Summary
Hier beschrijven we een protocol voor het identificeren van phrenic motorische neuronen in muizen nadat pleurale levering van fluorophore geconjugeerd cholera-toxine subeenheid bèta. Twee technieken worden vergeleken om te injecteren de pleurale Holte: transdiaphragmatic versus transthoracic benaderingen.
Abstract
Phrenic motorische neuronen zijn cervicale motorische neuronen die afkomstig zijn van C3 tot C6 niveaus in meest zoogdiersoorten. Axonale projecties convergeren in phrenic zenuwen innervating het respiratoire middenrif. In ruggenmerg plakjes, worden niet phrenic motorische neuronen van andere motorische neuronen van morfologische of biochemische criteria geïdentificeerd. Wij bieden de beschrijving van de procedures voor het visualiseren van phrenic motor neuron cel organen in muizen, volgende pleurale injecties voor cholera-toxine subeenheid beta (CTB) geconjugeerd met een fluorophore. Deze fluorescerende neuroanatomische tracer heeft de mogelijkheid om te worden ingehaald op de middenrif motorische eindplaat, retrogradely langs de phrenic axonen worden uitgevoerd en de phrenic cel organen bereiken. Twee methodische opbouw mbt de pleurale CTB levering worden vergeleken: transdiaphragmatic versus transthoracic injecties. Beide benaderingen zijn succesvol en leiden tot soortgelijke aantal CTB-label phrenic motorische neuronen. Kortom, kunnen deze technieken worden toegepast om te visualiseren of te kwantificeren van de phrenic motorische neuronen in verschillende experimentele studies zoals die gericht is op de membraan-phrenic circuits.
Introduction
Het doel van de studie is om een betrouwbare methode om te identificeren phrenic motorische neuronen (filem) op muis ruggenmerg secties. Injectie van een fluorescerende neuroanatomische tracer in de spouw van Pleurale werd gekozen als de leveringsmethode te bereiken de phrenic neuromusculaire projecties op het middenrif en retrograde vervoer langs de phrenic axonen gebruiken om label phrenic cel organen. Twee technieken van Pleurale levering worden beschreven: transdiaphragmatic versus transthoracic.
Phrenic motorische neuronen zijn spinale relay cellen waarvan axonen convergeren in phrenic zenuwen, die uiteindelijk het middenrif innervate. Dit zijn de lagere motorische neuronen het inspiratory station ontvangen de bulbaire respiratoire centra en het doorgeven aan de neuro-musculaire kruispunten van membraan (NMJ). Filem zijn gestructureerd in twee motor kolommen, een voor elke hemicord, loopt langs de medio-cervicale wervelkolom. In de meeste soorten zoogdieren, inclusief de mens, verspreiden de phrenic motor kolommen van niveaus C3 naar C61,2,3. Wij en anderen hebben bevestigd dat filem geconcentreerd in C3-C5-concentraties in de rat en muis ruggenmerg4,5,6,7,8. De topografische verdeling van phrenic cellen is niet willekeurig; motorische neuronen innervating de sternale deel van het middenrif bevinden zich dichter in de craniale deel van het phrenic zwembad van de motor (C3), overwegende dat motorische neuronen innervating de musculus deel meer caudal (C5)9. Bovendien zijn de filem afwisselend geclusterd in het ventrale hoorn grijze stof. Niveau van de C3, de clusters van phrenic cellen liggen lateraal, dan ze verschuiven in de richting van een ventrolateral en ventromedially zijn te vinden op de meest caudal niveaus10,11.
Gezien hun vitale rol tijdens inspiratie, is het van het allergrootste belang nauwkeurig identificeren filem in het gezonde ruggenmerg maar ook volgen hun lot tijdens pathologische toestanden, degeneratieve ziekten of traumatische letsels van het ruggenmerg. Aangezien filem niet morfologisch verschillen van andere cervicale motorische neuronen, identificatie van filem is afhankelijk van de gerichte levering van neuroanatomische traceurs hetzij op het niveau van primaire respiratoire centra8, of op het middenrif NMJ7 of in de phrenic zenuw4. De tracer is in beslag genomen door de zenuwvezels en droeg tot de phrenic cel organen in de cervicale wervelkolom, waar het kan worden gevisualiseerd met behulp van directe of indirecte detectiesystemen. Retrograad of anterograde verklikstoffen zijn commercieel verkrijgbaar met een brede waaier van geconjugeerde. Opmerkelijk, elke tracer is begiftigd met Nee, lage of hoge capaciteiten voor trans synaptic tracering.
In de huidige studie kozen we de subeenheid van de bèta van het cholera-toxine (CTB) matiemaatschappij met Alexa Fluor 555 (voortaan aangeduid als CTB-fluorophore) als een fluorescerende label, waardoor een directe visualisatie van filem op bevroren ruggenmerg secties. CTB wordt meestal beschreven als een monosynaptic tracer hoewel experimentele gegevens de neiging om te laten zien van een transneuronal passage12. CTB heeft de mogelijkheid om de ganglioside GM1 tijdens het plasma-membraan van de beëindiging van de zenuw binden. BTC is geïnternaliseerd via clathrin-afhankelijke of -onafhankelijke mechanismen en trafieken via de trans-Golgi-netwerk in het endoplasmatisch reticulum in een retrograde mode13,14. De internalisering en retrograde vervoer lijken te zijn afhankelijke op de actine cytoskelet15,16 , alsmede op de microtubuli netwerk17.
Om aan te tonen het nut van CTB als een retrograde neuroanatomische tracer labeling membraan-filem circuits, werd CTB-fluorophore intrapleurally geleverd. CTB werd toegediend gebruikend twee technieken: de eerste opgenomen een laparotomie en meerdere transdiaphragmatic injecties; de tweede, minder invasief, gebruikt een unieke transthoracic injectie. Vier dagen later, fluorescently-label PhMNs werden gekwantificeerd in het cervicale ruggenmerg van gezonde zowel uit spinally-verwonde (C4) dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het experimentele protocol werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese Gemeenschappen Raad voor dier Experiment (2010/63/EU, 86/609/EEG en 87-848/EEG) en is goedgekeurd door de Animal ethiek Commissie van Universiteit van namen (ethiek project n ° 17-284 ). Figuur 1 toont de twee benaderingen van de respectieve: transdiaphragmatic of transthoracic injecties. Mannelijke C57bl/6J muizen gebruiken (n = 18), leeftijd van 3 tot 4 maanden in de studie.
1. bereiding van CTB-oplossing
- Voor transdiaphragmatic injecties:
- Los van de macht van de BTC in steriel water bij de concentratie van 0,2% (m/v).
- Laden 7,5 µL van CTB oplossing (0,2% w/v) in een steriele 10-µL-microsyringe met een bijgevoegde 33-gauge naald (botte of korte schuine kant) voor elke muis.
- Transthoracic injectie:
- Los van de macht van de BTC in steriel water bij de concentratie van 0,1% (g/v).
- Laden 20 µL van CTB oplossing (0,1% w/v) in een steriele 500-µl-insuline spuit met een schuine 27-gauge naald voor elke muis.
Opmerking: Zorg ervoor dat u gedestilleerd en steriel water en goed los het CTB poeder. De oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C voor een maand (niet invriezen). Een neerslag kan vormen na enkele dagen. Breng de oplossing op kamertemperatuur en meng goed met behulp van een precisiepipet vóór gebruik.
2. voorbereiding voorafgaand aan pleurale injecties
- Chirurgische instrumenten vóór de operatie, met behulp van autoclaaf of glas-kraal sterilisator steriliseren. Een schone Bank vacht te doen chirurgie en te ontdoen van de chirurgische instrumenten voor te bereiden.
Opmerking: Elk materiaal dat wordt gebruikt tijdens de chirurgische ingreep moet steriel. Instrumenten die niet kunnen worden gesteriliseerd, zoals de microsyringe naar beneden moet worden geveegd met een ontsmettingsmiddel (chloorhexidine) of moet eenmalig gebruik alleen. De chirurg moet zijn/haar handen wassen met een ontsmettingsmiddel (chloorhexidine struikgewas) vóór het begin van de operatie. De chirurg moet steriele handschoenen, een gelaatsmasker en een schone jurk dragen. - Wegen van dier, en beheren van een passende dosis van anesthesie: intraperitoneale injectie met verdoving cocktail (bijvoorbeeld ketamine 100 mg/kg en xylazine 5 mg/kg).
- Teen knijpen en/of controleren voor het verlies van ooglidreflex reflex om te bepalen of de muis is goed verdoofd. Toepassing van een dierenarts zalf ter bescherming van het hoornvlies.
- Scheren zorgvuldig de ventrale huid (voor transdiaphragmatic de procedure) of de rechterpagina thoracale huid (voor transthoracic procedure), met behulp van elektrische tondeuses. Scheren goed en breed genoeg om te voorkomen dat haren krijgen in het gebied van chirurgie.
- Aseptische condities zorgen door actuele toepassing van 10% jodium-oplossing op de geschoren gebied. Schrob de chirurgische site met de jodiumoplossing, voorzichtig om te schrobben vanuit het midden van de site naar de periferie.
- Gebruik een warmbloedig pad gedurende de chirurgie te handhaven van de lichaamstemperatuur van het dier.
3. de pleurale injecties met behulp van de Transdiaphragmatic benadering
- De narcose muis in liggende positie op een verwarming pad vast. Plaats een gewalst gaas pad onder de nek van het dier. Voor een volwassen muis, gebruikt u een pad gewalst gaas van 0,5 inch in dikte. Tape deze pad aan het bestuur van de chirurgie om te vermijden verkeer indien van toepassing.
- Met behulp van een scalpel blad, incise de ventrale huid langs de middellijn: maken van een incisie van de xiphoid process naar de navelstreek tijdens het uitrekken van de huid lateraal met de andere hand om de huid strak. Niet teveel druk van toepassing op het blad om te voorkomen beschadiging van de onderliggende organen.
- Met behulp van kleine schaar, zorgvuldig loskoppelen van de huid van de buikspieren rond de incisie. Deze procedure zal helpen bij het stiksel van de spieren en de huid uit elkaar aan het einde van de operatie.
- Uitvoeren met behulp van kleine schaar laparotomie. Open de buikholte door het uitvoeren van een incisie knoopsgat op het niveau van de navel. Incise de buikspieren aan te spannen langs de witte lijn ("linea alba") tot de xiphoid process.
- Om te visualiseren de abdominale oppervlak van het middenrif, buikspieren met behulp van commerciële of zelfgemaakte OPROLMECHANISMEN worden ingetrokken.
Opmerking: Deze OPROLMECHANISMEN kunnen worden gemaakt van midi-formaat paperclips gevormd in L-haak19. - Strek beide zijden van de laparotomie, en tape naar beneden de oprolmechanismen aan de vacht van de Bank. Optimaliseren de verlichting van het gezichtsveld, zodat de abdominale oppervlak van het middenrif niet meer in de bijschaduw is. De meest krachtige verlichtingsinrichting voor dit doel is een LED-lamp met een oriënteerbare lichtbundel.
- Met behulp van zachte pincet in de ene hand, til het xyphoid aanhangsel en pull-down de laterale lobben van de lever (figuur 2A). Met behulp van kleine schaar in de andere hand, zorgvuldig afgesneden de opschortende ligament, zonder beschadiging van de galblaas of het middenrif (figuur 2B).
- Met behulp van zachte pincet in de ene hand, til het xyphoid aanhangsel. Pak de Hamilton spuit in de andere hand. Richten op drie plaatsen van injectie in de juiste hemidiaphragm voor respectievelijk de sternale, de mediaal en de musculus regio's (figuur 3A, inzet in figuur 3B).
- Zoals de diafragma dikte ongeveer 0,37 mm in muizen7 is, plaats de naald niet meer dan 1 of 2 mm buiten het diafragma blad ter voorkoming van schade van de longen tijdens de ademhaling. Leveren 2,5 µL van CTB oplossing (0,2% w/v) door het juiste diafragma op elke site (figuur 4B). Stabilisatie van het middenrif is niet vereist.
- Herhaal deze procedure voor de drie ipsilaterale sites van injectie (figuur 1A), en contralaterally voor een bilaterale labels van de filem pool.
- Tot slot de laparotomie site suture buikspieren met resorbeerbare hechtdraad 4-0. Gebruik onderbroken steken verdeeld door 3 mm. het nietje huid gesloten met 9.0 mm wond clips. Draai om te voorkomen dat dieren trekken uit staples nietjes. Ruimte nietjes ongeveer 5 mm uit elkaar. Niet teveel scherpen de wond clips, als dit tot verminderde genezing leiden kan.
- Schoon micro spuit met gedestilleerd water om te voorkomen dat verstopping. Langzaam opstellen en verdrijf 2 - 3 keer. Trekt niet lucht in spuit.
4. de pleurale injectie met behulp van de Transthoracic benadering
Opmerking: Deze methode is geïnspireerd door de procedure die wordt beschreven in ratten4 en werd aangepast aan de muis.
- De narcose muis in linker laterale decubitus plaats, op een verwarming pad (figuur 4A) vast.
- De zesde en zevende ribben onder de elleboog regio identificeren door manuele palpatie (figuur 4B).
- Terwijl een assistent breidt juiste voorgrond - en hind-ledematen (figuur 5A), plaatst u de spuit cranially georiënteerd en tangentieel onder de zesde of de zevende rib, 3 mm diep uit de huid, met de schuine kant naar beneden (figuur 1B en figuur 5B).
- Verhoog de naald voorzichtig om te bevestigen, door het opheffen van de ribben omhoog, dat is het goed gepositioneerd in de borstholte (figuur 5C, inzetstukken in figuur 1B).
- Stabiliseren ademhaling bewegingen van de borstkas door lichte druk met twee vingers toe te passen op de borstwand.
- Houd de injectiespuit in de andere hand en leveren 20 µL van CTB oplossing (0,1% w/v) in een enkele injectie.
5. post-operatieve zorg
- Onmiddellijk na de ingreep, lag de muis in recht laterale decubitus positie op een warmbloedig pad voor herstel. Dit zorgt voor de tracer te verspreiden aan de rechterkant van de pleura Holte en voorziet in controle van dierlijke ademhaling.
- 1 mL steriele zoutoplossing i.p. subcutaan beheren. Follow-up injecties geven als het dier uitgedroogd en/of lusteloos lijkt.
- Beheren subcutaan buprenorfine, 0,1 mg/kg tweemaal per dag tijdens de eerste twee dagen na operatie, om te minimaliseren van eventuele mogelijke pijn.
Opmerking: Veel instellingen zou raden multimodale analgesie voor invasieve procedures, zoals de hier afgebeelde laparotomie. Dit kan onder meer het gebruik van een niet-steroïdale anti-inflammatoire (NSAID) medicatie en/of een plaatselijke verdoving agent op de site van de snede. Deze medicijnen worden gewoonlijk geleverd vóór de eerste snede te minimaliseren wind-up pijn. - Toezicht op dieren dagelijks tot euthanasie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mannelijke C57bl/6J muizen (n = 18), leeftijd van 3 tot 4 maanden werden opgenomen in de studie. Op dag 0 van het experiment onderging 8 muizen een eenzijdige C4 kneuzingen, rechterpagina, volgens gepubliceerde protocol7,18. Als sham procedure onderging 10 muizen een laminectomie bovenop C4 zonder kneuzingen. Op dag 3, waren muizen voorbereid op de pleurale injecties van CTB-fluorophore volgens de twee verschillende procedures zoals hierboven beschreven. Op dag 7, waren alle muizen euthanized na verdoving (ketamine 100 mg/kg en xylazine 5 mg/kg) en exsanguination.
Hele spinal koorden zijn geoogst, opgelost in paraformaldehyde en cryoprotected in 30 gewichtspercenten sacharose volgens standaard lab procedures. Cervicale uitbreiding werd geïsoleerd, ingebed in O.C.T. en cryosectioned overlangs of textielgedeelte bij een dikte van 30 µm.
Longitudinale spinale secties werden waargenomen met een epifluorescerende Microscoop uitgerust met filter kubus fluorescentie p.a. (excitatie: 560/20nm; Emissie: 635/30nm). Fluorescerende motorische neuronen in de ventrale Hoorn werden geïdentificeerd als een lineaire kolom met cellen uit C3 C5 niveaus (figuur 6A, bovenste deelvenster). Alle gelabelde cellen waren gevestigd in de ipsilaterale grijze stof en tentoongesteld morfologie overeenstemming met motorische neuronen (figuur 6B). In gewonde dieren, was een opvallende verlies van gelabelde filem waargenomen bij C4 vlak betreft, alsmede de verstoring van de spinale weefsels (sterretje in figuur 6A en 6 C). CTB+ PhMNs telde handmatig elke vijfde dwarse sectie (verdeeld door 150 µm) in ongedeerd en C4-verwonde spinal koorden (Figuur 6 c). Een schatting van het totale aantal gelabelde PhMNs werd berekend door het aantal getelde cellen van de BTC+ te vermenigvuldigen met 5. Het totale aantal gelabelde PhMNs per hemicord was ongedeerd gezonde muizen geraamd op 151 ± 9 bij het gebruik van transdiaphragmatic (TDia) benadering, in vergelijking tot 178 ± 9 bij het gebruik van transthoracic (TTho) benadering (figuur 6D). Deze nummers daalde na C4 letsel, respectievelijk tot 59 ± 14 en 70 ± 10. In deze studie geen statistische verschillen tussen de twee soorten pleurale levering waren blijkt (p > 0,05, Mann-Whitney U test; TDia versus TTho).
Figuur 1. Pleurale injecties met transdiaphragmatic of transthoracic injecties. Transdiaphragmatic benadering omvat een laparotomie, blootstelling van abdominale oppervlak van het middenrif (in roze kleur) en drie injecties in de sternale, mediale en musculus regio's een. Voor de aanpak van het transthoracic, wordt de muis in de linker laterale decubitus positie gelegd. De zesde en zevende ribben worden aangeduid onder de elleboog regio met manuele palpatie B. De naald wordt ingebracht via de huid en het onderhuidse weefsel, de thoracale spieren, de intercostale spieren, de pariëtale pleura te bereiken de pleurale Holte (asterix). S, sternale; m, mediaal; c, musculus; S/SC, huid en subcutane weefsel; TM, thoracale spieren; IC, intercostale spieren; PP; pariëtale pleura; L, Long. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Chirurgische veld met uitzicht op de lever, galblaas en abdominale gezicht van het middenrif. A. opmerking de opschortende ligament tussen de galblaas en het middenrif. B. het ligament wordt zorgvuldig afgesneden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Uitzicht op het middenrif. De sternale (s), de mediale (m) en de musculus (c) gebieden worden geïdentificeerd in de juiste hemidiaphragm. A. merk op dat de musculus regio posterieure aan de lobben van de lever. B. om te injecteren CTB in de pleurale ruimte, plaats de naald 1 mm diep door het juiste hemi-diafragma. De injectie in de mediale gebied is geïllustreerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. De aanpak van de transthoracic. Muis bevindt zich in de linker laterale decubitus A. Het identificeren van de ribben marge van het middenrif en de elleboog-regio. B. de zesde en zevende intercostale ruimten worden geïdentificeerd diep aan de elleboog-regio. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5. De zesde en zevende intercostale ruimten worden geïdentificeerd diep aan de regio elleboog. A. Fore - en hind-ledematen worden uitgebreid. B. de spuit is cranially georiënteerd en tangentieel ingevoegd onder de zesde of de zevende rib, 3 mm diep door de intercostale spieren, met de schuine rand-ondersteboven. C. de naald is voorzichtig verhoogd en de ribben worden opgeheven om te bevestigen de naald is goed gepositioneerd in de borstholte. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6. Cellen van de BTC+ in de ventrale hoorn grijze stof van intrapleurally-geïnjecteerd muizen. A. In spinally-ongedeerd muis, CTB+ phrenic motorische neuronen verdelen langs het cervicale ruggenmerg van niveau C3 tot en met C5. In gekeusd muis, wordt verstoring van het weefsel waargenomen eenzijdig met verlies van CTB+ phrenic motorische neuronen C4 niveau (asterix). B. label CTB+ cellen werden gevestigd in de ipsilaterale grijze stof en morfologie overeenstemming met motorische neuronententoongesteld. C. Transverse secties spinal koorden te kwantificeren van het aantal cellen van de BTC+ op specifieke afstanden langs het ruggenmerg in ongedeerd (links) en geblesseerde (rechts) muizen werden gebruikt. D. kwantificering van CTB+ cellen in de ipsilaterale hemicord in ongedeerd of gewonde muizen, volgens de transdiaphragmatic (TDia) of transthoracic (TTho) benadering van Pleurale CTB levering. Bars vertegenwoordigen 250 µm. gegevens werden uitgedrukt als de gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde (SEM). n = 5-7 muizen in elke groep van de TDia; n = 3 muizen in elke groep TTho. Non-parametrical Mann-Whitney U tests werden uitgevoerd en de resultaten werden beschouwd als significant verschillend voor p < 0.05. p < 0.001 voor ongedeerd versus C4 letsel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hierin beschreven kan worden toegepast op elke stam van volwassen muizen of aan een experimentele paradigma waarin de integriteit van de membraan-filem circuits moet worden geëvalueerd. Amyotrofische laterale sclerose (ALS) en cervicale ruggenmerg letsel (cSCI) zijn bijvoorbeeld voorwaarden in verband met filem verlies, anterograde degeneratie van phrenic axonen en latere respiratoire compromis. Dierlijke modellen ALS of cSCI nabootsen histopathologisch en functionele respiratoire tekorten die worden waargenomen in ziekten bij de mens. In deze modellen, worden histologisch technieken vaak toegepast om te evalueren filem overleven volgende verschillende therapeutische interventies die gericht zijn op filem neuroprotectie18,20,21. Geen problemen voor opname in het middenrif NMJ of axonale vervoer zal ongetwijfeld de hoeveelheid CTB geaccumuleerd in de neuronale cel organen in gevaar brengen. Verlies van phrenic axonen of filem degeneratie zal uiteraard de hoeveelheid CTB retrotransported dalen in het ruggenmerg.
Elke benadering van Pleurale administratie heeft zijn eigen pros en cons. Transdiaphragmatic injecties zijn vrij invasief, vergend laparotomie en zorgvuldige binddraad van alle huidlagen om te voorkomen dat de dehiscentie en orgel uitsteeksel. Laparotomie interfereert met de normale ademhaling22 en men kan niet uitsluiten dat het filem activiteit of retro-transport-efficiëntie kan beïnvloeden. Echter, de directe visualisatie van het middenrif tijdens de injectie zorgt voor succesvolle doelgerichtheid van de pleurale ruimte alle tijd. Transthoracic injecties zijn minimaal-invasieve in vergelijking met transdiaphragmatic injecties en dus kunnen worden beschouwd als een procedure voor verfijning, in de trant van "Drie Rs" concept. Een nadeel is de verhoogde kans wordt uit-target voor een onervaren gebruiker (bijvoorbeeld in het onderhuidse weefsel of de borstwand).
Naar aanleiding van Pleurale TL-CTB administratie is het waarschijnlijk dat een motor neuron projecteren op spieren voering van de pleura holte zal worden gelabeld, met inbegrip van filem, intercostale motorische neuronen of verschillende populaties van de hersenstam motorische neuronen. Bij volwassen ratten, Mantilla et al. aangetoond dat intercostale motorische neuronen ook in de ventrale Hoorn van thoracale ruggenmerg, evenals sommige achterwortelganglia ganglion neuronen4waren gelabeld. Wij hebben nooit gecontroleerd op de aanwezigheid van CTB-geëtiketteerden cellen op andere sites dan het cervicale ruggenmerg in muizen.
Afhankelijk van de experimentele instellingen/modellen, resultaat maatregelen de in kolomvorm rangschikking van PhMNs langs het cervicale ruggenmerg, gedetailleerde analyse van de geometrische gegevens over de positie van elke filem kunnen opnemen of, zoals hier beschreven, de kwantificering van filem nummer. De nauwkeurige evaluatie van filem puntentotaal is afhankelijk van de technische overwegingen en inter-onderzoeker betrouwbaarheid; vanwege de variabiliteit van CTB intensiteit van de fluorescentie, neuron soma grootte of achtergrondkleuring. In onze ervaring in het gebruik van transdiaphragmatic injecties van CTB-fluorophore, hebben we het aantal filem per muis hemicord in een bereik tussen de 120 en 180 cellen, een aantal iets minder dan gegevens uit andere groepen8geschat. Inderdaad, er zijn twee beperkingen van de studie. Ten eerste, een beperkt aantal dieren worden geïnjecteerd met behulp van de transthoracic benadering en ten tweede is er onzekerheid op volledige labelen van filem zwembad. Phrenic zenuw duik (na zenuw transect) of intraneural injecties met fluorescerende neuroanatomische tracer zijn complementaire technieken die kunnen worden gebruikt om nauwkeuriger het etiket van alle PhMNs. Voor toekomstige studies, is het aanbevolen om het tellen van PhMNs door onbevooroordeelde methoden zoals stereology.
In onze ervaring, hebben wij nooit een duidelijke respiratoire tekort of complicaties (respiratoire nood) waargenomen zoals bloeding of pneumothorax u deze procedure uitvoert. Echter, als het middenrif is beschadigd tijdens de transdiaphragmatic injecties, overwegen met behulp van een naald van kleinere diameter of met scherpere schuine kant.
Om te voorkomen dat dieren overlijden tijdens of na de operatie Controleer zorgvuldig de concentraties van elk onderdeel in de verdoving cocktail. Vermijden makend verwondingen op het oppervlak van de lever, de galblaas en de darm en het middenrif.
Geen of lage labeling van filem kon te wijten zijn aan verschillende problemen. Als de transthoracic injectie de pleurale holte mist, opnieuw doen en controleren door manuele palpatie dat de naald wordt ingevoegd onder de ribben te doen of niet pop uit via de huid. Geen luchtbellen moeten na injectie van CTB oplossing vormen. Onthoud ook dat de internalisering van CTB in de nerveus cel pH-afhankelijke23: zure en neutrale pH zijn optimale terwijl elementaire pH belemmert de opname van het toxine. Het is aanbevolen om resuspendeer CTB poeder in water, in een zoutoplossing of in PBS buffer. De tijd van de persistentie van de gelabelde toxine in de neuronale cel lichaam overwegen. In onze ervaring, kunnen wij CTB-geëtiketteerden cellen in een venster van de tijd tussen vier dagen en twee weken na aflevering van de pleurale detecteren. Verminderen van de tijd toegewezen aan vervoer retrograde of verhoging van de tijd tussen pleurale levering en offer in gevaar kan brengen de optimale detectie van TL-CTB in het weefsel.
Voorkom fluorescentie fading juiste kleefpoeders methode gebruiken. Wij stellen voor dat het lichaam van het dier met gebufferde 4% paraformaldehyde zoogdierlevercellen. Zodra het ruggenmerg wordt geoogst, in de dezelfde fixeerspray na een nacht bebroeden. Cryoprotect het snoer in een 30% sacharoseoplossing voor 72 uur tot zinken, vervolgens insluiten de cervicale uitbreiding (ongeveer 8 mm) in O.C.T. medium. Niet uitdrogen of insluiten van het monster in paraffine. Spinale monsters of weefselsecties beschermen tegen licht tijdens de hele post verwerking. Vaste gehele spinal koorden kunnen worden bewaard bij 4 ° C voor maanden als thimerosal wordt toegevoegd aan de cryoprotectant-oplossing (Voeg geen natriumazide zoals deze fluorescentie vervagen provoceren zal). Weefselsecties kunnen gedurende maanden weg van licht bij-20 ° C worden bewaard. Tot slot, wij adviseren te monteren van de dia's met een anti-vervagen-reagens. Als de fluorescentie heeft verschoten, is het nog steeds mogelijk om op te sporen met behulp van immunohistochemistry CTB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij zijn Robert Graffin en Pauline Duhant dankbaar voor hun technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
References
- Webber, C. L. Jr, Wurster, R. D., Chung, J. M. Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping. Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).
- Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study. J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).
- Gordon, D. C., Richmond, F. J. Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques. J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).
- Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. The phrenic motor nucleus in the adult mouse. Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles. J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).
- Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study. J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).
- Gottschall, J. The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons. Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).
- Lai, B. Q., et al. Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve. PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).
- Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms. J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).
- Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).
- Fujinaga, Y., et al. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).
- Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton. Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).
- Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Llado, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).
- Sieck, G. C., Fournier, M. Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors. J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).
- Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action. Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).
