Summary
Nous décrivons ici, un protocole d’identification des motoneurones phréniques chez la souris après que livraison intrapleurale du fluorophore conjugué bêta de choléra toxine sous-unité. Deux techniques sont comparées pour injecter de la cavité pleurale : transdiaphragmatic par rapport aux approches transthoracique.
Abstract
Motoneurones phréniques sont des neurones de moteur du col utérin provenant de C3 à C6 niveaux en plus des mammifères. Projections axonales convergent dans des nerfs phréniques qui innervent le diaphragme respiratoire. Dans des tranches de la moelle épinière, les motoneurones phréniques ne peut être identifiés d’autres neurones moteurs sur des critères morphologiques ou biochimiques. Nous fournissons la description des procédures pour visualiser les corps cellulaires des motoneurones phréniques chez des souris, des injections d’intrapleurale suivants de bêta de sous-unité choléra toxine (CTB) conjugué à un fluorophore. Ce traceur fluorescent neuroanatomique a la capacité d’être rattrapé à la jonction neuromusculaire de diaphragme, être emportés marqués les axones phréniques et atteindre les corps cellulaires phréniques. On compare les deux approches méthodologiques de la livraison CTB intrapleurale : transdiaphragmatic versus les injections transthoracique. Les deux approches sont efficaces et donner lieu à un nombre similaire de motoneurones phréniques CTB-étiqueté. En conclusion, ces techniques peuvent être appliquées afin de visualiser ou de quantifier les motoneurones phréniques dans diverses études expérimentales telles que celles axées sur le circuit de diaphragme-phrénique.
Introduction
L’objectif de l’étude est de présenter une méthode fiable pour identifier les neurones moteurs phréniques (PhMN) sur des coupes de moelle épinière de souris. Injection d’un traceur fluorescent neuroanatomique dans la cavité pleurale a été choisie comme la méthode de livraison pour atteindre les projections neuromusculaires le diaphragme phréniques et transport rétrograde le long des axones phréniques permet d’étiqueter des corps cellulaires phréniques. Deux techniques de livraison intrapleurale sont décrites : transdiaphragmatic versus transthoracique.
Motoneurones phréniques sont des cellules de relais de la colonne vertébrale dont les axones convergent dans des nerfs phréniques, qui finalement innervent le diaphragme. Ce sont des neurones moteurs inférieurs recevoir l’entraînement inspiratoire des centres respiratoires bulbaires et il relais des messages vers les jonctions neuro-musculaires du diaphragme (NMJ). PhMN sont structurées en deux colonnes de moteurs, un pour chaque hemicord, le long de la colonne vertébrale-cervical. Dans la plupart des espèces de mammifères dont les humains, les colonnes moteurs phréniques propagation de niveaux C3 à C61,2,3. Nous et autres avons confirmé que PhMN concentrés dans des niveaux de C3-C5 dans le rat et la souris moelle épinière4,5,6,7,8. La répartition topographique des cellules phréniques n’est pas au hasard ; motoneurones innervant la partie sternale du diaphragme sont distribués plus dense dans la partie crânienne de la piscine de moteur phrénique (C3), tandis que les motoneurones innervant la partie crurale sont plus caudal (C5)9. En outre, les PhMN sont regroupés diversement dans la matière grise de corne ventrale. Au niveau de la C3, les grappes de cellules phréniques se trouvent latéralement, puis qu’elles bougent dans le sens ventro ni sont trouvent ventromedially à la plus caudale niveaux10,11.
Compte tenu de leur rôle essentiel pendant l’inspiration, il est primordial d’identifier avec précision PhMN dans la moelle épinière en bonne santé, mais également suivre leur sort au cours de pathologies, telles que les traumatismes de la moelle épinière ou de maladies dégénératives. Car PhMN ne diffèrent pas morphologiquement des autres neurones moteurs du col utérin, identification de PhMN repose sur l’administration ciblée des traceurs neuroanatomiques soit au niveau des centres respiratoires primaires8, le diaphragme NMJ7 ou au le nerf phrénique4. Le traceur est absorbé par les fibres nerveuses et transporté jusqu'à les phréniques corps cellulaires dans le rachis cervical, où elle peut être visualisée à l’aide de systèmes de détection directe ou indirecte. Rétrograde ou antérograde traceurs sont commercialement disponibles avec une large gamme de conjugués. Remarquable, chaque traceur est doté de no, basses ou hautes capacités pour le suivi des trans synaptique.
Dans la présente étude, nous avons choisi la sous-unité bêta de la toxine de choléra (CTB) fonctionnalisée avec Alexa Fluor 555 (désormais dénommé CTB-fluorophore) comme une étiquette fluorescente, ce qui permet une visualisation directe des PhMN sur des coupes congelées de la moelle épinière. CTB est habituellement décrite comme traceur monosynaptique, bien que les données expérimentales tendent à montrer un passage de transneuronal12. CTB a la capacité de lier le ganglioside GM1 à la membrane plasmique de la terminaison nerveuse. CTB est internalisée par clathrin-dépendante ou - indépendant des mécanismes et des trafics à travers le réseau trans-Golgi dans le réticulum endoplasmique dans un mode rétrograde13,14. L’internalisation et le transport rétrograde semblent dépendre l’actine cytosquelette15,16 , ainsi que sur le réseau de microtubules17.
Pour démontrer l’utilité de la CTB comme traceur neuroanatomique rétrograde étiquetage diaphragme-PhMN circuit, CTB-fluorophore fut livré intrapleurale. CTB a été administré à l’aide de deux techniques : l’une comprenait une laparotomie et injections multiples de transdiaphragmatic ; le second, moins invasive, utilisé une unique injection transthoracique. Quatre jours plus tard, fluorescent marqué PhMNs ont été quantifiés dans la moelle épinière cervicale à la fois sain et animaux (C4) spinal-blessés.
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Protocol
Le protocole expérimental a été réalisé conformément aux Directives du Conseil européen des communautés pour l’expérimentation animale (2010/63/UE, 86/609/CEE et 87-848/CEE) et a été approuvé par l’Animal éthique Comité des FUNDP (éthique du projet n ° 17-284 ). La figure 1 illustre les deux approches respectives : transdiaphragmatic ou injections transthoracique. Utilisez la souris C57bl/6J mâles (n = 18), âgés de 3 à 4 mois dans l’étude.
1. préparation de la Solution de la CTB
- Pour les injections de transdiaphragmatic :
- Dissoudre la puissance de la CTB dans de l’eau stérile à la concentration de 0,2 % (p/v).
- Chargez 7,5 µL de solution de la CTB (0,2 % p/v) dans une stérile 10-µL-microseringue avec une aiguille de calibre 33 ci-joint (biseau émoussé ou court) pour chaque souris.
- Pour injection transthoracique :
- Dissoudre la puissance de la CTB dans de l’eau stérile à la concentration de 0,1 % (p/v).
- Charger 20 µL de solution CTB (0,1 % p/v) dans une seringue stérile d’insulino-µl-500 avec une aiguille de calibre 27 biseautée pour chaque souris.
Remarque : Veillez à utiliser de l’eau distillée et stérile et bien dissoudre la poudre de la CTB. La solution peut être conservée à 4 ° C pendant un mois (ne pas congeler). Un précipité pourrait former après quelques jours. Porter la solution à température ambiante et mélanger bien à l’aide d’une pipette avant utilisation.
2. préparation avant injection intrapleurale
- Stériliser les instruments chirurgicaux avant la chirurgie, à l’aide d’un stérilisateur autoclave ou verre-perle. Préparer un manteau banc propre à faire de la chirurgie et à disposer des outils chirurgicaux.
Remarque : N’importe quel matériel utilisé au cours de l’intervention chirurgicale doit être stérile. Instruments qui ne peuvent pas être stérilisés comme la microseringue doit être essuyé avec un désinfectant (chlorhexidine) ou doit être à usage unique seulement. Le chirurgien doit laver ses mains avec un désinfectant (chlorhexidine gommage) avant le début de l’intervention chirurgicale. Le chirurgien doit porter des gants stériles, un masque et une blouse propre. - Peser l’animal et d’administrer une dose appropriée de l’anesthésie : injection intrapéritonéale de cocktail anesthésique (p. ex. kétamine 100 mg/kg et xylazine 5 mg/kg).
- Pincer les orteils et/ou vérifiez pour la perte du réflexe palpébral afin de déterminer si la souris est correctement anesthésiée. Appliquer une pommade vétérinaire pour protéger la cornée.
- Se raser avec soin la peau ventrale (pour transdiaphragmatic procedure) ou la côté droit thoracique peau (pour procédure transthoracique), à l’aide de tondeuses électriques. Se raser bien et suffisamment large pour éviter les cheveux dans le domaine de la chirurgie.
- Assurer des conditions d’asepsie par application topique de solution d’iode de 10 % sur la zone rasée. Frotter le site chirurgical avec la solution d’iode, en prenant soin de frotter du centre du site vers la périphérie.
- Utiliser un tampon homéothermes tout au long de la chirurgie pour maintenir la température du corps de l’animal.
3. intrapleurale Injections à l’aide de la méthode Transdiaphragmatic
- Fixer la souris anesthésiée en décubitus dorsal sur un coussin chauffant. Placez une compresse de gaze roulée sous le cou de l’animal. Pour une souris adulte, utilisez une compresse de gaze roulée de 0,5 pouce d’épaisseur. Ce coussin à la Commission de la chirurgie pour éviter tout mouvement éventuel du ruban.
- À l’aide d’une lame de bistouri Swann-Morton, inciser la peau ventrale le long de la ligne médiane : faire une incision du processus xiphoïde pour la région ombilicale tout en étirant la peau latéralement de l’autre main pour rendre la peau tendue. Ne pas appliquer trop de pression sur la lame pour éviter d’endommager les organes sous-jacents.
- À l’aide de petits ciseaux, détacher délicatement la peau des muscles autour de l’incision abdominales. Cette procédure permettra à piquer les muscles et la peau part à la fin de la chirurgie.
- Effectuer une laparotomie à l’aide de petits ciseaux. Ouvrir la cavité abdominale en effectuant une incision de la boutonnière au niveau de l’ombilic. Inciser les muscles abdominaux le long de la ligne blanche ("linea alba ») jusqu'à le processus xiphoïde.
- Afin de visualiser la surface abdominale du diaphragme, rétraction des muscles abdominaux, l’utilisation commerciales ou maison enrouleurs.
NOTE : Ces rétracteurs peuvent être faites de midi-taille trombones en forme de crochets en L19. - Étirer les deux côtés de la laparotomie et bande vers le bas les rétracteurs à la couche de banc. Optimiser l’éclairage du champ de vision de sorte que la surface abdominale du diaphragme n’est plus dans la pénombre. Le dispositif d’éclairage plus puissant à cet effet est une lampe à LED avec un faisceau lumineux orientable.
- Utilisez des pinces souples dans une main, soulevez l’appendice xyphoid et tirer vers le bas des lobes latéraux du foie (Figure 2 a). À l’aide de petits ciseaux dans l’autre main, découpez soigneusement le ligament suspenseur, sans endommager la vésicule biliaire ou du diaphragme (Figure 2 b).
- Utilisez des pinces souples dans une main, soulevez l’appendice xyphoid. Tenez la seringue de Hamilton dans l’autre main. Cibler les trois sites d’injection dans l’hémidiaphragme droit pour couvrir respectivement le sternum, du côté médial et les régions crurales (Figure 3 a, incrustés dans la Figure 3 b).
- L’épaisseur de la membrane étant environ 0,37 mm de souris7, insérer l’aiguille ne pèse que 1 ou 2 mm au-delà de la feuille de membrane pour empêcher des dommages de poumon au cours de la respiration. Fournir 2,5 µL de solution de la CTB (0,2 % p/v) à travers le diaphragme droit sur chaque site (Figure 4 b). Stabilisation de la membrane n’est pas nécessaire.
- Répétez cette procédure pour les trois sites ipsilatérale d’injection (Figure 1 a) et controlatérale pour un étiquetage bilatérale de la piscine de PhMN.
- Pour fermer le site de la laparotomie, suture des muscles abdominaux avec résorbable 4-0 suture. L’utilisation interrompus points espacés de 3 mm. peau Staple fermée avec clips 9,0 mm enroulé. Serrer les agrafes pour empêcher l’animal arrachant les agrafes. Espace des agrafes environ 5 millimètres. Ne pas trop serrer les attaches de la plaie, car cela peut conduire à la guérison avec facultés affaiblies.
- Microseringue nettoyer avec de l’eau distillée pour éviter tout colmatage. Lentement, dresser et expulser 2 ou 3 fois. Ne pas prendre l’air dans la seringue.
4. intrapleurale Injection en utilisant une approche transthoracique
Remarque : Cette méthode est inspirée de la procédure décrite dans les rats4 et a été adaptée à la souris.
- Fixer la souris anesthésiée en position de décubitus latéral, sur un coussin chauffant (Figure 4 a) à gauche.
- Identifier les sixième et septième côtes dans la région du coude par palpation manuelle (Figure 4 b).
- Alors qu’un assistant s’étend à droite avant - et -membres postérieurs (Figure 5 a), insérer la seringue parotidien orientée et tangentiellement au titre de la sixième ou la septième côte, 3 mm de profondeur de la peau, le biseau vers le bas (Figure 1 b et Figure 5 b).
- Élever l’aiguille doucement pour confirmer, en soulevant les côtes, qu’il est bien placé dans la cavité thoracique (Figure 5, encarts dans la Figure 1 b).
- Stabiliser les mouvements de la poitrine de la respiration en appliquant une légère pression avec deux doigts sur la paroi thoracique.
- Tout en tenant la seringue dans l’autre main, livrer 20 µL de solution CTB (0,1 % p/v) en une seule injection.
5. soins postopératoires
- Immédiatement après l’intervention, poser la souris en position de décubitus latéral droit sur un bloc homéothermes pour la récupération. Cela garantit le traceur à se répandre sur le côté droit de la cavité pleurale et permet de surveiller la respiration de l’animal.
- Administrer 1 mL de solution saline stérile i.p. par voie sous-cutanée. Fournir des injections suivies si l’animal semble déshydraté et/ou apathique.
- Administrer par voie sous-cutanée de 0,1 mg/kg de buprénorphine, deux fois par jour au cours de la première chirurgie après deux jours, afin de minimiser toute douleur potentielle.
NOTE : De nombreuses institutions recommande une analgésie multimodale pour les procédures invasives, telles que la laparotomie représentée ici. Cela pourrait inclure l’utilisation d’un non-stéroïdiens anti-inflammatoires (AINS) et/ou un agent anesthésique local à l’emplacement de l’incision. Ces médicaments sont généralement envoyées avant la première incision pour minimiser la douleur lié à la conversion. - Surveiller les animaux tous les jours jusqu'à l’euthanasie.
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Representative Results
Les souris C57bl/6J mâles (n = 18), âgés de 3 à 4 mois ont été inclus dans l’étude. Au jour J0 de l’expérience, 8 souris ont subi une contusion unilatérale de C4, côté droit, selon le protocole publié7,18. Comme intervention factice, 10 souris ont subi une laminectomie sur le dessus de C4 sans contusion. Au 3e jour, souris ont été préparés pour les injections intrapleurale de CTB-fluorophore selon les deux procédures différentes décrites ci-dessus. Au jour 7, toutes les souris ont été euthanasiés après anesthésie (kétamine 100 mg/kg et xylazine 5 mg/kg) et exsanguination.
Toute moelles épinières ont été récoltés, fixe du paraformaldéhyde et cryoprotected à 30 % de saccharose conformément aux procédures standard de laboratoire. L’élargissement du col utérin a été isolé, incorporés dans les PTOM et sectionnés longitudinalement ou transversalement sur une épaisseur de 30 µm.
Section longitudinale de la colonne vertébrale ont été observées avec un microscope à épifluorescence équipé avec cube de filtre pour l’analyse de fluorescence (Excitation : 560/20 nm ; Emission : 635/30nm). Fluorescent de motoneurones de la corne ventrale ont été identifiés comme une colonne linéaire des cellules de C3 à C5 niveaux (Figure 6 a, panneau supérieur). Toutes les cellules marquées se trouvaient dans la matière grise ipsilatérale et exposé morphologie conforme aux neurones moteurs (Figure 6 b). Chez les animaux blessés, une perte frappante de PhMN marquée a été observée au niveau de C4, ainsi que de la désorganisation tissulaire de la colonne vertébrale (astérisque dans la Figure 6 a et 6C). CTB+ PhMNs ont été comptés manuellement chaque cinquième section transversale (espacée de 150 µm) au blessé et C4-blessés moelles épinières (Figure 6). Une estimation du nombre total des PhMNs marqués a été calculée en multipliant le nombre de cellules CTB+ comptés par 5. Blessé chez la souris, le nombre total de marqués PhMNs par hemicord a été estimé à 151 ± 9 lorsque vous utilisez transdiaphragmatic (TDia) approche, par rapport à 178 ± 9 lorsque vous utilisez transthoracique (TTho) approche (Figure 6). Après blessure de C4, ces chiffres ont chuté respectivement de 59 ± 14 et 70 ± 10. Dans cette étude, aucune différence statistique ont été mis en évidence entre les deux méthodes de livraison intrapleurale (p > 0,05, test U de Mann-Whitney ; TDia versus TTho).
Figure 1. Intrapleurale injections à l’aide de transdiaphragmatic ou injections transthoracique. Transdiaphragmatic approche inclut une laparotomie, l’exposition de surface abdominale du diaphragme (en couleur rose) et trois injections dans les régions sternales, médiales et crurales A. Pour approche transthoracique, la souris est mises en position de décubitus latéral gauche. Les sixième et septième côtes sont identifiés dans la région du coude par palpation manuelle B. L’aiguille est insérée à travers la peau, les tissus sous-cutanés, les muscles thoraciques, les muscles intercostaux et la plèvre pariétale pour atteindre la cavité pleurale (asterix). S, sternale ; m, médiale ; c, crural ; S/SC, peau et tissu sous-cutané ; TM, les muscles thoraciques ; IC, les muscles intercostaux ; pp ; plèvre pariétale ; L, poumon. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Champ opératoire avec une vue sur le foie, la vésicule biliaire et visage abdominale du diaphragme. A. Notez le ligament suspenseur entre la vésicule biliaire et le diaphragme. B. le ligament est coupé avec soin. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Vue sur le diaphragme. Le sternal (s), la médiale (m) et le crurales (c) zones sont identifiés dans l’hémidiaphragme droit. A noter que la région crurale est postérieure aux lobes du foie. B. pour injecter la CTB dans la cavité pleurale, insérer l’aiguille de 1 mm de profondeur à travers le droit hemi-diaphragme. L’injection dans la zone médiane est illustré. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Approche transthoracique. La souris est placée en décubitus latéral gauche A. Identifier le rebord costal de la membrane et de la région du coude. B. les sixième et septième espaces intercostaux sont identifiés profond à la région du coude. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5. Les sixième et septième espaces intercostaux sont identifiés profond à la région du coude. A. Fore - et -pattes sont étendus. B. la seringue est orientée parotidien et tangentiellement insérée sous la sixième ou la septième côte, 3 mm de profondeur dans les muscles intercostaux, avec la coupe en biseau à l’envers. C. l’aiguille est légèrement élevée et les nervures sont levées pour confirmer l’aiguille est bien positionnée dans la cavité thoracique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 6. Les cellules dans la matière grise de corne ventrale des souris injection intrapleurale CTB+ . A. chez les souris indemnes spinal, CTB+ motoneurones phréniques distribuer le long de la moelle épinière cervicale de niveau C3 à C5. Chez les souris contuses, désorganisation tissulaire est observée unilatéralement avec perte de CTB+ motoneurones phréniques au niveau C4 (asterix). B. les cellules marquées CTB+ se trouvaient dans la matière grise ipsilatérale et exposé morphologie conforme aux neurones moteurs. C. des sections transversales des moelles épinières ont été utilisées pour quantifier le nombre de cellules de la CTB+ à des distances précises le long de la moelle épinière en blessé (gauche) et souris (à droite) blessées. D. cellules de Quantification de la CTB+ se trouvent dans le hemicord homolatéral chez la souris indemnes ou blessés, selon le transdiaphragmatic (TDia) ou transthoracique (TTho) approche de livraison CTB intrapleurale. Barres représentent 250 µm. les données ont été exprimés comme la moyenne ± erreur-type de la moyenne (SEM). n = 5-7 souris dans chaque groupe TDia ; n = 3 souris dans chaque groupe de TTho. Les tests non paramétriques de U de Mann-Whitney ont été réalisés et les résultats ont été considérés comme significativement différentes pour p < 0,05. p < 0,001 pour indemnes contre C4 blessure. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole décrit ci-après peut être appliqué à une souche de souris adultes ou à n’importe quel paradigme expérimental où l’intégrité de la circuiterie de diaphragme-PhMN doit être évaluée. Par exemple, sclérose latérale amyotrophique (SLA) et du col de la moelle épinière (cSCI) sont des conditions liées à la perte de PhMN, antérograde une dégénérescence des axones phréniques et compromis respiratoire subséquente. Modèles animaux de SLA ou cSCI imitent les déficits respiratoires histopathologiques et fonctionnelles observées dans les maladies humaines. Dans ces modèles, les techniques histologiques sont souvent appliqués pour évaluer qui suit PhMN survie diverses interventions thérapeutiques visant à PhMN neuroprotection18,20,21. Des problèmes d’absorption à la membrane NMJ ou transport axonal compromettra sans aucun doute la quantité de CTB accumulée dans le corps des cellules neuronal. Perte des axones phréniques ou dégénérescence PhMN sera évidemment diminuer la quantité de CTB retrotransported dans la moelle épinière.
Chaque approche d’administration intrapleurale a ses propres avantages et cons Transdiaphragmatic injections sont assez envahissantes, nécessitant une laparotomie et couture minutieuse de toutes les couches de la peau pour prévenir la déhiscence et protrusion de l’orgue. Laparotomie interfère avec la respiration normale22 et on ne peut pas exclure qu’il peut affecter PhMN rétro-transport ou activité efficacité. Cependant, la visualisation directe de la membrane pendant l’injection assure réussie de ciblage de la cavité pleurale tout le temps. Transthoracique injections sont mini-invasive par rapport à des injections de transdiaphragmatic et peuvent donc être considérées comme une procédure pour l’affinement, dans la veine du concept des « Trois r ». Un inconvénient est le risque accru d’être hors-cible pour un utilisateur inexpérimenté (p. ex. dans le tissu sous-cutané ou dans la paroi thoracique).
Après l’administration de fluorescent-CTB intrapleurale, il est probable que n’importe quel neurone moteur projetant sur muscles tapissant la cavité pleurale sera étiqueté, y compris les PhMN, les motoneurones intercostaux ou les différentes populations de neurones moteurs du tronc cérébral. Chez des rats adultes, Mantilla et coll. ont montré que les motoneurones intercostaux sont également marquées dans la corne ventrale de la moelle épinière thoracique, ainsi que certains de la racine dorsale de neurones ganglionnaires4. Nous n’avons jamais vérifié la présence de cellules marquées CTB dans d’autres sites que la moelle épinière cervicale chez la souris.
Selon les paramètres expérimentaux/modèles, mesures de résultats peuvent inclure la disposition colonnaire des PhMNs le long de la moelle épinière cervicale, une analyse détaillée des données géométriques sur la position de chaque PhMN ou, comme décrit ici, la quantification des PhMN nombre. L’évaluation précise du nombre total de PhMN dépend de considérations techniques et fiabilité inter-évaluateur ; en raison de la variabilité de la CTB intensité de fluorescence, la taille de soma neuron ou coloration de fond. Dans notre expérience, en utilisant des injections de transdiaphragmatic de CTB-fluorophore, nous avons estimé le nombre de PhMN par hemicord de souris dans une fourchette comprise entre 120 et 180 cellules, un nombre d’un peu moins que les données d’autres groupes8. En effet, il y a deux limites de l’étude. Tout d’abord, un nombre limité d’animaux est injecté en utilisant l’approche transthoracique et Deuxièmement, il y a une incertitude sur l’étiquetage complet de piscine PhMN. Nerf phrénique dip (après transection nerveuse) ou injection intraneurale avec traceur neuroanatomique fluorescent est des techniques complémentaires qui peuvent servir à mieux étiqueter tous les PhMNs. Pour les études futures, il est recommandé de compter PhMNs par des méthodes objectives telles que stéréologie.
Dans notre expérience, nous avons observé jamais un évident déficit respiratoire ou complications (détresse respiratoire) tels que des saignements ou un pneumothorax en procédant comme suit. Toutefois, si le diaphragme a été endommagé pendant les injections transdiaphragmatic, envisagez d’utiliser une aiguille d’un diamètre inférieur ou avec biseau plus nette.
Pour éviter les animale mort pendant ou après la chirurgie vérifier soigneusement les concentrations de chaque composant de l’anesthésique cocktail. Éviter de faire des blessures sur les surfaces de la foie, l’intestin, la vésicule biliaire ou le diaphragme.
Aucun ou faible marquage des PhMN pourrait être due à plusieurs problèmes. Si l’injection transthoracique rate la cavité pleurale, refaire et vérifier par palpation manuelle que l’aiguille est insérée sous les côtes, ou ne sont pas sortir par la peau. Aucune bulle ne devrait former après injection d’une solution CTB. N’oubliez pas aussi que l’internalisation des PFE dans la cellule nerveuse est dépendante du pH23: pH acide et neutre sont optimales tandis que le pH basique diminue l’absorption de la toxine. Il est recommandé de remettre en suspension des poudres CTB dans l’eau, dans une solution saline ou dans le tampon PBS. Tenir compte du temps de la persistance de la toxine étiquetée dans le corps cellulaire neuronale. Dans notre expérience, nous pouvons détecter des cellules marquées CTB dans une fenêtre de temps entre quatre jours et deux semaines après l’accouchement intrapleurale. Diminuant le temps alloué au rétrograde transport ou augmenter le temps entre intrapleurale livraison et sacrifice pourrait compromettre la détection optimale de fluorescent-CTB dans le tissu.
Pour éviter la fluorescence décoloration utilise méthode adéquate de fixation. Nous vous suggérons perfusant le corps de l’animal avec tampon de paraformaldéhyde à 4 %. Une fois que la moelle épinière est récoltée, incuber dans le fixateur même jusqu’au lendemain. Cryoprotect le cordon dans une solution de saccharose 30 % pendant 72 heures avant le naufrage, puis incorporez l’élargissement du col utérin (environ 8 mm) dans le milieu des PTOM. Ne pas déshydrater ou incorporer l’échantillon à la paraffine. Protéger des échantillons de la colonne vertébrale ou des sections de tissu de la lumière pendant le post-traitement ensemble. Fixes tout moelles épinières peuvent être conservés à 4 ° C pendant des mois si le thimérosal est ajouté à la solution cryoprotecteur (ne pas ajouter d’azide de sodium car il va provoquer la décoloration de la fluorescence). Des sections de tissu peuvent être conservées à-20 ° C pour les mois abri de la lumière. Enfin, nous vous conseillons de monter les lames avec un réactif anti-décoloration. Si la fluorescence a disparu, il est toujours possible de détecter la CTB par immunohistochimie.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Robert Graffin et Pauline Duhant pour leur soutien technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
References
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