Summary
Aqui, descrevemos um protocolo para identificar frênico neurônios em ratos após entrega intrapleural de fluoróforo conjugado beta de subunidade de toxina de cólera. Duas técnicas são comparadas para injetar a cavidade pleural: transdiaphragmatic versus transtorácicos abordagens.
Abstract
Frênico neurônios motores são cervicais neurônios motores provenientes de C3 a C6 níveis em espécies de mamíferos mais. Axonal projeções convergem em nervos frênico que inervam o diafragma respiratório. Em fatias de medula espinhal, neurônios frênico não pode ser identificados de outros neurônios motores em critérios morfológicos ou bioquímicos. Nós fornecemos a descrição dos procedimentos para a visualização do neurônio motor frênico corpos celulares em camundongos, seguir intrapleural injeções de beta cólera toxina subunidade (CTB) conjugada com um fluoróforo. Este marcador fluorescente neuroanatômica tem a capacidade de ser pego na junção neuromuscular de diafragma, efectuar-se retrogradely ao longo dos axônios frênico e alcançar os frênico corpos celulares. Duas abordagens metodológicas da entrega CTB intrapleural são comparadas: transdiaphragmatic versus transtorácicos injeções. Ambas as abordagens são bem sucedidas e resultam em número semelhante de CTB-rotulado frênico neurônios motores. Em conclusão, essas técnicas podem ser aplicadas para visualizar ou quantificar os neurônios motores frênico em vários estudos experimentais tais como aqueles focados no circuito frênico-diafragma.
Introduction
O objetivo do estudo é apresentar um método confiável para identificar os neurônios motores frênico (PhMN) em seções de rato da medula espinhal. Injeção de um traçador fluorescente neuroanatômica na cavidade pleural foi escolhida como o método de entrega para alcançar as projeções frênica neuromusculares sobre o diafragma e usar o transporte retrógrado ao longo dos axônios frênico para rótulo frênico corpos celulares. Duas técnicas de entrega intrapleural são descritas: transdiaphragmatic versus transtorácica.
Frênico neurônios são células de relé espinhal cujos axônios convergem em nervos frênico, que em última análise, inervam o diafragma. Estes são os neurônios motores inferiores recebendo o drive inspiratório do centro respiratório bulbar e retransmitindo-as junções de diafragma neuro-muscular (JNM). PhMN estão estruturados em duas colunas de motor, uma para cada hemicord, correndo ao longo da espinha meados-cervical. Na maioria das espécies mamíferas, incluindo os seres humanos, as colunas de motor frênica espalhar de níveis C3 a C61,2,3. Nós e os outros confirmaram que PhMN concentrada nos níveis C3-C5 no rato e o rato da medula espinhal4,5,6,7,8. A distribuição topográfica das células frênica não é ao acaso; os neurônios motores que inervam a parte esternal do diafragma são mais densamente distribuídos na parte cranial da frota de veículos frênica (C3), Considerando que os neurônios motores que inervam a parte crural são mais caudal (C5)9. Além disso, PhMN estão agrupadas vària no Corno ventral cinzenta. A nível de C3, os clusters de células frênico minto lateralmente, então eles se deslocar em uma direção ventrolateral e encontram-se ventromedially com a mais caudal níveis10,11.
Dado o seu papel vital durante a inspiração, é de extrema importância para identificar com precisão a PhMN na medula espinhal saudável mas também seguir seu destino durante condições patológicas, tais como doenças degenerativas ou lesões traumáticas da medula espinhal. Desde que PhMN não diferem morfologicamente outros neurônios motor cervicais, identificação de PhMN baseia-se na entrega alvo dos marcadores neuroanatômica, tanto ao nível dos centros respiratórios primária8, ou diafragma MNJ7 ou em o nervo frênico4. O tracer é retomado pelas fibras nervosas e transportado até os frênico corpos celulares na coluna cervical, onde ele pode ser visualizado usando sistemas de deteção direta ou indireta. Retrógrada ou anterógrada traçadores são comercialmente disponíveis com uma ampla gama de conjugados. Notável, cada marcador é dotado não, baixas ou altas habilidades para rastreamento sináptica trans.
No estudo atual, nós escolhemos a subunidade beta a toxina da cólera (CTB) acrescida com Alexa Fluor 555 (doravante referido como CTB-fluoróforo) como uma etiqueta fluorescente, permitindo uma visualização directa de PhMN em seções congeladas da medula espinhal. CTB normalmente é descrito como um tracer monosynaptic embora dados experimentais tendem a mostrar uma passagem de transneuronal12. CTB tem a capacidade de vincular o gangliosídeo GM1 na membrana plasmática do fim do nervo. CTB é internalizada através de Clatrina dependente ou - independente mecanismos e tráfegos através da rede trans-Golgi em retículo endoplasmático em uma moda retrógrada13,14. A internalização e o transporte retrógrado parecem ser dependente sobre o citoesqueleto de actina15,16 , bem como sobre a rede de microtúbulos17.
Para demonstrar a utilidade do CTB como um traçador neuroanatômica retrógrada rotulagem diafragma-PhMN circuitos, CTB-fluoróforo foi entregue intrapleurally. CTB foi administrado usando duas técnicas: a primeira que incluía uma laparotomia e múltiplas injecções de transdiaphragmatic; o segundo, menos invasiva, usado uma única injeção transtorácica. Quatro dias mais tarde, fluorescente-etiquetadas PhMNs foram quantificados na medula espinhal cervical de ambos de saudável e de feridas spinally (C4) animais.
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Protocol
O protocolo experimental foi realizado em conformidade com as directivas do Conselho das Comunidades Europeias para o experimento Animal (2010/63/UE, 86/609/CEE e 87-848/CEE) e foi aprovado pelo Animal ética Comissão de Universidade de Namur (ética projeto n ° 17-284 ). A Figura 1 descreve as duas abordagens respectivas: transdiaphragmatic ou injeções transtorácicos. Usar camundongos C57bl/6J machos (n = 18), a idade de 3 a 4 meses no estudo.
1. preparação da solução do CTB
- Para injeções de transdiaphragmatic:
- Dissolva o poder do CTB em água estéril na concentração de 0,2% (p/v).
- Carrega 7,5 µ l da solução CTB (0,2% p/v) em um estéril 10-µ l-microseringa com uma agulha de calibre 33 anexada (chanfro sem corte ou curto) para cada rato.
- Para injeção transtorácica:
- Dissolva o poder do CTB em água estéril na concentração de 0,1% (p/v).
- Carrega 20 µ l de solução CTB (0,1% w/v) em uma seringa estéril de insulina-500-µ l com uma agulha de calibre 27 chanfrada para cada rato.
Nota: Certifique-se de usar água destilada e esterilizada e dissolver adequadamente o pó do CTB. A solução pode ser mantida a 4 ° C por um mês (não congelar). Um precipitado pode formar após alguns dias. Trazer a solução à temperatura ambiente e misture bem com uma pipeta antes do uso.
2. preparação antes da Intrapleural injeções
- Esterilize instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia, utilizando o esterilizador autoclave ou grânulo de vidro. Prepare um casaco de banco limpo para fazer a cirurgia e para dispor os instrumentos cirúrgicos.
Nota: Qualquer material utilizado durante o procedimento cirúrgico deve ser estéril. Instrumentos que não podem ser esterilizados, tais como o microseringa deve ser limpo com um desinfectante (Clorexidina) ou deve ser descartáveis apenas. O cirurgião deve lavar suas mãos com um desinfectante (esfoliante de clorexidina) antes do início da cirurgia. O cirurgião deve vestir um vestido limpo, uma máscara e luvas estéreis. - Pesar o animal e administrar uma dose apropriada de anestesia: injeção intraperitoneal de anestésico cocktail (por exemplo, a cetamina 100mg/kg e xilazina 5 mg/kg).
- Aperte o dedo do pé e/ou verificar se há a perda do reflexo palpebral para determinar se o mouse está devidamente anestesiado. Aplica uma pomada de vet para proteger a córnea.
- Raspe com cuidado a pele ventral (para o procedimento de transdiaphragmatic) ou a lado direito torácica pele (para procedimento transtorácica), usando o cortador de cabelo elétrico. Raspe bem e suficientemente ampla para evitar cabelo entrando no campo da cirurgia.
- Assegurar condições assépticas por aplicação tópica de solução de iodo 10% sobre a área depilada. Esfregue o local cirúrgico com a solução de iodo, tendo o cuidado de esfregar no centro do local em direção a periferia.
- Use uma almofada homeotérmicos durante a cirurgia para manter a temperatura do corpo do animal.
3. Intrapleural injeções usando a abordagem de Transdiaphragmatic
- Coloque o mouse anestesiado em posição supina sobre uma almofada de aquecimento. Coloque uma gaze enrolada sob o pescoço do animal. Para um rato adulto, use uma gaze enrolada de 0,5 polegada de espessura. Fita esta almofada ao Conselho de cirurgia para evitar o movimento, se houver.
- Usando uma lâmina de bisturi, faça uma incisão na pele ventral ao longo da linha mediana: fazer uma incisão do processo xifoide à região umbilical ao esticar a pele lateralmente com a outra mão para fazer a pele esticada. Não exerça demasiada pressão sobre a lâmina para não danificar os órgãos subjacentes.
- Usando tesouras pequenas, cuidadosamente retire a pele dos músculos ao redor da incisão abdominais. Este procedimento ajudará na costura dos músculos e a pele separada no final da cirurgia.
- Realize laparotomia usando tesouras pequenas. Abra a cavidade abdominal através da realização de uma incisão de caseado ao nível do umbigo. Faça uma incisão ao longo da linha branca, os músculos abdominais ("linea alba") até o processo xifoide.
- A fim de visualizar a superfície abdominal, do diafragma, retrai os músculos abdominais, usando afastadores comerciais ou caseiros.
Nota: Estes retractores podem ser feitos de clipes de papel de tamanho midi moldadas em L-gancho19. - Estique-se ambos os lados da laparotomia e fita para baixo os afastadores para revestir o banco. Otimize a iluminação do campo de visão para que a superfície abdominal, do diafragma é não mais na penumbra. O mais poderoso dispositivo de iluminação para esta finalidade é uma lâmpada de LED com um feixe de luz orientável.
- Usando uma pinça macia em uma mão, levante o apêndice xyphoid e puxar para baixo os lóbulos laterais do fígado (Figura 2A). Usando tesouras pequenas na outra mão, cuidadosamente corte o ligamento suspensor, sem danificar a vesícula biliar ou do diafragma (Figura 2B).
- Usando uma pinça macia em uma mão, levante o apêndice xyphoid. Segure a seringa Hamilton na outra mão. Alvo de três locais de injecção no diafragma para cobrir respectivamente o esterno, a medial e as regiões crural (Figura 3A, inserir-se na Figura 3B).
- Como a espessura do diafragma é em torno de 0,37 mm em ratos7, insira a agulha não mais de 1 ou 2 mm além da folha de diafragma para impedir os danos de pulmão durante a respiração. Entrega 2,5 µ l de solução CTB (0,2% p/v) através do diafragma direito em cada local (Figura 4B). Estabilização do diafragma não é necessária.
- Repita este procedimento para os três sites ipsilaterais da injeção (figura 1A) e contralaterally para uma rotulagem bilateral da piscina PhMN.
- Para fechar o site de laparotomia, suture os músculos abdominais com reabsorvíveis sutura 4-0. Uso interrompidos pontos espaçados de 3 mm. pele de grampo fechado com grampos de 9,0 mm ferida. Aperte os grampos para impedir que o animal retirar agrafos. Espaço grampeia separado aproximadamente 5 mm. Não aperte os clipes de ferida, como isso pode levar a cicatrização prejudicada.
- Limpa micro seringa com água destilada para evitar o entupimento. Lentamente, elaborar e expulsar 2 - 3 vezes. Não extrair o ar na seringa.
4. Intrapleural injeção usando abordagem transtorácica
Nota: Este método é inspirado o procedimento descrito em ratos4 e foi adaptado ao rato.
- Coloque o mouse anestesiado em esquerda posição decúbito lateral, sobre uma almofada de aquecimento (Figura 4A).
- Identifica as sexta e sétima costelas sob a prega do cotovelo através da palpação manual (Figura 4B).
- Enquanto o assistente se estende direito dianteiro - e -membros posteriores (Figura 5A), inserir a seringa orientada cranialmente e tangencialmente sob a sexta ou sétima vértebra, 3 mm de profundidade da pele, com o bisel para baixo (figura 1B e Figura 5B).
- Eleve a agulha suavemente para confirmar, levantando as costelas, se ele está bem posicionado dentro da cavidade torácica (Figura 5, as inserções na figura 1B).
- Estabilize a respiração movimentos do tórax, aplicando leve pressão com dois dedos na parede torácica.
- Mantendo a seringa na outra mão, entrega 20 µ l de solução CTB (0,1% w/v) em uma única injeção.
5. no pós-operatório cuidados
- Imediatamente após o procedimento, coloque o mouse na posição de decúbito lateral direita sobre uma almofada homeotérmicos para recuperação. Isto assegura o tracer para espalhar no lado direito da cavidade pleural e permite o monitoramento de respiração do animal.
- 1 mL de solução salina estéril i.p. Administre por via subcutânea. Fornece acompanhamento injeções se o animal for exibida, desidratados e/ou apático.
- Administrar por via subcutânea 0,1 mg/kg de buprenorfina, duas vezes por dia durante o primeiro dois dias depois da cirurgia, para minimizar qualquer dor potencial.
Nota: Muitas instituições recomendaria analgesia multimodal de procedimentos invasivos, tais como a laparotomia retratado aqui. Isto pode incluir a utilização de um não-esteroides anti-inflamatórios (AINEs) e/ou de um agente anestésico local no local da incisão. Esses medicamentos normalmente são entregues antes da primeira incisão para minimizar a dor de dar corda. - Monitorar os animais diariamente até a eutanásia.
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Representative Results
Camundongos C57bl/6J machos (n = 18), com idade de 3 a 4 meses foram incluídos no estudo. No dia 0 do experimento, 8 ratos sofreram uma contusão unilateral do C4, lado direito, de acordo com o protocolo publicado7,18. Como procedimento de Souza, 10 ratos foi submetido a uma laminectomia em cima C4 sem contusão. No dia 3, os ratos estavam preparados para as injeções intrapleural do CTB-fluoróforo de acordo com os dois procedimentos diferentes, descritos acima. No dia 7, todos os ratos foram sacrificados após anestesia (cetamina 100mg/kg e xilazina 5 mg/kg) e perda de sangue.
Toda espinais foram colhidas, fixado em paraformaldeído e cryoprotected em sacarose 30% de acordo com os procedimentos padrão do laboratório. Alargamento cervical foi isolado, incorporado em O.C.T. e cryosectioned no sentido longitudinal ou transversalmente em uma espessura de 30 µm.
Cortes longitudinais da coluna vertebral foram observadas com um microscópio de epifluorescente equipado com cubo do filtro para análise de fluorescência (excitação: 560/20nm; Emissão: 635/30nm). Fluorescente de neurônios no Corno ventral foram identificados como uma coluna linear de células de C3 a C5 níveis (figura 6A, painel superior). Todas as pilhas etiquetadas foram localizadas na massa cinzenta ipsilateral e exibiram morfologia consistente com neurônios motores (Figura 6B). Em animais feridos, observou-se uma perda marcante de PhMN rotulada ao nível de C4, juntamente com o rompimento do tecido da coluna vertebral (asterisco na figura 6A e 6C). CTB+ PhMNs manualmente foram contados cada quinta seção transversal (espaçada por 150 µm) em ilesos e C4-ferido espinais (Figura 6). Uma estimativa do número total de rotulado PhMNs foi calculada multiplicando o número de células contadas do CTB+ 5. Em camundongos saudáveis ilesos, o número total de PhMNs rotulado por hemicord foi estimado em 151 ± 9 ao usar transdiaphragmatic (TDia) abordagem, em comparação com 178 ± 9 ao usar transtorácica (TTho) abordagem (Figura 6). Após lesão de C4, estes números caiu respectivamente para 59 ± 14 e 70 ± 10. Neste estudo, não há diferenças estatísticas foram evidenciadas entre os dois métodos de entrega intrapleural (p > 0,05, teste de Mann-Whitney U; TDia versus TTho).
Figura 1. Injeções de intrapleural usando transdiaphragmatic ou injeções transtorácicos. Transdiaphragmatic abordagem inclui uma laparotomia, exposição da superfície abdominal, do diafragma (na cor rosa) e três injeções na região esternal, medial e crural A. Para uma abordagem transtorácica, o mouse é colocado em posição de decúbito lateral esquerdo. As sexta e sétima costelas são identificadas sob a prega do cotovelo por palpação manual B. A agulha é inserida através da pele, tecido subcutâneo, musculatura torácica, os músculos intercostais e a pleura parietal para alcançar a cavidade pleural (asterix). S, esternal; m, medial; c, crural; S/SC, pele e tecido subcutâneo; TM, músculos torácicos; IC, músculos intercostais; PP; pleura parietal; L, pulmão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Campo cirúrgico com vista sobre o fígado, vesícula biliar e face abdominal do diafragma. R. Observe o ligamento suspensor entre a vesícula biliar e o diafragma. B. O ligamento é cuidadosamente cortado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Vista sobre o diafragma. O esterno (s), medial (m) e crural (c) áreas são identificadas no diafragma. R. Observe que a região crural posterior dos lóbulos do fígado. B. para injetar CTB no espaço pleural, insira a agulha de 1 mm de profundidade através do hemi-diafragma direito. A injeção na área medial é ilustrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Abordagem transtorácica. Mouse é posicionado em decúbito lateral esquerdo A. Identifica a margem costal, o diafragma e a região do cotovelo. B. os sexto e sétimo espaços intercostais são identificados no fundo para a região do cotovelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Os sexto e sétimo espaços intercostais são identificados no fundo para a região do cotovelo. A. Fore - e -patas são estendidos. B. A seringa é orientada cranialmente e tangencialmente inserida sob a sexta ou sétima vértebra, 3 mm de profundidade através dos músculos intercostais, com o chanfro de ponta-cabeça. C. A agulha suavemente é elevada e as costelas são levantadas para confirmar que a agulha está bem posicionada na cavidade torácica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Células CTB+ na massa cinzenta de ratos intrapleurally-injetado chifre ventral. R. no mouse spinally-ileso, CTB+ frênico neurônios distribuir ao longo da medula espinhal cervical do nível C3 a C5. No mouse contundido, rompimento de tecido é observado unilateralmente com perda de neurônios de motor frênico CTB+ a nível de C4 (asterix). B. CTB rotulado+ células foram localizadas na massa cinzenta ipsilateral e exibiram a morfologia consistente com neurônios motores. C. secções transversais de espinais foram usadas para quantificar o número de células CTB+ em distâncias específicas ao longo da medula espinhal em ileso (esquerda) e camundongos (à direita) feridos. Células de m. quantificação da CTB+ encontradas no hemicord ipsilateral em camundongos ilesos ou feridos, de acordo com o transdiaphragmatic (TDia) ou transtorácica (TTho) abordagem de entrega CTB intrapleural. Barras representam 250 µm. dados foram expressos como média ± erro padrão da média (SEM). n = 5-7 ratos em cada grupo TDia; n = 3 ratos em cada grupo de TTho. Realizaram-se testes não-paramétricos de U Mann-Whitney e os resultados foram considerados como significativamente diferentes para p < 0,05. p < 0,001 para ileso contra lesão C4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo descrito neste documento pode ser aplicado a qualquer tipo de ratos adultos ou qualquer paradigma experimental em que a integridade do diafragma-PhMN circuito deve ser avaliada. Por exemplo, a esclerose lateral amiotrófica (ela) e lesão medular cervical (cSCI) são condições associadas com perda de PhMN, anterógrada degeneração dos axônios frênico e subsequente compromisso respiratório. Modelos animais de ALS ou cSCI imitam histopatológicos e funcionais respiratórios déficits observados em doenças humanas. Nestes modelos, técnicas histológicas são aplicadas para avaliar o seguinte de sobrevivência PhMN várias intervenções terapêuticas visando PhMN neuroproteção18,20,21. Problemas de absorção no diafragma Nicotínico ou transporte axonal, sem dúvida, irão comprometer a quantidade de CTB acumulado nos corpos celulares neuronais. Perda de axônios frênico ou degeneração PhMN obviamente irá diminuir a quantidade de retrotransported CTB na medula espinhal.
Cada abordagem de administração intrapleural tem seus próprios prós e cons Transdiaphragmatic injeções são bastante invasivas, necessitando de laparotomia e costura cuidado de todas as camadas da pele para evitar deiscência e protrusão do órgão. Laparotomia interfere com a respiração normal22 e não se pode governar para fora que ele pode afetar a eficiência de atividade ou retrô-transporte PhMN. No entanto, a visualização directa do diafragma durante a injeção garante sucesso segmentação do espaço pleural o tempo todo. Transtorácicos injeções são minimamente invasivo em comparação com as injeções de transdiaphragmatic e, portanto, podem ser consideradas como um procedimento para refinamento, na veia do conceito de "Três Rs". Uma desvantagem é o aumento da probabilidade de ser o alvo para um usuário inexperiente (por exemplo, no tecido subcutâneo ou na parede torácica).
Após administração de fluorescente-CTB intrapleural, é provável que qualquer neurônio motor projetando em músculos que revestem a cavidade pleural será rotulado, incluindo PhMN, intercostais neurônios motores ou diferentes populações de neurônios no tronco cerebral. Em ratos adultos, Mantilla et al demonstraram que intercostal neurônios motores também foram rotulados no Corno ventral da medula torácica, bem como algum gânglio de raiz dorsal neurônios4. Nunca ter verificado a presença de células CTB-etiquetadas em outros sites do que a medula espinhal cervical em camundongos.
Dependendo os configurações/modelos experimentais, desfechos podem incluir o arranjo colunar de PhMNs ao longo da medula espinhal cervical, análise detalhada dos dados geométricos sobre a posição de cada PhMN ou, como descrito aqui, a quantificação de PhMN número. A avaliação exata do número total de PhMN depende de considerações técnicas e confiabilidade inter avaliador; devido a variabilidade da intensidade de fluorescência de CTB, neurônio soma tamanho ou coloração de fundo. Em nossa experiência usando injeções transdiaphragmatic de CTB-fluoróforo, podemos ter o número estimado de PhMN por hemicord do mouse em uma faixa entre 120 e 180 células, um número de um pouco menos do que os dados de outros grupos de8. Na verdade, existem duas limitações do estudo. Primeiro, um número limitado de animais é injetado usando a abordagem transtorácica e em segundo lugar, há uma incerteza na rotulagem completa de PhMN piscina. Mergulho do nervo frênico (após a transecção do nervo) ou injeções intraneural com tracer neuroanatômica fluorescente são técnicas complementares que podem ser usadas para rotular com mais precisão todos os PhMNs. Para estudos futuros, é recomendável contar PhMNs pelos métodos imparciais como stereology.
Em nossa experiência, nunca observamos qualquer défice respiratório óbvio ou complicações (insuficiência respiratória) como hemorragia ou pneumotórax seguindo este procedimento. No entanto, se o diafragma foi danificado durante as injeções de transdiaphragmatic, considere usando uma agulha de diâmetro menor ou com chanfro mais nítido.
Para evitar morte de animais durante ou após a cirurgia verificar cuidadosamente as concentrações de cada componente no coquetel do anestésico. Evite lesões nas superfícies de fígado, intestino, vesícula biliar ou o diafragma.
Não ou rotulagem baixa de PhMN pode ser devido a vários problemas. Se a injeção transtorácica perde a cavidade pleural, re-fazer e verificar através da palpação manual que a agulha é inserida sob as costelas ou não pop para fora através da pele. Sem bolhas devem formar após a injeção da solução CTB. Lembre-se também que a internalização da CTB na célula nervosa é dependente do pH23: pH ácido e neutro são ideais, enquanto pH básico prejudica a absorção da toxina. É aconselhável Resuspenda pó CTB em água, em solução salina ou em tampão PBS. Considere o tempo de persistência da toxina etiquetado no corpo celular neuronal. Em nossa experiência, nós poderia detectar células CTB-etiquetadas em uma janela de tempo entre quatro dias e duas semanas após o parto intrapleural. Diminuir o tempo alocado para retrograde transporte ou aumentar o tempo entre intrapleural entrega e sacrifício pode comprometer a detecção ideal de fluorescente-CTB no tecido.
Para evitar a fluorescência desvanecendo-se usa método fixador apropriado. Sugerimos que perfusing o corpo do animal com buffer paraformaldeído 4%. Uma vez que a medula espinhal é colhida, incube no fixador mesmo durante a noite. Crioproteção o cabo em solução de 30% de sacarose por 72 horas até ao naufrágio, incorporar o alargamento cervical (cerca de 8 mm) no meio de O.C.T.. Não desidratar ou incorporar a amostra em parafina. Protege amostras da coluna vertebral ou cortes de tecido de luz durante o pós-processamento todo. Fixos espinais inteiro pode ser mantidos a 4 ° C por meses se thimerosal é adicionado à solução crioprotetoras (não adicione azida de sódio como que vai provocar o desbotamento de fluorescência). Cortes de tecido podem ser mantidos a-20 ° C durante meses longe da luz. Finalmente, aconselha-se a montar as lâminas com um reagente antidesbotamento. Se a fluorescência desvaneceu-se, é ainda possível detectar CTB usando imuno-histoquímica.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Nós estamos gratos ao Robert Graffin e Pauline Duhant pelo apoio técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
References
- Webber, C. L. Jr, Wurster, R. D., Chung, J. M. Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping. Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).
- Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study. J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).
- Gordon, D. C., Richmond, F. J. Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques. J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).
- Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. The phrenic motor nucleus in the adult mouse. Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles. J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).
- Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study. J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).
- Gottschall, J. The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons. Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).
- Lai, B. Q., et al. Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve. PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).
- Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms. J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).
- Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).
- Fujinaga, Y., et al. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).
- Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton. Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).
- Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Llado, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).
- Sieck, G. C., Fournier, M. Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors. J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).
- Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action. Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).
