Summary
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לזיהוי הסרעפת מוטורי לגלוקוז בעכברים לאחר מסירת intrapleural fluorophore מצומדת כולרה הרעלן יחידה משנית בטא. שתי טכניקות מושווים להחדיר את חלל הצדר: transdiaphragmatic לעומת גישות אקו.
Abstract
הסרעפת מוטורי לגלוקוז הם צוואר הרחם מוטורי לגלוקוז שמקורם C3 C6 רמות ב יונקים ביותר. תחזיות עצב להתכנס לתוך הסרעפת העצבים innervating הסרעפת בדרכי הנשימה. חוט השדרה פרוסות, הסרעפת מוטורי לגלוקוז אין אפשרות לזהות של אחרים מוטורי לגלוקוז על קריטריון מורפולוגי או ביוכימי. אנו מספקים את התיאור של נהלים להמחשת גופות תא הסרעפת נוירון מוטורי בעכברים, זריקות intrapleural הבאות של כולרה הרעלן יחידה משנית בטא (CTB) מצומדת כדי fluorophore. מעקב neuroanatomical פלורסנט הזה יש את היכולת שהסתבכת בצומת עצב-שריר הסרעפת, האקסונים הסרעפת מידך retrogradely ולהגיע הגופים תא הסרעפת. שתי גישות מתודולוגיים intrapleural CTB מסירה מושווים: transdiaphragmatic לעומת זריקות אקו. שתי הגישות מצליחים וגוררים מספר דומה של התווית על-ידי CTB הסרעפת מוטורי לגלוקוז. לסיכום, שיטות אלה ניתן להחיל באופן חזותי או לכמת את הסרעפת מוטורי לגלוקוז במחקרים ניסיוני שונים כגון אלה התמקדו המעגלים דיאפרגמה-הסרעפת.
Introduction
מטרת המחקר היא להציג שיטה אמינה כדי לזהות הסרעפת מוטורי לגלוקוז (PhMN) על העכבר בחוט השדרה חלקים. הזרקה של מכשיר מעקב neuroanatomical פלורסנט בחלל פלאורלי נבחרה שיטת המשלוח יגיע ההשתקפויות עצב-שריר הסרעפת אל הסרעפת, להשתמש בתחבורה רטרוגרדית לאורך האקסונים הסרעפת לתייג גופות תא הסרעפת. שתי טכניקות מסירה intrapleural מתוארים: transdiaphragmatic נגד אקו.
הסרעפת מוטורי לגלוקוז הם תאים ממסר בעמוד השדרה אשר אקסונים להתכנס לתוך הסרעפת העצבים, אשר בסופו של דבר innervate הסרעפת. אלה נמוך מוטורי לגלוקוז הכונן inspiratory ממרכזי נשימה bulbar וקבלת העברתו אל צמתי neuro-שרירים הסרעפת (NMJ). PhMN בנויות לתוך שתי עמודות מוטוריים, אחד עבור כל hemicord, פועל לאורך עמוד השדרה אמצע-צוואר הרחם. ברוב זני יונקים לרבות בני אדם, העמודות מנוע הסרעפת התפשט ברמות C3 C61,2,3. אנחנו ואחרים אישרו כי PhMN מרוכז ברמות C3-C5 עכבר ועכבר חוט השדרה4,5,6,7,8. התפלגות הטופוגרפי של תאים הסרעפת אינו אקראי; מוטורי לגלוקוז innervating החלק בחיתוך של הסרעפת מופצים יותר בצפיפות בחלק הגולגולת של הסרעפת בתחזוקת (C3), בעוד מוטורי לגלוקוז innervating החלק crural הם יותר סימטרית (C5)9. יתר על כן, PhMN מקובצים בדרכים שונות בהחומר האפור קרן הגחון. בגובה C3, האשכולות של תאים הסרעפת לשקר רוחבית, ואז הם משמרת בכיוון ventrolateral נמצאים ventromedially ביותר סימטרית רמות10,11.
בהינתן תפקידם חיוני במהלך השראה, זה חשיבות עליונה כדי לזהות במדויק PhMN בחוט השדרה בריא אך גם לעקוב אחר גורלם במהלך מצבים פתולוגיים, כמו מחלות ניווניות או פציעה טראומטית של חוט השדרה. מאחר PhMN לא נבדלים מורפולוגית אחרים צוואר הרחם מוטורי לגלוקוז, זיהוי של PhMN מסתמך על מסירת יישוב המשדרים neuroanatomical או ברמה של מרכזי הנשימה העיקרי8, או ב- NMJ הסרעפת7 או ב עצב הסרעפת4. רכיב המעקב הוא נלקח על ידי סיבי העצב ונשא עד הגופים תא הסרעפת בעמוד השדרה הצווארי, שם זה ניתן לאבחן באמצעות מערכות זיהוי ישיר או עקיף. ואחר כך נסיגה או anterograde המשדרים זמינים מסחרית עם מגוון רחב של conjugates. ראוי לציין, מעקב כל אחד ניחן לא, יכולות נמוך או גבוה לעקיבה סינפטית טרנס.
במחקר הנוכחי, בחרנו את יחידת משנה של בטא של הרעלן כולרה (CTB) functionalized עם אלקסה עבור חיל הים 555 (המכונה מעתה ואילך CTB-fluorophore) כתווית פלורסנט, ומאפשר פריט חזותי ישיר של PhMN על חלקים קפואים בחוט השדרה. CTB מתואר בדרך כלל מכשיר מעקב monosynaptic למרות נתוני הניסוי נוטים להראות עם המעבר transneuronal12. CTB יש את היכולת לאגד את ganglioside GM1-קרום הפלזמה של הסוף עצב. CTB הוא הפנימו דרך clathrin תלוית או - עצמאית מנגנונים ו- traffics דרך הרשת הטרנס-גולג'י לתוך רשתית תוך-פלזמית13,אופנה רטרוגרדית14. הפנמה של תחבורה רטרוגרדית נראה אסתמך על ה15,שלד התא אקטין16 כמו גם על רשת microtubule17.
כדי להדגים את התועלת של CTB בתור מכשיר מעקב neuroanatomical רטרוגרדית תיוג דיאפרגמה-PhMN המעגלים, נמסרה CTB-fluorophore intrapleurally. CTB היה מנוהל באמצעות שתי שיטות: הראשון כולל פתיחה של הבטן זריקות transdiaphragmatic מרובים; השני, פחות פולשני, להשתמש זריקה אקו ייחודי. ארבעה ימים מאוחר יותר, שכותרתו fluorescently PhMNs היו לכמת בחוט השדרה הצווארי מן בריא והן מחיות (C4) נפגע spinally.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול הניסוי נערך בהתאם להוראות מועצת הקהילות באירופה לניסוי בעל חיים (2010/63/האיחוד האירופי, 86/609/EEC ו- 87-848/EEC), אושרה על ידי החיה אתיקה הוועדה של אוניברסיטת נאמור (מוסר פרוייקט n ° 17-284 ). איור 1 מציג את שתי הגישות בהתאמה: transdiaphragmatic או זריקות אקו. השתמש עכברים C57bl/6J זכר (n = 18), בגילאי 3 עד 4 חודשים במחקר.
1. הכנת CTB פתרון
- לזריקות transdiaphragmatic:
- להמיס את הכוח CTB במים סטריליים לריכוז 0.2% (w/v).
- טען µL 7.5 של CTB פתרון (0.2% w/v) ב סטרילי 10-µL-microsyringe עם מחט בקוטר 33 המצורפת (שיקוע בוטה או קצר) עבור כל עכבר.
- להזרקה אקו:
- להמיס את הכוח CTB במים סטריליים לריכוז 0.1% (w/v).
- לטעון µL 20 של CTB פתרון (0.1% w/v) מזרק 500-µl-אינסולין סטרילי עם מחט 27-מד משופע עבור כל עכבר.
הערה: הקפד להשתמש במים מזוקקים, סטרילי, כראוי להמיס את האבקה CTB. הפתרון ניתן לשמור ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודש (לא להקפיא). את התמיסה שעלולים להיווצר לאחר כמה ימים. להביא את הפתרון לטמפרטורת החדר ומערבבים היטב בעזרת פיפטה לפני השימוש.
2. הכנה לפני זריקות Intrapleural
- לחטא כלי ניתוח לפני הניתוח, באמצעות מעקר אוטוקלב או חרוזי זכוכית. להכין מעיל נקיים לעשות ניתוח, להיפטר כלים כירורגיים.
הערה: כל חומר המשמש במהלך הליך כירורגי צריך להיות סטרילי. כלי זה לא ניתן לעקר כגון microsyringe שאמור להימחק עם חומר מחטא (chlorhexidine) או צריך להיות חד-פעמי בלבד. המנתח צריך לשטוף את הידיים שלו עם חומר מחטא (chlorhexidine סקראב) לפני תחילת הניתוח. המנתח צריך ללבוש כפפות סטריליות facemask, חלוק נקי. - שוקל חיה, ולפקח על המינון המתאים של הרדמה: הזרקה בקרום הבטן של הרדמה קוקטייל (למשל קטמין 100 מ"ג/ק"ג, חריגות השירותים הווטרינריים 5 מ"ג/ק"ג).
- לצבוט הבוהן ו/או לבדוק ההפסד של רפלקס palpebral כדי לקבוע אם העכבר הוא מורדם כראוי. להחיל משחה הוטרינר כדי להגן על הקרנית.
- לגלח בקפידה את העור הגחון (עבור הליך transdiaphragmatic) או ימנית צדדית בית החזה העור (עבור הליך אקו), בעזרת קוצץ שיער חשמלי. מגלחת טוב ורחב מספיק כדי למנוע שיער מקבל לתוך שדה הניתוח.
- להבטיח תנאים aseptic על-ידי יישום מקומי של 10% הפתרון יוד על האזור המגולח. להשתתף באתר כירורגית עם הפתרון יוד, וישתדלו לקרצף מהמרכז של האתר לעבר הפריפריה.
- השתמש כרית homeothermic לאורך כל הניתוח כדי לשמור על טמפרטורת גוף של החיה.
3. Intrapleural זריקות באמצעות גישה Transdiaphragmatic
- . תשכבי על העכבר anesthetized במצב פרקדן על משטח חימום מקם כרית גזה מגולגלת מתחת לצוואר של החיה. העכבר למבוגרים, להשתמש בפתקים גזה מגולגלת 0.5 ס מ עובי. קלטת זו pad ללוח ניתוח כדי למנוע תנועה אם בכלל.
- באמצעות להב אזמל, פצעים וחתכים בעור הגחון לאורך הקו האמצעי: בחתך של הסרעפת באזור הטבור תוך מתיחת עור רוחבית עם היד השנייה כדי להפוך את העור מתוח. אל תחיל לחץ רב מדי על הלהב כדי למנוע נזק איברים המשמש כבסיס.
- בעזרת מספריים קטנות, ניתוק בקפידה את העור מפני שרירי הבטן סביב החתך. הליך זה יעזור לתפירת השרירים ואת העור בנפרד בסוף הניתוח.
- לבצע בעזרת מספריים קטנות laparotomy. פתח את חלל הבטן על ידי ביצוע חתך בדש ברמה של הטבור. תחתכי את שרירי הבטן לאורך הקו הלבן ("linea alba") עד הסרעפת.
- על מנת להמחיש את פני הבטן הסרעפת, משכי שרירי הבטן בעזרת רטרקטורים מסחריים או תוצרת בית.
הערה: אלה רטרקטורים יכול להיעשות מתוך מהדקי נייר בגודל midi בצורת L-הוק19. - למתוח את שני הצדדים של פתיחת בטן, וכן הקלטת למטה דרק המעיל ספסל. למטב את ההארה של שדה הראייה כך פני הבטן הסרעפת היא לא יותר בתוך הצללים. המכשיר תאורה החזקים ביותר למטרה זו הוא מנורת LED עם קרני האור orientable.
- באמצעות פינצטה רך ביד אחת, תרים את התוספתן xyphoid ולפתוח האונות לרוחב של הכבד (איור 2 א). בעזרת מספריים קטנות ביד אחרים, בזהירות לחתוך רצועה suspensory, ללא פגיעה בכיס המרה או הסרעפת (איור 2B).
- באמצעות פינצטה רך ביד אחת, הרם את התוספתן xyphoid. לתפוס את המזרק המילטון וביד השנייה. יעד שלושה אתרים של הזרקת ב ריקמת לכסות את בחזה ובצלעות, בהתאמה, את האמצעי ואת האזורים crural (איור 3A, כניסה ב- 3B איור).
- כמו העובי הסרעפת מ 0.37 מ בסביבה עכברים7, הכנס את המחט לא יותר מ 1 או 2 מ מ מעבר הגיליון הסרעפת כדי למנוע נזקים ריאות במהלך הנשימה. לספק µL 2.5 של CTB פתרון (0.2% w/v) דרך הסרעפת נכון בכל אתר (איור 4B). ייצוב של הסרעפת אינה נדרשת.
- חזור על הליך זה עבור שלושת האתרים חולשת של הזרקה (איור 1 א'), ו contralaterally עבור תיוג דו צדדיים של הבריכה PhMN.
- כדי לסגור את האתר פתיחת בטן, תפר שרירי הבטן עם resorbable 4-0 בתפר. שימוש תפרים קטעה במרווחים קבועים על ידי 3 מ מ. הידוק העור סגור עם קטעי 9.0 mm פצע. הדק סיכות כדי למנוע חיה חליצה סטייפלס. שטח סטייפלס כ 5 מ מ אחד מהשני. יתר להדק את הפריטים הפצע, כמו זה יכול להוביל לריפוי לקוי.
- המזרק מיקרו לנקות עם מים מזוקקים למניעת סתימת. לאט לאט למשוך ולהוציא 2 - 3 פעמים. אל תצייר אוויר לתוך מזרק.
4. Intrapleural הזרקת בגישה אקו
הערה: שיטה זו השראה מן ההליך המתואר חולדות4 , הותאם העכבר.
- . תשכבי העכבר השמאלי למקם חמצן לרוחב, על כרית החימום (איור 4A) anesthetized
- לזהות את הצלעות השישית לשביעית תחת באזור המרפק על ידי מישוש ידני (איור 4B).
- בעוד עוזרת מרחיב נכון קידמה - ו הינד-הגפיים (איור 5A), הכנס את המזרק אוריינטציה cranially, tangentially תחת השישי או הצלע השביעית, 3 מ מ עמוקה מהעור, עם שפוע למטה (איור 1B , איור 5B).
- לרומם את המחט בעדינות כדי לאשר, על-ידי הרמת הצלעות למעלה, זה היא ממוצבת היטב לתוך חלל בית החזה (איור 5C, כניסות ב איור 1B).
- ייצוב נושם תנועות החזה על ידי הפעלת לחץ קל עם שתי אצבעות על הקיר החזה.
- בעוד אתה מחזיק את המזרק ביד אחרים, לספק 20 µL של CTB פתרון (0.1% w/v) זריקה אחת.
5. לאחר הניתוח טיפול
- מיד לאחר הניתוח, להניח את העכבר במצב חימום הימנית על משטח homeothermic להתאוששות. זה מבטיח את רכיב המעקב למרוח אותו על הצד הימני של חלל פלאורלי, מאפשר ניטור הנשימה של בעלי החיים.
- מחלקים 1 מ"ל של תמיסת סטרילית i.p. subcutaneously. לספק זריקות המשך טיפול אם החיה מופיע מיובש ו/או תשוש.
- ניהול subcutaneously 0.1 מ"ג/ק"ג של הבופרנורפין, פעמיים ביום במשך יומיים שלאחר הניתוח הראשון, כדי למזער את כאב פוטנציאליים.
הערה: מוסדות רבים ממליצים שיכוך כאבים עם מודאלים מרובים עבור הליכים פולשניים, כגון פתיחת בטן מתוארים כאן. הדבר עשוי לכלול שימוש תרופות אנטי דלקתיות לא סטרואידיות (NSAID) ו/או סוכן הרדמה מקומית באתר החתך. תרופות אלו מועברים בדרך כלל לפני החתך הראשוני כדי למזער את הכאב המכנית. - לפקח על חיות מדי יום עד המתת חסד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עכברים C57bl/6J זכר (n = 18), בגילאי 3 עד 4 חודשים נכללו במחקר. ביום 0 של הניסוי, עכברים 8 עברה לחבורה C4 חד צדדית, ימנית צדדית, על-פי פרוטוקול שפורסמו7,18. כמו שאם שגרת, עכברים 10 עברה של laminectomy על C4 בלי החבורה. יום 3, עכברים הוכנו על הזריקות intrapleural של CTB-fluorophore על-פי שני ההליכים השונים שתוארו לעיל. יום 7, כל העכברים היו מורדמים בעקבות הרדמה (קטמין 100 מ"ג/ק"ג, חריגות השירותים הווטרינריים 5 מ"ג/ק"ג), דימום למוות.
כל שידרה נקטפו, קבוע ב- paraformaldehyde ו- cryoprotected ב- 30% סוכרוז על פי הנהלים מעבדה סטנדרטיים. התרחבות צוואר הרחם היה מבודד, מוטבע לתוך O.C.T., cryosectioned longitudinally או ערמוני-עובי של 30 מיקרומטר.
סעיפים האורך בעמוד השדרה נצפו עם מיקרוסקופ פלורסנטי מצויד עם מסנן קוביה לניתוח קרינה פלואורסצנטית (עירור: 560/20nm; פליטה: 635/30nm). פלורסנט מוטורי לגלוקוז ב הצופר הגחון אותרו כעמודה ליניארי של תאים C3 לרמות C5 (איור 6A, החלונית העליונה). כל התאים שכותרתו אותרו החומר האפור חולשת, הציג מורפולוגיה בקנה אחד עם מוטורי לגלוקוז (איור 6B). אצל בעלי חיים פצועים, לאובדן מרשים שכותרתו PhMN נצפתה ברמת C4, יחד עם הפרעה רקמות בעמוד השדרה (כוכבית ב 6A איור ו- 6 C). CTB+ PhMNs נספרו באופן ידני כל החמישי רוחבי בסעיף (רווח על ידי 150 מיקרומטר) חוטי השדרה שציווית ונפצעו C4 (איור 6C). הערכה של המספר הכולל של PhMNs שכותרתו מחושב על ידי הכפלת מספר התאים CTB+ שנספרו 5. בעכברים בריאים שציווית, המספר הכולל של PhMNs שכותרתו לכל hemicord נאמד ב 151 ± 9 בעת שימוש בגישה transdiaphragmatic (TDia), לעומת 178 ± 9 כאשר באמצעות גישה (TTho) אקו (6D איור). בעקבות פגיעה C4, מספרים אלה ירד בהתאמה ל ± ± 14 ו- 70 59 10. במחקר זה, אין הבדלים סטטיסטיים היו עדות בין שתי שיטות של משלוח intrapleural (p > 0.05, מבחן מאן-ויטני U; TDia לעומת TTho).
איור 1. זריקות Intrapleural באמצעות transdiaphragmatic או זריקות אקו- Transdiaphragmatic גישה כוללת פתיחה של הבטן, חשיפת פני הבטן הסרעפת (בצבע ורוד), שלוש זריקות באזורים בחזה ובצלעות, המדיאלי, crural A. לגישה אקו, העכבר מונח בתנוחה חמצן הלטראלי השמאלי. הצלעות השישית לשביעית מזוהים תחת באזור המרפק על ידי מישוש ידני B. המחט מוחדרת דרך העור, הרקמה התת עורית, שרירי בית החזה, השרירים הבין-צלעי את קרום הריאות הקודקוד כדי להגיע את חלל הצדר (אסטריקס). S, בחזה ובצלעות; m, המדיאלי; c, crural; S/SC, לעור ולרקמה התת-עורית; TM, שרירי בית החזה; IC, השרירים הבין-צלעי; pp; הקודקוד קרום הריאות; L, ריאות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. דימומים עם נוף על הכבד, כיס המרה, פני הבטן הסרעפת. א הערה רצועה suspensory בין כיס המרה הסרעפת. B. רצועה בקפידה נחתך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. תצוגה על הסרעפת. ריקמת מזוהים את בחזה ובצלעות (s), המדיאלי (ז) ואזורי crural (ג). א שימו לב כי האזור crural האחורי כדי האונות בכבד. B. להזריק CTB בחלל פלאורלי, הכנס את המחט עמוק דרך הסרעפת-חמי נכון 1 מ"מ. הזריקה באזור המדיאלי הוא מאויר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. הגישה אקו- כשהעכבר ממוקם בתוך חמצן הלטראלי השמאלי A. לזהות את השוליים costal של הסרעפת ובאזור המרפק. B. השישית לשביעית בצלעות מזוהים עמוק לאזור המרפק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. החללים הבין-צלעי השישית לשביעית מזוהים עמוק לאזור המרפק. א. קידמה - ו הינד-גפיים מורחבות. B. המזרק cranially מונחה ונוסף tangentially תחת השישי או הצלע השביעית, 3 מ מ עמוק דרך השרירים הבין-צלעי, עם שפוע הפוך. ג. המחט בעדינות הוא גבוה ואת הצלעות מוסרות כדי לאשר המחט היא ממוצבת היטב לתוך חלל בית החזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6. תאים CTB+ החומר האפור קרן הגחון של עכברים המוזרק intrapleurally. א spinally שציווית עכבר, CTB+ הסרעפת מוטורי לגלוקוז להפיץ לאורך חוט השדרה הצווארי של רמת C3 ל- C5. עכבר גורמים להתדרדות, רקמות השיבוש הוא ציין באופן חד צדדי עם הפסד של CTB+ הסרעפת מוטורי לגלוקוז ברמת C4 (אסטריקס). ב' שכותרתו CTB+ התאים היו ממוקמים בתוך החומר האפור חולשת, הציג מורפולוגיה בקנה אחד עם מוטורי לגלוקוז. ג מקטעים רוחבי של שידרה שימשו כדי לכמת את מספר התאים CTB+ במרחקים מסוימים לאורך חוט השדרה שציווית (משמאל) ועכברים (מימין) פצוע. למצוא את hemicord חולשת בעכברים שציווית או פצוע, בהתאם transdiaphragmatic (TDia) או בגישה אקו (TTho) של intrapleural CTB משלוח תאים של כימות של CTB+ ד . ברים מייצגים 250 מיקרומטר. הנתונים היו לבטא זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM). n = 5-7 עכברים בכל קבוצה TDia; n = 3 עכברים בכל קבוצה TTho. בוצעו בדיקות U מאן-ויטני Non-parametrical ואת תוצאות נחשבו שונה באופן משמעותי גם עבור p < 0.05. p < 0.001 עבור שציווית נגד פגיעה C4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתן להחיל את פרוטוקול המתוארים בזאת כל זן של עכברים בוגרים או כל פרדיגמה נסיונית שבה ניתן להעריך את תקינות המעגלים דיאפרגמה-PhMN. למשל, נוירודגנרטיביות (ALS) פגיעה בחוט השדרה הצווארי (cSCI) הם תנאים הקשורים PhMN הפסד, anterograde ניוון של אקסונים הסרעפת ואת הבאים פשרה בדרכי הנשימה. מודלים חייתיים של ALS או cSCI לחקות histopathological ופונקציונליים גירעונות הנשימה שנצפתה מחלות אנושיות. דגמים אלה, טכניקות היסטולוגית מוחלים לעיתים קרובות כדי להעריך PhMN הישרדות בעקבות התערבויות טיפוליות שונות, מכוון PhMN neuroprotection18,20,21. בעיות של ספיגת על הסרעפת NMJ או תחבורה עצב יפגע ללא ספק את הכמות של CTB שנצבר בגופים תאים עצביים. אובדן של הסרעפת אקסונים או ניוון PhMN ברור יקטן הסכום של CTB retrotransported לתוך חוט השדרה.
בכל אחת מהגישות מינהל intrapleural יש יתרונות משלו, זריקות Transdiaphragmatic cons. הם די פולשני, המחייב פתיחת בטן, תפרים זהיר של כל שכבות העור למניעת התבקעות ו עוגב בליטה. פתיחת בטן מפריע נשימה נורמלית22 , אחד לא יכול לשלול כי זה עשוי להשפיע על יעילות פעילות או רטרו-תחבורה PhMN. עם זאת, פריט חזותי ישיר של הסרעפת במהלך ההזרקה מבטיחה מיקוד מוצלחת של המרחב פלאורלי כל הזמן. זריקות אקו-פולשנית לעומת זריקות transdiaphragmatic, יכול ובכך להיחשב הליך עבור עידון, בווריד של המושג "ר' שלושה". חסרון אחד הוא גדל הסיכוי להיות את-יעד למשתמש לא מנוסה (למשל, הרקמה התת עורית או בדופן בית החזה).
בעקבות פלורסנט-CTB intrapleural ניהול, סביר כי כל נוירון מוטורי מקרין על השרירים המצפים את חלל הצדר יסומנו כסעיפים, כולל PhMN, הבין-צלעי מוטורי לגלוקוז או אוכלוסיות שונות של גזע המוח מוטורי לגלוקוז. בחולדות למבוגרים, Mantilla et al. הוכיח כי הבין-צלעי מוטורי לגלוקוז גם תוויות ב הצופר הבטני של חוט השדרה החזי, כמו גם כמה נוירונים גנגליון העזוב שורש4. לא בדקנו הנוכחות של תאים התווית על-ידי CTB באתרים אחרים מאשר חוט השדרה הצווארי בעכברים.
בהתאם ההגדרות/ניסיוניות, התוצאה אמצעים יכולים לכלול את סידור טורי PhMNs לאורך חוט השדרה הצווארי, ניתוח מפורט של הנתונים הגיאומטריים אודות המיקום של כל PhMN או, כפי שמתואר כאן, כימות של PhMN מספר. הערכה מדויקת של סה כ PhMN תלוי שיקולים טכניים ואמינות המאבחן אינטר; בגלל ההשתנות של CTB עוצמת קרינה פלואורסצנטית, נוירון סומא גודל או צביעת הרקע. מניסיוננו באמצעות זריקות transdiaphragmatic של CTB-fluorophore, אנחנו מעריכים את מספר PhMN לכל hemicord העכבר בטווח בין 120 ל- 180 תאים, מספר של קצת פחות נתונים אחרים קבוצות8. אכן, קיימות שתי מגבלות המחקר. ראשית, מספר מצומצם של בעלי חיים מוזרקים באמצעות גישה אקו, השני ויש אי על תיוג מלא של הבריכה PhMN. מטבל עצב הסרעפת (לאחר חיתוך העצב) או זריקות intraneural עם פלורסנט מעקב neuroanatomical טכניקות משלימים ניתן לתייג באופן מדויק יותר את כל PhMNs. ללימודים בעתיד, מומלץ לספור PhMNs על ידי שיטות לא משוחדת כמו stereology.
מניסיוננו, לא הבחנו כל ברור קשב בדרכי הנשימה או סיבוכים (מצוקה נשימתית) כגון דימום או חזה הליך זה. עם זאת, אם הסרעפת ניזוק במהלך זריקות transdiaphragmatic, שקול להשתמש מחט של קוטר קטן יותר או עם שיפוע חד.
כדי למנוע מוות בעלי חיים במהלך או לאחר הניתוח בדוק הריכוזים של כל רכיב בקוקטייל ההרדמה. להימנע מפציעות על גבי המשטחים של הכבד, המעי, כיס המרה או הסרעפת.
לא או תיוג נמוך של PhMN יכול להיות בגלל מספר בעיות. אם הזריקה אקו מפספס את חלל הצדר, מחדש, בדוק על ידי מישוש ידני כי המחט מוחדרת תחת הצלעות או לא פופ החוצה דרך העור. אין בועות יוצרות על הזרקה של CTB פתרון. זכור גם כי הפנמת האמונה CTB התא לחוץ הוא תלוי-pH23: pH חומצי ונייטרלי הם אופטימלית ואילו pH בסיסי מחליש את ספיגת של הרעלן. מומלץ resuspend אבקת CTB במים, בתוך תמיסת מלח או במאגר PBS. שקול את הזמן התמדה של הרעלן שכותרתו בגוף תאים עצביים. מניסיוננו, אנו היתה אפשרות לזהות תאים התווית על-ידי CTB בחלון הזמן בין ארבעה ימים שבועיים לאחר הלידה intrapleural. הפחתת הזמן המוקצים ייסוג תחבורה או הגדלת הזמן בין intrapleural משלוח והקרבה שיכול לסכן גילוי אופטימלית של פלורסנט-CTB ברקמה.
כדי להימנע פלורסצנטיות נמוגה השיטה הנכונה מקבע. אנו מציעים פרפוזיה גוף החיה עם paraformaldehyde 4% במאגר. לאחר האיסוף חוט השדרה, תדגור לשבועיים באותו לילה Cryoprotect החוט בפתרון 30% סוכרוז למשך 72 שעות עד שוקע, ואז להטביע התרחבות צוואר הרחם (כ 8 מ מ) O.C.T. בינוני. לא מייבשים או להטביע את הדגימה פרפין. להגן על דוגמאות בעמוד השדרה או מקטעי רקמת אור במהלך עיבוד שלאחר כל. שידרה כל קבוע יכול להישמר ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודשים אם תימרוסל מתווסף הפתרון cryoprotectant (אין להוסיף אזיד הנתרן כמו זה לעורר פלורסצנטיות דהייה). ניתן לשמור מקטעי רקמת ב-20 מעלות צלזיוס במשך חודשים מן האור. לבסוף, אנו ממליצים להרכיב השקופיות עם ריאגנט נגד דהייה. אם ידי קרינה פלואורסצנטית נעלם, זה עדיין ניתן לזהות באמצעות אימונוהיסטוכימיה CTB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנחנו אסירי תודה, רוברט Graffin, פאולין Duhant לתמיכה טכנית שלהם
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
References
- Webber, C. L. Jr, Wurster, R. D., Chung, J. M. Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping. Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).
- Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study. J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).
- Gordon, D. C., Richmond, F. J. Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques. J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).
- Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. The phrenic motor nucleus in the adult mouse. Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles. J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).
- Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study. J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).
- Gottschall, J. The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons. Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).
- Lai, B. Q., et al. Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve. PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).
- Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms. J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).
- Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).
- Fujinaga, Y., et al. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).
- Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton. Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).
- Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Llado, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).
- Sieck, G. C., Fournier, M. Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors. J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).
- Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action. Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).
