Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Retrograd Neuroanatomical sporing af Phrenic motoriske neuroner i mus

Published: February 22, 2018 doi: 10.3791/56758

Summary

Her, beskriver vi en protokol til at identificere phrenic motoriske neuroner i mus efter intrapleural levering af fluorophore konjugeret kolera toksin subunit beta. To teknikker er sammenlignet for at injicere den pleural hulrum: transdiaphragmatic versus transthoracic tilgange.

Abstract

Phrenic motoriske neuroner er cervikal motoriske neuroner stammer fra C3 til C6 niveauer i mest pattedyrarter. Cytoskeletale fremskrivninger konvergerer i phrenic nerver, der innerverer de respiratoriske membran. I rygmarven skiver, ikke kan phrenic motoriske neuroner identificeres fra andre motoriske neuroner på morfologiske eller biokemiske kriterier. Vi leverer beskrivelse af procedurer til at visualisere phrenic motorneuron celle organer i mus, følgende intrapleural injektioner af kolera toksin subunit beta (CTB) konjugeret med et fluorophore. Denne fluorescerende neuroanatomical tracer har mulighed for at blive fanget på mellemgulvet neuromuskulære junction, udføres retrogradely langs de phrenic axoner og nå de phrenic celle organer. To metodiske tilgange til intrapleural CTB levering sammenlignes: transdiaphragmatic versus transthoracic injektioner. Begge tilgange er vellykket og resultere i tilsvarende antal CTB-mærket phrenic motor neuroner. Afslutningsvis kan disse teknikker anvendes for at visualisere eller kvantificere phrenic motoriske neuroner i forskellige eksperimentelle undersøgelser som dem, der fokuserede på den membran-phrenic kredsløb.

Introduction

Formålet med undersøgelsen er at præsentere en pålidelig metode til at identificere phrenic motor neuroner (PhMN) på mus rygmarven sektioner. Injektion af en fluorescerende neuroanatomical sporstof i pleural hulrum blev valgt som leveringsmetode til at nå de phrenic neuromuskulære fremskrivninger på mellemgulvet og bruge retrograd transport langs de phrenic axoner til at mærke phrenic celle organer. To teknikker til intrapleural levering er beskrevet: transdiaphragmatic versus transthoracic.

Phrenic motoriske neuroner er spinal relæ celler hvis axoner konvergerer i phrenic nerver, som i sidste ende innerverer mellemgulvet. Disse er lavere motor neuroner modtager inspiratory drevet fra de bulbar respiratoriske Centre og formidle det til mellemgulvet neuro-muskulære vejkryds (NMJ). PhMN er opbygget i to motor kolonner, en for hver hemicord, løber langs de midten af halshvirvelsøjlen. I de fleste pattedyr, herunder mennesker, spredes de phrenic motor kolonner fra niveauer C3 til C61,2,3. Vi og andre har bekræftet, at PhMN koncentreret i C3-C5 niveauer i rotter og mus rygmarven4,5,6,7,8. Den topografiske fordeling af phrenic celler er ikke tilfældigt; motoriske neuroner innerverer den brystbenet del af mellemgulvet er fordelt mere tæt i den kranielle del af phrenic motor pool (C3), motoriske neuroner innerverer den crural del er mere caudale (C5)9. PhMN er endvidere grupperet skiftevis i ventrale horn grå materie. På C3 plan, klyngerne af phrenic celler ligger lateralt, så de skift i retningen til ventrolaterale og findes ventromedially på de mest caudale niveauer10,11.

Givet deres afgørende rolle under inspiration, er det af yderste vigtighed at identificere PhMN i sund rygmarven men også følge deres skæbne under patologiske tilstande, som degenerative sygdomme eller traumatiske skader på rygmarven. Da PhMN ikke afviger morfologisk fra andre cervikal motoriske neuroner, identifikation af PhMN er afhængig af målrettet levering af neuroanatomical røbestoffer enten på niveauet af primære respiratoriske Centre8, eller på mellemgulvet NMJ7 eller i phrenic nerve4. Sporstof er taget op af nervefibre og transporteres op til de phrenic celle organer i halshvirvelsøjlen, hvor det kan visualiseres ved hjælp af direkte eller indirekte detektionssystemer. Retrograd eller anterograd røbestoffer er kommercielt tilgængelige med en bred vifte af konjugater. Bemærkelsesværdigt, hver tracer er begavet med nej, lav eller høj evner for trans synaptic sporing.

I den aktuelle undersøgelse valgte vi beta underenheden af kolera toksin (CTB) functionalized med Alexa Fluor 555 (herefter benævnt CTB-fluorophore) som en fluorescerende etiket, giver mulighed for en direkte visualisering af PhMN på frosne rygmarven sektioner. CTB er som regel beskrevet som en monosynaptic tracer selvom forsøgsdata tendens til at vise en transneuronal passage12. CTB har evnen til at binde ganglioside GM1 på plasma membran af nerve ender. CTB er internaliseret via clathrin-afhængige eller -uafhængige mekanismer og trafikker gennem trans-Golgi netværk i det endoplasmatiske reticulum i en retrograd mode13,14. Internalisering og retrograd transport synes at være afhænger actin cytoskeleton15,16 samt mikrotubulus netværk17.

For at påvise nytten af CTB som en retrograd neuroanatomical tracer mærkning membran-PhMN kredsløb, blev CTB-fluorophore leveret intrapleurally. CTB blev administreret ved hjælp af to metoder: den ene omfattede en laparotomi og flere transdiaphragmatic injektioner; den anden, mindre invasive, brugte en unik transthoracic injektion. Fire dage senere, fluorescently-mærket PhMNs var kvantificeres i de cervikale rygmarv fra både fra raske og spinally sårede (C4) dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En eksperimentel protokol blev gennemført i overensstemmelse med de Europæiske Fællesskabers Rådets direktiver for dyr eksperiment (2010/63/EU, 86/609/EOEF og 87-848/EØF) og blev godkendt af den dyr etiske udvalg af Universitet Namur (etik projekt n ° 17-284 ). Figur 1 viser de to respektive tilgange: transdiaphragmatic eller transthoracic injektioner. Brug mandlige C57bl/6J mus (n = 18), i alderen fra 3 til 4 måneder i studiet.

1. forberedelse af CTB løsning

  1. For transdiaphragmatic injektioner:
    1. Opløse CTB magt i sterilt vand til koncentrationen af 0,2% (w/v).
    2. Indlæse 7,5 µL af CTB løsning (0,2% w/v) i en steril 10 µL mikrosprøjte med en vedhæftet 33-gauge kanyle (stump eller korte facet) for hver mus.
  2. For transthoracic injektion:
    1. Opløse CTB magt i sterilt vand til koncentrationen af 0,1% (w/v).
    2. Indlæse 20 µL af CTB løsning (0,1% w/v) i en steril 500 µl insulin sprøjte med en skrå 27-gauge kanyle til hver mus.
      Bemærk: Sørg for at bruge destilleret og sterilt vand og CTB pulveret opløses ordentligt. Opløsningen kan opbevares ved 4 ° C for en måned (ikke fryse). Et bundfald kan danne efter få dage. Bringes opløsningen til stuetemperatur og bland godt ved hjælp af en pipette før brug.

2. forberedelse forud for Intrapleural injektioner

  1. Sterilisere kirurgiske værktøjer før operation, ved hjælp af autoklave eller glas-perle sterilizer. Forberede en ren bænk coat at gøre kirurgi og at afhænde de kirurgiske værktøjer.
    Bemærk: Materiale, der anvendes under den kirurgiske procedure bør være sterilt. Instrumenter, der ikke kan steriliseres, såsom mikrosprøjte skal tørres med et desinfektionsmiddel (chlorhexidin) eller bør være enkelt-bruger kun. Kirurgen skal vaske hans/hendes hænder med et desinfektionsmiddel (chlorhexidin krat) før begyndelsen af operationen. Kirurgen skal bære sterile handsker, en ansigtsmaske og et rent kjole.
  2. Vejer dyr, og administrere en passende dosis af anæstesi: intraperitoneal injektion af anæstesi cocktail (fx ketamin 100 mg/kg og xylazin 5 mg/kg).
  3. Knivspids tå og/eller kontrollere, om tabet af palpebral refleks at afgøre, om musen er korrekt bedøvede. Anvende en vet salve for at beskytte hornhinden.
  4. Barbere omhyggeligt den ventrale hud (for transdiaphragmatic procedure) eller højresidig torakal huden (for transthoracic procedure), ved hjælp af elektriske hårklippere. Barbere godt og bredt nok til at forhindre hår at komme ind i feltet operation.
  5. Sikre aseptiske forhold ved topikal applikation af 10% jodopløsning på det barberede område. Skrub operationsstedet med jodopløsning, være omhyggelig med at skrubbe fra midten af sted mod periferien.
  6. Bruge en varmblodet pad hele operationen for at bevare dyrets kropstemperatur.

3. Intrapleural injektioner med Transdiaphragmatic tilgang

  1. Fastsætte de bedøvede mus i liggende stilling på en varmepude. Placer rullede gaze pad under halsen på dyret. For en voksen mus, skal du bruge en rullet gaze pad på 0,5 tommer i tykkelse. Tape denne pad til kirurgi brættet for at undgå bevægelser hvis nogen.
  2. Ved hjælp af en skalpel klinge, incise den ventrale hud langs midterlinjen: gøre et snit fra formet som et sværd proces til området omkring navlen mens strækker huden sideværts med anden hånden at gøre huden stram. Gælde ikke for meget pres på blade til at undgå at beskadige underliggende organer.
  3. Ved hjælp af lille saks, forsigtigt frigøre hud fra mavemusklerne omkring indsnittet. Denne procedure vil hjælpe på syning musklerne og huden apart i slutningen af operationen.
  4. Udføre laparotomi med lille saks. Åbn bughulen ved at udføre et knaphul indsnit på niveauet af navlen. Incise mavemusklerne langs den hvide linje ("linea alba") op til formet som et sværd proces.
  5. For at visualisere abdominal overfladen af mellemgulvet, trække mavemuskler ved hjælp af kommercielle eller hjemmelavet retraktorer.
    Bemærk: Disse retraktorer kan foretages fra midi-størrelse papir klip formet i L-hook19.
  6. Strække begge sider af laparotomi, og tape ned retraktorer til bænken pels. Optimere belysning af synsfeltet, så mellemgulvet abdominal overflade er ikke mere i penumbra. Den stærkeste belysning enhed til dette formål er en LED lampe med en båndet lysstråle.
  7. Ved hjælp af bløde pincet i den ene hånd, løft op xyphoid tillæg og trække ned sidefligerne af leveren (figur 2A). Ved hjælp af lille saks i anden hånden, skæres omhyggeligt ud den opsættende ledbånd, uden at beskadige galdeblæren eller mellemgulvet (figur 2B).
  8. Ved hjælp af bløde pincet i den ene hånd, løft op xyphoid tillæg. Tag fat i Hamilton sprøjten i anden hånden. Målrette tre sider af injektion i den rigtige hemidiaphragm til henholdsvis dækning af brystbenet, medialt og de crural regioner (figur 3A, indsatser i figur 3B).
  9. Som membran tykkelse er omkring 0,37 mm i mus7, indsætte nålen ikke mere end 1 eller 2 mm uden for arket membran til at forhindre lungekræft skader i løbet af vejrtrækning. Levere 2,5 µL af CTB løsning (0,2% w/v) gennem det rigtige mellemgulvet på hvert websted (figur 4B). Der kræves ikke stabilisering af mellemgulvet.
  10. Gentag denne procedure for de tre ipsilaterale websteder af injektion (figur 1A), og contralaterally for en bilateral mærkning af PhMN swimmingpool.
  11. For at lukke webstedet laparotomi, sutur mavemuskler med resorberbare 4-0 sutur. Brug afbrudt sting fordelt af 3 mm. korte hud lukket med 9.0 mm sår klip. Stramme hæfteklammer for at forhindre dyr fra at trække off hæfteklammer. Plads hæfteklammer ca 5 mm fra hinanden. Ikke overspænde sår klip, da dette kan føre til nedsat heling.
  12. Ren mikro sprøjte med destilleret vand for at undgå tilstopning. Langsomt trække og udvise 2 - 3 gange. Drage ikke luft ind i sprøjten.

4. Intrapleural injektion ved hjælp af Transthoracic tilgang

Bemærk: Denne metode er inspireret fra proceduren beskrevet i rotter4 og blev tilpasset til musen.

  1. Fastsætte bedøvede musen i venstre lateral decubitus holdning, på en varmepude (figur 4A).
  2. Identificere de sjette og syvende ribben under regionen albue ved manuel palpation (figur 4B).
  3. Mens en assistent udvider rigtige fore - og hind-lemmer (figur 5A), Indsæt sprøjten cranially orienteret og tangentielt under sjette eller syvende ribben, 3 mm dybe fra huden med facet ned (figur 1B og figur 5B).
  4. Ophøje nål forsigtigt for at bekræfte ved at løfte ribbenene op, at det er godt placeret i brysthulen (figur 5 c, mellemværker i figur 1B).
  5. Stabilisere vejrtrækning bevægelser af brystet ved at anvende let tryk med to fingre på brystvæggen.
  6. Mens du holder sprøjten i anden hånden, levere 20 µL af CTB løsning (0,1% w/v) i en enkelt injektion.

5. postoperativ pleje

  1. Umiddelbart efter proceduren, lå musen i højre laterale decubitus position på en varmblodet pad til nyttiggørelse. Dette sikrer sporstof til at sprede på højre side af den pleural hulrum og giver mulighed for overvågning dyrets vejrtrækning.
  2. Administrere 1 mL steril saltvandsopløsning i.p. subkutant. Give opfølgende injektioner, hvis dyret vises kunsttørret og/eller sløv.
  3. Administrere subkutant 0,1 mg/kg af buprenorphin, to gange om dagen i løbet af de første to dage efter operationen, at minimere enhver potentiel smerte.
    Bemærk: Mange institutioner vil anbefale multimodale analgesi for invasive procedurer, såsom laparotomi afbildet her. Dette kunne omfatte brugen af et non-steroide anti-inflammatoriske (NSAID) medicin og/eller en lokalbedøvelse agent på webstedet indsnit. Disse medikamenter er typisk leveres inden den første indsnit at minimere vind-up smerte.
  4. Overvåge dyr dagligt op til dødshjælp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mandlige C57bl/6J mus (n = 18), i alderen fra 3 til 4 måneder blev inkluderet i undersøgelsen. På dag 0 af eksperimentet undergik 8 mus en ensidig C4 kontusion, højresidig, ifølge offentliggjorte protokol7,18. Som fingeret procedure undergik 10 mus en laminektomi på toppen af C4 uden kontusion. På dag 3, blev mus forberedt til intrapleural injektioner af CTB-fluorophore efter to forskellige procedurer beskrevet ovenfor. På dag 7, alle mus blev aflivet efter bedøvelse (ketamin 100 mg/kg og xylazin 5 mg/kg) og exsanguination.

Hele rygmarv blev høstet, fast i PARAFORMALDEHYD og cryoprotected i 30% saccharose ifølge standard lab procedurer. Cervikal udvidelsen blev isoleret, indlejret i O.C.T. og cryosectioned på langs eller sprængsnorene på en tykkelse på 30 µm.

Spinal længdesnit blev observeret med en epifluorescerende mikroskop udstyret med filter kube til fluorescens analyse (Excitation: 560/20nm; Emission: 635/30nm). Fluorescerende motor neuroner i den ventrale horn blev identificeret som en lineær kolonne af celler fra C3 til C5 niveauer (figur 6A, øverste panel). Alle mærket celler var placeret i den ipsilaterale grå materie og udstillet morfologi overensstemmelse med motoriske neuroner (fig. 6B). Tilskadekomne dyr, blev en slående tab af mærket PhMN observeret på C4 niveau, sammen med spinal væv forstyrrelser (stjerne i figur 6A og 6 C). CTB+ PhMNs blev manuelt optalt hver femte tværsnit (fordelt med 150 µm) i uskadt og C4-såret rygmarv (figur 6 c). Et skøn over det samlede antal af mærket PhMNs blev beregnet ved at gange antallet af optalte CTB+ celler med 5. I uskadt sund mus, blev det samlede antal af mærket PhMNs pr. hemicord anslået til 151 ± 9 når ved hjælp af transdiaphragmatic (TDia) tilgang, i forhold til 178 ± 9, når du bruger transthoracic (TTho) fremgangsmåde (figur 6D). Efter C4 skade faldt disse tal henholdsvis til 59 ± 14 og 70 ± 10. I denne undersøgelse, var ingen statistiske forskelle fremgår mellem de to metoder til intrapleural levering (p > 0,05, Mann-Whitney U test; TDia versus TTho).

Figure 1
Figur 1. Intrapleural injektioner ved hjælp af transdiaphragmatic eller transthoracic injektioner. Transdiaphragmatic tilgang omfatter en laparotomi, eksponering af abdominal overfladen af mellemgulvet (i lyserød farve) og tre injektioner i regionerne brystbenet, mediale og crural A. Transthoracic tilgang, er musen lagt i venstre lateral decubitus holdning. De sjette og syvende ribben er identificeret under regionen albue ved manuel palpation B. Nål indsættes gennem huden, det subkutane væv, thorax musklerne, den interkostale muskulatur og parietal brysthinden at nå den pleural hulrum (asterix). Sørensen, brystbenet; Møller, mediale; c, crural; S/SC, hud og subkutane væv; TM, thorax muskler; IC, mellemsiddende muskler; PP; parietal brysthinden; Larsen, lunge. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Kirurgiske felt med henblik på leveren, galdeblæren og abdominal ansigt af mellemgulvet. A. Bemærk opsættende ledbånd mellem galdeblæren og mellemgulvet. B. ligament er omhyggeligt skæres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Se på mellemgulvet. Brystbenet (s), medial (m) og crural (c) områder er identificeret i den rigtige hemidiaphragm. A. Bemærk, at regionen crural posteriort for de lever fliger. B. for at injicere CTB i pleural rummet, indsætte nålen 1 mm dybe gennem højre hemi-mellemgulvet. Injektion i den mediale område er illustreret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Transthoracic tilgang. Mus er placeret i venstre lateral decubitus A. Identificere costal margenen af mellemgulvet og albue-regionen. B. de sjette og syvende interkostale rum er identificeret dybt til regionen albue. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. De sjette og syvende interkostale rum er identificeret dybt til regionen albue. A. forgrunden og hind lemmer er udvidet. B. sprøjten er cranially orienteret og tangentielt indsat under sjette eller syvende ribben, 3 mm dyb gennem den interkostale muskulatur med facet hovedet. C. nålen er forsigtigt forhøjet og ribbenene hæves for at bekræfte nålen er godt placeret i brysthulen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. CTB+ celler i den ventrale horn grå substans i intrapleurally-indsprøjtning mus. A. i spinally uskadt mus distribuere CTB+ phrenic motoriske neuroner langs den cervikale rygmarv fra niveau C3 til C5. I contused mus, er væv forstyrrelser observeret ensidigt med tab af CTB+ phrenic motoriske neuroner på C4 niveau (asterix). B. mærket CTB+ celler var placeret i den ipsilaterale grå materie og udstillet morfologi overensstemmelse med motoriske neuroner. C. tværgående sektioner af rygmarv blev brugt til at opgøre antallet af CTB+ celler på bestemte afstande langs rygmarven i uskadt (venstre) og sårede (højre) mus. D. kvantificering af CTB+ celler findes i den ipsilaterale hemicord i uskadt eller tilskadekomne mus, transdiaphragmatic (TDia) eller transthoracic (TTho) tilgang af intrapleural CTB levering. Barer repræsenterer 250 µm. Data blev udtrykt som gennemsnit ± standard fejl af middelværdien (SEM). n = 5-7 mus i hver TDia gruppe; n = 3 mus i hver TTho gruppe. Non-parametrical Mann-Whitney U test blev udført og resultater blev anset som væsentligt anderledes for p < 0,05. p < 0,001 for uskadt versus C4 skade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet heri kan anvendes til en stamme af voksen mus eller enhver eksperimentelle paradigme integriteten af membran-PhMN kredsløb bør evalueres. For eksempel, er Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og cervikal rygmarvsskade (cSCI) betingelser forbundet med PhMN tab, anterograd degeneration af phrenic axoner og efterfølgende respiratorisk kompromis. Dyremodeller for ALS eller cSCI efterligne histopatologiske og funktionelle respiratorisk underskud observeret i menneskelige sygdomme. I disse modeller, der histologiske teknikker ofte anvendes til at vurdere PhMN overlevelse følgende forskellige terapeutiske interventioner med henblik på PhMN neuroprotection18,20,21. Problemer med optagelsen på mellemgulvet NMJ eller cytoskeletale transporten vil utvivlsomt kompromittere mængden af CTB akkumuleret i de neuronale celle organer. Tab af phrenic axons eller PhMN degeneration vil naturligvis reducere mængden af CTB retrotransported i rygmarven.

Hver enkelt tilgang af intrapleural administration har sine egne fordele og cons. Transdiaphragmatic injektioner er ganske invasive, nødvendiggør laparotomi og omhyggelig syning af alle hudlag at forhindre opspringning og orgel fremspring. Laparotomi forstyrrer normal respiration22 , og man kan ikke udelukke, at det kan påvirke PhMN aktivitet eller retro-transport effektivitet. Men direkte visualisering af mellemgulvet under injektionen sikrer succesfulde målretning af pleural rummet hele tiden. Transthoracic injektioner er minimalt invasiv sammenlignet med transdiaphragmatic injektioner og kan således betragtes som en procedure for raffinement, i stil med "Tre Rs" koncept. En ulempe er øget sandsynligheden for at være off-mål for en uerfaren bruger (f.eks. i det subkutane væv eller i brystvæggen).

Efter intrapleural fluorescerende-CTB administration er det sandsynligt, at enhver motor neuron projicere på muskler foring den pleural hulrum bliver mærket, herunder PhMN, interkostale motoriske neuroner eller forskellige populationer af hjernestammen motor neuroner. Voksne rotter demonstreret Mantilla et al. at interkostale motoriske neuroner var også mærket i den ventrale horn af thorax rygmarv, samt nogle dorsalrods ganglion neuroner4. Vi har aldrig tjekket tilstedeværelsen af CTB-mærket celler i andre steder end de cervikale rygmarv i mus.

Afhængigt af de eksperimentelle indstillinger/modeller, statusmålinger kan omfatte den søjleformede arrangement af PhMNs langs den cervikale rygmarv, detaljeret analyse af geometriske oplysninger om placeringen af hver PhMN eller som beskrevet her, kvantificering af PhMN antal. Nøjagtig evaluering af PhMN antallet afhænger af tekniske overvejelser og Inter evaluator pålidelighed; på grund af variabiliteten af CTB fluorescens intensitet, neuron soma størrelse eller baggrunden farvning. I vores erfaring med at bruge transdiaphragmatic injektioner af CTB-fluorophore, har vi estimeret antallet af PhMN pr. mus hemicord i et interval mellem 120 og 180 celler, en række af lidt mindre end data fra andre grupper8. Faktisk er der to begrænsninger i undersøgelsen. Først, et begrænset antal dyr er injiceret med den transthoracic tilgang og for det andet er der en usikkerhed på komplet mærkning af PhMN pool. Phrenic nerve dip (efter nerve transection) eller intraneural injektioner med fluorescerende neuroanatomical tracer er supplerende teknikker, der kan bruges til mere præcist mærke alle PhMNs. For fremtidige undersøgelser anbefales det at tælle PhMNs af uvildige metoder såsom Stereologi.

Vores erfaring, har vi aldrig observeret nogen indlysende respiratorisk underskud eller komplikationer (åndedrætsbesvær) såsom blødninger eller pneumothorax efter denne procedure. Men hvis mellemgulvet er blevet beskadiget under transdiaphragmatic injektioner, overveje at bruge en nål med en mindre diameter eller med skarpere facet.

For at undgå dyrs død under eller efter operationen nøje kontrollere koncentrationerne af hver komponent i narkose cocktail. Undgå skader på overflader af leveren, tarmen, galdeblæren eller mellemgulvet.

Ingen eller lav mærkning af PhMN kunne være på grund af flere problemer. Hvis den transthoracic injektion savner den pleural hulrum, re-do og tjekke ved manuel palpation at nålen er indsat under ribbenene eller ikke pop ud gennem huden. Ingen bobler bør danne ved injektion af CTB løsning. Husk også, at internalisering af CTB i cellen nervøs er pH-afhængige23: sure og neutral pH er optimal, mens grundlæggende pH hæmmer optagelsen af toksin. Det anbefales at resuspend CTB pulver i vand, saltvand eller PBS buffer. Overveje persistens tid af mærket toksin i neuronal cellen kroppen. Vores erfaring, kan vi afsløre CTB-mærket celler i et tidsvindue mellem fire dage og to uger efter intrapleural levering. Faldende tid afsat til retrograd transport eller øge tiden mellem intrapleural levering og offer kan kompromittere den optimale påvisning af fluorescerende-CTB i vævet.

For at undgå at bruge fluorescens fading ordentlig Fikseringsvæske metode. Vi foreslår perfusing dyrets krop med buffered 4% PARAFORMALDEHYD. Når rygmarven er høstet, inkuberes i den samme fiksativ natten over. Cryoprotect ledningen i 30% rørsukkeropløsning i 72 timer før forliset, derefter integrere den cervikale udvidelse (ca. 8 mm) i O.C.T. medium. Ikke dehydrere eller integrere prøven i paraffin. Beskytte spinal prøver eller væv sektioner fra lys under hele efterbehandling. Fast hele rygmarv kan opbevares ved 4 ° C for måneder hvis thimerosal er føjet til den kryoprotektant løsning (Tilføj ikke natriumazid, som det vil provokere fluorescens fading). Væv sektioner kan opbevares ved-20 ° C for måneder væk fra lys. Endelig anbefaler vi for at montere dias med en anti-fading reagens. Hvis Fluorescens er falmet, er det stadig muligt at påvise CTB ved hjælp af Immunhistokemi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for Robert Graffin og Pauline Duhant deres tekniske support.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass-bead sterilizer Steri 250 Keller 31-101
Small scissors F.S.T. 14058-00
Soft tweezers F.S.T. 11042-08
Scalpel blades Swann Morton No.11 or 15
Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 Life Technologies C22843 Bring at room temperature before use 
10ul Hamilton syringue, removable needle Sigma-Aldrich 701RN
33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 Filter Service 7803-05
500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge Terumo BS05M2713
Orientable LED lamp V.W.R. 631-0995
Resorbable 4/0 sutures S.M.I. AG 15151519
Needle holder F.S.T. 12002-14
9mm autoclips Bioseb 205016
Autoclip 9mm applier Bioseb MikRon 9mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Webber, C. L. Jr, Wurster, R. D., Chung, J. M. Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping. Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).
  2. Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study. J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).
  3. Gordon, D. C., Richmond, F. J. Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques. J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).
  4. Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
  5. Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).
  6. Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
  7. Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).
  8. Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. The phrenic motor nucleus in the adult mouse. Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).
  9. Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles. J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).
  10. Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study. J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).
  11. Gottschall, J. The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons. Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).
  12. Lai, B. Q., et al. Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve. PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).
  13. Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms. J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).
  14. Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).
  15. Fujinaga, Y., et al. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).
  16. Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton. Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).
  17. Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
  18. Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).
  19. Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
  20. Llado, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
  21. Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).
  22. Sieck, G. C., Fournier, M. Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors. J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).
  23. Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action. Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).

Tags

Neurovidenskab sag 132 Phrenic motoriske neuroner retrograd mærkning intrapleural kolera toksin subunit beta mus neuroanatomical tracer
Retrograd Neuroanatomical sporing af Phrenic motoriske neuroner i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vandeweerd, J. M., Hontoir, F., DeMore

Vandeweerd, J. M., Hontoir, F., De Knoop, A., De Swert, K., Nicaise, C. Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice. J. Vis. Exp. (132), e56758, doi:10.3791/56758 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter