Summary
Здесь мы описываем протокол для выявления диафрагмальный двигательных нейронов в мышей после доставки внутриплевральной Флюорофор конъюгированных бета Субблок токсинов холеры. Придать плевральной полости сравниваются две техники: transdiaphragmatic против Трансторакальная подходов.
Abstract
Диафрагмальный моторные нейроны являются шейки матки двигательных нейронов, возникая от C3, C6 уровни в наиболее млекопитающих. Аксональное прогнозы сходятся в диафрагмального нервов, иннервирующих дыхательной диафрагмы. В спинном ломтиками диафрагмальный моторные нейроны нельзя определить от других двигательных нейронов на морфологические и биохимические критерии. Мы предоставляем описание процедур для визуализации диафрагмальный мотонейрона клеток органов мышей, следующей инъекции внутриплевральной холеры бета Субблок токсин (СТВ) проспряганное Флюорофор. Этот флуоресцентные нейроанатомический трассирующими имеет возможность догнал на стыке нервно диафрагмы, перевозиться retrogradely вдоль диафрагмальный аксонов и достичь диафрагмальный клеток тела. Сравниваются два методологических подходов внутриплевральной CTB доставки: transdiaphragmatic против Трансторакальная инъекции. Оба подхода являются успешными и привести к аналогичное количество CTB-меченых диафрагмальный двигательных нейронов. В заключение эти методы могут применяться для визуализации или количественно диафрагмальный двигательных нейронов в различных экспериментальных исследований, таких как тех, сосредоточены на Диафрагма диафрагмального схемы.
Introduction
Цель исследования заключается в представлении надежный метод идентификации диафрагмальный двигательных нейронов (PhMN) на мышь спинной секции. Инъекции флуоресцентные нейроанатомический трассировщика в плевральной полости был выбран в качестве метода доставки достичь диафрагмальный нервно проекции на диафрагму и использовать Ретроградная транспорта вдоль диафрагмальный аксоны маркировать диафрагмальный клеток органов. Описаны два способа доставки внутриплевральной: transdiaphragmatic против трансторакальный.
Диафрагмальный моторные нейроны являются клетки спинного реле, чьи аксонов сходятся в диафрагмального нервов, которые в конечном итоге иннервируют диафрагмы. Это Нижняя моторные нейроны получают вдоха езды от бульбарной дыхательных центров и ретрансляции для диафрагмы нейро мышечной развязок (NMJ). PhMN структурированы в мотор две колонки, одна для каждого hemicord, идущую вдоль середины шейного отдела позвоночника. В большинстве видов млекопитающих, включая человека диафрагмальный мотор столбцы распространилась от уровней C3 С61,2,3. Мы и другие подтвердили, что PhMN в основном в С3-С5 уровнях в крысы и мыши спинного4,5,6,,7,8. Топографический распределение диафрагмальный клеток не является случайным; двигательных нейронов, иннервирующих грудная часть диафрагмы распределяются более плотно в черепной части диафрагмальный автопарк (С3), тогда как моторные нейроны, иннервирующих части голеней являются более хвостового (C5)9. Кроме того PhMN сгруппированы различно в вентральной Рог серого вещества. На уровне С3 кластеры диафрагмальный клетки лежат сбоку, то они сдвиг в направлении, вентролатеральной и ventromedially, находятся в наиболее хвостового уровней10,11.
Учитывая их жизненно важную роль во вдохновение, это крайне важно точно определить PhMN в спинной мозг здорового, но также следить за их судьбу в ходе патологических состояний, таких как дегенеративных заболеваний или травм спинного мозга. Так как PhMN не морфологически отличаются от других шейки матки двигательных нейронов, выявление PhMN опирается на адресности нейроанатомический Трейсеры либо на уровне первичной дыхательных центров8, или в Диафрагма NMJ7 или в диафрагмальный нерв4. Трассировщик принятые нервных волокон и осуществляется до диафрагмальный клеток тела в шейном отделе позвоночника, где могут быть визуализированы с помощью систем прямого или косвенного обнаружения. Антероградная Трейсеры коммерчески доступны с широким спектром конъюгаты или ретроградной. Примечательно, каждый трассирующими наделен нет, низкой или высокой способности для транс синаптических трассировки.
В текущем исследовании мы выбрали бета Субблок холеры токсин (СТВ) функционализированных с Alexa 555 Fluor (далее CTB-Флюорофор) как флуоресцентные метки, позволяя прямой визуализации PhMN на замороженных спинной секции. CTB обычно описывается как трассировщик monosynaptic хотя экспериментальных данных, как правило, чтобы показать transneuronal проход12. CTB обладает способностью связывать Ганглиозиды GM1 на плазматической мембране нервные окончания. CTB включены через Клатрин зависимые или - независимые механизмы и трафика через сеть транс Гольджи в эндоплазматический ретикулум в ретроградное мода13,14. Ретроградная транспорта и интернализации, как представляется, зависит от Цитоскелет актина,15,,16 , а также сети микротрубочек17.
Чтобы продемонстрировать полезность ДВЗИ как Ретроградная нейроанатомический трассирующими маркировки диафрагма PhMN схема, СТВ Флюорофор было поставлено intrapleurally. CTB осуществлялось с помощью двух методов: первая включала лапаротомии и несколько transdiaphragmatic инъекции; Вторая, менее инвазивные, используется уникальный Трансторакальная инъекции. Четыре дня спустя, дневно меченых PhMNs были количественно оценены в шейного отдела спинного от обоих из здоровых и spinally povrejdennyx животных (C4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Экспериментальный протокол был проведен во исполнение директивы Совета европейских сообществ для животного эксперимента (2010/63/ЕС, 86/609/ЕЕС и 87-848/EEC) и была утверждена животных этики Комитет из университета Намюр (этика проекта n ° 17-284 ). Рисунок 1 изображает два соответствующих подходов: transdiaphragmatic или Трансторакальная инъекции. Используйте самцов мышей C57bl/6J (n = 18), в возрасте от 3 до 4 месяцев в исследовании.
1. Приготовление раствора СТВ
- Для transdiaphragmatic инъекции:
- Растворите CTB власть в стерильной воде в концентрации 0,2% (w/v).
- Загрузите 7,5 мкл раствора (0,2% w/v) СТВ в стерильные 10-мкл microsyringe с прилагаемой 33-иглы (тупой или короткие скос) для каждой мыши.
- Для Трансторакальная инъекций:
- Растворите CTB власть в стерильной воде в концентрации 0,1% (w/v).
- Загрузите 20 мкл раствора (0,1% w/v) СТВ в стерильный шприц 500-мкл инсулин с скошенный 27-иглы для каждой мыши.
Примечание: Убедитесь, что пользоваться дистиллированной и стерильной водой и должным образом растворить порошок ВЗИ. Раствор может храниться при температуре 4 ° C на месяц (не замораживать). Через несколько дней могут образовывать осадок. Довести раствор до комнатной температуры и перемешать хорошо с помощью пипетки перед использованием.
2. подготовка до внутриплевральной инъекции
- Стерилизуйте хирургические инструменты до операции, используя автоклаве или штапика стерилизатор. Подготовьте слой чистого скамейке делать операцию и распоряжаться хирургические инструменты.
Примечание: Любой материал, используемый в ходе хирургической процедуры должны быть стерильными. Инструменты, которые нельзя стерилизовать, такие, как microsyringe должно быть вытер вниз с дезинфицирующим средством (хлоргексидин) или должно быть одноразового использования только. Хирург должен мыть его руки дезинфицирующим средством (хлоргексидин скраб) перед началом операции. Хирург должен носить стерильные перчатки, маску и чистое платье. - Вес животного и осуществлять соответствующую дозу наркоза: внутрибрюшинной инъекции анестетика коктейль (например кетамина 100 мг/кг и ксилазина 5 мг/кг).
- Щепотка мыс проверять и/или за потерю глазной рефлекс, чтобы определить, если мышь должным образом под наркозом. Примените мазь ветеринара для защиты роговицы.
- Бритье тщательно вентральной (для transdiaphragmatic процедуры) или правосторонняя грудной клетки кожи (для Трансторакальная процедуры), используя электрические машинки для стрижки. Бритье хорошо и достаточно широкой для предотвращения вдаваясь в области хирургии волос.
- Обеспечения асептических условиях актуальным применение 10% раствор йода на область побрился. Скраб для хирургической сайта раствором йода, стараясь вымыть из центра сайта к периферии.
- Используйте пусковую площадку гомойотермных всей операции для поддержания температуры тела животного.
3. внутриплевральной инъекции с использованием Transdiaphragmatic подход
- Сложить наркотизированных мышь в лежачем положении на грелку. Места проката марлевой под шею животного. Для взрослой мыши используйте рулонный марлевой 0,5 дюйма толщиной. Лента эту площадку в Правление хирургии чтобы избежать движения, если таковые имеются.
- С помощью лезвие скальпеля, надрезать вентральной кожу вдоль средней линии: сделать разрез от мечевидного отростка в пупочную регион при растяжении кожи боков с другой стороны, чтобы кожа стягивается. Не применять слишком много давления на лезвии, чтобы избежать повреждения основных органов.
- Использование малых ножницами, аккуратно отсоедините кожу от брюшной мышцы вокруг разрез. Эта процедура поможет при шитье мышцы и кожу врозь в конце операции.
- Выполните лапаротомия, используя маленькие ножницы. Откройте брюшной полости, выполняя петли разрез на уровне пупка. Надрезать мышцы живота по белой линии («linea alba») до мечевидного отростка.
- Для того, чтобы визуализировать брюшной поверхности диафрагмы, отозвать мышцы живота, с использованием коммерческих или домашнее ретракторы.
Примечание: Эти ретракторы могут быть сделаны из скрепки midi размер формы в L-крюк19. - Растянуть обе стороны лапаротомия, и лентой вниз ретракторы скамейке пальто. Оптимизируйте освещения поля зрения, чтобы на брюшной поверхности диафрагмы no more в полутени. Наиболее мощные устройства освещения для этой цели является светодиодная лампа с ориентируемых луч света.
- С помощью мягкой пинцета в одной руке, поднимите вверх xyphoid приложение и потяните вниз боковых долей печени (рис. 2A). С помощью маленькие ножницы с другой стороны, тщательно отрезать отлагательное связки, не повреждая желчного пузыря или диафрагмы (рис. 2B).
- С помощью мягкой пинцета в одной руке, поднимите вверх xyphoid приложение. Возьмите шприц Гамильтон в другой. Конечные три сайтов инъекции в правильном hemidiaphragm к соответственно покрыть грудины, медиальной и голеней регионов (рис. 3A, врезка в рисунке 3B).
- Как толщина диафрагмы около 0,37 мм7мышей, вставьте иглы не более чем 1 или 2 мм за мембраны лист для предотвращения повреждения легких во время дыхания. Доставить 2,5 мкл раствора CTB (0,2% w/v) через правый диафрагму на каждом сайте (рис. 4В). Не требуется стабилизация диафрагмы.
- Повторите эту процедуру для трех ипсилатеральные сайтов впрыска (рис. 1а) и contralaterally для двусторонних маркировки пула PhMN.
- Чтобы закрыть сайт лапаротомия, шовные брюшных мышц с рассасывающимся швом 4-0. Использовать Прерванный швы на расстоянии 3 мм по. штапель кожи закрыты с 9,0 мм раны клипов. Закрепите скобы для предотвращения животных от потянув скобы. Пространство скобы примерно 5 мм друг от друга. Не затягивайте слишком сильно рану клипов, как это может привести к нарушения заживления.
- Чистой микро шприц с дистиллированной водой для предотвращения засорения. Медленно подготовить и выслать 2 - 3 раза. Не сделать воздух в шприц.
4. внутриплевральной инъекций с использованием Трансторакальная подход
Примечание: Этот метод вдохновили от процедуры, описанной в крыс4 и была адаптирована к мыши.
- Сложить наркотизированных мыши в левой боковой пролежни позицию, на грелку (рис. 4A).
- Идентифицировать шестого и седьмого ребра под локоть региона ручной пальпация (рис. 4В).
- В то время как помощник расширяет правый передний план - и задних конечностей (Рисунок 5A), вставьте шприц краниально ориентированной и нагнетается под шестого или седьмого ребра, 3 мм, глубиной от кожи, с наклонной вниз (Рисунок 1B и Рисунок 5B).
- Поднимите иглу осторожно, чтобы подтвердить, подняв ребер, что он хорошо позиционируется в грудной полости (рис. 5 c, вставками в Рисунок 1B).
- Стабилизируйте дыхательные движения грудной клетки, применяя небольшое давление с двумя пальцами на грудной стенке.
- Держа шприц с другой стороны, доставить 20 мкл раствора (0,1% w/v) СТВ в одной инъекции.
5. послеоперационный уход
- Сразу же после процедуры заложить мыши в правой боковой пролежни позиции на гомойотермных площадку для восстановления. Это обеспечивает трассировщик распространить на правой стороне плевральной полости и позволяет для контроля дыхания животных.
- Вводят 1 мл стерильным физиологическим раствором и.п. подкожно. Обеспечивать последующие инъекции, если животное появляется сухой и вялой.
- Администрировать подкожно 0,1 мг/кг бупренорфина, дважды в день в течение первых двух дней после операции, для сведения к минимуму любых потенциальных боль.
Примечание: Многие учреждения рекомендую Мультимодальная анальгезия инвазивных процедур, таких как лапаротомия, изображенные здесь. Это могло бы включать использование нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) или местной анестезией агент в месте разреза. Эти препараты обычно доставляются до первый разрез для сведения к минимуму предметы боли. - Мониторинг животных ежедневно до эвтаназии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Самцов мышей C57bl/6J (n = 18), в возрасте от 3 до 4 месяцев, были включены в исследование. В день 0 эксперимента 8 мышей претерпел односторонних C4 ушиба, правосторонняя, согласно опубликованной протокол7,18. Как процедура Шам 10 мышей претерпел Ламинэктомия поверх C4 без ушиба. На 3 день мышей были подготовлены для инъекции внутриплевральной CTB-Флюорофор по две различные процедуры, описанной выше. На 7 день, всех мышей были умерщвлены после анестезии (кетамина 100 мг/кг и ксилазина 5 мг/кг) и обескровливания.
Собрано всего позвоночника шнуры, фиксированной в параформальдегида и cryoprotected в 30%-ая сахароза согласно стандартных лабораторных процедур. Расширение шейки матки был изолирован, встроенный в O.C.T. и cryosectioned продольно и поперечно на толщиной 30 мкм.
Продольные спинной секции были замечены с помощью микроскопа epifluorescent оснащены фильтром куб для флуоресценции анализа (возбуждения: 560/20 Нм; Эмиссия: 635/30нм). Флуоресцентный двигательных нейронов в вентральной рога были определены как линейный столбец ячеек от C3 C5 уровни (рис. 6A, верхняя группа). Все обозначенные клетки были расположены в ипсилатеральные серого вещества и выставлены морфология соответствует двигательных нейронов (Рисунок 6B). В раненых животных поразительной потери помечены PhMN наблюдалось на уровне С4, а также спинного тканей срыв (звездочка в рисунке 6A и 6 C). СТВ+ PhMNs вручную были подсчитаны каждый пятый поперечного сечения, (на расстоянии 150 мкм) в ранен и C4-ранения позвоночника шнуры (рис. 6 c). Оценки общего числа помечены PhMNs была рассчитана путем умножения количество подсчитанных CTB+ клеток на 5. Ранен здоровых мышей общее количество помечены PhMNs в hemicord оценивалась в 151 ± 9 при использовании подхода transdiaphragmatic (TDia), по сравнению с 178 ± 9 при использовании Трансторакальная подход (TTho) (рис. 6 d). После травмы C4 эти цифры соответственно снизилась до 59 14 и 70 ± 10. В этом исследовании, были свидетельствует не статистические различия между двумя методами внутриплевральной доставки (p > 0,05, U Манна-Уитни испытания; TDia против TTho).
Рисунок 1. Внутриплевральной инъекции с использованием transdiaphragmatic или Трансторакальная инъекции. Transdiaphragmatic подход включает в себя лапаротомия, экспозиции брюшной поверхности диафрагмы (в розовый цвет) и три инъекции в области грудины, медиальной и голеней A. Трансторакальная подход мышь укладывается в позиции левой боковой пролежни. Шестой и седьмой ребра определяются ручной пальпация Bпод локоть региона. Игла вводится через кожу, подкожную ткань, грудной мышцы, межреберные мышцы и париетальной плевры достичь в плевральной полости (звездочкой). S, грудины; m, медиальной; c, голеней; S/SC, кожи и подкожной клетчатки; ТМ, грудной мышцы; IC, межреберные мышцы; PP; париетальной плевры; L, легких. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Операционного поля с видом на печень, желчный пузырь и брюшной лицом диафрагмы. А. Обратите внимание отлагательное связки между желчного пузыря и диафрагмы. B. связки тщательно отрезать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Вид на диафрагму. Грудины (s), медиальной (m) и голеней (c) областях определены в правом hemidiaphragm. A. Обратите внимание, что область голеней кзади печени лопастями. Б. придать ДВЗИ в плевральную полость, Вставьте иглу 1 мм в глубину через правый hemi диафрагмы. Инъекции в области медиальной — иллюстрированная. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Трансторакальная подход. Мышь позиционируется в левой боковой пролежни A. Идентифицировать реберную маржа диафрагмы и локоть региона. Б. шестой и седьмой межреберные пространства определяются глубоко в районе локтя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Шестой и седьмой межреберные пространства определяются глубоко в районе локтя. А. расширенный передние и задние конечности. Б. шприц краниально ориентированных и касательной вставляется под шестого или седьмого ребра, 3 мм глубиной через межреберные мышцы, с наклонной вверх вниз. C. иглы слегка повышенных и ребра будут отменены подтвердить иглы хорошо позиционируется в грудной полости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. СТВ+ клетки в вентральной Рог серого вещества вводят intrapleurally мышей. A. в spinally непострадавший мыши, диафрагмальный мотонейронов CTB+ распространять вдоль шейного отдела спинного от уровня C3 C5. В повредили мыши тканей срыв наблюдается в одностороннем порядке с потерей CTB+ диафрагмальный двигательных нейронов на уровне С4 (звездочкой). B. помечены CTB+ клетки были расположены в ипсилатеральные серого вещества и выставлены морфология соответствует двигательных нейронов. C. поперечной части спинной мозг, были использованы для подсчитать количество ячеек CTB+ на определенных расстояниях вдоль спинного мозга в ранен (слева) и раненых (справа) мышах. D. количественная оценка CTB+ клетки обнаружены в ипсилатеральные hemicord ранен или раненых мышей, согласно transdiaphragmatic (TDia) или Трансторакальная подход (TTho), внутриплевральной CTB доставки. Бары представляют 250 мкм. данные были высказаны как среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). n = 5-7 мышей в каждой TDia группы; n = 3 мышей в каждой группе TTho. Non параметрической U Манна-Уитни тесты были выполнены и результаты рассматривались как значительно отличаться для p < 0,05. p < 0,001 для непострадавший против C4 травмы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанные здесь, могут применяться к любой штамм взрослых мышей или любой экспериментальной парадигмы, в котором должны оцениваться целостности цепи диафрагма PhMN. К примеру боковой амиотрофический склероз (ALS) и травмы шейного отдела спинного (cSCI) являются условия, связанные с потерей PhMN, антероградная дегенерация диафрагмальный аксонов и последующих дыхательных компромисс. Животные модели ALS или cSCI имитировать гистопатологические и функциональных респираторных дефицит наблюдается в заболеваниях человека. В этих моделях Гистологические техники часто применяются для оценки PhMN выживания ниже различных терапевтических вмешательств, направленных на PhMN нейропротекции18,,2021. Любые проблемы усвоение в диафрагму NMJ или аксональное транспорта несомненно будет компромиссом количество ВЗИ, накопленных в нейрональных клеток тела. Потери диафрагмальный аксоны или PhMN дегенерации, очевидно, уменьшить количество CTB retrotransported в спинной мозг.
Каждый подход администрации внутриплевральной имеет свои плюсы и минусы. Transdiaphragmatic инъекции очень инвазивных, требуя лапаротомии и тщательного шить всех слоев кожи для предотвращения зияние и орган выступ. Лапаротомия мешает нормальное дыхание22 , и не исключено, что это может повлиять на эффективность деятельности или ретро транспортных PhMN. Однако прямая визуализация диафрагмы во время инъекции гарантирует успешные нападения на плевральную полость все время. Трансторакальная инъекции минимально инвазивной по сравнению с transdiaphragmatic инъекции и может рассматриваться как процедура для уточнения, в духе концепции «Трех р». Один недостаток-это увеличение вероятность пробить для неопытного пользователя (например, в подкожной клетчатке или в грудной стенке).
После внутриплевральной люминесцентные CTB администрации вполне вероятно, что любой мотонейрона проецирование на мышцы, вагонка плевральной полости будут помечены, включая PhMN, межреберные двигательных нейронов или различных популяций двигательных нейронов мозга. В взрослых крыс Мантилья et al. продемонстрировали, что межреберные моторные нейроны также были названы в вентральной рога грудного отдела спинного мозга, а также некоторые ганглий Спинной корень нейроны4. Мы никогда не проверили наличие CTB-меченых клеток в других сайтов, чем шейного отдела спинного у мышей.
В зависимости от экспериментальные параметры/модели результат меры может включать расположения столбчатых PhMNs вдоль шейного отдела спинного, детальный анализ геометрических данных о позиции каждого PhMN или, как описано здесь, количественная оценка PhMN номер. Точную оценку общего числа PhMN зависит от технических соображений и межучрежденческой оценки надежности; из-за изменчивости интенсивности флуоресценции ВЗИ, нейрон Сома размер или окрашивания фона. В нашем опыте, с использованием transdiaphragmatic инъекции СТВ Флюорофор мы подсчитали количество PhMN в hemicord мыши в диапазоне между 120 и 180 клеток, количество немного меньше, чем данные из других групп8. Действительно существуют два ограничения исследования. Во-первых ограниченное количество животных вводят с помощью Трансторакальная подход и второй на полный маркировки пула PhMN есть неопределенность. Диафрагмальный нерв купанием (после перерезка нерва) или intraneural инъекции с флуоресцентные нейроанатомический трассирующими дополнительных методов, которые могут быть использованы для более точно обозначить все PhMNs. Для будущих исследований рекомендуется рассчитывать PhMNs беспристрастной методами, такими как stereology.
В нашем опыте мы никогда не наблюдали любой очевидный дефицит дыхания или осложнений (респираторный дистресс) такие как кровотечение или пневмотораксом после этой процедуры. Однако если диафрагмы был поврежден во время инъекции transdiaphragmatic, рассмотрите возможность использования иглы меньшего диаметра или с резким фаски.
Чтобы избежать смерти животного во время или после операции, тщательно проверьте концентрации каждого компонента в анестезии коктейль. Избегайте повреждений на поверхности печени, кишечника, желчного пузыря или диафрагмы.
Нет или низкой маркировки PhMN может быть связано несколько проблем. Если Трансторакальная инъекции пропускает плевральной полости, переделать и проверить вручную пальпация что игла вводится под ребрами или не выскочить через кожу. Не пузыри должны образовывать после инъекции раствора ВЗИ. Помните также, что интернализация ВЗИ в нервной клетке рН зависимых23: кислых и нейтральных рН являются оптимальными, в то время как базовых pH ухудшает усвоение токсин. Рекомендуется для Ресуспензируйте CTB порошка в воде, в соленой или PBS буфера. Рассмотрим сохранение время помечены токсина в организме нейрональных клеток. В нашем опыте мы могли обнаружить CTB-меченых клетки в окно времени между четырех дней и через две недели после внутриплевральной доставки. Уменьшение времени передать ретроградной транспорта или увеличение промежутка времени между внутриплевральной доставки и жертва может нарушить оптимального обнаружения люминесцентные CTB в ткани.
Чтобы избежать увядать флуоресценции метод надлежащего фиксирующие. Мы предлагаем perfusing животного тела с буферизацией параформальдегида 4%. После того, как собирают спинного мозга, Инкубируйте в том же фиксатором на ночь. Cryoprotect шнур в 30% раствора сахарозы для 72 часов до гибели, затем встроить расширение шейки матки (около 8 мм) в O.C.T. среде. Не обезвоживая или вставлять образец в парафин. Защитите позвоночника образцы или разделов ткани от света во время весь пост-обработки. Фиксированной всей Хребтовая шнуры могут храниться при температуре 4 ° C для месяцев если тимеросал добавляется криопротектора решение (не добавляйте азид натрия, как он будет провоцировать затухания флуоресценции). Разделах ткани может храниться при температуре-20 ° C для месяцев вдали от света. Наконец мы советуем вам смонтировать слайды с реактивом анти выцветанию. Если флюоресценция исчезла, это еще можно обнаружить ВЗИ с помощью иммуногистохимия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарны Роберт Граффин и Полин Duhant за их техническую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
References
- Webber, C. L. Jr, Wurster, R. D., Chung, J. M. Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping. Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).
- Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study. J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).
- Gordon, D. C., Richmond, F. J. Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques. J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).
- Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. The phrenic motor nucleus in the adult mouse. Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles. J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).
- Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study. J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).
- Gottschall, J. The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons. Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).
- Lai, B. Q., et al. Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve. PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).
- Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms. J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).
- Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).
- Fujinaga, Y., et al. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).
- Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton. Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).
- Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Llado, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).
- Sieck, G. C., Fournier, M. Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors. J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).
- Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action. Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).
