Summary
本文描述了荧光共轭霍乱毒素亚单位β胸腔内分娩后小鼠膈运动神经元识别的一种协议。比较两种方法注射胸腔: 膈与经胸的方法。
Abstract
膈运动神经元是由 C3 到 C6 水平的颈椎运动神经元。轴突投射到膈神经支配呼吸隔膜。在脊髓切片中, 膈运动神经元不能从其他运动神经元中识别出形态学或生物化学标准。我们提供描述的程序, 以可视化膈运动神经元细胞体的小鼠, 后胸腔注射霍乱毒素亚基β (CTB) 共轭荧光。该荧光神经解剖学示踪剂有能力被抓住在隔膜神经肌肉交界, 被携带 retrogradely 沿膈轴突和到达膈细胞体。比较了胸腔 CTB 分娩的两种方法: 膈与经胸注射。这两种方法都是成功的, 并导致了类似数量的 CTB 标记的膈运动神经元。总之, 这些技术可用于可视化或量化的膈运动神经元的各种实验研究, 如那些关注膈膈电路。
Introduction
本研究的目的是提出一种可靠的方法来识别膈运动神经元 (PhMN) 在小鼠脊髓部分。在胸腔内注射荧光神经解剖学示踪剂作为传递方法, 以达到膈肌神经的投射到膜片上, 并使用逆行运输沿膈轴突标记膈细胞体。本文介绍两种胸腔内分娩技术: 膈与胸肺。
膈运动神经元是脊髓中继细胞, 其轴突汇聚成膈神经, 最终支配膈肌。这些是较低的马达神经元接受吸气驱动从球呼吸中心和中继到隔膜神经肌肉连接 (NMJ)。PhMN 结构成两个马达柱, 一个为每个 hemicord, 运行沿中颈椎脊柱。在包括人类在内的大多数哺乳动物物种中, 膈电机列从 C3 级别扩展到 C61,2,3。我们和其他人已经证实, PhMN 集中在大鼠和小鼠脊髓的 C3-C5 水平4,5,6,7,8。膈细胞的地形图分布不随机;在膈肌运动池 (C3) 的颅骨部分, 支配的运动神经元分布较密, 而支配脚部的运动神经元则更是尾鳍 (C5)9。此外, PhMN 在腹角灰质中有不同的聚集。在 C3 水平, 膈细胞的簇在侧向, 然后他们在一个延髓方向转移并且被发现 ventromedially 在最尾部水平10,11。
考虑到他们在灵感中的重要作用, 准确地识别 PhMN 在健康的脊髓中是至关重要的, 但在病理条件下, 如退行性疾病或脊髓外伤损伤, 也应遵循他们的命运。由于 PhMN 与其他颈椎运动神经元的形态学不同, PhMN 的识别依赖于在初级呼吸系统中心 (8) 的水平, 或在隔膜 NMJ7或在膈神经4。追踪器由神经纤维占去并且运载到膈肌细胞身体在颈椎, 在那里它可以被视觉化使用直接或间接检测系统。逆行或顺示踪剂在商业上有广泛的共轭。值得注意的是, 每个追踪器都被赋予无、低或高的跨突触追踪能力。
在目前的研究中, 我们选择了霍乱毒素的β亚基 (CTB) 功能性与 Alexa 555 (从今以后称为 CTB-荧光) 作为荧光标签, 允许直接可视化 PhMN 的冰冻脊髓部分。CTB 通常被描述为 monosynaptic 示踪器, 尽管实验数据倾向于显示 transneuronal 通道12。CTB 有能力将苷 GM1 在神经末端的等离子膜上。CTB 是通过网格蛋白依赖或独立的机制内化, 并通过反式高尔基网络进入内质网, 在逆行的时尚13, 14.内部化和逆行传输似乎依赖于肌动蛋白骨架15、16以及微管网络17。
为了证明 CTB 作为逆行神经解剖学示踪贴标膜片-PhMN 电路的用处, CTB 荧光被交付 intrapleurally。CTB 使用两种技术进行管理: 第一个包括剖腹手术和多膈注射;第二个, 较少侵入, 使用了独特的经胸注射。四天后, 荧光标记的 PhMNs 从健康和 spinally 受伤 (C4) 动物的颈椎脊髓中定量。
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Protocol
实验性议定书是按照欧洲共同体理事会动物实验指令 (2010/63/欧盟、86/609/欧洲经济共同体和 87-848/欧洲经济共同体) 进行的, 并得到了纳尔大学动物伦理委员会 (伦理项目 n°17-284) 的批准。).图 1描述了两种方法: 膈或经胸注射。在研究中使用雄性 C57bl/6J 小鼠 (n=18), 年龄从3个月到4月。
1. CTB 溶液的制备
- 膈注射:
- 将 CTB 在无菌水中的能量溶解到浓度为 0.2% (w/v)。
- 负载7.5 µL 的 CTB 溶液 (0.2% 瓦特/v) 在无菌 10-µL 微量泵与附加33口径针 (钝或短斜角) 为每个鼠标。
- 经胸注射:
- 将 CTB 在无菌水中的能量溶解到浓度为 0.1% (w/v)。
- 负载20µL CTB 溶液 (0.1% 瓦特/v) 在一个无菌 500-µL 胰岛素注射器与斜面27口径针为每只老鼠。
注: 请务必使用蒸馏水和无菌水, 并适当溶解 CTB 粉。该解决方案可以保持一个月摄氏4摄氏度 (不要冻结)。沉淀可能在几天后形成。使用前用吸管将溶液带入室温, 并混合使用。
2. 胸腔注射前的准备工作
- 使用高压釜或玻璃珠灭菌器, 在手术前消毒手术工具。准备一件干净的长凳做手术, 并处理手术工具。
注意: 在手术过程中使用的任何材料都应该是无菌的。不能灭菌的仪器, 如微量泵, 应用消毒剂 (必泰) 擦拭, 或者只应使用一次性。外科医生应该在手术开始前用消毒剂 (洗必泰擦洗) 洗手。外科医生应该戴上无菌手套、面罩和干净的长袍。 - 称量动物, 并管理适当的麻醉剂量: 腹腔注射麻醉鸡尾酒 (如氯胺酮100毫克/千克和甲苯噻嗪5毫克/千克)。
- 捏脚趾和/或检查眼睑反射的损失, 以确定是否正确麻醉鼠标。应用兽医软膏保护角膜。
- 仔细剃须腹部皮肤 (为膈程序) 或右胸皮肤 (经胸手术), 使用电剪。剃得好, 足够宽, 以防止头发进入手术领域。
- 通过局部应用10% 碘溶液在剃毛地区确保无菌条件。用碘溶液擦洗手术部位, 小心地从中心部位擦洗到周围。
- 在整个手术中使用恒温垫保持动物的体温。
3. 用膈方法进行胸腔注射
- 将麻醉鼠标放在加热垫上仰卧位。将卷纱垫放在动物的脖子下。对于成年鼠标, 请使用0.5 英寸厚度的滚动纱布垫。把这个垫子贴到手术板上, 以免发生运动。
- 使用手术刀刀片, 切割腹侧皮肤沿中线: 做一个切口从剑突过程到脐区域, 而伸展皮肤侧向与另一只手, 使皮肤绷紧。不要对刀片施加太多的压力, 以免损害底层器官。
- 使用小剪刀, 小心地把皮肤从腹部肌肉的切口周围剥离。这个程序将有助于缝合的肌肉和皮肤分开的手术结束。
- 用小剪刀进行剖腹手术。通过在脐的水平上执行一个纽扣切口打开腹腔。切割腹部肌肉沿白色线 ("linea") 由剑突过程。
- 为了形象化的腹部表面的隔膜, 收回腹部肌肉使用商业或自制拉钩。
注意: 这些拉钩可以由形状为 L 挂钩19的 midi 大小的回形针组成。 - 伸展开腹的两侧, 并把拉钩到板凳大衣上。优化视野的光照, 使隔膜的腹面不再在半影中。最强大的照明设备为这个目的是一个 LED 灯与定向光束。
- 一方面使用软镊子, 举起 xyphoid 阑尾, 拉下肝脏的侧面裂片 (图 2A)。另一方面使用小剪刀, 小心切断悬吊韧带, 不损害胆囊或隔膜 (图 2B)。
- 一方面用软镊子, 举起 xyphoid 附录。另一方面抓住哈密尔顿注射器。目标三的注射地点在右 hemidiaphragm 分别覆盖胸骨, 内侧和脚区域 (图 3A, 插入图 3B)。
- 由于膜片厚度约为0.37 毫米小鼠7, 插入针不超过1或2毫米超过隔膜片, 以防止肺部损害在呼吸期间。通过每个站点的右膜片 (图 4B) 提供2.5 µL 的 CTB 解决方案 (0.2% 瓦特/v)。不需要膜片的稳定。
- 对三个同侧注射点 (图 1A) 重复此过程, 并为 PhMN 池的双向标记 contralaterally。
- 闭合剖腹手术部位, 缝合腹部肌肉与可吸收4-0 缝合。使用被打断的针间距为3毫米, 主要皮肤闭合与9.0 毫米伤口剪辑。收紧主食, 以防止动物拔下主食。间隔约5毫米的空间钉。不要过度收紧伤口夹, 因为这会导致愈合受损。
- 用蒸馏水清洁微型注射器, 防止堵塞。慢慢地起草和驱逐2-3 次。不要把空气抽进注射器。
4. 胸腔内注射用经胸法
注意: 此方法灵感来自4中描述的过程, 并适合于鼠标。
- 在加热垫 (图 4A) 上, 将麻醉鼠标放在左侧压疮位置。
- 用手动触诊 (图 4B) 识别肘部区域下的第六和第七根肋骨。
- 当助手扩展右前-和后肢 (图 5A) 时, 插入注射器 cranially 定向和切下的第六或第七肋, 3 毫米深从皮肤, 与斜角向下 (图 1B和图 5B)。
- 轻轻抬高针, 以确认, 通过解除肋骨, 它是很好地定位到胸腔 (图 5C, 插入图 1B)。
- 用两个手指在胸壁上施加轻微的压力, 稳定胸部的呼吸运动。
- 在拿着注射器的同时, 在单个注射中提供20µL 的 CTB 溶液 (0.1% 瓦特/v)。
5. 术后护理
- 术后立即将鼠标放置在恒温垫上的右侧压疮位置, 以恢复。这确保了示踪剂传播在胸腔的右侧, 并允许监测动物的呼吸。
- 管理1毫升无菌盐水溶液。提供后续注射, 如果动物出现脱水和/或无精打采。
- 在手术后的头两天, 每天两次在术后0.1 毫克/公斤的丁丙诺啡, 以尽量减少任何潜在的疼痛。
注: 许多机构建议对侵入性手术进行多模镇痛, 如这里所描述的剖腹手术。这可能包括使用非甾体抗炎 (NSAID) 药物和/或局部麻醉剂在切口部位。这些药物通常是在第一个切口之前提供的, 以减少出现的疼痛。 - 每天监视动物直至安乐死。
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Representative Results
研究中包括雄性 C57bl/6J 小鼠 (n=18), 年龄从3个月到4月。在实验的0天, 8 只小鼠接受了单边 C4 挫伤, 右侧, 根据发布的协议7,18。作为假手术, 10 只小鼠在 C4 顶部进行了椎板切除术, 无挫伤。3天, 根据上述两种不同的程序, 对 CTB 荧光胸腔注射的小鼠进行了准备。7天, 所有小鼠在麻醉后被安乐死 (氯胺酮100毫克/千克和甲苯噻嗪5毫克/千克) 和放血。
根据标准实验室程序, 在30% 蔗糖中多聚甲醛和 cryoprotected 的全脊髓进行了采集。宫颈肿大是孤立的, 嵌入 O.C.T. 和 cryosectioned 纵向或横向厚度为30µm。
用 epifluorescent 显微镜观察脊柱纵段的荧光分析 (励磁: 560/20 nm;发射: 635/30 nm)。在腹角上的荧光马达神经元被确定为从 C3 到 C5 水平的细胞的线性列 (图 6A, 上部面板)。所有标记细胞都位于同侧灰质中, 表现出与运动神经元 (图 6B) 一致的形态学。在受伤的动物中, C4 水平观察到标记 PhMN 的显著损失, 以及脊柱组织中断 (图 6A和6C中的星号)。CTB+ PhMNs 被手动计算每第五横断面 (间隔150µm) 在未受伤和 C4-injured 脊髓 (图 6C)。通过将计数 CTB+单元格数乘以 5, 计算出标记 PhMNs 的总数。在未受伤的健康小鼠中, 当使用膈 (TDia) 方法时, 每 hemicord 标记的 PhMNs 的总数估计为151到 9, 而使用经胸 (TTho) 方法时 178 @ 9 (图 6D)。C4 受伤后, 这些数字分别下降到 59 14 和 70 @ 10。在本研究中, 两种胸腔内分娩方法之间没有统计学差异 (p > 0.05, 曼-惠特尼 U 检验;TDia vs TTho)。
图1。胸腔注射用膈或经胸注射.膈方法包括剖腹手术, 暴露腹部表面的膜片 (粉红色的颜色) 和三注射在胸骨, 内侧和脚区域a。对于经胸的方法, 鼠标放置在左侧压位位置。第六和第七肋骨是在肘部区域内通过手动触诊B确定的。针通过皮肤, 皮下组织, 胸肌, 肋间肌肉和壁胸膜进入胸腔 (阿斯特里克斯)。S, 胸骨;m, 内侧;c, 脚;S/SC, 皮肤和皮下组织;TM, 胸肌;IC, 肋间肌肉;pp;顶叶胸膜;我肺请单击此处查看此图的较大版本.
图2。外科领域与肝脏、胆囊和腹部面孔的膜片.A.注意胆囊与隔膜之间的悬吊韧带。B.韧带被小心切断。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。在膜片上查看.胸骨 (s), 内侧 (m) 和脚 (c) 区域被辨认在正确的 hemidiaphragm。A.注意到脚区域位于肝叶的后部。B.在胸腔内注入 CTB, 将针插入1毫米深通过右半膜片。在内侧区域中的注入被说明为.请单击此处查看此图的较大版本.
图4。经胸的方法.鼠标定位在左侧压疮A上。确定隔膜和肘区的肋缘。B. 第六和第七肋间空间被确定为肘区深。请单击此处查看此图的较大版本.
图5。第六和第七肋间空间被确定深到肘部区域.A. 前后四肢延长。B. 注射器是 cranially 定向和切向插入第六或第七肋, 3 毫米深穿过肋间肌肉, 与斜角倒置。C. 针被轻轻抬高, 肋骨被抬起, 以确认针被放置在胸腔内。请单击此处查看此图的较大版本.
图6。CTB 在 intrapleurally 注射小鼠腹角灰质中的+单元格.A.在 spinally 未受伤的小鼠中, CTB+膈运动神经元从水平 C3 到 C5 沿颈椎脊髓分布。在挫伤鼠中, 组织中断是单方面观察到的 CTB+膈运动神经元在 C4 水平 (阿斯特里克斯) 的损失。B.标记为 CTB+细胞位于同侧灰质中, 表现出与运动神经元的形态学一致。C.脊髓横断面用于量化 CTB+在未受伤 (左) 和受伤 (右) 小鼠脊髓沿特定距离的细胞数。D.根据胸腔 TTho 分娩的膈 (TDia) 或经胸 (CTB) 方法, 对在未受伤或受伤小鼠的同侧 hemicord 中发现的 CTB+细胞进行量化。酒吧代表250µm. 数据被表示为平均标准误差 (SEM)。n = 每 TDia 组的5-7 只小鼠;n = 每 TTho 组3只老鼠。对非参数曼-惠特尼 U 型试验进行了研究, 结果被认为对 p < 0.05 有显著的不同。p < 0.001 为未受伤的与 C4 损伤。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本文所描述的协议可以适用于任何成年小鼠的应变或任何实验范式, 其中的 PhMN 电路的完整性应评估。例如, 肌萎缩侧索硬化 (ALS) 和颈脊髓损伤 (cSCI) 是与 PhMN 丢失、膈轴突顺变性和随后的呼吸折衷有关的条件。动物模型的 ALS 或 cSCI 模拟病理学和功能性呼吸衰竭观察到人类疾病。在这些模型中, 组织学技术经常被用来评估 PhMN 生存后, 针对 PhMN 神经保护18,20,21的各种治疗干预措施。任何在隔膜 NMJ 或轴突传输中摄取的麻烦, 无疑将会影响神经元细胞体内累积的 CTB 量。膈轴突或 PhMN 变性的丧失将明显减少 CTB retrotransported 入脊髓的数量。
胸腔内管理的每一种方法都有其优缺点. 膈注射是相当侵入性的, 有必要剖腹手术和仔细缝合所有的皮肤层, 以防止裂开和器官突出。剖腹手术干扰正常呼吸22 , 并且你不能排除它可能影响 PhMN 活动或复古运输效率。然而, 在注射过程中, 膜片的直接可视化确保了胸膜空间的成功定位。经胸注射与膈注射液相比微创, 因此可以被认为是一种改良的程序, 在 "三 Rs" 概念的静脉。其中一个缺点是, 缺乏经验的用户 (例如在皮下组织或胸腔壁) 上的目标的可能性增加。
经胸腔荧光-CTB 管理, 有可能是任何运动神经元投射到胸腔内的肌肉将被标记, 包括 PhMN, 肋间运动神经元或不同人群的脑干运动神经元。在成年大鼠中, 薄头纱等人表明, 肋间运动神经元也被标记在胸脊髓的腹角, 以及一些背根神经节神经元 4.我们从来没有检查过是否有 CTB 标记的细胞在其他网站比颈椎脊髓在小鼠。
根据实验的设置/模型, 结果措施可以包括 PhMNs 沿颈脊髓的柱状排列, 详细分析每 PhMN 位置的几何数据, 如下所述, PhMN 的量化数.对总 PhMN 数的准确评估取决于技术考虑和评价员之间的可靠性;由于 CTB 荧光强度的变异性, 神经元躯体大小或背景染色。根据我们使用膈注射 CTB 荧光的经验, 我们估计每个鼠标 hemicord 在120到180个单元格之间的 PhMN 数, 比其他组8中的数据少一点。的确, 这项研究有两个局限性。首先, 用经胸法注射有限数量的动物, 其次是 PhMN 池完整标记的不确定性。膈神经浸泡 (后神经切断) 或神经内注射荧光神经解剖学示踪剂是互补技术, 可用于更准确地标签所有 PhMNs。对于未来的研究, 建议用不公正的方法 (如视学) 来计算 PhMNs。
根据我们的经验, 我们从来没有观察到任何明显的呼吸缺陷或并发症 (呼吸窘迫), 如出血或气胸后, 这一程序。但是, 如果隔膜在膈注射过程中被损坏, 考虑使用直径较小或锥度更锋利的针。
为了避免在手术期间或术后动物死亡仔细检查麻醉鸡尾酒中每个成分的浓度。避免在肝脏、肠道、胆囊或隔膜上造成损伤。
没有或低标签的 PhMN 可能是由于几个问题。如果经胸注射错过胸腔, 重新做和检查的手动触诊, 针插入下肋骨或不弹出通过皮肤。注射 CTB 溶液时不应形成气泡。还要记住, CTB 在神经细胞内化是 pH 依赖性的23: 酸性和中性 ph 值是最佳的, 而碱性 ph 值会损害毒素的摄取。建议在水中并用重悬 CTB 粉, 生理盐水或 PBS 缓冲器。考虑在神经元细胞体中标记毒素的持续时间。在我们的经验, 我们可以检测 CTB 标记的细胞在一个时间窗口之间的四天和两个星期后胸腔分娩。减少分配给逆行运输的时间或增加胸腔分娩和牺牲之间的时间可能会危及组织中荧光 CTB 的最佳检测。
为避免荧光褪色, 使用适当的固定方法。我们建议用缓冲的4% 多聚甲醛灌注动物的身体。一旦脊髓被收割, 在同一固定的固定在夜间孵化。在蔗糖30% 溶液中 Cryoprotect 脐带72小时直到下沉, 然后在 O.C.T. 培养基中嵌入宫颈增大 (约8毫米)。不要将样品脱水或嵌入石蜡中。在整个后处理过程中, 从光中保护脊柱标本或组织切片。固定的整个脊髓可以保持在4°c 几个月, 如果硫柳汞添加到 cryoprotectant 解决方案 (不添加叠氮化钠, 因为它会引起荧光褪色)。组织切片可以保持在-20 摄氏度, 在远离光的几个月。最后, 我们建议用防褪色试剂装上幻灯片。如果荧光褪色, 仍然可以用免疫组化方法检测 CTB。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢罗伯特 Graffin 和宝琳 Duhant 的技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
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