Summary
Deze nieuw ontwikkelde fluorescentie gebaseerde technologie kan op lange termijn van de transcriptie van de circadiane klok genen in de suprachiasmatic kern (SCN) vrij bewegen muizen in real time en met een hoge temporele resolutie.
Abstract
Deze techniek combineert optische vezel gemedieerde fluorescentie opnamen met de nauwkeurige levering van recombinante adeno-associated virus gebaseerd gene verslaggevers. Dit nieuwe en makkelijk te gebruiken in vivo fluorescence bewakingssysteem is ontwikkeld om het opnemen van het transcriptionele ritme van het klok gen, Cry1, in de suprachiasmatic kern (SCN) van vrij bewegende muizen. Om dit te doen, is een Cry1 transcriptie fluorescentie verslaggever ontworpen en verpakt in Adeno-associated virus. Gezuiverde en geconcentreerde virus werd geïnjecteerd in de muis SCN gevolgd door het inbrengen van een optische vezel, die vervolgens werd vastgesteld op het oppervlak van de hersenen. De dieren waren keerde terug naar hun huis kooien en een 1-maand postoperatief herstel periode om voldoende verslaggever expressie. Fluorescentie werd vervolgens opgenomen in vrij verplaatsen van muizen via een in vivo monitoringsysteem dat werd gebouwd op onze instelling. Voor de in vivo opname-systeem, ging een 488 nm laser gepaard met een 1 × 4 beam-splitter die het licht in de vier uitgangen van de excitatie van de laser van gelijke macht verdeeld. Deze instelling ingeschakeld ons tegelijk opnemen van vier dieren. Elk van de signalen uitgezonden fluorescentie werd verzameld via een fotomultiplicator en een data-acquisitie kaart. In tegenstelling tot de vorige bioluminescentie in vivo circadiane klok opname techniek, deze fluorescentie in vivo opname-systeem mag de opname van de circadiane klok genexpressie tijdens de lichte cyclus.
Introduction
Bij zoogdieren regelt de suprachiasmatic kern (SCN) van het hele lichaam circadiane ritme te coördineren van iemands reactie op exogene veranderingen in het milieu (bijvoorbeeld, licht, temperatuur, stress, etc.)1. De componenten van de klok van de kern bestaat uit Per1-3, Cry1-2, kloken Bmal1, en een centrale rol bij het reguleren van de circadiane klok van elke cel. Elke cel in de SCN bevat de transcriptionele activator, klok/BMAL1, die als een heterodimer fungeert voor het opwekken van de expressie van PER en huilen. De PER / CRY complex dan remt de functie van klok/BMAL1 om te vormen van een transcriptie-vertaling feedback lus waarmee ongeveer 24 h naar complete2,3.
Eerdere studies over de SCN hebben voornamelijk werkzaam voor de ex vivo SCN segment cultuur methode4,5,6 en, terwijl deze aanpak waardevolle informatie heeft verstrekt, zijn beperkingen ons vermogen om te hebben geremd het verkrijgen van gegevens betreffende de invloed van andere kernen van de hersenen op de SCN, evenals het effect van exogene stimuli (zoalslicht) op cellen die woonachtig zijn in deze belangrijke regio. In 2001 was Hitoshi Okamura de groep de eerste die de Bioluminescentie systeem in vivo monitor circadiane klok genexpressie gebruiken in de SCN in muizen7vrij te verplaatsen. Ken-ichi Honma de groep heeft doorgebracht de afgelopen jaren verdere ontwikkeling van de Bioluminescentie in vivo opname-systeem in de SCN8,9,10. Samen, hebben deze studies voorzien van onderzoekers de mogelijkheid om te controleren van de circadiane klok in constante duisternis of na een lichte puls. Echter omdat bioluminescentie ook dim te voorzien in continue monitoring tijdens de licht/donker cyclus, in combinatie met het feit dat licht het overheersende signaal nodig zijn voor de SCN-gemedieerde meevoeren van circadiane klokken11 is, is er toenemende vraag naar de ontwikkeling van experimentele methoden die overwinnen van de beperkingen die zijn gekoppeld aan bioluminescentie opname. Het huidige verslag beschrijft een fluorescentie-gebaseerd systeem dat werd gebouwd om te controleren van de circadiane klok van de SCN in vivo in vrij bewegende muizen. Deze easy-to-use methode toelaat continue monitoring tijdens de licht/donker cyclus en zorgt voor de lange termijn waarneming van de transcriptie van de circadiane klok genen in de SCN in real-time en hoge temporele resolutie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures in dit protocol werden uitgevoerd met de goedkeuring van de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van het National Institute of Biological Sciences, Peking, overeenkomstig de bepalingen van de gouvernementele van China.
1. bouw van de Cry1 fluorescentie verslaggever
Opmerking: Vorige circadiane studies met behulp van de12van bioluminescentie systeem2,,13 zekering een circadiane promotor met een gedestabiliseerd luciferase (dLuc) voor het opwekken van ritmische dLuc expressie. Ontwikkeling van een verslaggever van de fluorescentie, werd gedestabiliseerd luciferase vervangen door gedestabiliseerd fluorescentie eiwit (dVenus) voor het opwekken van ritmische dVenus expressie. De generatie van de P (Cry1)-dVenus verslaggever is hieronder beschreven, de constructie waarvan momenteel wordt voorgelegd aan de Addgene en zal beschikbaar spoedig voor academisch gebruik.
- Versterken van de functionele muis Cry1 promotor (+328 voor-1208 bp regio van het Cry1 gen, transcriptie start site uitgeroepen tot-'' 1 ''). Gebruik van het PCR-enzym (KOD Plus Neo), inleidingen F1 en R1 (Zie tabel 2), genoom muis als een sjabloon en van de fabrikant PCR protocol om te versterken van het Cry1 promotor DNA fragment.
- Intron 336 van het Cry1 -gen, dat belangrijk voor het functioneren van de circadiane klok van Cry114 iste versterken. Gebruik het enzym PCR inleidingen F2 en R2, muis genoom als een sjabloon en van de fabrikant PCR protocol om de intron 336 DNA fragment te vergroten.
- Versterken van Venus. Gebruik het enzym PCR inleidingen F3 en R3, pVENUS-N1 plasmide als een sjabloon en van de fabrikant PCR protocol om de Venus DNA fragment te vergroten.
- Versterken de NLS-D2 DNA-fragment. Gebruik het enzym PCR inleidingen F4 en R4, pcDNA3.3-d2eGFP plasmide als een sjabloon en van de fabrikant PCR protocol om de NLS-D2 DNA-fragment te vergroten.
- Synthetiseren DNA fragment 1 als exon 1.
- Synthetiseren fragment van DNA 2 als de linker tussen intron 336 en het Venus DNA fragment.
- Snijd de pAAV-EF1a-double floxed-hChR2 (H134R) - mCherry - WPRE-HGHpA vector plasmide met de MluI en EcoRI enzymen. Gebruik de Gel extractie Kit voor het zuiveren van de grotere fragment van DNA. Van de fabrikant-protocol gebruiken.
- Met behulp van een mix van de vergadering Gibson en haar standaardprotocol, monteren alle van de DNA-fragmenten samen te produceren van de pAAV-P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA verslaggever. Van de fabrikant-protocol gebruiken.
2. productie van Adeno-associated Virus15
- Voorbereiding van de volgende plasmide DNA voorraden: 31.25 µg voor pRV1, 31.25 µg pH21 125 µg voor pFdelta6 en 62,5 µg pAAV-P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS - D2-WPRE-HGHpA.
- Vijf 15 cm schotels van 293T cellen voor te bereiden en wacht totdat de cellen 90% heuvels worden.
- Transfect de plasmiden in de cellen van de 297T na het protocol van de reagens van de transfectie. Gebruik voor elk gerecht, 6,25 µg pRV1, 6,25 µg van 25 µg voor pFdelta6, pH21, 12,5 µg pAAV-P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA, en 120 µL van transfectiereagens.
- 72 uur na de transfectie, Los de cellen van elke plaat met behulp van een pipet pistool; het oogsten van de cellen in twee buizen van 50 mL.
- Pellet de cellen bij 800 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant. Wassen van de cellen door het plaatsen van 20 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in elke buis; pellet de cellen bij 800 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer pellets in 150 mM NaCl en 20 mM Tris oplossing, pH 8.0; gebruik 25 mL van oplossing/buis. Voeg 1,25 mL vers bereide 10% natrium deoxycholate (in dH2O) aan elke buis. Benzonase nuclease toevoegen om een eindconcentratie van 50 eenheden per mL en meng. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Cellulaire puin verwijderen door centrifugatie bij 3000 x g gedurende 15 minuten. Verder garanderen dat alle puin heeft zijn verwijderd door het indrukken van het mengsel door een filter van de spuit 0,45 μm; deze stap zal helpen voorkomen blokkering van heparine kolommen.
- De kolommen van de heparine gebruik een peristaltische pomp; instellen Stel het debiet op 1 mL/min, ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de kolommen worden binnengebracht.
- De kolommen met 10 mL van een 150 mM NaCl, 20 mM Tris oplossing, pH 8,0 equilibreer. De oplossing die met het virus aan elke kolom toevoegen. Was de kolommen met 20 mL van een 100 mM NaCl, 20 mM Tris oplossing, pH 8,0. Vervolgens met behulp van een spuit 5 mL, was de kolommen met 1 mL van een 200 mM NaCl en 20 mM Tris oplossing pH 8.0, gevolgd door 1 mL van een 300 mM NaCl en 20 mM Tris oplossing, pH 8,0.
- Gebruik een 5 mL-spuit om Elueer van het virus met 3 mL van een 400 mM NaCl, 20 mM Tris oplossing, pH 8.0, gevolgd door 4 mL van een 450 mM NaCl, 20 mM Tris oplossing, pH 8.0, en ten slotte door een 3 mL van een 500 mM NaCl , 20 mM Tris oplossing, pH 8.0. De uitgepakte materialen verzamelen.
- Voor recombinante adeno-associated virus (rAAV) de concentratie, de uitgepakte materialen, 4 mL tegelijk, in centrifugaal filter eenheden met een 100.000 moleculair gewicht cutoff te laden. Centrifugeer elk 4-mL monster bij 2000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, teruggooi de doorstroming.
- Wanneer alle uitgepakte materialen zijn uitgevoerd door de centrifugale filter eenheden, Voeg 4 mL PBS en Centrifugeer het mengsel tot ongeveer 250 μL. Verwijderen van rAAVs (virale titer moet over 2-8 x 1012 virale deeltjes per mL) van de centrifugaal filter eenheden, aliquot en winkel bij-80 ° C tot gebruik. In dit stadium kan het virus worden opgeslagen voor enkele maanden.
3. rAAV injectie en Optic Fiber invoegen in de volwassen muis SCN
- Injectie van verslaggever-uitvoering rAAVs van circadiane fluorescentie in de SCN
- Laden van 5 µL van rAAV (de titer van het virus is over 2-8 x 1012 virusdeeltjes per mL) in een micro-spuit.
- Anesthetize een volwassen muis (2 tot 5-maand-oude, C57BL/6 achtergrond) met Nembutal (80 mg/kg) via intraperitoneale injectie. Controleren op voldoende diepte van verdoving door het ontbreken van een teen-snuifje reactie.
- Gebruik schaar te verwijderen bont uit de kop van de muis en dan mount de muis op een stereotaxic apparaat. Een warmtebron geven narcose dieren via een circulerende warm water deken of een ander verwarmingstoestel.
Opmerking: Gebruik als alternatief, ontharende room of elektrische tondeuses voor het verwijderen van de vacht. - Reinig de chirurgische site met de juiste ontsmetting agenten. Bijvoorbeeld, kon dit omvatten steriel water of alcohol en jodium, betadine, of verdund chloorhexidine afwisselend scrubs. Herhaal dit minstens 3 keer. Drape de chirurgische site.
- De schaar gebruik te maken van een incisie in de hoofdhuid en bloot de schedel.
- Aanpassen van het stereotaxic apparaat zodat bregma en lambda in hetzelfde horizontale vlak; Maak twee symmetrische punten van bregma in hetzelfde horizontale vlak.
- Gebruik een steriel katoenen doekje gedrenkt in 4% H2O2/H2O te corroderen de hersenen beenvlies. Gebruik dan een schoon, steriel katoenen doekje te wissen en droog het oppervlak van de schedel.
- Met behulp van een micro boor, maken een gat van ongeveer 1 mm in diameter 0.46 mm posterior en 0,25 mm laterale bregma.
- fi Gebruik een schone katoenen steriel doekje met fysiologische zoutoplossing oplossing om te wissen van botfragmenten van het blootgestelde oppervlak van de hersenen.
- Plaats een micro-spuit in de hersenen, ervoor te zorgen dat het uiteinde van de micro-spuit 0.46 mm posterior en 0,25 mm laterale bregma en 5.7 mm diepe van de oppervlakte van de schedel.
- Injecteren van 500 nL van rAAV (50 nL min-1) in de SCN, verlaten van de micro-spuit in plaats gedurende 10 minuten na de injectie om ervoor te zorgen volledige verspreiding van rAAV.
- Langzaam trekt de micro-spuit.
- Steek de optische vezel in de SCN-gebied.
- Met behulp van een optische vezel mes, snijd een vezel 17-mm in lengte, ervoor te zorgen dat elke zijde van de optische vezel glad is.
- Plaats van de optische vezel in de keramische verlengstuk en monteren van de optische vezel naar een keramische verlengstuk met methylethylketon peroxide (AB lijm), ervoor te zorgen dat het oppervlak van de glasvezel en keramische verlengstuk flush.
- Reinig de vezel met een koude sterilant oplossing of ethyleen oxide.
- Na rAAV injectie (stap 3.1.11), plaatst u de keramische verlengstuk-bevattende optische vezel in de SCN.
- De keramische verlengstuk en optische vezel op de schedel met behulp van tandheelkundige hars vast te stellen en laten drogen.
- Het oppervlak van de tandheelkundige hars smeren met terug nagellak. Herhaal de procedures die worden beschreven in 3.1.2 te 3.2.5, het weglaten van de werkelijke injectie van rAAV voor controle.
- Post chirurgische zorg
- Voorzien van muizen postoperatieve pijnstillers, zoals buprenorfine 2 mg/kg lichaamsgewicht, subcutaan, twee keer per dag.
- Muizen in een kooi herstel plaatsen terwijl ze uit de narcose komen.
- Huis muizen individueel onder een 12u licht/donker voorwaarde (lichtintensiteit ~ 100 lux op de bodem van de kooi) met voedsel/water beschikbaar ad libitum. Acht dagen dient te worden toegekend vóór verdere experimenten om te voorzien in voldoende hersteltijd en om optimale fluorescentie verslaggever expressie.
4. in vivo Fluorescence signaal bewaking en gegevensverzameling
- Acht dagen na de operatie, eventueel gecombineerd met de vezel op de kop van de muis de fluorescentie signaal monitor (bv., Gene Observer). Controleer het signaal van de fluorescentie in de SCN van controle muizen om het signaal van de achtergrond. Het uitvoeren van de observatie en meting van dit signaal met behulp van fluorescentie signaal monitor.
- Het signaal van de fluorescentie van experimentele muis met dezelfde bewerking van de controle muis te evalueren. Uitsluiten muizen die hebben ontvangen de virale vector maar die het signaal van de achtergrond van analyse, worden alleen weergegeven als dit waarschijnlijk geeft aan dat het uiteinde van de optische vezel de SCN heeft gemist. Na deze eerste maatregelen door muizen te keren naar hun huis kooien voor nog 3 weken om het signaal van de fluorescentie te stabiliseren.
- Na 3 weken, sluit u de muizen met de fluorescentie signaal monitor. Meten van de fluorescentie voor 15 s elke 10 min, met een frequentie van 100 Hz. Tijdens deze metingen zijn de muizen vrij bewegen in hun kooien met voedsel/water beschikbaar ad libitum. Gebruik een lichtintensiteit aan de onderkant van de kooi van ~ 100 lux, en de kracht van de laser op het puntje van de optische vezel tussen 15-20 μW.
- Na de voltooiing van alle opnamen, muizen met 4% paraformaldehyde, perfuse en verwijderen en snijd de hersenen om te controleren van de plaatsing van de optische vezel. Uitsluiten muizen analyse als het uiteinde van de optische vezel is niet correct geïmplanteerd in de SCN.
5. de gegevensanalyse en presentaties
- Maatregel fluorescentie signaal elke 10 min voor 15 s, met een frequentie van 100 Hz, aan opbrengst 1500 gegevenspunten. Het gemiddelde van deze 1500 punten vertaalt naar het signaal van de fluorescentie op elk gegeven moment punt. Uitzetten van meerdere gemiddelden na verloop van tijd produceert een signaal-aan-tijd curve, die overeenkomt met het transcriptionele ritme van Cry1 onder een lichte voorwaarde van de controle in de SCN van vrij bewegende muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescentie verslaggever ontwerp van Cry1 was Toon in figuur 1A. Met behulp van de aanpak hierboven, 500 nL van rAAV-P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 met succes werd geïnjecteerd in de SCN van een volwassen muis en robuuste Venus expressie (figuur 1B, 1 C) tentoongesteld. Fluorescentie signalen opgenomen onder 12h / 12h licht/donker (LD) (DD) donker/donker (Figuur 2) leverde robuuste circadiane ritme in beide voorwaarden. Ten slotte, fluorescentie signaal was opgenomen in lange en korte fotoperiode voorwaarden (Figuur 3).
Figuur 1. Fluorescentie verslaggever ontwerp en het expressie in de SCN
(A) de fluorescentie verslaggever ontwerp van Cry1. (B) gekleurd van de hersenen van de muis tonen verslaggever expressie 8 dagen na de injectie van virus. (C) vergroting van het gebied boxed in rood op de gekleurd weergegeven in (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Fluorescentie in vivo opnemen in de SCN LD en DD voorwaarden
(A) achtergrond van fluorescentie in de SCN tonen geen detecteerbare ritme zowel LD en DD voorwaarden. De witte en grijze gebieden geven licht-on en licht-off-perioden, respectievelijk. (B) P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 expressie in de loop van 7 dagen in een 12-12 LD voorwaarde en 7 dagen in een DD-voorwaarde. (C) analyse van circadiane ritme in de LD voorwaarde (~24.4 h); de rode lijn geeft de geconvergeerde passen in de bocht van de sinus (het resultaat van de pasvorm wordt weergegeven in het linker paneel). (D) analyse van circadiane ritme in de DD staat (~23.25 h); de rode lijn geeft de geconvergeerde passen in de bocht van de sinus (het resultaat van de pasvorm wordt weergegeven in het linker paneel). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. In vivo de opnamen van de fluorescentie in de SCN onder 20-4 lang en 4-20 korte fotoperiode voorwaarden
Voorbeeld van een opname van de fluorescentie van P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 expressie in de SCN voor 7 dagen onder 12-12 LD voorwaarde, gevolgd door 7 dagen onder 20-4 lange fotoperiode voorwaarde, 3 dagen onder de voorwaarde van een DD, 3 dagen onder 12-12 LD voorwaarde, en vervolgens 7 dagen onder een 4-20 korte fotoperiode voorwaarde. Witte en grijze gebieden geven de licht-on en licht-off-perioden, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Tabel 1. Specifieke reagentia vereist voor protocol (Zie Tabel van materialen)
| de naam van de primer | volgorde | ||
| primer F1 | cactaggggttcctgcggccgcACGCGTGTAAAGATGCACATGTG | ||
| primer R1 | TTGTAACCTTGATACTTACCTACTTAGATCGCAGATCTCGTCCGG | ||
| primer F2 | GTTATGACACAGTGTAGAAACTATGGCATAGGACAGATGACTGTG | ||
| primer R2 | CATGGTCTTTGTAGTCCATGGTGGGTACCtCTTGACAGCTCTACC | ||
| primer F3 | ctgtattttcagggcCCTGCAGGtGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG | ||
| primer R3 | TACCTTTCTCTTCTTTTTTGGAGGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC | ||
| primer F4 | GCATGGACGAGCTGTACAAGCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAG | ||
| primer R4 | tgatatcgaattcGGATCCCTACACATTGATCCTAGCAGAAGCAC | ||
Tabel 2. Primer gebruikt in het protocol
Tabel 3. DNA-sequentie in het protocol gebruikt Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In tegenstelling tot ex vivo methoden, zoals segment cultuur4,5, RT-PCR16en in situ hybridisatie17, die vereisen dat de dieren worden gedood, de in vivo methode opnemen kunt onderzoekers bestuderen circadiane genexpressie in een levend dier. Als zodanig is deze technologie biedt de mogelijkheid om te evalueren van het effect van verschillende fysieke verstoringen (b.v., slaaptekort, stress, voedselinname, etc.) op de neurale circadiane klok. In tegenstelling tot de in vivo bioluminescentie7,8,10 -methode die alleen maar in constante donkere omstandigheden functioneren kan, kan de fluorescentie in vivo opname methode worden toegepast onder licht voorwaarden-een belangrijk voordeel van de technologie als licht signalen opnieuw entrainment van de SCN circadiane klok18. Hoewel relatief constant, robuuste circadiane ritmen kunnen worden opgespoord met deze methode, dient te worden opgemerkt dat de verslaggever-technologie geen kwantitatieve informatie levert en kan daarom niet worden gebruikt voor het meten van gene transcriptie en vertaling.
Er zijn vele kritische stappen van dit protocol. De titer van de geconcentreerde rAAV moet zo hoog zoals 2-8 x 1012 virale deeltjes per mL; lagere virale titers zou dim of zelfs niet detecteerbaar fluorescentie signalen afgeven. Bij de vaststelling van het hoofd van de muis op het stereotaxic apparaat, zorgen ervoor dat de schedel is horizontaal ten opzichte van veilige nauwkeurige positionering voor virus injectie en optische vezel implantatie. Injectie van het virus moet gebeuren langzaam (≤50 nL min-1) om ervoor te zorgen dat het virus in de SCN blijft. De keramische verlengstuk en optische vezel moeten veilig worden vastgesteld op de schedel en tandheelkundige hars moet niet contact met de huid. Als de keramische verlengstuk en optische vezels zijn niet adequaat wordt opgelost, zal ze geleidelijk losmaken van het hoofd van de muis.
Deze techniek kan worden uitgebreid tot andere verslaggevers gen (b.v., Per2, Bmal1, c-Fos, Pomc, enz.) door de promotor en de bijbehorende intron19te wijzigen. Door het omkeren van de vlag-inton336-Venus-NLS-D2-cassette met twee omgekeerde lox sequenties en de verslaggever te combineren met een lijn van de muis Cre, kan deze technologie worden gebruikt om activiteit in specifieke neuronen. Bijvoorbeeld, kan het deze aanpak te combineren met een Vip-cre muis lijn zou zijn voor de opname van Cry1 transcriptionele ritmes in vasoactieve intestinale polypeptide-uiten neuronen in de SCN. Deze methode kan ook gebruikmaken van GCaMP6 als een Ca2 + indicator voor het opnemen van de Ca2 + circadiane ritme in de hersenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
Wij danken de leden in het lab Zhang voor het verstrekken van discussies en leden in het lab Zhan te stimuleren om technische bijstand te verlenen. Dit onderzoek werd gesteund door subsidies 31500860 (met C.Z.) van het NSFC, 2012CB837700 (om E.E.Z. en C.Z.) van het 973 programma van de M.O.S.T. van China, en door financiële middelen van de gemeentelijke overheid van Peking. E.E.Z. werd gesteund door de Chinezen "Recruitment programma van Global Youth deskundigen".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
References
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).
- Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system. European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).
- Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Yamaguchi, S., et al. Gene expression: View of a mouse clock gene ticking. Nature. 409, 684-684 (2001).
- Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice. Science Reports. 5, 12310 (2015).
- Ono, D., Honma, S., Honma, K. Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms. European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).
- Ono, D., et al. Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).
- Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).
- Ukai-Tadenuma, M., et al. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).
- Yamaguchi, Y., et al. Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag. Science. 342, 85-90 (2013).
- Nagano, M., et al. An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center. Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).
- Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. Physiology of Circadian Entrainment. Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
