A)، وكونترالاتيرالي لتسمية ثنائية تجمع فمن.
- لإغلاق الموقع فتح البطن، خياطة عضلات البطن مع ريسوربابل خياطة 4-0. استخدام غرز توقف متباعدة من 3 مم-الجلد تدبيس مغلقة مع مقاطع 9.0 ملم الجرح. تشديد المواد الغذائية الأساسية للحيلولة دون سحب قبالة المواد الغذائية الحيوانية. مساحة الدبابيس بعيداً حوالي 5 ملم. عدم المبالغة في تشديد المقاطع الجرح، وهذا يمكن أن يؤدي إلى شفاء البصر.
- المحاقن النظيفة الصغيرة مع الماء المقطر للحيلولة دون انسداد. رسم ببطء وطرد 2-3 مرات. لا رسم الهواء في محقن.
4-المؤدية الحقن باستخدام "النهج عبر الصدر"
ملاحظة: هذا الأسلوب هو مستوحاة من الإجراء الموضح في الفئران4 وتم تكييفها للماوس.
- تقع أسفل الماوس أنيسثيتيزيد في اليسار موقف استلقاء الأفقي، على وسادة تدفئة (الشكل 4 أ).
- تحديد الأضلاع السادسة والسابعة تحت منطقة الكوع بالجس اليدوي (الشكل 4 باء).
- بينما مساعد يمتد حق الصدارة-وهند-أطرافه (الشكل 5A)، إدراج المحاقن cranially الموجه وعرضية تحت السادسة أو الضلع السابع، 3 مم العميقة من الجلد، ومع المجسم مشطوف الحواف إلى الأسفل (الشكل 1B و الشكل 5 (ب)).
- رفع الإبرة برفق لتأكيد، من خلال رفع الأضلاع، أن ذلك هو في وضع جيد في تجويف الصدر (الشكل 5، insets في الشكل 1B).
- استقرار التنفس حركات الصدر عن طريق تطبيق ضغط طفيف مع اثنين من أصابعه على جدار الصدر.
- أثناء الضغط حقنه في ناحية أخرى، تسليم 20 ميليلتر من حل الحظر الشامل للتجارب (0.1% w/v) في حقنه واحدة.
5-بعد العمليات الجراحية الرعاية
- مباشرة بعد هذا الإجراء، وضع الماوس في وضع استلقاء جانبية الحق على منصة هوميوثيرميك لاسترداد. وهذا يكفل التتبع تنتشر على الجانب الأيمن من التجويف الجنبي ويسمح بمراقبة التنفس للحيوان.
- إدارة 1 مل من المحلول الملحي العقيمة القائمة تحت الجلد. توفير الحقن المتابعة إذا ظهر الحيوان المجففة و/أو فاتر.
- إدارة 0.1 مغ/كغ البوبرينورفين، تحت الجلد مرتين في يوم خلال يومين بعد الجراحة الأولى، التقليل إلى أدنى حد من أي ألم المحتملة.
ملاحظة: العديد من المؤسسات أن أوصى التسكين المتعدد الوسائط من أجل إجراءات الغازية، مثل فتح البطن يصور هنا. ويمكن أن يشمل استخدام أدوية المضادة للالتهابات غير الستيرويدية (الأدوية المضادة للالتهاب) و/أو عامل مخدر موضعي في موقع شق. عادة ما يتم تسليم هذه الأدوية قبل الشق الأول للتقليل من الألم التصفية. - مراقبة الحيوانات يوميا يصل إلى القتل الرحيم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C57bl/6J الفئران الذكور (ن = 18)، سن من 3 إلى 4 أشهر وأدرجت في الدراسة. في اليوم 0 من التجربة، خضع 8 الفئران كدمة C4 انفرادية، من جانب الحق، وفقا لبروتوكول نشر7،18. كإجراءات صورية، خضع الفئران 10 الصفيحة على رأس الخلية C4 دون كدمة. في اليوم الثالث، أعدت الفئران لحقن المؤدية للحظر الشامل للتجارب-fluorophore طبقاً لإجراءات مختلفة اثنين المذكورة أعلاه. في يوم 7، قد euthanized جميع الفئران بعد التخدير (الكيتامين 100 مغ/كغ وإكسيلازيني 5 مغ/كغ) واكسسانجوينيشن.
كانت تحصد كله الشوكي الحبال، ثابتة في بارافورمالدهيد وكريوبروتيكتيد في السكروز 30% وفقا لإجراءات المختبر القياسية. توسيع عنق الرحم كانت معزولة، جزءا لا يتجزأ في O.C.T. وكريوسيكتيونيد طوليا أو مستعرضة في سماكة 30 ميكرون.
أقسام العمود الفقري الطولي لوحظت مع مجهر ابيفلوريسسينت مجهزة بتصفية المكعب لتحليل الفلورية (الإثارة: 560/20nm؛ الانبعاثات: 635/30nm). وحددت الفلورسنت الخلايا العصبية الحركية في القرن البطني كعمود خطي للخلايا من C3 إلى مستويات C5 (الشكل 6A، اللوحة العلوية). كانت موجودة في الرمادية عن كافة الخلايا المسماة ومعارضها مورفولوجيا متسقة مع الخلايا العصبية الحركية (الشكل 6B). الحيوانات المصابين، لوحظ فقدان فمن المسمى ملفتة للنظر على مستوى C4، جنبا إلى جنب مع توقف أنسجة العمود الفقري (العلامة النجمية في الشكل 6 ألف و 6 ج). الحظر الشامل للتجارب+ فمنس أحصى يدوياً كل قسم عرضية الخامس (متباعدة من 150 ميكرومتر) في الحبال الشوكي يصب وأصيب C4 (الشكل 6). وحسب تقدير العدد الإجمالي للمسمى فمنس بضرب عدد الأصوات التي تم فرزها الحظر الشامل للتجارب+ الخلايا 5. في الفئران صحية يصب، قدرت العدد الإجمالي للمسمى فمنس كل هيميكورد 151 ± 9 عند استخدام نهج ترانسديافراجماتيك (تديا)، بالمقارنة إلى 178 ± 9 عند استخدام نهج (تو) عبر الصدر (الشكل 6). وعقب إصابة C4، انخفضت هذه الأرقام على التوالي إلى 59 ± 14 و 70 ± 10. في هذه الدراسة، اتضحت أي فروق إحصائية بين طريقتين لإيصال المؤدية (p > 0.05، اختبار مان-ويتني U؛ تديا مقابل تتهو).
رقم 1. حقن المؤدية باستخدام ترانسديافراجماتيك أو حقن عبر الصدر. ويشمل النهج ترانسديافراجماتيك فتح البطن، والتعرض لسطح البطن من الحجاب الحاجز (باللون الوردي) وثلاث حقن في المناطق القصية والانسي والمغبنيه A. للنهج عبر الصدر، هو وضع الماوس في وضع استلقاء الجانبي الأيسر. الضلع السادس والسابع حددها الجس اليدوي بضمن منطقة الكوع. يتم إدخال الإبرة من خلال الجلد والنسيج تحت الجلد, عضلات الصدر, عضلات ربية والجنب الجدارية للوصول إلى التجويف الجنبي (استريكس). S، القصية؛ m، الآنسي؛ ج، المغبنية؛ S/SC والجلد والنسيج تحت الجلد؛ الخرائط المواضيعية، عضلات الصدر؛ IC، عضلات ربية؛ pp؛ غشاء الجنب الجدارية؛ L، والرئة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. ميدان العمليات الجراحية مع طريقة عرض في الكبد والمرارة والوجه البطن والحجاب الحاجز. ألف ملاحظة في الرباط suspensory بين المرارة والحجاب الحاجز. ب قطع في الرباط بعناية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. عرض على الحجاب الحاجز- يتم تعريف القصية (s) والانسي (m) المغبنية (ج) في هيميديافراجم الصحيح. ألف ملاحظة أن المنطقة المغبنية الخلفي فصوص الكبد. باء لحقن الحظر الشامل للتجارب في الفضاء الجنبي، إدراج إبرة 1 مم العميقة من خلال نصفي الحق-الحجاب الحاجز. الحقن في منطقة وسطى هو المصور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. النهج عبر الصدر. يتم وضع الماوس في استلقاء الجانبي الأيسر A. تحديد الهامش الساحلي من منطقة الكوع والحجاب الحاجز. ب. يتم تحديد المسافات ربية السادسة والسابعة العميق لمنطقة الكوع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5. وتحدد المسافات ربية السادسة والسابعة العميقة لمنطقة الكوع. أ-يتم تمديد أطرافه الصدارة وهند. ب. cranially الموجهة المحاقن وعرضية إدراجها تحت السادسة أو الضلع السابع، 3 مم العميقة من خلال العضلات ربية، مع ميل رأسا. ج-الإبرة برفق مرتفعة وهي رفع الأضلاع لتأكيد الإبرة في وضع جيد في تجويف الصدر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6. الحظر الشامل للتجارب+ الخلايا في القرن البطني الرمادية من الفئران حقن إينترابليورالي. ألف في الماوس يصب سبينالي، توزيع الخلايا العصبية الحركية فرنك الحظر الشامل للتجارب+ على طول الحبل الشوكي عنق الرحم من مستوى C3 إلى C5. في الماوس كونتوسيد، لوحظ تعطل الأنسجة من جانب واحد مع فقدان للحظر الشامل للتجارب+ الخلايا العصبية الحركية فرنك على مستوى C4 (استريكس). ) ب ( الخلايا "المسماة الحظر"+ كانت موجودة في الرمادية عن ومعارضها مورفولوجيا متسقة مع الخلايا العصبية الحركية. جيم مقاطع عرضية من الحبال الشوكي واستخدمت لتحديد عدد الخلايا الحظر الشامل للتجارب+ على مسافات معينة على طول الحبل الشوكي في يصب (يسار) والفئران (يمين) المصابين. د "القياس الكمي للحظر الشامل للتجارب"+ الخلايا الموجودة في هيميكورد عن الفئران يصب أو المصابين، وفقا ترانسديافراجماتيك (تديا) أو عبر الصدر (تتهو) نهج التسليم المؤدية الحظر الشامل للتجارب. أشرطة تمثل 250 البيانات ميكرومتر. أبديت ما يعني ± الخطأ المعياري للوسط (SEM). n = 5-7 الفئران في كل مجموعة تديا؛ n = 3 الفئران في كل مجموعة تو. عدم باراميتريكال يو مان-ويتني اختبارات أجريت، واعتبرت نتائج مختلفة شكل ملحوظ ف < 0.05. ف < 0.001 ليصب مقابل الضرر C4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن تطبيق البروتوكول المبينة في هذا التقرير إلى أي سلالة من الفئران الكبار أو أي النموذج التجريبي الذي ينبغي تقييم سلامة الدوائر فمن الحجاب الحاجز. على سبيل المثال، التصلب العضلي الجانبي (المرض)، وإصابات النخاع الشوكي عنق الرحم (كسسي) هي الشروط المرتبطة بفقدان فمن، انحطاط anterograde فرنك محاور عصبية والرعشات اللاحقة. تحاكي نماذج حيوانية للمرض أو كسسي العجز التنفسي التشريحية المرضية والوظيفية الملاحظة في الأمراض التي تصيب الإنسان. في هذه النماذج، وكثيراً ما تطبق تقنيات نسيجية لتقييم فمن البقاء على قيد الحياة بعد مختلف التدخلات العلاجية التي تهدف إلى فمن نيوروبروتيكشن18،،من2021. أي مشكلة في الإقبال على الحجاب الحاجز NMJ أو النقل محواري سيقلل بلا شك مقدار الحظر الشامل للتجارب المتراكمة في الهيئات الخلايا العصبية. ومن الواضح أن ستنخفض الخسارة من محاور عصبية فرنك أو الانحطاط فمن مبلغ ريتروترانسبورتيد الحظر الشامل للتجارب في الحبل الشوكي.
كل نهج الإدارة المؤدية لها الإيجابيات ومساوئها ترانسديافراجماتيك الحقن الغازية تماما، مما استلزم فتح البطن وخياطة حذراً من جميع طبقات الجلد لمنع ديهيسسينسي وبروز الجهاز. فتح البطن يتداخل مع التنفس الطبيعي22 وواحدة لا يستبعد أنه قد يؤثر على كفاءة النشاط أو الرجعية-النقل فمن. ومع ذلك، يضمن التصور مباشرة من الحجاب الحاجز أثناء الحقن نجاح استهداف الحيز الجنبي طوال الوقت. الحقن عبر الصدر الغازية الحد الأدنى مقارنة بحقن ترانسديافراجماتيك ويمكن وبالتالي يمكن اعتبارها إجراء للصقل، في هذا السياق مفهوم "الاعادات الثلاثة". عيب واحد هو زيادة احتمالات يجري خارج الهدف لخبرة مستخدم (على سبيل المثال في النسيج تحت الجلد أو في جدار الصدر).
بعد الإدارة المؤدية فلوري-الحظر الشامل للتجارب، فمن المحتمل أن يكون المسمى العصبون أي إسقاط على بطانة التجويف الجنبي العضلات، بما في ذلك فمن، والخلايا العصبية الحركية ربية أو فئات سكانية مختلفة من الخلايا العصبية الحركية في الدماغ. في الجرذان الكبار، أظهرت مانتيلا et al. أن الخلايا العصبية الحركية ربية كانت المسمى أيضا في القرن الأفريقي البطني الحبل الشوكي الصدري، فضلا عن بعض الخلايا العصبية العقدة الجذرية الظهرية4. ونحن لم راجعت وجود خلايا المسمى الحظر الشامل للتجارب في مواقع أخرى من الحبل الشوكي عنق الرحم في الفئران.
اعتماداً الإعدادات/نماذج تجريبية، نتائج التدابير يمكن أن تشمل ترتيب فمنس عمودي على طول الحبل الشوكي عنق الرحم، تحليل مفصل لبيانات هندسية حول موقف كل فمن أو، كما هو موضح هنا، التحديد الكمي فمن عدد. تقييم دقيقة من مجموع فمن يعتمد على اعتبارات تقنية وموثوقية مقيم بين الوكالات؛ بسبب تباين كثافة fluorescence الحظر الشامل للتجارب، وحجم سوما العصبية أو تلوين الخلفية. في تجربتنا استخدام الحقن ترانسديافراجماتيك للحظر الشامل للتجارب--فلوروفوري، نحن يقدر عدد فمن كل هيميكورد الماوس في نطاق بين 120 و 180 الخلايا، عددا من أقل قليلاً من بيانات من مجموعات أخرى8. وفي الواقع، هناك قيود اثنين من الدراسة. أولاً، يتم حقن عدد محدود من الحيوانات باستخدام النهج عبر الصدر وثانيا هناك عدم يقين على العلامات الكاملة لتجمع فمن. تراجع العصب فرنك (بعد ترانسيكشن العصب) أو الحقن إينترانيورال مع الراسم نيورواناتوميكال نيون هي التقنيات التكميلية التي يمكن استخدامها لتسمية أكثر دقة جميع فمنس. للدراسات المستقبلية، من المستحسن لعد فمنس بأساليب غير متحيز مثل ستيريولوجي.
في تجربتنا، وقد لاحظنا ابدأ أي العجز الواضح في الجهاز التنفسي أو مضاعفات (الضائقة التنفسية) مثل النزيف أو استرواح الصدر اتباع هذا الإجراء. ومع ذلك، إذا كان الحجاب الحاجز قد أصيبت بأضرار أثناء الحقن ترانسديافراجماتيك، النظر في استخدام إبرة قطرها أصغر أو مجسم مشطوف الحواف أكثر وضوحاً.
لتجنب وفاة الحيوان أثناء أو بعد الجراحة فحص دقيق لتركيزات كل مكون في مخدر كوكتيل. تجنب الوقوع في الإصابات على السطوح في الكبد، والأمعاء، والمرارة أو الحجاب الحاجز.
لا أو وضع العلامات منخفضة من فمن يمكن أن يكون سبب العديد من القضايا. إذا كان الحقن عبر الصدر يفتقد التجويف الجنبي، القيام بإعادة والتحقق بالجس اليدوي أن يتم إدخال الإبرة تحت الأضلاع أو لا البوب خارجاً من خلال الجلد. وينبغي أن تشكل لا فقاعات عند حقن الحل الحظر الشامل للتجارب. تذكر أيضا أن الاستيعاب الداخلي للحظر الشامل للتجارب في الخلية العصبي هو تعتمد على درجة الحموضة23: الرقم الهيدروجيني الحمضية ومحايدة الأمثل بينما pH الأساسية يعوق امتصاص السم. من المستحسن أن ريسوسبيند مسحوق الحظر الشامل للتجارب في المياه المالحة أو في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني. النظر في وقت استمرار السم المسمى في جسم الخلية العصبية. في تجربتنا، نحن يمكن أن الكشف عن الخلايا المسماة الحظر الشامل للتجارب في إطار زمني بين أربعة أيام وأسبوعين بعد الولادة المؤدية. خفض الوقت المخصص للوراء النقل أو زيادة الفترة الزمنية بين التسليم المؤدية والتضحية قد خرق الأمثل كشف فلوري-الحظر في الأنسجة.
لتجنب استخدام fluorescence يتلاشى الأسلوب الصحيح مثبت. ونحن نقترح بيرفوسينج جسم الحيوان مع المخزن 4% بارافورمالدهيد. حالما يتم حصاد الحبل الشوكي، احتضان في مثبت نفسه بين عشية وضحاها. كريوبروتيكت الحبل السري في محلول السكروز 30% لمدة 72 ساعة حتى الغرق، قم بتضمين توسيع عنق الرحم (حوالي 8 مم) في المتوسط O.C.T.. لا يذوي أو تضمين العينة في البارافين. حماية العينات العمود الفقري أو أقسام الأنسجة من الضوء أثناء تجهيز كامل. يمكن أن تظل ثابتة الحبال الشوكي كله عند 4 درجة مئوية لمدة أشهر إذا تم إضافة thimerosal في حل كريوبروتيكتانت (لا تقم بإضافة أزيد الصوديوم كما أنه سيثير يتلاشى الأسفار). يمكن الاحتفاظ بأقسام الأنسجة في-20 درجة مئوية لمدة أشهر بعيداً عن الضوء. وأخيراً، فإننا ننصح لتحميل الشرائح مع كاشف يتلاشى المضادة. إذا قد تﻻشى الأسفار، لا يزال من الممكن الكشف عن الحظر الشامل للتجارب باستخدام إيمونوهيستوتشيميستري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن ممتنون لروبرت جرفين وبولين دانة لتقديم الدعم التقني لهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
References
- Webber, C. L. Jr, Wurster, R. D., Chung, J. M. Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping. Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).
- Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study. J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).
- Gordon, D. C., Richmond, F. J. Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques. J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).
- Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. The phrenic motor nucleus in the adult mouse. Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles. J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).
- Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study. J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).
- Gottschall, J. The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons. Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).
- Lai, B. Q., et al. Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve. PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).
- Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms. J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).
- Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).
- Fujinaga, Y., et al. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).
- Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton. Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).
- Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Llado, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).
- Sieck, G. C., Fournier, M. Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors. J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).
- Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action. Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).
