Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Identifizierung Phrenicus Motoneuronen bei Mäusen nach intrapleurale Lieferung der Fluorophor Cholera Toxin Untereinheit Beta konjugiert. Zwei Techniken werden verglichen, um den pleural Raum zu injizieren: Transdiaphragmatic versus transthorakalen Ansätze.
Abstract
Phrenicus Motoneuronen sind zervikale Motoneuronen aus C3 bis C6 Ebenen in die meisten Säugetierarten. Axonale Projektionen konvergieren in Phrenicus Nerven innervieren die Atemwege Membran. Im Rückenmark Scheiben werden nicht Phrenicus Motoneuronen aus anderen motorischen Neuronen auf morphologische und biochemische Kriterien identifiziert. Wir bieten die Beschreibung der Verfahren zur Visualisierung von Phrenicus Motoneuron Zellkörper in den Mäusen, folgende intrapleurale Injektionen von Cholera Toxin Untereinheit Beta (CTB) zu einem Fluorophor konjugiert. Diese fluoreszierenden neuroanatomischen Tracer hat die Fähigkeit, bei der neuromuskulären Membran aufgeholt werden, Phrenicus Axone Doppelthebel mitgenommen werden und erreichen den Phrenicus Zellkörper. Zwei methodische Ansätze der intrapleurale CTB Lieferung werden verglichen: Transdiaphragmatic versus transthorakalen Injektionen. Beide Ansätze sind erfolgreich und führen zu ähnlichen Anzahl von CTB-Label Phrenicus Motoneuronen. Zusammenfassend können diese Techniken angewendet werden, um sichtbar zu machen oder den Phrenicus motorischen Neuronen in verschiedenen experimentellen Studien wie die konzentrierte sich auf die Membran-Phrenicus Schaltung zu quantifizieren.
Introduction
Das Ziel der Studie ist es, eine zuverlässige Methode um Phrenicus Motoneuronen (PhMN) auf Maus Rückenmark Abschnitte identifizieren zu präsentieren. Injektion eines fluoreszierenden neuroanatomischen Tracers in den pleural Raum wurde gewählt, als die Versandart der Phrenicus neuromuskulären Projektionen auf der Membran zu erreichen und mit retrograder Transport entlang der Phrenicus Axone Phrenicus Zellkörpern beschriften. Zwei Techniken der intrapleurale Lieferung werden beschrieben: Transdiaphragmatic versus transthorakalen.
Phrenicus Motoneuronen sind spinale Relais Zellen, deren Axone in Phrenicus Nerven zusammenlaufen, die letztlich das Zwerchfell innervieren. Dies sind die unteren Motoneuronen bulbärer respiratorischen Zentren den inspiratorischen Antrieb erhalten und auf die Membran Neuro-muskuläre Kreuzungen (NMJ) Weiterleitung. PhMN gliedert sich in zwei motor Spalten, eine für jede Hemicord, die entlang der Mitte der Halswirbelsäule. In den meisten Säugetierarten einschließlich des Menschen breitete sich die Phrenicus motor Spalten von Ebenen C3 bis C61,2,3. Wir und andere haben bestätigt, dass PhMN in C3-C5-Ebenen im Ratte und Maus Rückenmark4,5,6,7,8konzentriert. Die topographische Verteilung der Phrenicus Zellen ist nicht nach dem Zufallsprinzip; motorischen Neuronen innervieren die sternalen Teil der Membran sind Dichter im kranialen Teil der Phrenicus Fuhrpark (C3), verteilt, während motorischen Neuronen innervieren den musculorum Teil mehr kaudalen (C5)9sind. Darüber hinaus PhMN sind verschiedentlich in der ventralen Horn grauen Substanz gruppiert. Ebene C3 die Cluster der Phrenicus Zellen liegen seitlich, dann im ventrolateralen Richtung verschieben und ventromedially finden sich in den meisten caudale Ebenen10,11.
Ihre wichtige Rolle während der Inspiration gegeben, ist es von größter Wichtigkeit zu PhMN genau zu identifizieren, im gesunden Rückenmark sondern auch ihr Schicksal während der pathologischen Zuständen, z. B. degenerativen Erkrankungen oder traumatische Verletzungen des Rückenmarks. Da PhMN nicht unterscheiden sich morphologisch von anderen zervikalen Motoneuronen, hängt Identifizierung von PhMN die gezielte Bereitstellung von neuroanatomischen Tracern entweder auf der Ebene des primären respiratorischen Zentren8, oder an der Membran NMJ7 oder in der Phrenicus Nerv4. Die Tracer ist von Nervenfasern aufgegriffen und bis zu den Phrenicus Zellkörper an der Halswirbelsäule, wo es mit direkter oder indirekter Detection Systeme visualisiert werden kann. Retrograde und Anterograde Tracer sind im Handel erhältlich, mit einer breiten Palette von Konjugate. Bemerkenswert, jeder Tracer ist dotiert mit Nein, niedrigen oder hohen Fähigkeiten für die synaptische Trans-Ablaufverfolgung.
In der aktuellen Studie wählten wir die Beta-Untereinheit das Cholera-Toxin (CTB) funktionalisiert mit Alexa Fluor 555 (im folgenden als CTB-Fluorophor bezeichnet) als fluoreszierende Label ermöglicht eine direkte Visualisierung der PhMN auf gefrorenen Rückenmark Abschnitte. CTB ist in der Regel als monosynaptische Tracer beschrieben, obwohl experimentelle Daten weisen darauf hin eine Transneuronal Durchgang12zeigen. CTB hat die Fähigkeit, das Gangliosid GM1 in der Plasmamembran von der Nervenendigung binden. CTB ist über Clathrin-abhängige oder -unabhängige Mechanismen und Verkehre über das Trans-Golgi-Netzwerk in dem endoplasmatischen Retikulum in eine retrograde Mode13,14verinnerlicht. Die Internalisierung und retrograder Transport scheinen abhängig von der Aktin-Zytoskelett15,16 sowie auf die Mikrotubuli Netzwerk17sein.
Um die Nützlichkeit von CTB als retrograde neuroanatomischen Tracer Kennzeichnung Membran-PhMN Schaltung zu demonstrieren, wurde die CTB-Fluorophor Intrapleurally geliefert. CTB verabreicht wurde, mit zwei Techniken: Erstens enthalten eine Laparotomie und mehrere Transdiaphragmatic Injektionen; die zweite, weniger invasiv und verwendet einer einzigartige transthorakalen Injektion. Vier Tage wurden später, Eindringmittel beschriftet PhMNs im zervikalen Rückenmark aus gesunden und spinally verletzt (C4) Tiere quantifiziert.
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Protocol
Das experimentelle Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den Europäischen Gemeinschaften Ratsrichtlinien für Tier-Experiment (2010/63/EU, 86/609/EWG und 87-848/EWG) durchgeführt und wurde genehmigt durch das Tier Ethik Ausschuss der Universität Namur (Ethik Projekt n ° 17-284 ). Abbildung 1 zeigt die beiden jeweiligen Ansätze: Transdiaphragmatic oder transthorakalen Injektionen. Verwenden Sie männliche Mäuse C57bl/6J (n = 18), im Alter von 3 bis 4 Monate in der Studie.
1. Vorbereitung der CTB-Lösung
- Für Transdiaphragmatic-Injektionen:
- Lösen Sie die CTB macht in sterilem Wasser auf die Konzentration von 0,2 % (w/V).
- Laden Sie 7,5 µL CTB-Lösung (0,2 % w/V) in eine sterile 10-µL-Microsyringe mit einer angehängten 33-Gauge-Nadel (stumpf oder kurze Fase) für jede Maus.
- Transthorakalen Injektionslösung:
- Lösen Sie die CTB macht in sterilem Wasser auf die Konzentration von 0,1 % (w/V).
- Laden Sie 20 µL CTB-Lösung (0,1 % w/V) in eine sterile 500 µl Insulin-Spritze mit einer abgeschrägten 27-Gauge-Nadel für jede Maus.
Hinweis: Achten Sie darauf, destilliert und steriles Wasser verwenden und ordnungsgemäß auflösen der CTB-Pulver. Die Lösung kann bei 4 ° C aufbewahrt werden, für einen Monat (nicht einfrieren). Nach paar Tagen könnte einen Niederschlag bilden. Bringen Sie die Lösung auf Raumtemperatur und mischen Sie gut mit einer Pipette vor Gebrauch.
2. Vorbereitung vor intrapleurale Injektionen
- Chirurgische Instrumente vor der Operation, mit Autoklav oder Glasperlen Sterilisator zu sterilisieren. Bereiten Sie einen sauberen Werkbank Mantel Chirurgie und chirurgische Instrumente zu entsorgen.
Hinweis: Jedes Material verwendet während des chirurgischen Eingriffs sollte steril sein. Instrumente, die sterilisiert werden können nicht, wie die Microsyringe mit einem Desinfektionsmittel (Chlorhexidin) abgewischt werden sollten oder sollte Einmalgebrauch. Der Chirurg sollte seine/ihre Hände mit einem Desinfektionsmittel (Chlorhexidin Peeling) vor dem Beginn der Operation waschen. Der Chirurg sollte sterile Handschuhe, eine Gesichtsmaske und ein sauberes Kleid tragen. - Tier wiegen und verwalten eine angemessene Dosis der Anästhesie: intraperitoneale Injektion von Betäubungsmittel cocktail (z.B. Ketamin 100 mg/kg und Xylazin 5 mg/kg).
- Zeh kneifen und/oder für den Verlust von palpebrale Reflex um festzustellen, ob die Maus richtig betäubt ist zu überprüfen. Wenden Sie eine Tierarzt Salbe zum Schutz der Hornhaut an.
- Rasieren Sie sorgfältig die ventralen (für Transdiaphragmatic-Verfahren) oder die rechtsseitige thorakalen Haut (für transthorakalen Verfahren), mit elektrischen Haarschneidemaschinen. Rasieren Sie gut und breit genug, um zu verhindern, dass die Haare immer in das OP-Feld.
- Sicherstellen Sie aseptische Bedingungen durch topische Anwendung von 10 %-Jod-Lösung auf den rasierten Bereich. Scheuern der Operationsstelle mit Jod-Lösung, dabei darauf achten, aus der Mitte des Grundstücks in Richtung der Peripherie zu schrubben.
- Verwenden Sie homöotherm Pad während der Operation, um das Tier Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.
3. intrapleurale Injektionen mit Transdiaphragmatic Ansatz
- Legen Sie den narkotisierten Maus in Rückenlage auf ein Heizkissen. Legen Sie einem gerollten Tupfer unter dem Hals des Tieres. Verwenden Sie bei einer erwachsenen Maus einem gerollten Tupfer von 0,5 Zoll dicke. Kleben Sie das Pad in den Vorstand der Operation, wenn jede Bewegung zu vermeiden.
- Mit einem Skalpellklinge, die ventrale Haut entlang der Mittellinie einschneiden: einen Einschnitt von Xiphoid Prozeß der Nabelschnur Region während der Dehnung der Haut seitlich mit der anderen Hand die Haut straff zu machen. Nicht zu viel Druck auf die Klinge zur Vermeidung von Schäden zugrunde liegenden Organe.
- Nehmen Sie mit einer kleinen Schere ab, sorgfältig die Haut von den Abdominal-Muskeln rund um den Schnitt. Dieses Verfahren hilft beim Nähen der Muskeln und der Haut, die am Ende der Operation auseinander.
- Führen Sie mit einer kleinen Schere Laparotomie. Öffnen Sie die Bauchhöhle durch ein Knopfloch Einschnitt auf der Ebene des Nabels durchführen. Die Abdominal-Muskeln entlang der weißen Linie einschneiden ("Linea Alba") bis zum Xiphoid Prozeß.
- Zurückziehen Sie, um den Bauch das Zwerchfell sichtbar gemacht, Bauchmuskeln mit kommerziellen oder hausgemachte Retraktoren.
Hinweis: Diese Retraktoren können von der Midi-Größe Büroklammer geformt L-Haken19erfolgen. - Strecken Sie beide Seiten der Laparotomie und Klebeband unten der Retraktoren Bench Mantel. Optimieren Sie die Ausleuchtung des Sichtfeldes, so dass die Bauch Oberfläche der Membran nicht mehr in den Halbschatten ist. Die mächtigste Beleuchtungseinrichtung für diesen Zweck ist eine LED-Lampe mit einem orientierbar Lichtstrahl.
- Weiche Pinzette in der Hand, heben Sie Xyphoid Anhang und ziehen Sie die seitlichen Lappen der Leber (Abbildung 2A). Mit einer kleinen Schere in der anderen Hand vorsichtig abgeschnitten Hodenbeutel Ligament, ohne Beschädigung der Gallenblase oder der Membran (Abbildung 2 b).
- Heben Sie weiche Pinzette in der Hand, die Xyphoid Anhang. Die Hamilton-Spritze in der anderen Hand zu erfassen. Ziel der drei Standorte der Injektion in die richtigen Hemidiaphragm bzw. der sternalen, decken die Medial und musculorum Regionen (Abb. 3A, Einfügung in Abb. 3 b).
- Da die Dicke der Membran rund 0,37 mm in Mäusen7ist, legen Sie die Nadel nicht mehr als 1 oder 2 mm über der Membran-Blatt zur Verhinderung der Lunge beim Atmen. 2.5 µL CTB-Lösung (0,2 % w/V) durch die richtige Membrane an jedem Standort (Abbildung 4 b) zu liefern. Stabilisierung der Membran ist nicht erforderlich.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für die drei ipsilateral Standorte der Einspritzung (Abbildung 1A) und contralaterally für eine bilaterale Kennzeichnung des PhMN Pools.
- Bauchmuskeln mit resorbierbaren Naht um die Laparotomie-Standort in der Nähe, 4-0 Naht. Mit 9,0 mm Wunde Clips geschlossenes verwenden unterbrochene Stiche von 3 mm. Grundnahrungsmittel Haut verteilt. Ziehen Sie die Klammern verhindern, dass Tier abziehen Heftklammern. Platz heftet ca. 5 mm auseinander. Nicht überdrehen der Wunde Clips, da dies zur Beeinträchtigung Heilung führen kann.
- Saubere Mikro Spritze mit destilliertem Wasser, Verstopfung zu verhindern. Langsam erarbeiten und vertreiben 2-3 Mal. Ziehen Sie keine Luft in die Spritze.
4. intrapleurale Injektion mittels transthorakalen Ansatz
Hinweis: Diese Methode ist inspiriert von dem in Ratten4 beschriebenen Verfahren und wurde an die Maus.
- Legen Sie den narkotisierten Maus im linken seitlichen Dekubitus auf ein Heizkissen (Abb. 4A) positionieren.
- Identifizieren Sie die sechsten und siebten Rippen unter der Ellenbogen-Region durch manuelle Abtasten (Abbildung 4 b).
- Während ein Assistent rechten Vordergrund - und -Hinterbeine (Abb. 5A) erstreckt, legen Sie die Spritze cranially orientiert und tangential unter dem sechsten oder siebten Rippe, 3 mm tief aus der Haut, mit der Fase nach unten (Abbildung 1 b und Abbildung 5 b).
- Heben Sie die Nadel vorsichtig zur Bestätigung durch Anheben der Rippen, dass es gut, in der Brusthöhle (Abbildung 5, Einsätze in Abbildung 1 b positioniert ist).
- Atembewegungen des Brustkorbs durch leichten Druck mit zwei Fingern auf die Brustwand zu stabilisieren.
- Halten Sie die Spritze in der anderen Hand, liefern Sie 20 µL der CTB-Lösung (0,1 % w/V) in einer einzigen Injektion.
5. postoperative Pflege
- Unmittelbar nach dem Eingriff lag der Maus im rechten seitlichen Dekubitus Position auf einem homöotherm Pad für Erholung. Dies sorgt für die Tracer auf der rechten Seite den pleural Raum zu verbreiten und für die Überwachung des Tieres Atmung ermöglicht.
- Verabreichen Sie 1 mL steriler Kochsalzlösung i.p subkutan. Geben Sie Follow-up-Injektionen, wenn das Tier dehydriert und/oder lustlos erscheint.
- Verwalten von Buprenorphin 0,1 mg/kg subkutan zweimal täglich während der ersten zwei Tage nach der Operation, um mögliche Schmerzen zu minimieren.
Hinweis: Viele Institutionen empfehlen multimodalen Analgesie für invasive Verfahren, wie die hier abgebildete Laparotomie. Dazu zählen die Verwendung von einer nicht-steroidale Entzündungshemmer (NSAR) und/oder ein Lokalanästhetikum Agent bei der Schnitt-Website. Diese Medikamente sind in der Regel vor dem ersten Schnitt Aufzieh Schmerzen zu minimieren geliefert. - Beobachten Sie Tiere täglich bis zur Sterbehilfe.
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Representative Results
Männliche Mäuse C57bl/6J (n = 18), im Alter von 3 bis 4 Monate wurden in die Studie eingeschlossen. Am Tag 0 des Experiments unterzog 8 Mäuse eine einseitige C4-Prellung, rechtsseitige, nach veröffentlichten Protokoll7,18. Als Farce Verfahren unterzog 10 Mäuse eine Laminektomie auf C4 ohne Prellung. Am 3. Tag waren die intrapleurale Injektionen von CTB-Fluorophor nach zwei verschiedenen Verfahren, die oben beschriebenen Mäuse vorbereitet. Am 7. Tag waren alle Mäuse nach Narkose eingeschläfert (Ketamin 100 mg/kg und Xylazin 5 mg/kg) und Entbluten.
Ganze Rückenmark wurden geerntet, Paraformaldehyd und Cryoprotected in 30 % Saccharose nach standard-Lab-Verfahren festgelegt. Zervikale Erweiterung wurde isoliert, eingebettet in O.C.T. und Cryosectioned längs oder quer bei einer Dicke von 30 µm.
Spinale Längsprofile wurden beobachtet mit einem Epifluorescent Mikroskop mit Filter Cube für Fluoreszenzanalyse ausgestattet (Anregung: 560/20nm; Emission: 635/30nm). Fluoreszierende motorischen Neuronen im ventralen Horn wurden als eine lineare Spalte von Zellen von C3 bis C5 Ebenen (Abb. 6A, obere Leiste) identifiziert. Alle markierte Zellen befanden sich in der ipsilateralen grauen Substanz und Morphologie Einklang mit motorischen Neuronen (Abb. 6 b) ausgestellt. Bei verletzten Tieren wurde eine markante beschrifteten PhMN auf C4 Ebene sowie spinale Gewebe Störungen (Sternchen in Abbildung 6A und 6 C) beobachtet. CTB+ PhMNs wurden manuell jeden fünften Querschnitt (Abstand von 150 µm) in unverletzt und C4 verletzten Rückenmark (Abbildung 6) gezählt. Eine Schätzung der Gesamtzahl der beschrifteten PhMNs wurde mit 5 multipliziert die Anzahl der gezählten CTB+ Zellen berechnet. In unverletzten gesunden Mäusen war die Gesamtzahl der beschrifteten PhMNs pro Hemicord schätzungsweise bei Verwendung Transdiaphragmatic (TDia) Methode, im Vergleich zu 178 ± 9 bei Verwendung transthorakalen (TTho) Methode (Abbildung 6) 151 ± 9. Nach C4 Verletzungen sank diese Zahl bzw. 59 ± 14 und 70 ± 10. In dieser Studie wurden keine statistischen Unterschiede zwischen den beiden Methoden der intrapleurale Lieferung belegt (p > 0,05, Mann-Whitney U-Test; TDia versus TTho).
Abbildung 1: Intrapleurale Injektionen mit Transdiaphragmatic oder transthorakalen Injektionen. Transdiaphragmatic Ansatz beinhaltet eine Laparotomie, Belichtung der Abdominal-Oberfläche der Membran (in rosa Farbe) und drei Injektionen in den Regionen sternalen, medialen und musculorum A. Transthorakalen Ansatz ist die Maus im linken seitlichen Dekubitus Position gelegt. Die sechsten und siebten Rippen sind unter den Ellenbogen-Region durch manuelle Palpation Bgekennzeichnet. Die Nadel wird durch die Haut, das subkutane Gewebe, die thorakalen Muskeln, die Zwischenrippenmuskeln und der parietalen Pleura, der Pleurahöhle (Asterix) zu erreichen. S, sternale; m, mediale; c, musculorum; S/SC, Haut und Unterhaut; TM, thorakale Muskulatur; IC, Zwischenrippenmuskeln; PP; Parietal Pleura; L, Lunge. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: OP-Feld mit Blick auf Leber, Galle und Bauch Gesicht des Zwerchfells. A. beachten Sie die aufschiebende Ligamentum zwischen der Gallenblase und des Zwerchfells. B. das Ligament wird sorgfältig abgeschnitten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Blick auf das Zwerchfell. Sternale (s), Medial (m) und musculorum (C) Bereiche werden in der richtigen Hemidiaphragm identifiziert. A. beachten Sie, dass die musculorum Region posterior, die Leber Lappen ist. B. CTB im Pleuraraum zu injizieren, stechen Sie die Nadel 1 mm tief durch die richtige Hemi-Membran. Die Injektion im medialen Bereich ist illustrierten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Transthorakalen Ansatz. Maus ist im linken seitlichen Dekubitus Aplatziert. Die kostalen Seitenrand des Zwerchfells und der Ellenbogen-Region zu identifizieren. B. die sechste und siebte Intercostalneuralgie Räume werden tief in die Ellenbogen Region identifiziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5. Die sechste und siebte Intercostalneuralgie Räume werden tief in die Ellenbogen Region identifiziert. A. Vordergrund und Hintergliedmaßen verlängert. B. die Spritze ist cranially orientiert und tangential unter dem sechsten oder siebten Rippe, 3 mm tief durch die Zwischenrippenmuskeln, mit die Abschrägung Upside-Down eingefügt. C. die Nadel ist leicht erhöht und die Rippen werden angehoben, um zu bestätigen, die Nadel ist gut positioniert, in der Brusthöhle. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6. CTB+ Zellen im ventralen Horn grauen Zellen von Mäusen injiziert Intrapleurally. A. In spinally unverletzt Maus verteilen CTB+ Phrenicus motorischen Neuronen entlang des zervikalen Rückenmarks aus Ebene C3 bis C5. Kontusion Maus wird Gewebe Störung einseitig mit Verlust von CTB+ Phrenicus Motoneuronen C4 Ebene (Asterix) beobachtet. B. mit der Bezeichnung CTB+ Zellen befanden sich in der ipsilateralen grauen Substanz und Morphologie Einklang mit motorischen Neuronenausgestellt. C. Querschnitte von Rückenmark wurden verwendet, um die Anzahl der CTB+ Zellen in bestimmten Abständen entlang des Rückenmarks bei unverletzten (links) und verletzte (rechts) Mäusen zu quantifizieren. D. Quantifizierung von CTB+ Zellen in der ipsilateralen Hemicord unverletzt oder verletzte Mäuse nach dem Transdiaphragmatic (TDia) oder transthorakalen (TTho) Ansatz der intrapleurale CTB Lieferung. Bars sind 250 µm. Daten wurden als der Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM) ausgedrückt. n = 5-7 Mäuse in jeder TDia Gruppe; n = 3 Mäuse in jeder TTho Gruppe. Nicht-parametrischen Mann-Whitney-U-Tests wurden durchgeführt und Ergebnisse galten als signifikant verschieden p < 0,05. p < 0,001 für unverletzt versus C4 Verletzungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die hierin beschriebene Protokoll kann angewendet werden, um jede Belastung erwachsener Mäuse oder experimentellen Paradigma, in dem die Integrität der Membran-PhMN Schaltung ausgewertet werden soll. Zum Beispiel sind die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und Verletzungen des zervikalen Rückenmarks (cSCI) Bedingungen im Zusammenhang mit PhMN Verlust, Anterograde Degeneration der Phrenicus Axone und anschließende Atemwege Kompromiss. Tiermodelle der ALS oder cSCI imitieren histopathologische und funktionelle Atemwege Defizite bei menschlichen Erkrankungen beobachtet. In diesen Modellen sind oft histologische Techniken angewandt, um PhMN überleben im folgenden verschiedene therapeutische Interventionen mit dem Ziel PhMN Neuroprotektion18,20,21bewerten. Probleme der Aufnahme an der Membrane NMJ oder axonalen Transport wird zweifellos die Menge an CTB angesammelt in den neuronalen Zellkörpern beeinträchtigen. Verlust der Phrenicus Axone oder PhMN Degeneration offensichtlich verringert der CTB-Retrotransported ins Rückenmark sich.
Jeder Ansatz der intrapleurale Verwaltung hat seine eigenen Vorteile und Nachteile Transdiaphragmatic Injektionen sind sehr invasiv, erfordern Laparotomie und sorgfältige Nähen von allen Hautschichten, Dehiszenzen und Orgel überstand zu verhindern. Laparotomie stört die normale Atmung22 und man kann nicht ausschließen, dass es PhMN Aktivität oder Retro-Transport-Effizienz beeinträchtigen können. Allerdings sorgt die direkte Visualisierung der Membran während der Injektion erfolgreiche Ausrichtung der Pleuraraum aller Zeiten. Transthorakalen Injektionen sind minimal-invasive im Vergleich zu Transdiaphragmatic Injektionen und können daher als ein Verfahren zur Verfeinerung, im Stile von "Drei Rs" Konzept. Ein Nachteil ist die erhöhte Wahrscheinlichkeit des Seins-Target für einen unerfahrenen Benutzer (z. B. in das subkutane Gewebe oder in der Brustwand).
Nach intrapleurale Leuchtstofflampen-CTB-Verwaltung ist es wahrscheinlich, dass jede Projektion auf Muskeln entlang der Pleurahöhle Motoneuron bezeichnet werden, einschließlich PhMN, Intercostalneuralgie Motoneuronen oder verschiedenen Populationen der Hirnstamm motorischen Neuronen. Bei erwachsenen Ratten zeigten Mantilla Et Al., dass Intercostalneuralgie motorischen Neuronen im ventralen Horn der thorakalen Rückenmark sowie einige Dorsal Root Ganglion Neuronen4auch beschriftet waren. Wir haben nie überprüft das Vorhandensein von CTB-markierten Zellen an anderen Standorten als des zervikalen Rückenmarks bei Mäusen.
Je nach den Einstellungen/Versuchsmodelle Zielparameter zählen die spaltenweise Anordnung der PhMNs entlang der zervikalen Rückenmark, detaillierte Analyse der geometrischen Daten über die Position der einzelnen PhMN oder, wie hier beschrieben, die Quantifizierung der PhMN Anzahl. Die genaue Auswertung der Gesamtzahl PhMN richtet sich nach technischen Überlegungen und Inter Evaluator Zuverlässigkeit; Aufgrund der Variabilität der CTB Fluoreszenzintensität, Neuron Soma Größe oder Hintergrundfärbung. Nach unserer Erfahrung mit Transdiaphragmatic Injektionen von CTB-Fluorophor haben wir die Anzahl der PhMN pro Maus Hemicord in einem Bereich zwischen 120 und 180 Zellen, eine Reihe von Daten aus anderen Gruppen8ein bisschen weniger geschätzt. In der Tat gibt es zwei Einschränkungen der Studie. Erstens eine begrenzte Anzahl von Tieren mit der transthorakalen Ansatz injiziert werden und zweitens gibt es eine Unsicherheit über die vollständige Kennzeichnung PhMN Pool. Phrenicus Nerv Dip (nach Durchtrennung der Nerven) oder intraneural Injektionen mit fluoreszierenden neuroanatomischen Tracer sind ergänzende Techniken, die verwendet werden können, um alle PhMNs genauer bezeichnen. Für zukünftige Studien empfiehlt es sich, PhMNs zählen durch unvoreingenommene Methoden wie Stereologie.
Nach unserer Erfahrung haben wir nie irgendwelche offensichtlichen Atemwege Defizit oder Komplikationen (Atemnot) wie Blutungen oder Pneumothorax nach diesem Verfahren beobachtet. Wenn die Membrane während der Transdiaphragmatic Injektionen beschädigt wurde, jedoch sollten Sie mit Hilfe einer Nadel mit kleinerem Durchmesser oder mit schärfer Fase.
Zur Vermeidung von tierischen Tod während oder nach der Operation sorgfältig prüfen die Konzentrationen der einzelnen Komponenten in der Narkose cocktail. Verhindern Sie, dass Verletzungen auf die Oberflächen von Leber, Darm, Gallenblase oder des Zwerchfells.
Keine oder geringe Kennzeichnung von PhMN könnte aus mehreren Gründen. Versäumt die transthorakalen Injektion der Pleurahöhle, nochmals machen und durch manuelle Abtasten überprüfen, ob die Nadel unter den Rippen eingeführt wird oder nicht durch die Haut herausspringen. Nach Einspritzung von CTB Lösung sollten keine Luftblasen bilden. Denken Sie auch daran, dass die Internalisierung der CTB in der Nervenzelle pH-abhängig23 ist: sauren und neutralen pH sind optimal, während grundlegende pH-Wert beeinträchtigt die Aufnahme des Toxins. Es wird empfohlen, CTB-Pulver in Wasser oder in Kochsalzlösung PBS-Puffer aufzuwirbeln. Betrachten Sie die Persistenz-Zeit des beschrifteten Toxins im neuronalen Zelle Körper. Nach unserer Erfahrung konnten wir CTB-markierten Zellen in einem Zeitfenster zwischen vier Tagen und zwei Wochen nach der Entbindung intrapleurale erkannt werden. Verringerung der Zeit zugewiesen retrograde Transport oder Erhöhung der Zeit zwischen intrapleurale Lieferung und Opfer die optimale Erkennung von Leuchtstoff-CTB im Gewebe beeinträchtigen könnte.
Um zu vermeiden verwenden Fluoreszenz verblassen richtige Fixativ Methode. Wir empfehlen Ihnen, Körper des Tieres mit gepufferten 4 % Paraformaldehyd Vorrichtung. Nach der Ernte des Rückenmarks inkubieren Sie über Nacht in der gleichen Fixiermittel. Cryoprotect die Schnur in 30 % Saccharoselösung für 72 Stunden bis zum Untergang, dann einbetten die zervikale Erweiterung (ca. 8 mm) in O.C.T. Medium. Nicht austrocknen oder die Probe in Paraffin einbetten. Schützen Sie spinale Proben oder Gewebeschnitte während der gesamten Post-Processing vor Licht. Feste ganze Rückenmark können monatelang bei 4 ° C gehalten werden, wenn Thiomersal Kryoprotektivum Lösung hinzugefügt wird (fügen Sie Natriumazid wie es Fluoreszenz verblassen zu provozieren). Gewebeschnitte können monatelang lichtgeschützt bei-20 ° C gehalten werden. Zu guter Letzt empfehlen wir um die Dias mit einem Anti-Fading-Reagenz zu montieren. Wenn die Fluoreszenz ist verblasst, ist es noch möglich, CTB verwenden Immunohistochemistry zu erkennen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir sind dankbar, Robert Graffin und Pauline Duhant für ihre technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
References
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