Summary
Vi beskriver en metod att syntetisera biokompatibla 10-nm guld nanopartiklar, functionalized av beläggning poly-etylenglykol på ytan. Dessa partiklar kan vara används in vitro- och in-vivo för att leverera therapeutics till nanoskala cellulära och extracellulära utrymmen som är svåra att komma åt med konventionella nanopartiklar storlekar.
Abstract
Guldnanopartiklar (AuNPs) har använts i stor utsträckning i medicinsk forskning på grund av sin storlek, biokompatibilitet och modifierbara yta. Specifika inriktning och drug delivery är några av tillämpningarna av dessa AuNPs, men endothelial extracellulära matriser defensiva egenskaper hindrar partikel upptag. För att lösa problemet, beskriver vi en syntesmetod för nanoskaliga guld nanopartiklar att förbättra vaskulär leverans, med anpassningsbara funktionella grupper och polymer längder för ytterligare anpassningar. Den protokoll avkastning 2.5 nm AuNPs som är täckta med tetrakis (hydroximetyl) phosphonium chloride (THPC). Byte av THPC med hetero-funktionella polyetylenglykol (PEG) på ytan av AuNP ökar hydrodynamiska radien till 10.5 nm samtidigt som den ger olika funktionella grupper på ytan. Den sista delen av protokollet innehåller ett valfritt tillägg av en fluorophore att tillåta AuNPs att visualiseras under fluorescens att spåra nanopartiklar upptag. Dialys och frystorka den användes att rena och isolera AuNPs. Dessa fluorescerande nanopartiklar kan visualiseras i både in vitro och i vivo experiment på grund av det biokompatibla PEG beläggning och fluorescerande sonder. Dessutom storleksintervallet av dessa nanopartiklar återge dem en idealisk kandidat för sondera glykokalyx utan att störa normala vaskulatur funktion, vilket kan leda till förbättrad leverans och therapeutics.
Introduction
Nanopartiklar har tillämpats till drogen leverans och imaging för sin förmåga att navigera genom kroppen för att nå målet områden av intresse1,2. Partiklarna kan ackumuleras inom tumörer via den läckande kärlsystemet eller lokalisera där en målligand är i ökad utsträckning och utsatt. Guld, specifikt, har blivit ett vanligt förekommande nanopartiklar material på grund av dess unika kemiska och fysiska egenskaper som påverkar transport och lanseringen av therapeutics3. Guld är en effektiv nanopartiklar material eftersom dess yta kan ändras för att binda till tioler och har höga biokompatibilitet på grund av dess låga toxicitet4. AuNPs kan vara bärare av stora Biomolekylär droger och har varit framgångsrika i att leverera peptider, nukleinsyror och proteiner, vilket gör att AuNPs att vara gynnsam för inriktning2,4.
Tyvärr, nanopartiklar drogen leverans effektiviteten har hämmats av den negativt laddade glykokalyx, som är den extracellulära pälsen på membranet i mest däggdjursceller och porstorlek på upp till 7 nm5,6. Detta porstorlek är mindre än de flesta nanopartiklar drog bärare, som har typiska diametrar alltifrån 50-200 nm. Under sjukdomstillstånd blivit dessa glykokalyx porerna större på grund av nedbrytning, ökande permeabilitet genom att endotelceller. De flesta nanopartiklar är dock fortfarande för stor för att dra nytta av denna strukturomvandling i glykokalyx. En implikation av denna storlek mismatch är att konventionellt storlek partiklar inte interagerar positivt med endothelial celler som kantar blodkärl. Detta påverkar distribution av intravenöst administrerad partiklar i endotelet, och kan också sägas av partikel transport genom blod hjärna barriären7,8,9,10.
En strategi för att bekämpa problemet är att utnyttja mindre partiklar passera de små porerna i glykokalyx. Här, syntetisera vi en 10,5 nm nanoskaliga guld nanopartiklar, som normalt bör avskräckas av intakt, friska glykokalyx. När glykokalyx börjar äventyras, bör nanopartikelportföljen lätt tränga in cellerna genom ökande porstorleken. Protokollet i detta papper Detaljer en syntes av nanoskaliga guld core belagd med PEG, vilket ökar biokompatibiliteten och minskar systemisk clearance4. PEG kan också innehålla flera olika typer av funktionella grupper, öppna vägar för Konjugation av inriktning ligander, fluorophores och therapeutics. Tidigare indikerar publicerade resultat att dessa nanoskaliga nanopartiklar tenderar att tas upp mer gynnsamt i regioner av störd endotelfunktion glykokalyx funktion även utan någon aktiv inriktning4,11. Detta indikerar genomförbarheten och vikten av att använda partiklar av rätt storlek för leverans program. Följande protokoll presenterar syntesen, rening och karakterisering av de PEG-belagd AuNPs (PEG-AuNP), med diskussionen för att skräddarsy den funktionella grupper och konjugationer för andra applikationer.
Protocol
1. beredning eller upphandling av stamlösningar (förvaras i rumstemperatur eller frysta till användning)
- Förbereda en 1 M natriumhydroxid (NaOH) stamlösning av upplösning 400 mg NaOH i 10 mL ultrarent vatten vid rumstemperatur och blanda material väl.
Obs: Ultrarent vatten definieras som vatten utan orenheter som partiklar, bakterier, nukleaser, joner eller spår av organics. Ett reningssystem används för att erhålla den ultrarent vatten, vilket resulterar i dess resistivitet av upp till 18,2 mΩ·cm, vilket indikerar en låg anjon förorening. Användning av kommersiellt tillgängliga ultrarena flaskvatten rekommenderas inte. Hädanefter kommer kommer att denna ultrarent vatten betecknas som vatten, såvida inte annat anges. - Förbereda en 6M NaOH stamlösning av upplösning 2.4 g NaOH i 10 mL vatten och lagra lösningen vid rumstemperatur.
- Förbereda en 250 mM stamlösning av chloroauric syra (HAuCl4) genom upplösning 1 g torkade HAuCl4 i 10,16 mL vatten. Späd 1 mL 250 mM HAuCl4 med 9 mL vatten för att få arbeta koncentration av 25 mM HAuCl4. Lagra HAuCl4 lösningen vid rumstemperatur.
- Förbereda en 0,1 M karbonat buffert med pH 8,8, genom upplösning 84 mg natriumbikarbonat i 10 mL vatten och justera pH till 8,8 av NaOH 6 M från steg 1.2. Lagra karbonat bufferten vid rumstemperatur.
- Blanda 20 mL tetrazolium förening, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium salt (MTS), med en stabiliserande agent, phenazine ethosulfate (PSE) (se Tabell för material). Lagra MTS PSE blandningen i alikvoter (för högst 10 frysning-tining cykler) vid-20 ° C i mörker.
2. Sammanfattning av guld nanopartiklar kärnor
- Bereda en utspädd THPC-lösning genom att lägga till 12 µL av 80% THPC i vatten till 1 mL vatten i en mikrocentrifug rör vid rumstemperatur.
- Säkra en 100 mL rund botten kolv över centrum av en magnetisk uppståndelse tallrik. Häll kolven 45 mL vatten och rör om vattnet vid 300 rpm med hjälp av en liten ägg-formade magnetiska rör bar. Tillsätt 0,5 mL 1 M NaOH och 1 mL utspädd THPC lösning. Fortsätt att röra reaktionsblandningen kraftigt i 5 min.
- Fortsätt röra blandningen och tillsätt 2 mL av 25 mM HAuCl4 lösning. Färgen på blandningen ändras från gult till mörkbrunt inom två sekunder vilket visar bildandet av THPC utjämnade AuNPs med en negativ laddning. Rör blandningen för en ytterligare 15 min till möjliggöra komplett bildandet av guld kärnor.
3. tillsats av Polymer Corona runt Guldnanopartiklar
- Under perioden 15 min beskrivs i steg 2,3 förbereda PEG lösningar genom att lösa var och en av följande i 1 mL vatten i 4 mL injektionsflaskor av glas: 30 mg NH2-PEG-SH; 7,5 mg m-PEG-SH; 7,5 mg COOH-PEG-SH.
Obs: De resulterande koncentrationerna bör vara 8,8 M NH2-PEG-SH, 3,75 M m-PEG-SH och 3,75 M COOH-PEG-SH. - Efter att minska omrörning hastigheten av lösningen i rund botten kolven till 100 rpm, lägga till PEG utjämnade lösningar till lösningen av THPC AuNPs droppvis. Fortsätt att röra blandningen försiktigt över natten, vid rumstemperatur, att säkerställa effektiv borttagning av THPC och ersättande av PEG.
- För nästa 72 h, Använd ett 12-14 kDa molekylvikt cutoff cellulosa membran för att dialyze rörs blandningen mot en 4 L hink med vatten rörs vid 60 rpm. Knyt ändarna av membran av dialys clips och överför lösningen via pipett.
Obs: Denna dialys process med 12-14 kDa cutoff membranet tar bara bort oreagerad PEG, THPC och andra kemiska reaktanter, genom diffusion längs en koncentrationsgradient. - För att upprätthålla hög koncentrationsgradient och främja kontinuerlig diffusion, byta vatten varje timme under de första 6 h 2 och varje 6-12 h för återstående 66 h.
Obs: Syftet med detta vatten ändra schema är att rymma den snabba spridningen som uppstår tidigt på grund av den inledningsvis höga koncentrationen i provet. Dialys processen beskrivs ovan bladen nanopartiklar lösningen delvis renat, eftersom nanopartiklarna, fällningar, aggregat och andra stora föroreningar inte kan passera genom porerna i 12-14 kDa cutoff membranet. - Filtrera delvis renat nanopartiklar lösningen till en 50mL konisk slang med ett 0,2 µm spruta filter att ta bort de återstående fällningar, aggregat och andra stora föroreningar.
- Placera koniska röret i-80 ° C frys och låt den renade PEGylated AuNP (PEG-AuNP) lösningen att frysa under ca 5 h.
- Använd en frysning torktumlare för att lyophilize den renade PEG-AuNP.
- Förvaras på torr, renat PEG-AuNP vid 4 ° C fram till användning.
4. konjugera Fluorophores med N-hydroxysuccinimide (NHS) Ester på NH2 grupper på den PEG-AuNP
- Säkra en 50 mL rund botten kolv över centrum av en magnetisk uppståndelse tallrik. Fyll kolven med 18 mL vatten och rör om vattnet vid 100 rpm med en ägg-formade magnetiska rör bar.
- Väg 2 mg den frystorkade PEG-AuNP på en 4 mL koniska rör, med en hög precision bänkmonterade skala. Använda en anti-statisk pistol för att eliminera statisk laddning och klängande av PEG-AuNP pulvret till röret. Tillsätt 2 mL vatten till röret. Häll på 2 mL PEG-AuNP lösning i rund botten kolven för ytterligare beredning i totalt 20 ml vatten. Fortsätt att röra blandningen på 100 varv med en ägg-formade magnetiska rör bar.
- Tillsätt 1 mL 0,1 M, pH 8,8 karbonat buffert till 20 mL av färdigberedd AuNP i rund botten kolven. Fortsätt omrörningen.
- Tillsätt 5 µL 10 mg/mL fluorescerande NHS ester i dimetyl sulfoxid.
Obs: Alla fluorescerande färg kan användas i denna process. Rör den fluorescerande PEG över natten. Förvara det i rumstemperatur och täckt i folie. - Ta bort överflödig fluorophores med hjälp av protokollet som beskrivs i steg 3.3 för nästa 72 h. Kort, dialyze rörs blandningen med en 4 L hink med vatten och 12-14 kDa molekylvikt cutoff cellulosa membran. Byt vatten varje 2 h för de första 6 h och varje 6-12 h för återstående 66 h.
- Få 1 mL renat fluorescerande PEG-AuNP lösningen, som ska användas för karakterisering som beskrivs nedan i avsnitt 5. Frysa och lyophilize återstående lösningen för att få fluorescerande nanopartiklar i pulverform för lagring vid 4 ° C, enligt beskrivningen i steg 3,5-3,7.
- Använd ett 0,2 µm spruta filter att sterilisera och ta bort alla potentiella fällningar en gång beredas för cell kultur applikationer.
5. karakterisering av fluorescerande pegylerat guld nanopartiklar
- Med transmissionselektronmikroskopi (TEM) för att visualisera guld nanopartiklar kärnan och kvantifiera storleken
- Släpp 10 µL av renat fluorescerande PEG-AuNP lösningen på ett kol belagd mesh TEM rutnät.
- Efter 5 min, Använd ett filter papper att noggrant transportera bort överflödig vätska från kanten av rutnätet TEM tills en film som innehåller de fluorescerande PEG-AuNPs är kvar.
- Visa den fluorescerande PEG-AuNPs på 80 kV och vid 50 000-150 000 gångers förstoring. Ta digitala bilder.
Obs: Endast guld kärnan kommer att visas eftersom PEG inte är electron tät på TEM. - Med en mätning programvara, Ange måttskalan i korrelation till skalstapeln. Beräkna diametrarna av ungefärligt 20 guld kärnor, och sedan bestämma den genomsnittliga guldiga core diametern.
Obs: TEM bildgivande systemet automatiskt placerar en skala bar på de digitala bilderna.
- Mätning av hydrodynamisk nanopartiklar storlek använder dynamisk ljusspridning (DLS)
- Överföra 1 mg frystorkade THPC-belagda AuNPs in i en mikrocentrifug rör med hjälp av den metod som beskrivs i steg 4,2. Överföra 1 mg frystorkade PEG-AuNP i ett separat rör. Tillsätt 1 mL vatten i varje rör och överföra varje AuNP lösning till en 1 mL klar plast.
- Placera en kyvetten i en DLS instrument och mäta sfäriska hydrodynamiska diametrar med programvaran partikel analyzer som är inbyggd i systemets DLS.
- De uppmätta diametrarna hydrodynamiska med ett histogram-format.
Obs: Histogrammet grupperar nanopartiklar av storlek. Den största gruppen av nanopartiklar kommer att klargöra den diameter som bäst beskriver storleken på den AuNPs som syntetiseras i detta protokoll.
- Fluorometric fluorescens bekräftelse
Obs: Samma prov och kyvetten från steg 5.2 kan användas att mäta fluorescerande signal.- Ta bort kyvetten från DLS och sätt i en spectrofluorometer. Uppsättning excitation våglängden till 633 nm och Läs den utsända fluorescensen signaler längs ett våglängdsområde på 650-800 nm.
- Bekräfta att toppen är cirka 665 nm, som korrelerar till utsläpp peak för NHS.
Obs: Justera excitation och utsläpp våglängder enligt fluorophore används i processen.
- MTS assay11 för att bedöma biokompatibilitet
- I en 96-väl tydlig botten steril vävnad kultur behandlas plattan, Pipettera 100 µL av Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM; kompletteras med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin/streptomycin) och 3.2 x 103 celler i varje brunn.
Obs: I denna studie används råtta fett pad endotelceller. Sammanlagt 21 brunnar används för att möjliggöra 3 replikat för varje av de 7 olika nanopartiklar koncentrationerna (se punkt 5.4.3 för särskilda koncentrationer av intresse). - Tillåta cellerna att växa till konfluens i luftfuktighet och 5% CO2 kontrollerade inkubatorer vid 37 ° C11.
- Förbereda enskilda mikrocentrifugrör, vardera innehållande 300 µL av DMEM med nanopartiklar av olika koncentrationer. Denna studie kräver 7 olika rör av DMEM med följande PEG-AuNP koncentrationer: 0 µg/mL, 10 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL och 1000 µg/mL.
- Aspirera på DMEM från röret. Fyll brunnarna i tre exemplar med 100 µL av DMEM media som innehåller 0, 10, 50, 100, 250, 500 eller 1 000 µg/mL AuNP.
- Låt celler och nanopartiklar Co Inkubera under en förutbestämd tid, här för 16 h.
- Nära slutet av inkubationstiden, Tina MTS PSE blandningen från steg 1,5.
- Efter inkubation, aspirera på DMEM och de suspenderade, löst bifogade nanopartiklarna från brunnarna. Tillsätt 100 µL av färska DMEM tillsammans med 20 µL av MTS PSE lösning att få 1:5 MTS PSE DMEM förhållande enligt tillverkarens protokollet. Inkubera cellerna med MTS PSE vid 37 ° C i 2 h.
Obs: Denna 2 h inkubationstiden bestäms av den metaboliska aktiviteten av endotelceller och kan ökas till upp till 4 h för andra celltyper. Inom perioden 2 h metaboliseras MTS av endotelceller in färgade formazan som blandar med DMEM. Biokompatibilitet av PEG-AuNP och sannolikheten för cellviabilitet kommer att demonstreras med fler färgade formazan. Toxicitet av PEG-AuNP och chansen att cellerna dör visas med mindre intensiv färg. - Utföra kolorimetriska analys av varje brunn genom att läsa absorbans vid 492 nm med en kompatibel Plattläsare.
- Beräkna genomsnittlig absorbans från tre exemplar absorptionsvärden för varje koncentration av nanopartiklar. Dela Genomsnittligt absorbansen av det värde som erhålls från genomsnitt absorbansen i brunnar som innehåller 0 µg/mL nanopartiklar.
Obs: Dessa brunnar som innehåller inga AuNPs fungera som kontroller för att beräkna procentandelen cellviabilitet svar på nanopartiklar behandling administreras i andra brunnar.
- I en 96-väl tydlig botten steril vävnad kultur behandlas plattan, Pipettera 100 µL av Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM; kompletteras med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin/streptomycin) och 3.2 x 103 celler i varje brunn.
- Fluorescens konfokalmikroskopi bedömning av nanopartiklar upptag i vidhäftande endotelceller med intakt eller dysfunktionella glykokalyx11
- Utsäde 1,0 x 104 celler/cm2 rat fett pad endotelceller på sterila 12 mm glas coverslips och flöde celler med DMEM kompletteras med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin/streptomycin. Tillåta cellerna att växa till full konfluens i luftfuktighet och CO2 kontrollerade inkubatorer vid 37 ° C, i ca 3 dagar.
- Lägg till behandlingar för att ändra glykokalyx, om tillämpligt. Exempelvis försämrar 2 h behandling av odlade endotelceller med 2.5 x 10-6 IU heparinase III enzym glykokalyx av specifikt klyva sin heparansulfat sulfat komponenten.
Obs: Friska glykokalyx kan modelleras av växande endotelceller som beskrivs i steg 5.5.1 utan tillsats av nedbrytning enzymer. - Med den endothelial glykokalyx intakta eller återges dysfunktionella, inkubera endotelceller med fluorescerande AuNPs på 550 µg/mL för 16 h eller annan önskad tid.
- Försiktigt tvätta cellerna med 2 mL 37 ° C 1% bovint serumalbumin i fosfatbuffrad saltlösning (PBS; innehållande 100 mg/L kalcium- och 100 mg/L). Dränka cellerna i 2 mL 2% PARAFORMALDEHYD och 0,1% glutaraldehyd i PBS, och låta cellerna att fixa i 30 min i rumstemperatur.
- Ta bort aldehyd fastställande lösningen och tvätta cellerna med rumstemperatur PBS för tre 5-min cykler.
- Före primär antikropp applicering, exponera endotelceller till 2% get serum i PBS för 30 min i rumstemperatur att blockera icke-specifik bindningsställen. Cellerna måste täckas helt av blockerande lösningen.
- Inkubera endotelceller över natten med 1% anti-heparansulfat sulfat primär antikropp i 2% get serum i PBS i 4 ° C att märka komponenten heparansulfat sulfat i glykokalyx. Se till att fasta cellerna är helt i kontakt med den antikropp-lösningen.
- Nästa dag, tvätta ut antikroppen med rumstemperatur PBS för tre 10 min cykler.
- Inkubera endotelceller med 1:1,000 utspädning av lämpliga fluorescerande sekundär antikropp i 30 min i rumstemperatur, i mörka eller täckt med aluminiumfolie.
- Tvätta ur den sekundära antikroppen med rumstemperatur PBS för tre 10 min cykler.
- Montera täckglaset på objektglas med en anti fade monteringsmedium innehållande 4', 6-diamidin-2-fenylindol, dihydroklorid (DAPI) för kärnor färgning. Försegla kanterna av det täckglaset med nagellack.
- Bild fluorescerande immunostained endothelial cellen prover med konfokalmikroskopi, med blå, gröna och långt röd kanaler för att visualisera atomkärnor, heparansulfat sulfat glykokalyx och nanopartiklarna, respektive.
Representative Results
Den synthesized AuNPs, belagda med THPC eller PEG (figur 1A och figur 1B, respektive), är avbildade med TEM och partiklar storlekar mäts med hjälp av TEM och DLS för att säkerställa korrekt nanopartiklar storlek distribution. Figur 2 visar TEM bilden av ett THPC-AuNP prov på 80 kV och 150 000 x förstoring. Diametrarna på de THPC-AuNP partiklar varierar från 2-3 nm, baserat på baren kalibrering i TEM bilder. Denna THPC-AuNP storlek är också tydligt i DLS storlek mätning histogrammet visas i figur 2, i vilket THPC belagd visas AuNP att ha en topp på 2.5 nm. Pegylering syns inte under TEM som polymererna inte är electron tät. TEM avbildning av PEG-AuNP prover bekräftar bara närvaron av enskilda spridda partiklar, som är förväntat eftersom PEG polymer corona runt nanopartiklarna stöd i förebyggande av aggregation. För dessa PEG-AuNP prover, DLS storlek mätning histogrammet visar en förskjutning i toppen, till cirka 10,5 nm på DLS. Bilagor av ytterligare ligander eller droger på funktionella grupper kommer att påverka storleken på nanopartikelportföljen samt och bör beaktas när man mäter diametern.
Fluorophore tillägg (figur 1 c) bekräftas genom att använda en fluorometer för att mäta fluorescens signal från ett urval av nanopartiklar, som visas i figur 3. När glada med en våglängd av 633 nm, utsläpp mäts för att ha maximalt mellan 660 och 672 nm, som matchar tillverkarens produktinformation för maximala utsläpp på 665 nm. Fastsättning av andra fluorescerande sonder bör kontrolleras på ett liknande sätt att säkerställa fluorescerande svar.
Biokompatibiliteten för partiklar och relaterad cell lönsamhet bedöms med MTS-analys för att kontrollera relativa cellmetabolism av MTS efter 16 h inkubation med olika koncentrationer av nanopartiklarna. Fluorophore konjugerad PEGylated AuNPs visar ingen signifikant toxicitet, som indikeras av de liknande nivåerna av cellernas viabilitet vid alla koncentrationer upp till 1 mg/mL (figur 4A). Detta biokompatibilitet kan ändras beroende på de terapeutiska eller liganden bifogas de återstående funktionella grupperna att ytterligare anpassa partiklarna. Drogen bilagor tenderar att öka toxicitet, men beroende på de arbetande koncentrationerna, det kan inte påverka lönsamheten på ett betydande sätt.
Upptag av fluorescerande, PEGylated AuNPs (figur 1 c) av vidhäftande celler bedöms med odlade råtta fett pad endotelceller med intakt eller dysfunktionella glykokalyx (figur 4B). De dysfunktionella glykokalyx villkor uppnås genom att lägga till heparinase III enzym i kulturen, vilket resulterar i en försämring av komponenten heparansulfat sulfat glykokalyx och äventyrar den matrix12. Figur 4B visar olika nivåer av upptaget av PEG-AuNPs, som röda prickar på tvärsnittsdata visningen av representativa endotelceller. En hälsosam glykokalyx avskräcker upptag av dessa Guldnanopartiklar, men en betydande ökning som observerats när enzymet är sysselsatta11. Detta resultatet belyser dessa nanoskaliga nanopartiklar potential att leverera therapeutics till endothelial celler på ett sätt som kontrolleras av olika interaktioner som är baserade på glykokalyx hälsa.
Figur 1: guld nanopartiklar scheman. (A) THPC belagda AuNP nanosphere före PEG byte. (B) PEGylated AuNP med 3 typer av PEG avslutningar, inklusive COOH, NH2och CH3. Blå vågor representerar polymeren. (C) konjugerade nanopartiklar för fluorescens avbildning. Röda stjärnor visar den fluorophores konjugerat till NH2 funktionella grupper. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: storlek mätningar av Guldnanopartiklar. Vänster: TEM av Guldnanopartiklar före tillsats av PEG på 80 kV och 150 000 X förstoring, med skalstapeln visas. Höger: Histogram av nanopartiklar storlek mätt med DLS innan (AuNP) och efter (PEG-AuNP) THPC byte med PEG. DLS resultaten för THPC-belagda AuNP kvantifiera vad visualiseras av TEM. DLS PEG-belagd AuNP resultaten övervinna utmaningen av oförmågan att visualisera PEG av TEM på grund av de polymerer som inte är elektron tät. En TEM för PEG-AuNP visas endast de core guldiga nanopartiklarna och ser likadana ut som en THPC-capped AuNP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: fluorescens data av den fluorescerande PEG-AuNP. Fluorescens toppen vid 667 nm matcher utsläpp av fluorophore konjugerat till PEG-AuNP. A.U.: godtyckliga enheter.
Figur 4: Cell interaktioner med den fluorescerande PEG-AuNP. (A) Cell livskraft (MTS metabolism) tomt för råtta fett pad endothelial celler efter 16 h samtidig inkubering med fluorescerande PEG-AuNP. (B) Confocal tvärsnittsdata bilder av fasta råtta fett pad endotelceller som färgas med DAPI för kärnor (blå) och antikroppar mot heparansulfat sulfate, beståndsdel glykokalyx (grön). Översta bilden är en hälsosam glykokalyx och botten är ett försämrat glykokalyx lager; i området i närheten finns det betydligt mer röd fluorescens från nanopartiklarna i provet med försämrade glykokalyx. Skalstapeln är 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
Denna teknik är en effektiv metod för syntetisera anpassningsbara, nanoskaliga PEG belagda AuNPs. En viktig del av detta förfarande är inledande bildandet av THPC utjämnade guld nanopartiklar, som kan bekräftas genom färgen förändras från gul till brun som kommer att uppstå efter HAuCl4 har lagts till innehållet i rund botten kolven (protokoll steg 2.3). Ingen färgförändring indikerar att det finns inga nanopartiklar bildas och att de första stegen bör kontrolleras och upprepas innan du fortsätter. I fall färgen ändras till något annat än brown som vin rött eller grått, de resulterande partiklarna kommer sannolikt inte vara runt den målet 2.5 nm och en ny batch bör göras också.
Efter bildandet av guld kärnan, utbyte av THPC för PEG och rening procedurer innehåller flera viktiga steg för ett framgångsrikt slutförande av protokollet. Blanda under natten möjliggör byte reaktionen att gå till slutförandet. Misslyckade rening kan uppstå om dialys vattnet inte ändras med föreskriven frekvens. Aggregering och utfällning av partiklarna kan också uppstå om partiklarna är kvar i dialys för mer än 72 h. Andra potentiella problem kunde observeras under frysa torkning. Om den nanoskaliga PEG belagda AuNP lösning inte var helt fryst eller om lyophilizer inte har ställts in korrekt, kan prover förloras. Bruksanvisningen till den lyophilizer, som vissa utrustning kan kräva olika prov preparat.
Lättheten av syntes och biokompatibilitet partiklarnas resulterande representerar fördelar för att använda dessa PEG-AuNPs. Dessa nanopartiklar har dessutom fördelen av att kunna interagera med nanoskala cellulära strukturer som visat förmåga att identifiera försämrade glykokalyx upptag av dessa nanopartiklar. Denna fördel kan utnyttjas för utveckling av nya åderförkalkning behandlingsmetoder och förebyggande åtgärder. Bortom det vi presenterar här, en annan fördel med detta protokoll är att det möjliggör omfattande anpassning av partiklar samt ökad stabilitet och lagringsmöjligheter genom att fästa thiol innehållande PEG på Guldnanopartiklar4. Den andra änden av kedjan PEG kan innehålla någon funktionell grupp, och en myriad av molekyler kan vara konjugerat till dessa grupper. Detta protokoll, kopplas alla tre gemensamma funktionella grupper (metyl, carboxyl, och aminosyror). Förhållandet mellan PEG är valt att prioritera fluorescerande upptäckt först, sedan möjligheten att införliva en sekundär målgrupp biexponentiellt använder gruppen karboxylsyra. Var kvoterna för dessa grupper kan finjusteras utifrån ansökan, och i längder och former för polymerer kan justeras också.
För att mäta partikel upptag, konjugerat vi en fluorescerande sonden till en av de funktionella grupperna. Det bör noteras att varje konjugation utöver vad vi har beskrivit kommer att resultera i en förändring av ytegenskaper av nanopartikelportföljen. Varje iteration av nanopartiklarna med avseende på ytterligare komponenter och konjugation reaktioner bör testas för önskade egenskaper.
Denna metod producerar nanoskaliga guld nanopartiklar avsedda att övervinna den endothelial extracellulära glykokalyx, som hämmar upptag av konventionellt storlek nanopartiklar defensiva egenskaper. Dock lånar små till svårigheter i både imaging och drog lastning aspekt. Dessa partiklar är betydligt mindre än intervallet typiska nanopartiklar storlek, och som ett resultat yta som är tillgänglig för bilagor therapeutics och inriktning beståndsdelarna minskas kraftigt. Detta kan leda till svårigheter plocka upp enskilda signaler i imaging applikationer, även om kluster av partiklar kan fortfarande lätt identifieras, som visas i confocal bilderna. Reducerad yta för bifogade filer för att rikta ligander och therapeutics kan kräva fler partiklar ska administreras för att uppnå målet dosering krav. De mindre partiklarna kommer dock effektivare i leveransen när beaktar glykokalyx.
Dessa nya nanoskaliga partiklar klarar av leverans till svårt att nå nanoskala områden inom kroppen med minimala störningar av mikromiljö. Tillägg av PEG möjliggör ökad biokompatibilitet och erbjuder funktionella grupper för tunga anpassning av partiklar för olika tillämpningar. Den mindre storleken jämfört med typiska nanopartiklar kommer med vissa brister, men om utvecklat strategiskt, nanoskaliga partikeln är en lovande strategi för boende av den svår att penetrera, intrikata och bräckliga glykokalyx i vaskulära inriktning och drug delivery.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av departementet Northeastern University Chemical Engineering, bevilja nystartade fonder och Tier 1 Pilot utbildningsbidrag från nordöstra universitet Provost Office, NIH K01 HL125499 och NSF-IGERT NSF/DGE-096843. Författarna vill även tacka Thomas J. Webster och hans labb för deras hjälp samt nanomedicin Science och Technology Center och Pharmaceutical Sciences institutionen vid Northeastern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 795429 | |
| Gold (III) Chloride trihydrate (HAuCl4.3H2O) | Sigma Aldrich | 520918 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Tetrakis (hydroxymethyl) phosphnium chloride | Sigma Aldrich | 404861 | |
| Mono-functional mPEG-thiol | Layson Bio Inc. | MPEG-SH-2000-1g | Mw: 2,000 Da |
| hetero bi-functional anime-PEG-thiol | Layson Bio Inc. | NH2-PEG-SH-3400-1g | Mw: 3,400 Da |
| Carboxymethyl-PEG-thiol | Layson Bio Inc. | CM-PEG-SH-2000-1g | Mw: 2,000 Da |
| Cellulose dialysis membrane (12-14 kDa) | Sigma Aldrich | D9777 | |
| Zerostat anti-static instrument | Sigma Aldrich | Z108812 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) carboxylic acid succinimidyl ester | Fisher | A20006 | Fluorophore |
| Fisherbrand Qualitative Grade Plain Filter Paper Circles - P5 grade | Thermo Fisher Scientific | 09-801-B | |
| Transmission electron microscopy | JEOL USA | JEOL JEM-1000 | TEM |
| Dynamic Light Scattering | Brookhaven Instruments Corporation | Brookhaven 90 Plus Particle Size Analyzer | DLS |
| Fluorometer | Horiba Scientific | Jobin Yvon Fluromax 4 | Fluorometer |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | MTS |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M4 | Plate reader |
| 10E4 epitope HS mouse monoclonal IgM antibody (primary antibody) | Amsbio | 370255 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (secondary antibody) | Thermo Fisher Scientific | R37120 | Secondary antibody |
| VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | With DAPI |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss Meditex AG | Zeiss LSM 700 | Confocol microscopy |
References
- Veiseh, O., Gunn, J., Zhang, M. Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging. Adv. Drug Deliv. Rev. 62 (3), 284-304 (2010).
- Feng, X., et al. Conjugated polymer nanoparticles for drug delivery and imaging. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (8), 2429-2435 (2010).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Adv. Drug Deliv. Rev. 60 (11), 1307-1315 (2008).
- Kumar, R., et al. Third generation gold nanoplatform optimized for radiation therapy. Transl. Cancer Res. 2 (4), 1-18 (2013).
- Tarbell, J. M., Ebong, E. E. The endothelial glycocalyx: a mechano-sensor and -transducer. Sci. Signal. 1 (40), (2008).
- Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454 (3), 345-359 (2007).
- Becker, B. F., Jacob, M., Leipert, S., Salmon, A. H., Chappell, D. Degradation of the endothelial glycocalyx in clinical settings: searching for the sheddases. Br. J. Clin. Pharmacol. 80 (3), 389-402 (2015).
- Muzykantov, V., Muro, S. Targeting delivery of drugs in the vascular system. Int. J. Transp. Phenom. 12 (1-2), 41-49 (2011).
- Simone, E., Ding, B. -S., Muzykantov, V. Targeted delivery of therapeutics to endothelium. Cell Tissue Res. 335 (1), 283-300 (2009).
- Lockman, P. R., Mumper, R. J., Khan, M. A., Allen, D. D. Nanoparticle technology for drug delivery across the blood-brain barrier. Drug Dev. Ind. Pharm. 28 (1), 1-13 (2002).
- Cheng, M. J., Kumar, R., Sridhar, S., Webster, T. J., Ebong, E. E. Endothelial glycocalyx conditions influence nanoparticle uptake for passive targeting. Int. J. Nanomedicine. 11, 3305-3315 (2016).
- Fels, J., Jeggle, P., Liashkovich, I., Peters, W., Oberleithner, H. Nanomechanics of vascular endothelium. Cell Tissue Res. 355 (3), 727-737 (2014).
