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Bioengineering

Endothelium लक्ष्यीकरण और नशीली दवाओं के वितरण के लिए कार्यात्मक 10 एनएम पॉलिमर लेपित सोने के कणों का संश्लेषण

Published: January 15, 2018 doi: 10.3791/56760
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1,2,3, 1,4,5
1Department of Chemical Engineering, Northeastern University, 2Nanomedicine Science and Technology Center, Northeastern University, 3Department of Physics, Northeastern University, 4Departments of Bioengineering, Northeastern University, 5Department of Neuroscience, Albert Einstein College of Medicine

Summary

हम synthesizing की एक विधि का वर्णन संगत 10-एनएम गोल्ड नैनोकणों, सतह पर कोटिंग पाली-ईथीलीन ग्लाइकोल द्वारा कार्यात्मक । इन कणों विट्रो में और नेनो सेलुलर और extracellular रिक्त स्थान है कि पारंपरिक nanoparticle आकार के साथ उपयोग करने के लिए मुश्किल है चिकित्सा देने के लिए vivo में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

गोल्ड नैनोकणों (AuNPs) चिकित्सा अनुसंधान में बड़े पैमाने पर उनके आकार, जैव अनुकूलता, और परिवर्तनीय सतह के कारण इस्तेमाल किया गया है । विशिष्ट लक्ष्यीकरण और दवा वितरण इन AuNPs के आवेदनों में से कुछ हैं, लेकिन endothelial extracellular ' मैट्रिक्स रक्षात्मक गुण बाधा कण को ले लो । इस समस्या को हल करने के लिए, हम ultrasmall गोल्ड नैनोकणों के लिए एक संश्लेषण विधि का वर्णन संवहनी वितरण में सुधार करने के लिए, अनुकूलन योग्य कार्यात्मक समूहों और आगे समायोजन के लिए बहुलक लंबाई के साथ. प्रोटोकॉल पैदावार २.५ एनएम AuNPs कि tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium क्लोराइड (THPC) के साथ छाया हुआ है । AuNP की सतह पर hetero कार्यात्मक पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) के साथ THPC के प्रतिस्थापन १०.५ एनएम के लिए hydrodynamic त्रिज्या बढ़ जाती है, जबकि सतह पर विभिंन कार्यात्मक समूहों प्रदान करते हैं । प्रोटोकॉल के पिछले भाग में एक fluorophore के वैकल्पिक अतिरिक्त शामिल करने के लिए AuNPs प्रतिदीप्ति ट्रैक करने के लिए nanoparticle के तहत visualized की अनुमति है । AuNPs को शुद्ध और अलग करने के लिए डायलिसिस और lyophilization का प्रयोग किया गया । इन फ्लोरोसेंट नैनोकणों दोनों विट्रो में और vivo में प्रयोगों के कारण में visualized किया जा सकता है-संगत खूंटी कोटिंग और फ्लोरोसेंट जांच । इसके अतिरिक्त, इन नैनोकणों के आकार रेंज उंहें सामांय vasculature समारोह में खलल न डालें बिना glycocalyx जांच के लिए एक आदर्श उंमीदवार प्रदान, जो बेहतर प्रसव और चिकित्सीय उपचार के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

Introduction

नैनोकणों अपने शरीर के माध्यम से नेविगेट करने की क्षमता के लिए दवा वितरण और इमेजिंग करने के लिए लागू किया गया है के लिए ब्याज1,2के लक्ष्य क्षेत्रों तक पहुंचने । कणों टपका हुआ vasculature के माध्यम से ट्यूमर के भीतर जमा हो सकता है या स्थानीयकरण जहां एक लक्ष्य ligand और स्पष्ट रूप से उजागर है । सोने, विशेष रूप से, क्योंकि अपनी अनूठी रासायनिक और भौतिक गुण है कि परिवहन और चिकित्सीय3के रिलीज को प्रभावित की एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया nanoparticle सामग्री बन गया है । सोने की एक प्रभावी nanoparticle सामग्री है क्योंकि इसकी सतह को thiols से बांध संशोधित किया जा सकता है और उच्च अपनी कम विषाक्तता के कारण असंगति है4। AuNPs बड़े आणविक दवाओं के वाहक होने में सक्षम हैं और पेप्टाइड्स, न्यूक्लिक एसिड, और प्रोटीन देने में सफल रहे हैं, AuNPs2,4लक्ष्यीकरण के लिए अनुकूल होने की अनुमति ।

दुर्भाग्य से, nanoparticle दवा वितरण प्रभावशीलता नकारात्मक आरोप लगाया glycocalyx, जो सबसे स्तनधारी कोशिकाओं की झिल्ली पर extracellular कोट है और 7 एनएम5,6तक का आकार ताकना है द्वारा बाधा उत्पंन किया गया है । इस ताकना आकार सबसे nanoparticle दवा वाहक है, जो ठेठ 50-200 एनएम से लेकर व्यास है से छोटा है । रोग की स्थिति के तहत, इन glycocalyx pores बड़ा क्षरण के कारण हो, endothelial कोशिकाओं के माध्यम से पारगम्यता बढ़ रही है । हालांकि, सबसे नैनोकणों अभी भी glycocalyx में इस संरचनात्मक परिवर्तन का लाभ लेने के लिए बहुत बड़े हैं । इस आकार बेमेल का एक निहितार्थ यह है कि पारंपरिक आकार के कणों endothelial कोशिकाओं है कि लाइन रक्त वाहिकाओं के साथ अनुकूल बातचीत नहीं है । यह endothelium में नसों में प्रशासित कणों की डिलीवरी को प्रभावित करता है, और यह भी रक्त मस्तिष्क बाधा7,8,9,10के माध्यम से कण परिवहन के बारे में कहा जा सकता है ।

एक दृष्टिकोण इस मुद्दे का मुकाबला करने के लिए छोटे कणों का उपयोग करने के लिए glycocalyx में छोटी pores के माध्यम से पारित है । यहां, हम एक १०.५ एनएम ultrasmall गोल्ड nanoparticle, जो आम तौर पर बरकरार, स्वस्थ glycocalyx से भयभीत किया जाना चाहिए संश्लेषित । एक बार glycocalyx के लिए समझौता हो शुरू होता है, nanoparticle आसानी से बढ़ती ताकना आकार के माध्यम से कोशिकाओं घुसना चाहिए । इस पत्र में प्रोटोकॉल का विवरण ultrasmall गोल्ड कोर का संश्लेषण खूंटी के साथ लेपित, जो कि असंगति को बढ़ाता है और प्रणालीगत क्लीयरेंस को कम करता है4. खूंटी भी कार्यात्मक समूहों के कई प्रकार शामिल कर सकते हैं, लाइगैंडों, fluorophores लक्ष्यीकरण के विकार के लिए रास्ते खोलने, और चिकित्सकीय । पहले प्रकाशित परिणाम संकेत मिलता है कि इन ultrasmall नैनोकणों के लिए कर रहे है और अधिक इष्ट को बाधित endothelial glycocalyx समारोह के क्षेत्रों में भी किसी भी सक्रिय लक्ष्यीकरण4,11के बिना लिया । यह व्यवहार्यता और वितरण अनुप्रयोगों के लिए सही आकार के कणों के उपयोग के महत्व को इंगित करता है । निंनलिखित प्रोटोकॉल संश्लेषण, शुद्धि और खूंटी लेपित AuNPs (खूंटी-AuNP) के लक्षण वर्णन, कार्यात्मक समूहों और अंय अनुप्रयोगों के लिए conjugations सिलाई के लिए चर्चा के साथ प्रस्तुत करता है ।

Protocol

1. तैयारी या स्टॉक समाधान की खरीद (कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा करने के लिए या उपयोग तक जमे हुए)

  1. कमरे के तापमान पर 10 मिलीलीटर ultrapure पानी में ४०० मिलीग्राम NaOH भंग करके एक 1 एम सोडियम हीड्राकसीड (NaOH) स्टॉक समाधान तैयार करें, और अच्छी तरह से सामग्री मिश्रण ।
    नोट: Ultrapure पानी जैसे कण, बैक्टीरिया, nucleases, आयनों, या ऑर्गेनिक्स के निशान के रूप में अशुद्धियों के बिना पानी के रूप में परिभाषित किया गया है । एक शोधन प्रणाली ultrapure पानी प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है, उसके प्रतिरोधकता में जिसके परिणामस्वरूप अप करने के लिए १८.२ mΩ · cm, एक कम anionic संदूषण का संकेत है । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बोतलबंद ultrapure पानी का उपयोग अनुशंसित नहीं है । इसके बाद, इस ultrapure पानी पानी के रूप में भेजा जाएगा, जब तक अंयथा निर्दिष्ट ।
  2. पानी की 10 मिलीलीटर में NaOH के २.४ जी भंग करके एक 6M NaOH स्टॉक समाधान तैयार है, और कमरे के तापमान पर समाधान की दुकान ।
  3. chloroauric एसिड (HAuCl4) के 1 जी को भंग करके २५० mM स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें १०.१६ मिलीलीटर पानी में सूखे HAuCl के4 । 25 मिमी HAuCl के काम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 9 मिलीलीटर पानी के साथ २५० mm HAuCl4 के 1 मिलीलीटर पतला4। कमरे के तापमान पर HAuCl4 समाधान की दुकान ।
  4. पीएच ८.८ पर एक ०.१ मीटर कार्बोनेट बफर तैयार करें, 10 मिलीलीटर पानी में ८४ मिलीग्राम सोडियम बिकारबोनिट भंग करके और पीएच को ८.८ से 6 मीटर NaOH जोड़कर १.२ से समायोजित करें । कमरे के तापमान पर कार्बोनेट बफर स्टोर ।
  5. tetrazolium यौगिक के 20 मिलीलीटर मिश्रण, 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium नमक (MTS), एक स्थिर एजेंट के साथ, phenazine ethosulfate (पी इ एस) ( सामग्री की तालिकादेखें) । aliquots में टन/पी इ एस मिश्रण (10 फ्रीज-गल चक्र की एक अधिकतम के लिए) में-20 ° c अंधेरे में स्टोर ।

2. गोल्ड Nanoparticle कोर का संश्लेषण

  1. कमरे के तापमान पर एक microcentrifuge ट्यूब में पानी की 1 मिलीलीटर के लिए पानी में ८०% THPC के 12 µ एल जोड़कर एक पतला THPC समाधान तैयार करें ।
  2. एक चुंबकीय हलचल प्लेट के केंद्र पर एक १०० मिलीलीटर दौर नीचे कुप्पी सुरक्षित । कुप्पी में पानी की ४५ मिलीलीटर डालो और ३०० rpm पर पानी हलचल एक छोटे से अंडे के आकार का चुंबकीय हलचल पट्टी का उपयोग कर । 1 मीटर NaOH के ०.५ मिलीलीटर और पतला THPC समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़ें । प्रतिक्रिया मिश्रण जोरदार 5 मिनट के लिए हलचल जारी रखें ।
  3. मिश्रण सरगर्मी जारी रखें और 25 मिमी HAuCl के 2 मिलीलीटर जोड़ें4 समाधान । मिश्रण का रंग पीला से गहरे भूरे से सेकंड के भीतर बदल जाएगा, एक नकारात्मक आरोप के साथ THPC छाया हुआ AuNPs के गठन का संकेत है । एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए मिश्रण हिलाओ सोने की कोर के पूर्ण गठन के लिए अनुमति देते हैं ।

3. गोल्ड नैनोकणों के आसपास बहुलक कोरोना के अलावा

  1. चरण २.३ में वर्णित 15 मिनट की अवधि के दौरान, निम्न में से प्रत्येक को भंग करके खूंटी समाधान तैयार करें 1 मिलीलीटर पानी में 4 मिलीलीटर ग्लास शीशियों: 30 मिलीग्राम एनएच2-खूंटी-एसएच; ७.५ मिलीग्राम एम-खूंटी-एसएच; ७.५ मिलीग्राम COOH-खूंटी-एसएच.
    नोट: परिणामस्वरूप सांद्रता ८.८ मीटर एनएच2-खूंटी-एसएच, ३.७५ एम एम-खूंटी-एसएच, और ३.७५ मीटर COOH-खूंटी-एसएच होना चाहिए ।
  2. १०० rpm को गोल नीचे कुप्पी में समाधान की सरगर्मी गति को कम करने के बाद, THPC छाया हुआ AuNPs dropwise के समाधान के लिए खूंटी समाधान जोड़ें । मिश्रण धीरे रात भर हलचल जारी रखें, कमरे के तापमान पर, THPC के कुशल हटाने और खूंटी द्वारा प्रतिस्थापन सुनिश्चित करने के लिए ।
  3. अगले ७२ ज के लिए, एक 12-14 केडीए आणविक वजन कटऑफ फाइबर झिल्ली का उपयोग करने के लिए एक 4 एल के खिलाफ उभारा मिश्रण dialyze पानी की बाल्टी ६० rpm पर हड़कंप मच गया । डायलिसिस क्लिप्स द्वारा झिल्ली के सिरों टाई और पिपेट के माध्यम से समाधान हस्तांतरण ।
    नोट: 12-14 केडीए कटऑफ झिल्ली के साथ यह डायलिसिस प्रक्रिया केवल एक एकाग्रता ढाल के साथ प्रसार द्वारा, unTHPC खूंटी, और अन्य रासायनिक reactants, निकालता है ।
  4. उच्च एकाग्रता ढाल को बनाए रखने और निरंतर प्रसार को बढ़ावा देने के लिए, पानी हर 2 एच के लिए पहले 6 एच और शेष ६६ एच के लिए हर 6-12 ज बदल जाते हैं ।
    नोट: इस पानी परिवर्तन अनुसूची का उद्देश्य तेजी से प्रसार है कि पर जल्दी होता है समायोजित करने के लिए है, क्योंकि नमूने के भीतर शुरू में उच्च एकाग्रता की । ऊपर वर्णित डायलिसिस प्रक्रिया nanoparticle समाधान अर्द्ध शुद्ध छोड़ देता है, क्योंकि नैनोकणों, हाला, समुच्चय, और अंय बड़े आकार अशुद्धियों 12-14 केडीए cutoff झिल्ली के pores के माध्यम से पारित नहीं कर सकते ।
  5. अर्द्ध-शुद्धि nanoparticle समाधान ५०-एमएल शंकु ट्यूब में एक ०.२ µm सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर शेष हाला, समुच्चय, और अन्य बड़े आकार अशुद्धियों को दूर करने के लिए फ़िल्टर ।
  6. एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में शंकु ट्यूब प्लेस और शुद्ध PEGylated AuNP (खूंटी-AuNP) समाधान के बारे में 5 एच के लिए फ्रीज करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  7. शुद्ध खूंटी-AuNP lyophilize करने के लिए एक फ्रीज ड्रायर का प्रयोग करें ।
  8. स्टोर सूखी, शुद्ध खूंटी-4 डिग्री सेल्सियस पर AuNP उपयोग तक ।

4. Conjugating Fluorophores का उपयोग N-hydroxysuccinimide (एन एच एस) एस्टर पर एनएच2 समूहों पर खूंटी-AuNP

  1. एक चुंबकीय हलचल प्लेट के केंद्र पर एक ५० मिलीलीटर दौर नीचे कुप्पी सुरक्षित । पानी की 18 मिलीलीटर के साथ कुप्पी भरें और एक अंडे के आकार का चुंबकीय हलचल बार का उपयोग कर १०० rpm पर पानी हलचल ।
  2. एक उच्च परिशुद्धता benchtop पैमाने का उपयोग कर, एक 4 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में lyophilized खूंटी-AuNP के 2 मिलीग्राम वजन । एक विरोधी स्थैतिक बंदूक स्थिर प्रभारी और ट्यूब सतह के लिए खूंटी-AuNP पाउडर की पकड़ को खत्म करने के लिए उपयोग करें । ट्यूब के लिए पानी की 2 मिलीलीटर जोड़ें । पानी की कुल 20 मिलीलीटर में आगे पुनर्गठन के लिए गोल नीचे कुप्पी में 2 मिलीलीटर खूंटी-AuNP समाधान डालो । १०० rpm पर मिश्रण हलचल जारी रखने के लिए एक अंडा के आकार का उपयोग चुंबकीय हलचल बार ।
  3. ०.१ मीटर की 1 मिलीलीटर, पीएच ८.८ कार्बोनेट बफर पुनर्गठन AuNP के 20 मिलीलीटर गोल नीचे कुप्पी में निहित जोड़ें । सरगर्मी जारी है ।
  4. dimethyl sulfoxide में 10 मिलीग्राम/एमएल फ्लोरोसेंट एन एच एस एस्टर के 5 µ एल जोड़ें ।
    नोट: किसी भी फ्लोरोसेंट डाई इस प्रक्रिया में इस्तेमाल किया जा सकता है । फ्लोरोसेंट रात भर खूंटी हिलाओ । इसे कमरे के तापमान पर रखें और पन्ना में ढक दें ।
  5. अगले ७२ h के लिए, चरण ३.३ में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके अतिरिक्त fluorophores निकालें । संक्षेप में, dialyze पानी की एक 4 एल बाल्टी का उपयोग कर उभारा मिश्रण और एक 12-14 केडीए आणविक वजन कटऑफ फाइबर झिल्ली. बदल पानी हर 2 ज के लिए पहले 6 ज और हर 6-12 h के लिए शेष ६६ h.
  6. शुद्ध फ्लोरोसेंट खूंटी-AuNP समाधान के 1 मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए, धारा 5 में नीचे वर्णित लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । फ्रीज और शेष समाधान lyophilize 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए पाउडर के रूप में फ्लोरोसेंट नैनोकणों प्राप्त करने के लिए, के रूप में 3.5-3.7 चरणों में वर्णित है ।
  7. एक ०.२ µm सिरिंज फिल्टर का उपयोग करने के लिए निष्फल और सेल संस्कृति अनुप्रयोगों के लिए गठित एक बार किसी भी संभावित हाला को दूर ।

5. फ्लोरोसेंट PEGylated गोल्ड नैनोकणों का लक्षण वर्णन

  1. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) का उपयोग करने के लिए सोने की nanoparticle कोर कल्पना और आकार यों तो
    1. ड्रॉप 10 µ शुद्ध फ्लोरोसेंट खूंटी के एल-AuNP समाधान एक कार्बन लेपित मेष उनि ग्रिड पर ।
    2. 5 मिनट के बाद, फिल्टर कागज के एक टुकड़े का उपयोग करने के लिए ध्यान से दूर बाती उनि ग्रिड के किनारे से अतिरिक्त तरल जब तक एक फ्लोरोसेंट खूंटी-AuNPs युक्त फिल्म के पीछे छोड़ दिया है ।
    3. ८० केवी पर फ्लोरोसेंट खूंटी-AuNPs देखें और 50000-150000 का इज़ाफ़ा पर । डिजिटल चित्र लें ।
      नोट: केवल गोल्ड कोर दिखाई देगा क्योंकि खूंटी के उनि पर इलेक्ट्रॉन घना नहीं है.
    4. एक मापने सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, पैमाने पर सहसंबंध में माप पैमाने बार सेट । लगभग 20 सोने कोर के व्यास की गणना, और फिर औसत स्वर्ण कोर व्यास का निर्धारण ।
      नोट: उनि इमेजिंग प्रणाली स्वचालित रूप से डिजिटल चित्रों पर एक पैमाने पर पट्टी रखता है ।
  2. डायनेमिक लाइट कैटरिंग (DLS) का उपयोग करके hydrodynamic nanoparticle आकार का मापन
    1. स्थानांतरण 1 ४.२ चरण में वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग कर एक microcentrifuge ट्यूब में lyophilized THPC-लेपित AuNPs के मिलीग्राम । एक अलग ट्यूब में lyophilized खूंटी-AuNP के 1 मिलीग्राम स्थानांतरण । प्रत्येक ट्यूब के लिए पानी की 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक 1 मिलीलीटर स्पष्ट प्लास्टिक के लिए प्रत्येक AuNP समाधान हस्तांतरण ।
    2. एक DLS साधन में एक cuvette प्लेस और गोलाकार hydrodynamic व्यास कण विश्लेषक सॉफ्टवेयर है कि DLS प्रणाली में बनाया गया है का उपयोग कर उपाय ।
    3. हिस्टोग्राम स्वरूप का उपयोग करके मापा hydrodynamic व्यास प्लॉट करें ।
      नोट: हिस्टोग्राम नैनोकणों आकार द्वारा समूहीकृत करेगा । नैनोकणों का सबसे बड़ा समूह व्यास स्पष्ट है कि सबसे अच्छा इस प्रोटोकॉल में संश्लेषित AuNPs के आकार का वर्णन करेगा ।
  3. Fluorometric प्रतिदीप्ति पुष्टि
    नोट: एक ही नमूना और कदम ५.२ से cuvette फ्लोरोसेंट संकेत को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. DLS से cuvette निकालें और एक spectrofluorometer में डालें । ६३३ एनएम के लिए उत्तेजना तरंग दैर्ध्य सेट और 650-800 एनएम के एक तरंग दैर्ध्य रेंज के साथ उत्सर्जित प्रतिदीप्ति संकेतों को पढ़ें ।
    2. पुष्टि करें कि चोटी लगभग ६६५ एनएम है, जो एन एच एस के लिए उत्सर्जन चोटी को संबद्ध है ।
      नोट: प्रक्रिया में प्रयुक्त fluorophore के अनुसार उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य को समायोजित करें ।
  4. MTS परख11 के लिए असंगति का आकलन
    1. एक ९६ में अच्छी तरह से स्पष्ट नीचे बाँझ ऊतक संस्कृति का इलाज प्लेट, Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम से पिपेट १०० µ एल (DMEM; 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन/streptomycin) और ३.२ एक्स 103 कोशिकाओं के साथ एक अच्छी तरह से पूरक ।
      नोट: इस अध्ययन में, चूहे फैट पैड endothelial कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है । कुल 21 कुओं के लिए अनुमति देने के लिए उपयोग किया जाता है 3 7 विभिंन nanoparticle सांद्रता में से प्रत्येक के लिए दोहराने (ब्याज की विशिष्ट सांद्रता के लिए कदम 5.4.3 देखें) ।
    2. कोशिकाओं नमी में प्रवाह और 5% CO2 नियंत्रित करने के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दें ३७ ° c11पर मशीन ।
    3. व्यक्तिगत microcentrifuge ट्यूबों, विभिंन सांद्रता के नैनोकणों के साथ DMEM के ३०० µ l युक्त प्रत्येक तैयार करें । इस अध्ययन में निम्नलिखित खूंटी-AuNP सांद्रता के साथ DMEM के 7 विभिन्न ट्यूबों की आवश्यकता है: 0 µ g/एमएल, 10 µ g/एमएल, ५० µ जी/एमएल, १०० µ g/ml, २५० µ g/एमएल, ५०० µ जी/एमएल, और १,००० µ जी/
    4. ट्यूब से DMEM को महाप्राण । तपसिल में कुओं को DMEM मीडिया के १०० µ l के साथ भरें जिसमें 0, 10, ५०, १००, २५०, ५००, या १,००० µ जी/AuNP के एमएल/
    5. कोशिकाओं और नैनोकणों की अनुमति के लिए सह एक पूर्व समय की लंबाई निर्धारित के लिए-गर्मी, यहां 16 के लिए एच ।
    6. मशीन अवधि के अंत के पास, गल MTS/१.५ कदम से पी इ एस मिश्रण ।
    7. मशीनीकरण के बाद महाप्राण ने DMEM और निलंबित, कुएँ से गिरे हुए नैनोकणों से जुड़ी हुई. १०० µ एल के साथ ताजा DMEM के 20 µ एल के साथ जोड़ें टन/पी इ एस समाधान 1:5 mts/पी इ एस के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार DMEM अनुपात प्राप्त करने के लिए । 2 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर MTS के साथ कोशिकाओं की मशीन/
      नोट: यह 2 एच मशीन समय endothelial कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि द्वारा निर्धारित किया जाता है और अन्य प्रकार के सेल के लिए 4 ज तक बढ़ाया जा सकता है । 2 एच अवधि के भीतर, MTS DMEM के साथ घोला जा सकता है कि रंग formazan में endothelial कोशिकाओं द्वारा metabolized है । खूंटी के AuNP और कोशिका व्यवहार्यता की संभावना अधिक रंग का formazan के साथ प्रदर्शन किया जाएगा । खूंटी की विषाक्तता-AuNP और संभावना है कि कोशिकाओं को मर रहे है कम तीव्र रंग के साथ दिखाया जाएगा ।
    8. एक संगत प्लेट रीडर के साथ ४९२ एनएम पर अवशोषक पढ़ने के द्वारा एक अच्छी तरह से वर्णमिति विश्लेषण प्रदर्शन ।
    9. प्रत्येक nanoparticle एकाग्रता के लिए, तपसिल अवशोषक मूल्यों से औसत अवशोषित की गणना । 0 µ g/mL नैनोकणों वाले कुओं में औसत अवशोषण से प्राप्त मूल्य द्वारा औसतन अवशोषण को विभाजित ।
      नोट: इन कुओं कि कोई AuNPs nanoparticle अंय कुओं में प्रशासित उपचार के जवाब में प्रतिशत कोशिका व्यवहार्यता की गणना के लिए नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं ।
  5. बरकरार या बेकार glycocalyx के साथ अनुयाई endothelial कोशिकाओं में nanoparticle प्रतिदीप्ति के फोकल माइक्रोस्कोपी आकलन11
    1. बीज १.० x 104 कोशिकाओं/सेमी2 चूहे वसा पैड endothelial कोशिकाओं पर बाँझ 12 मिमी ग्लास coverslips और फ़ीड कोशिकाओं DMEM के साथ पूरक के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन/streptomycin. कोशिकाओं को नमी और सह में पूर्ण प्रवाह को विकसित करने की अनुमति दें2 ३७ ° c पर नियंत्रित मशीन, लगभग 3 दिनों के लिए ।
    2. यदि लागू हो, तो glycocalyx को संशोधित करने के लिए उपचार जोड़ें । उदाहरण के लिए, २.५ x 10-6 IU heparinase III एंजाइम के साथ प्रसंस्कृत endothelial कोशिकाओं के 2 एच उपचार विशेष रूप से अपने heparan सल्फेट घटक सट द्वारा glycocalyx को नीचा ।
      नोट: स्वस्थ glycocalyx क्षरण एंजाइमों के अलावा बिना कदम 5.5.1 में वर्णित के रूप में endothelial कोशिकाओं बढ़ द्वारा मॉडलिंग की जा सकती है ।
    3. के साथ endothelial glycocalyx बरकरार छोड़ दिया या बेकार प्रदान की, मशीन 16 ज या अंय वांछित समय के लिए ५५० µ जी/एमएल में फ्लोरोसेंट AuNPs के साथ endothelial कोशिकाओं ।
    4. धीरे ३७ डिग्री सेल्सियस 1% के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं धो फॉस्फेट में सीरम एल्ब्युमिन बफर खारा (पंजाबियों; युक्त १०० mg/l कैल्शियम और १०० mg/l मैग्नीशियम). 2% paraformaldehyde के 2 मिलीलीटर और पंजाब में ०.१% glutaraldehyde में कोशिकाओं को जलमग्न, और कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    5. एल्डिहाइड फिक्सिंग समाधान निकालें और तीन 5 मिनट के चक्र के लिए कमरे के तापमान पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धोने ।
    6. प्राथमिक एंटीबॉडी आवेदन करने से पहले, गैर-विशिष्ट बाइंडिंग साइटों को ब्लॉक करने के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पंजाब में 2% बकरी सीरम के लिए endothelial कोशिकाओं को बेनकाब । कोशिकाओं को पूरी तरह से अवरुद्ध समाधान द्वारा कवर किया जाना चाहिए ।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस में पंजाब में 2% बकरी सीरम में 1% एंटी heparan सल्फेट प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रात भर endothelial कोशिकाओं को glycocalyx के heparan सल्फेट घटक लेबल करने के लिए । सुनिश्चित करें कि निश्चित कक्ष एंटीबॉडी समाधान के साथ पूरी तरह से संपर्क में हैं ।
    8. अगले दिन, ३ १० मिनट के चक्र के लिए कमरे के तापमान पंजाबियों के साथ एंटीबॉडी बाहर धोने ।
    9. 1 के साथ endothelial कोशिकाओं मशीन: 30 मिनट के लिए उपयुक्त फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के 1000 कमजोर पड़ने कमरे के तापमान पर, अंधेरे में या एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर किया ।
    10. ३ १० मिनट के चक्र के लिए कमरे के तापमान पंजाबियों के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी बाहर धो लें ।
    11. एक विरोधी-फीका बढ़ते मध्यम 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) नाभिक धुंधला के लिए युक्त का उपयोग कर माइक्रोस्कोप स्लाइड पर coverslip माउंट । नेल पॉलिश का प्रयोग कर coverslip के किनारों को सील कर दीजिये ।
    12. छवि, फोकल माइक्रोस्कोप के साथ फ्लोरोसेंट immunostained endothelial सेल के नमूनों, नीले, हरे, और सुदूर लाल चैनलों का उपयोग करने के लिए नाभिक, heparan सल्फेट glycocalyx, और नैनोकणों, क्रमशः कल्पना ।

Representative Results

संश्लेषित AuNPs, THPC या खूंटी के साथ लेपित (आंकड़ा 1a और आंकड़ा 1b, क्रमशः), उनि के साथ imaged कर रहे हैं और कण आकार उचित nanoparticle आकार वितरण सुनिश्चित करने के लिए उनि और DLS का उपयोग कर मापा जाता है. चित्रा 2 ८० केवी और 150, 000x आवर्धन पर एक THPC-AuNP नमूना के उनि छवि से पता चलता है. THPC-AuNP कणों का व्यास 2-3 एनएम से लेकर, उनि छवियों में अंशांकन पट्टी पर आधारित है । यह THPC-AuNP आकार में भी स्पष्ट है DLS आकार माप हिस्टोग्राम में दिखाया गया चित्रा 2, जिसमें THPC लेपित AuNP २.५ एनएम पर एक चोटी है दिखाया गया है । PEGylation के तहत नहीं दिख रहा है के रूप में बहुलक इलेक्ट्रॉन घने नहीं हैं । उनि इमेजिंग के खूंटी-AuNP नमूनों बस व्यक्तिगत फैलाया कणों की उपस्थिति की पुष्टि करता है, जो की उम्मीद है, क्योंकि एकत्रीकरण की रोकथाम में नैनोकणों सहायता के आसपास खूंटी बहुलक कोरोना. इन खूंटी-AuNP नमूनों के लिए, DLS आकार माप हिस्टोग्राम DLS पर लगभग १०.५ एनएम के लिए, चोटी में एक बदलाव से पता चलता है । कार्यात्मक समूहों पर आगे लाइगैंडों या दवाओं के संलग्नक के रूप में अच्छी तरह से nanoparticle के आकार को प्रभावित करेगा, और ध्यान में रखा जाना चाहिए जब व्यास को मापने ।

fluorophore इसके अलावा (चित्र 1C) एक fluorometer के नैनोकणों का एक नमूना से मापने के लिए का उपयोग करके पुष्टि की है, के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है । जब ६३३ एनएम के एक तरंग दैर्ध्य के साथ उत्तेजित, उत्सर्जन के लिए ६६० और ६७२ एनएम के बीच एक अधिकतम है, जो ६६५ एनएम में अधिकतम उत्सर्जन के निर्माता के उत्पाद जानकारी से मेल खाता मापा जाता है । अंय फ्लोरोसेंट जांच के लगाव एक समान तरीके से जांच की जानी चाहिए फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया सुनिश्चित करने के लिए ।

कणों और संबंधित कोशिका व्यवहार्यता के असंगति के नैनोकणों के विभिंन सांद्रता के साथ 16 ज मशीन के बाद mts के सापेक्ष सेल चयापचय की जांच करने के लिए mts परख का उपयोग कर मूल्यांकन कर रहे हैं । fluorophore संयुग्मित PEGylated AuNPs कोई महत्वपूर्ण विषाक्तता से पता चलता है, के रूप में सेल व्यवहार्यता के समान स्तर तक सभी सांद्रता पर संकेत 1 मिलीग्राम/एमएल (चित्रा 4a) । इस असंगति चिकित्सकीय या शेष कार्यात्मक समूहों को आगे कणों को अनुकूलित करने के लिए संलग्न ligand के आधार पर बदल सकते हैं । दवा संलग्नक विषाक्तता को बढ़ाने के लिए करते हैं, लेकिन काम कर रहे सांद्रता पर निर्भर करता है, यह एक महत्वपूर्ण तरीके से व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं कर सकते ।

फ्लोरोसेंट के ऊपर, PEGylated AuNPs (चित्रा 1C) अनुयाई कोशिकाओं द्वारा बरकरार या बेकार endothelial (चित्रा glycocalyx) के साथ संस्कृतिपूर्ण चूहा वसा पैड 4B कोशिकाओं का उपयोग कर मूल्यांकन किया है । बेकार glycocalyx शर्तों संस्कृति को heparinase III एंजाइम जोड़कर हासिल कर रहे हैं, heparan सल्फेट glycocalyx घटक के एक क्षरण में जिसके परिणामस्वरूप और मैट्रिक्स12समझौता । चित्रा 4B खूंटी के AuNPs के विभिन्न स्तरों को दर्शाता है, प्रतिनिधि endothelial कोशिकाओं के पार अनुभागीय दृश्य पर लाल डॉट्स के रूप में. एक स्वस्थ glycocalyx इन सोने नैनोकणों के ऊपर उठाना रोकते हैं, लेकिन एक पर्याप्त वृद्धि मनाया जब एंजाइम11कार्यरत है । यह परिणाम इन ultrasmall नैनोकणों की क्षमता पर प्रकाश डाला endothelial कोशिकाओं को एक अलग बातचीत है कि glycocalyx स्वास्थ्य पर आधारित है द्वारा नियंत्रित तरीके से चिकित्सीय उद्धार ।

Figure 1
चित्र 1: गोल्ड nanoparticle योजनाबद्ध । (क) खूंटी प्रतिस्थापन से पहले THPC लेपित AuNP nanosphere । (ख) PEGylated AuNP, COOH, एनएच2, और CH3सहित खूंटी समाप्ति के 3 प्रकार के साथ । ब्लू तरंगों बहुलक प्रतिनिधित्व करते हैं । (ग) प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए संयुग्मित नैनोकणों । लाल सितारे एनएच2 कार्यात्मक समूहों को fluorophores संयुग्मित दिखाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: सोने नैनोकणों का आकार माप. वाम: ८० केवी और 150 पर खूंटी के अलावा सोने नैनोकणों के उनि, 000X आवर्धन, स्केल बार दिखाए गए के साथ । सही: nanoparticle आकार के हिस्टोग्राम से पहले DLS द्वारा मापा (AuNP) और उसके बाद (खूंटी-AuNP) खूंटी के साथ THPC प्रतिस्थापन. THPC-लेपित AuNP के लिए DLS परिणाम क्या उनि द्वारा visualized है । DLS खूंटी-लेपित AuNP परिणाम बहुलक के कारण उनि द्वारा खूंटी की कल्पना करने में असमर्थता की चुनौती को दूर इलेक्ट्रॉन घना नहीं किया जा रहा । खूंटी के एक उनि-AuNP केवल कोर गोल्ड नैनोकणों दिखाएगा और एक THPC-ढकी AuNP के रूप में ही दिखेगा. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: फ्लोरोसेंट खूंटी-AuNP के प्रतिदीप्ति डेटा । ६६७ एनएम पर प्रतिदीप्ति पीक fluorophore संयुग्मित के उत्सर्जन को खूंटी-AuNP से मेल खाता है । A.U.: मनमानी इकाइयां ।

Figure 4
चित्रा 4: फ्लोरोसेंट खूंटी के साथ सेल बातचीत-AuNP । (क) कोशिका व्यवहार्यता (MTS चयापचय) साजिश के लिए चूहा वसा पैड endothelial कोशिकाओं के बाद 16 ज सह-फ्लोरोसेंट खूंटी-AuNP के साथ मशीन । (ख) फोकल क्रॉस-फिक्स्ड चूहा वसा पैड endothelial कोशिकाओं के नाभिक (नीला) और heparan सल्फेट, एक glycocalyx घटक (हरा) के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए DAPI के साथ दाग की धारा छवियां । शीर्ष छवि एक स्वस्थ glycocalyx और नीचे एक नीचा glycocalyx परत है; गौरतलब है कि नैनोकणों से नीचा glycocalyx वाले सैंपल में से लाल प्रतिदीप्ति है । स्केल बार 10 µm है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

इस तकनीक synthesizing अनुकूलन, ultrasmall खूंटी लेपित AuNPs के लिए एक प्रभावी तरीका है । इस प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है THPC छाया गोल्ड नैनोकणों, जो पीले रंग से भूरा है कि HAuCl4 दौर नीचे कुप्पी (प्रोटोकॉल कदम २.३) में सामग्री के लिए जोड़ दिया गया है के बाद घटित होगा की पुष्टि कर सकते है के प्रारंभिक गठन है । कोई रंग परिवर्तन इंगित करता है कि कोई नैनोकणों का गठन नहीं है और कि प्रारंभिक चरणों की जांच और आगे बढ़ने से पहले दोहराया जाना चाहिए । मामले में रंग शराब लाल या ग्रे जैसे ब्राउन के अलावा कुछ करने के लिए बदल जाता है, जिसके परिणामस्वरूप कणों की संभावना लक्ष्य २.५ एनएम के आसपास नहीं होगा और एक नया बैच के रूप में अच्छी तरह से किया जाना चाहिए ।

गोल्ड कोर के गठन के बाद, खूंटी के लिए THPC के आदान प्रदान और शुद्धि प्रक्रियाओं प्रोटोकॉल के सफल समापन के लिए कई महत्वपूर्ण कदम होते हैं । मिश्रण रातोंरात प्रतिस्थापन प्रतिक्रिया के लिए पूरा करने के लिए जाने के लिए अनुमति देता है । असफल शुद्धि यदि डायलिसिस पानी निर्धारित आवृत्ति के साथ नहीं बदला है हो सकता है । कणों के ७२ से अधिक के लिए डायलिसिस में छोड़ दिया जाता है, तो एकत्रीकरण और कणों का वर्षण भी हो सकता है । स्थिर सुखाने के दौरान अंय संभावित समस्याएं देखी जा सकती हैं । ultrasmall खूंटी लेपित AuNP समाधान पूरी तरह से जम नहीं था या यदि lyophilizer सही रूप से सेट नहीं किया गया था, तो नमूने खो सकते हैं । lyophilizer मैनुअल को देखें, के रूप में कुछ उपकरणों के विभिंन नमूना तैयारी की आवश्यकता हो सकती है ।

संश्लेषण की आसानी और जिसके परिणामस्वरूप कणों की असंगति इन खूंटी-AuNPs उपयोग करने के लिए लाभ का प्रतिनिधित्व करते हैं । इसके अलावा, इन नैनोकणों को नेनो सेलुलर संरचनाओं के साथ बातचीत करने के रूप में इन नैनोकणों के ऊपर से नीचा glycocalyx की पहचान करने की क्षमता के द्वारा प्रदर्शित करने में सक्षम होने का लाभ है । यह लाभ नए atherosclerosis उपचारों और निवारक उपायों के विकास के लिए leveraged किया जा सकता है । परे क्या हम यहां मौजूद, इस प्रोटोकॉल का एक और लाभ यह है कि यह कणों के व्यापक अनुकूलन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वृद्धि हुई स्थिरता और भंडारण क्षमताओं सोने नैनोकणों4पर खूंटी युक्त thiol संलग्न द्वारा की अनुमति देता है । खूंटी श्रृंखला के दूसरे छोर किसी भी कार्यात्मक समूह में शामिल कर सकते हैं, और अणुओं के असंख्य उन समूहों के लिए संयुग्मित जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, सभी तीन सामांय कार्यशील समूह (मिथाइल, carboxyl, और अमीनो) अनुलग्न हैं । खूंटी का अनुपात पहले फ्लोरोसेंट पहचान को प्राथमिकता के लिए चुना जाता है, तो carboxylic एसिड समूह का उपयोग कर एक माध्यमिक लक्ष्यीकरण moiety को शामिल करने की क्षमता. इन समूहों के अनुपात आवेदन के आधार पर tweaked किया जा सकता है, और लंबाई और पॉलिमर के आकार के रूप में अच्छी तरह से समायोजित किया जा सकता है ।

कण तेज को मापने के लिए, हम कार्यात्मक समूहों में से एक के लिए एक फ्लोरोसेंट जांच संयुग्मित । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हम क्या वर्णित है परे किसी भी विकार nanoparticle की सतह के गुणों का एक परिवर्तन में परिणाम होगा । अतिरिक्त घटकों और विकार प्रतिक्रियाओं के संबंध में नैनोकणों के प्रत्येक पुनरावृत्ति वांछित गुणों के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए ।

इस विधि ultrasmall सोने नैनोकणों endothelial extracellular glycocalyx है, जो पारंपरिक आकार नैनोकणों के ऊपर बाधा उत्पंन की रक्षात्मक गुणों को दूर करने का इरादा पैदा करता है । हालांकि, छोटे आकार दोनों इमेजिंग और दवा लोडिंग पहलू में कठिनाई के लिए उधार देता है । इन कणों ठेठ nanoparticle आकार सीमा से काफी छोटे हैं, और एक परिणाम के रूप में चिकित्सकीय और लक्ष्यीकरण moieties के अनुलग्नकों के लिए उपलब्ध सतह क्षेत्र बहुत कम है । इस कठिनाई इमेजिंग अनुप्रयोगों में उठा व्यक्तिगत संकेतों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, हालांकि कणों के समूहों अभी भी आसानी से पहचाना जा सकता है, के रूप में फोकल छवियों में दिखाया गया है । लक्ष्यीकरण लाइगैंडों और चिकित्सीय के अनुलग्नकों के लिए कम सतह लक्ष्य खुराक आवश्यकताओं को प्राप्त करने के लिए प्रशासित किया जा करने के लिए और अधिक कणों की आवश्यकता हो सकती है. हालांकि, छोटे कणों को जब ध्यान में glycocalyx लेने के वितरण में अधिक कुशल हो जाएगा ।

ये उपंयास ultrasmall कणों microenvironment के ंयूनतम व्यवधान के साथ शरीर के भीतर नेनो क्षेत्रों तक पहुंचने के लिए मुश्किल में प्रसव के लिए सक्षम हैं । खूंटी के अलावा वृद्धि हुई है और अधिक अनुकूलता के लिए कणों के भारी अनुकूलन के लिए कार्यात्मक समूह प्रदान करता है के लिए अनुमति देता है । ठेठ नैनोकणों की तुलना में छोटे आकार कुछ कमियों के साथ आता है, लेकिन अगर रणनीतिक विकसित, ultrasmall कण मुश्किल के आवास के लिए एक होनहार दृष्टिकोण है घुसना, जटिल, और कमजोर नाड़ी में glycocalyx लक्ष्यीकरण और दवा वितरण ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस कार्य को पूर्वोत्तर विश्वविद्यालय केमिकल इंजीनियरिंग विभाग, स्टार्ट-अप फंडों और पूर्वोत्तर विश्वविद्यालय प्रोवोस्ट कार्यालय से टियर 1 प्रायोगिक अध्ययन अनुदान, NIH K01 HL125499, और NSF-IGERT ग्रांट NSF/डीजीई-096843 द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक भी थॉमस जे Webster और उनकी सहायता के लिए उनकी प्रयोगशाला के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Nanomedicine विज्ञान और प्रौद्योगिकी केंद्र और पूर्वोत्तर विश्वविद्यालय में दवा विज्ञान विभाग का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich 795429
Gold (III) Chloride trihydrate (HAuCl4.3H2O) Sigma Aldrich 520918
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Tetrakis (hydroxymethyl) phosphnium chloride Sigma Aldrich 404861
Mono-functional mPEG-thiol Layson Bio Inc. MPEG-SH-2000-1g Mw: 2,000 Da
hetero bi-functional anime-PEG-thiol Layson Bio Inc. NH2-PEG-SH-3400-1g Mw: 3,400 Da
Carboxymethyl-PEG-thiol Layson Bio Inc. CM-PEG-SH-2000-1g Mw: 2,000 Da
Cellulose dialysis membrane (12-14 kDa) Sigma Aldrich D9777
Zerostat anti-static instrument Sigma Aldrich Z108812
Alexa Fluor 647 (AF647) carboxylic acid succinimidyl ester Fisher A20006 Fluorophore
Fisherbrand Qualitative Grade Plain Filter Paper Circles - P5 grade Thermo Fisher Scientific 09-801-B
Transmission electron microscopy JEOL USA JEOL JEM-1000 TEM
Dynamic Light Scattering Brookhaven Instruments Corporation Brookhaven 90 Plus Particle Size Analyzer DLS
Fluorometer Horiba Scientific Jobin Yvon Fluromax 4 Fluorometer
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3582 MTS
Plate reader Molecular Devices SpectraMax M4 Plate reader
10E4 epitope HS mouse monoclonal IgM antibody (primary antibody) Amsbio 370255 Primary antibody
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (secondary antibody) Thermo Fisher Scientific R37120 Secondary antibody
VECTASHIELD mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1000 With DAPI
Confocal Microscope Carl Zeiss Meditex AG Zeiss LSM 700 Confocol microscopy

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References

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अभियांत्रिकी अंक १३१ सोना नैनोकणों ultrasmall PEGylation भूतल विकार glycocalyx औषध वितरण endothelial कक्ष
Endothelium लक्ष्यीकरण और नशीली दवाओं के वितरण के लिए कार्यात्मक 10 एनएम पॉलिमर लेपित सोने के कणों का संश्लेषण
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Cheng, M. J., Prabakaran, P., Kumar, R., Sridhar, S., Ebong, E. E. Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery. J. Vis. Exp. (131), e56760, doi:10.3791/56760 (2018).

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