Summary
이 새로 개발된 된 형광 기반 기술을 통해 자유롭게 이동 하는 쥐 실시간 및 높은 시간 해상도 suprachiasmatic 핵 (SCN)에서 circadian 시계 유전자의 녹음 방송을의 장기 모니터링 됩니다.
Abstract
이 기술을 기반으로 하는 재조합 형 adeno 관련 바이러스 유전자 기자 들의 정확한 납품 광섬유 중재 형광 녹음을 결합합니다. 이 새로운 및 사용 하기 쉬운 vivo에서 형광 모니터링 시스템 개발 되었다 자유롭게 마우스를 이동의 suprachiasmatic 핵 (SCN)에서 시계 유전자, Cry1의 transcriptional 리듬을 기록 하. 이렇게 하려면, Cry1 전사 형광 기자 설계와 Adeno 관련 바이러스로 포장. 정제, 집중 바이러스 SCN 광케이블은 두뇌의 표면에 고정 후 삽입 하 여 다음 마우스에 주입 했다. 동물 자신의 집 새를 반환 하 고 충분 한 기자 식 되도록 1 개월 수술 회복 기간을 허용 했다. 형광 다음 자유롭게는 vivo에서 우리의 기관에서 만들어진 시스템 모니터링을 통해 마우스를 이동에 기록 되었다. 대 한 vivo에서 녹화 시스템, 488 nm 레이저는 동등한 힘의 4 개의 레이저 구동 출력으로 빛을 분할 한 1 × 4 빔-스플리터와 결합 했다. 이 설치 프로그램 4 동물에서 동시에 레코드를 사용할 수 있습니다. 각 내보낸된 형광 신호 광 전 증폭 관 관 및 데이터 수집 카드 통해 수집 되었다. 반면 이전 생물 발광 vivo에서 circadian 시계 기록 기술,이 형광에서 vivo에서 녹화 시스템 허용 빛 주기 circadian 시계 유전자 발현의 기록.
Introduction
포유류에서 suprachiasmatic 핵 (SCN) 외 인 환경 변화 (예를 들면, 빛, 온도, 스트레스, 등)1개인의 응답을 조정 전체 신체의 circadian 리듬을 제어 합니다. 코어 클록 구성 요소 Per1-3, Cry1 2, Clock, Bmal1의 구성 하 고 각 셀의 circadian clock을 조절에 중추적인 역할. 각 셀은 SCN에 transcriptional 활성 제, 시계/BMAL1, 당의 표현을 유도에 heterodimer 역할 포함 및 외침. 당 / 울 복잡 한 다음 시계/BMAL1 완료2,3약 24 h는 녹음 방송 번역 피드백 루프를 형성 하기의 기능을 억제.
이전 연구는 SCN에 비보 전 SCN 슬라이스 문화 방법4,,56 주로 고용 하 고, 한계가 우리의 능력을 저해는 동안이 접근은 귀중 한 정보를 제공 하 고, SCN에 다른 뇌 핵의 영향 뿐만 아니라이 중요 한 영역에 있는 셀에 외 인 자극 (예를 들면, 빛)의 효과 대 한 데이터를 가져옵니다. 2001 년에, 히토시 오카무라의 그룹 자유롭게 이동 마우스7에서 SCN에 vivo에서 모니터 circadian 시계 유전자 발현을 생물 발광 시스템을 사용 하는 첫번째 이었다. 켄 이치 혼 마의 그룹은 지난 몇 년 동안에는 생물 발광에서 vivo에서 SCN8,,910녹화 시스템 개발 지출 했습니다. 함께, 이러한 연구는 지속적인 암흑 또는 빛 펄스 후 circadian 시계를 모니터링 하는 기능 연구를 제공 합니다. 그러나, 때문에 생물 발광 너무 희미 한 명암 주기 동안 지속적인 모니터링 사실 빛 circadian 시계11, SCN 중재 진입에 필요한 주된 신호 함께 있도록입니다. 생물 발광 녹화와 관련 된 한계를 극복 하는 실험 방법의 개발에 대 한 수요 증가. 현재 보고서는 circadian 시계는 SCN에서 vivo에서 자유롭게 이동 하는 쥐에서의 모니터링을 건립 되었다 형광 기반 시스템을 설명 합니다. 이 사용 하기 쉬운 메서드 명암 주기 동안 지속적인 모니터링을 허용 하 고 실시간 및 높은 시간 해상도에서 SCN에 circadian 시계 유전자의 녹음 방송의 장기 관찰에 대 한 허용.
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Protocol
이 프로토콜의 모든 절차는 중국의 정부 규정에 따라 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 국립 연구소의 생물학, 베이징의 승인을 실시 했다.
1. 건설 Cry1 형광 기자
참고: 이전 circadian 연구 생물 발광 시스템2,12를 사용 하 여,13 퓨즈 리듬 dLuc 식 유도를 정한 luciferase (dLuc)와 circadian 발기인. 개발 하기 위해 형광 기자, 정한 luciferase 리듬 dVenus 식 유도를 정한 형광 단백질 (dVenus)로 대체 되었다. P (Cry1)의 생성-d금성 기자 아래 설명의 구조는 현재 Addgene에 제출 되 고 학문적 인 사용을 위해 곧 유효할 것 이다.
- 증폭 기능 마우스 Cry1 발기인 (-1208 bp 지역 전사 시작 사이트 '-1'로 지정, Cry1 유전자의 +328). PCR 효소 (로그인 플러스 네오)를 사용 하 여, 뇌관 f 1와 r 1은 ( 표 2참조), 서식 파일 및 제조업체의 PCR 프로토콜 Cry1 발기인 DNA 파편을 증폭으로 게놈을 마우스.
- Intron 336 Cry114의 circadian 시계 기능을 위해 중요 하다, Cry1 유전자의 증폭. 사용 하 여 PCR 효소 뇌관 f 2와 r 2, 서식 파일 및 제조업체의 intron 336 DNA 파편을 증폭 하기 위하여 PCR 프로토콜 마우스 게놈.
- 금성을 증폭. 뇌관 f 3와 R3, 템플릿과 제조업체의 금성 DNA 파편을 증폭 하기 위하여 PCR 프로토콜으로 pVENUS N1 플라스 미드 PCR 효소를 사용 합니다.
- NLS-D2 DNA 파편을 증폭. 뇌관 f 4와 R4, 서식 파일 및 NLS D2 DNA 파편을 증폭 하는 제조 업체의 PCR 프로토콜 pcDNA3.3 d2eGFP 플라스 미드 PCR 효소를 사용 합니다.
- Exon 1로 DNA 조각 1을 음성 합성.
- Intron 336와 금성 DNA 파편 사이 링커로 DNA 조각 2를 음성 합성.
- 잘라 두 번 pAAV-EF1a floxed-hChR2 (H134R)-mCherry-WPRE-MluI 및 EcoRI 효소 HGHpA 벡터 플라스 미드. 젤 추출 키트를 사용 하 여 더 큰 DNA 파편을 정화. 제조 업체의 프로토콜을 사용 합니다.
- Using 깁슨 어셈블리 혼합 및 그것의 표준 프로토콜, 모두 함께-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA pAAV-P (Cry1) 기자를 생산 하는 DNA 파편의 조립. 제조 업체의 프로토콜을 사용 합니다.
2. 생산 Adeno 관련 바이러스15
- 준비 다음 플라스 미드 DNA 주식: 31.25 µ g의 pRV1, pH21의 31.25 µ g, pFdelta6의 125 µ g 및 62.5 µ g (Cry1)-intron336-pAAV-P의 금성-NLS-d 2-WPRE-HGHpA.
- 293T 세포의 5 15 cm 요리를 준비 하 고는 세포가 90% 합칠 때까지 기다립니다.
- Transfection 시 프로토콜을 따르고 297T 셀에는 플라스 미드를 transfect. 각 요리에 대 한 사용 하 여 pRV1의 6.25 µ g, pH21, pFdelta6의 25 µ g, pAAV-P (Cry1)의 12.5 µ g의 6.25 µ g-transfection 시 약의 intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA, 그리고 120 µ L.
- transfection, 후 72 h 피 펫 총;를 사용 하 여 각 접시에서 셀 분리 2 50 mL 튜브에 세포를 수확.
- 10 분 동안 800 x g에서 셀 작은 고는 상쾌한 삭제. 각 관;에 20 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 배치 하 여 세포를 씻어 10 분, 800 x g에서 셀 펠 렛 하 고는 상쾌한 삭제.
- 150 mM NaCl에 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0; 펠 릿 resuspend 솔루션/튜브의 25 mL를 사용 합니다. 각 튜브를 갓된 10% 나트륨 deoxycholate (dH2O)에서 1.25 mL를 추가 합니다. Benzonase nuclease mL 당 50 단위의 최종 농도에 추가 하 고 철저 하 게 혼합. 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
- 15 분 동안 3000 x g에서 centrifuging 세포질 파편을 제거 합니다. 0.45 μ m 주사기 필터;를 통해 혼합물을 추진 하 여 모든 파편 제거 되었습니다 확인 이 단계는 덤플링 열 차단 방지 하는 데 도움이 됩니다.
- 연동 펌프;를 사용 하 여 헤 파 린 열 설정 1 mL/min, 아무 공기 방울 열에 소개 된다 보장에 흐름 속도 설정 합니다.
- 150 mM NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 10 mL와 함께 열 equilibrate 각 열에 바이러스를 포함 하는 솔루션을 추가 합니다. 100 mM NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 20 mL의 열을 씻어. 그런 다음 5 mL 주사기를 사용 하 여 300 mM NaCl의 1 mL와 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0 200 m m NaCl의 1 mL와 20 mM Tris 솔루션 pH 8.0, 열 세척.
- Elute 400 m m NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 3 mL와 함께 바이러스 4 mL 450 m m NaCl, 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0의 뒤에 5 mL 주사기를 사용 하 여 마지막으로 500 m m NaCl의 3 mL로 20 mM Tris 솔루션, pH 8.0. 추출 된 자료를 수집 합니다.
- 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) 농도 대 한 100000 분자량 컷오프와 원심 필터 단위를 추출 된 자료를 한 번에 4 mL를 로드 합니다. 실내 온도에, 흐름을 통해 삭제 5 분 x g 2000에서 각각 4 mL 샘플 원심
- 모든 추출된 물질을 원심 필터 단위를 통해 실행 하는 경우 PBS의 4 mL를 추가 하 고 약 250 μ로 혼합물을 원심. RAAVs 제거 (바이러스 titer에 관하여 이어야 한다 2-8x mL 당 1012 바이러스 성 입자) 원심 필터 단위, 약 수와 사용까지-80 ° C에서 저장소에서. 이 단계에서 바이러스는 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.
3. rAAV 주입 및 성인 마우스 SCN에 광학 섬유 삽입
- Circadian 형광 기자 들고 rAAVs는 SCN에 주입
- RAAV의 5 µ L 로드 (바이러스 titer에 대 한은 mL 당 1012 바이러스 입자 x 2-8) 마이크로 주사기로.
- Nembutal (80 mg/kg)을 복 주입을 통해 성인 마우스 (2에 5-달-오래 된, C57BL/6 배경)를 anesthetize. 발가락-핀치 응답의 부족에 의해 마 취의 충분 한 깊이를 확인 합니다.
- 가 위를 사용 하 여 마우스의 머리에서 모피를 제거 한 다음 stereotaxic 장치에 마우스를 탑재. 순환 온수 담요 또는 다른 난방 장치를 통해 마 취 동물에 열 소스를 제공 합니다.
참고: 또는, 모피를 제거 하려면 depilatory 크림 또는 전기 머리 깍을 사용 합니다. - 적절 한 소독 작용 외과 사이트를 청소. 예를 들어 포함 살 균 물 또는 알코올 및 요오드 화물, betadine, 또는 스크럽을 번갈아에 액체를 희석 수이. 3 번 이상 반복 합니다. 수술 사이트 드러 워 진.
- 가 위를 사용 하 여 두 피에 절 개 하 고 두개골을 노출 시킵니다.
- 있도록 bregma 및 람다; 동일한 가로 평면에서 stereotaxic 장치 조정 동일한 가로 평면에서 bregma의 두 개의 대칭 포인트를 확인 합니다.
- 멸 균 면봉을 사용 하 여 H2O2/H2O 뇌과 부식에 4%에 배어. 다음 깨끗 한 멸 균 면봉을 사용 하 여 명확 하 고 두개골의 표면 건조.
- 마이크로 드릴을 사용 하 여, 게 구멍 약 1 m m 0.46 m m 후부와 0.25 m m 직경에서 측면 bregma.
- fi 생리 염 분 해결책으로 깨끗 한 멸 균 면봉을 사용 하 여 두뇌의 노출 된 표면에서 뼈 파편을 취소.
- 마이크로 주사기의 팁 후부 0.46 m m 되도록 두뇌 및 두개골의 표면에서 bregma, 및 깊은 5.7 m m 0.25 m m 옆에 마이크로 주사기를 삽입 합니다.
- 500 주사 rAAV의 완전 한 보급을 보장 하기 위해 주사 후 10 분에 대 한 장소에서 마이크로 주사기를 떠나 SCN에 rAAV (50 nL 분-1)의 nL.
- 천천히 마이크로 주사기를 철회 한다.
- SCN 지역에 광섬유를 삽입 합니다.
- 광섬유 나이프를 사용 하 여, 섬유 17 m m 길이, 눈 섬유의 양쪽이 부드러운 컷.
- 광학 섬유 세라믹 깃 봉으로 삽입 하 고 광학 섬유와 세라믹 아무의 표면 플러시 되는지 확인 메 틸 에틸 케 톤 과산화물 (AB 접착제)와 세라믹 아무에 광케이블을 수정.
- 차가운 sterilant 솔루션 또는 에틸렌 산화물과 섬유를 청소.
- RAAV 주입 (3.1.11 단계), 후는 SCN에 세라믹 깃 봉 포함 된 광학 섬유를 삽입 합니다.
- 세라믹 아무와 광섬유 치과 수 지를 사용 하 여 두개골에 해결 하 고 건조를 허용.
- 다시 매니큐어와 치과 수 지의 표면 얼룩. 3.2.5 하 3.1.2, 제어를 위한 rAAV의 실제 주입 생략에 설명 된 절차를 반복 합니다.
- 수술 후 관리
- Buprenorphine 2 mg/kg 몸 무게, 같은 수술 후 진통제, 피하, 마우스 제공 하루에 두 번.
- 그들은 마 취에서와 서 하는 동안 복구에 마우스를 놓습니다.
- 음식/물 사용 가능한 광고 libitum와 12 h 명암 조건 (빛의 강도 감 금 소의 바닥에서 ~ 100 럭 스)에서 개별적으로 집 쥐. 8 일 더 충분 한 회복 시간을 허용 하 고 최적의 형광 기자 식 되도록 실험 하기 전에 할당 해야 합니다.
4. vivo에서 형광 신호 모니터링 및 데이터 수집
- 수술 후 8 일 형광 신호 모니터와 마우스 머리에 섬유를 연결 (예., 유전자 관찰자). 배경 신호를 설정 하려면 컨트롤 마우스의 SCN에 형광 신호를 확인 하십시오. 관찰 및 형광 신호 모니터를 사용 하 여이 신호 측정을 수행 합니다.
- 컨트롤 마우스의 동일한 작업과 실험 마우스의 형광 신호를 평가 합니다. 이 가능성이 광 섬유의 끝은 SCN을 놓친 있다 나타냅니다 마우스는 바이러스 성 벡터 받았지만 분석, 배경 신호 표시를 제외 합니다. 이러한 초기 조치 후 자신의 집 새 형광 신호를 안정 시킬 수 있도록 또 다른 3 주 동안에 쥐를 반환 합니다.
- 3 주 후 형광 신호 모니터와 마우스를 연결 합니다. 15 형광 측정 s 100 Hz의 주파수에서 매 10 분. 이러한 측정 동안 쥐 음식/물 사용 가능한 광고 libitum와 그들의 감 금 소에 자유롭게 움직이는 있습니다. ~ 100 럭 스의 감 금 소의 바닥에는 빛의 강도 사용 하 여 그리고 15-20 µW 사이 광 섬유의 끝에 레이저 전원.
- 모든 녹음 완료 후 4 %paraformaldehyde 마우스를 perfuse 및 제거 하 고 슬라이스는 광케이블의 위치를 확인 하는 머리. 광섬유 팁은 SCN에 제대로 이식 되지 경우에 분석에서 마우스를 제외 합니다.
5. 데이터 분석 및 프레 젠 테이 션
- 측정 형광 신호 15 매 10 분 1500 데이터 포인트를 100 Hz의 주파수에서 s. 이 1500 점의 평균 주어진된 시간에서 형광 신호를 변환합니다. 시간이 지남에 따라 여러 평균 플로팅 transcriptional의 리듬에 맞춰 Cry1 자유롭게 마우스를 이동는 SCN에 제어 조명 조건 하에서 해당 신호-시간 곡선을 생성 합니다.
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Representative Results
Cry1 의 형광 기자 디자인 그림 1A에 게재 했다. 500 이상 상세한 접근을 사용 하 여 (Cry1)-intron336-rAAV-P의 nL 금성-NLS-d 2는 성인 마우스의 SCN에 성공적으로 주입 했다 그리고 강력한 금성 식 (그림 1B, 1c) 전시. 12 h/12 h 명암 (LD)와 어둠/어두운 (DD) 조건 (그림 2)에서 기록 하는 형광 신호 두 조건에서 강력한 circadian 리듬 나왔고. 마지막으로, 형광 신호는 길고 짧은 photoperiod 조건 (그림 3)에 기록 되었다.
그림 1입니다. 형광 기자 디자인 및 그것는 SCN에 식
(A) Cry1의 형광 기자 디자인. 보여주는 기자 식 바이러스 주입 후 8 일 쥐의 뇌의 (B) Photomicrograph. (C) (B)에 표시 된 photomicrograph에 빨간색에서 박스 영역의 확대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 형광에서 vivo에서 LD와 DD 조건 하에서 SCN에 기록
(A) LD와 DD 조건 없음 감지 리듬을 보여주는 SCN에 형광 배경. 흰색과 회색 영역에 빛 및 빛-오프 기간, 각각 나타냅니다. (B) P (Cry1)-intron336-금성-NLS-12-12 LD 조건 및 DD 상태에서 7 한 일의 과정을 통해 d 2 식. LD 조건 (~24.4 h); circadian 리듬의 (C) 분석 빨간색 선은 수렴 (적응의 결과 왼쪽된 패널에 표시 됩니다) 사인 곡선에 맞는 것을 나타냅니다. DD 조건 (~23.25 h); circadian 리듬의 (D) 분석 빨간색 선은 수렴 (적응의 결과 왼쪽된 패널에 표시 됩니다) 사인 곡선에 맞는 것을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. Vivo에서 형광 녹음에서 SCN에 20-4 길고 짧은 photoperiod 조건 4-20
P (Cry1)-intron336-형광 녹음의 예 금성-NLS-12-12 LD 조건 7 일 SCN에 D2 식 뒤에 20-4 긴 photoperiod 조건, DD 조건, 12-12 LD 조건 3 한 한 일 고 4-20 짧은 photoperiod 조건 하에서 다음 7 일. 흰색과 회색 영역에 빛 및 빛-오프 기간 각각 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1입니다. 프로토콜에 필요한 특정 시 약 ( 재료의 표참조)
| 뇌관 이름 | 시퀀스 | ||
| 뇌관 F1 | cactaggggttcctgcggccgcACGCGTGTAAAGATGCACATGTG | ||
| 뇌관 R1 | TTGTAACCTTGATACTTACCTACTTAGATCGCAGATCTCGTCCGG | ||
| 뇌관 F2 | GTTATGACACAGTGTAGAAACTATGGCATAGGACAGATGACTGTG | ||
| 뇌관 R2 | CATGGTCTTTGTAGTCCATGGTGGGTACCtCTTGACAGCTCTACC | ||
| 뇌관 F3 | ctgtattttcagggcCCTGCAGGtGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG | ||
| 뇌관 R3 | TACCTTTCTCTTCTTTTTTGGAGGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC | ||
| 뇌관 F4 | GCATGGACGAGCTGTACAAGCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAG | ||
| 뇌관 R4 | tgatatcgaattcGGATCCCTACACATTGATCCTAGCAGAAGCAC | ||
표 2입니다. 프로토콜에 사용 되는 뇌관
테이블 3입니다. 프로토콜에 사용 하는 DNA 순서 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Ex vivo 방법, 동물 살해는 요구, 슬라이스 문화4,5, RT-PCR16, 제자리 교 잡17, 등 달리는 vivo에서 메서드를 기록 수 있습니다. 살아있는 동물에 circadian 유전자 발현 연구 조사. 따라서,이 기술은 신경 circadian 시계에 다른 물리적 섭 (예를 들어, 수 면 부족, 스트레스, 음식 섭취, 등)의 효과 평가 하는 능력을 제공 한다. Vivo에서 생물 발광7,8,만 지속적인 어두운 조건에서 일할 수 있는10 방법 달리는 형광 vivo에서 녹음 방법 적용 될 수 있다 빛에서 빛으로 기술의 주요 장점은 조건 한 SCN circadian 시계18의 재 유입 신호. 비교적 일정, 강력한 circadian 리듬이이 방법으로 검출 될 수 있다, 비록 그것은 언급 되어야 기자 기술 정량적 인 정보를 제공 하지 않습니다 및 따라서 사용할 수 없는 유전자 전사의 수준을 측정 하 고 번역입니다.
이 프로토콜의 많은 중요 한 단계가 있습니다. 집중된 rAAV titer; mL 당 1012 바이러스 성 입자 x 2-8로 높은 해야 낮은 바이러스 titers dim 또는 심지어 탐지 형광 신호 줄 것 이다. Stereotaxic 장치에는 마우스의 머리를 고정, 두개골 바이러스 주입 및 광섬유 이식에 대 한 보안 정확한 위치 수평 인지 확인 합니다. 바이러스의 주입은 천천히 이루어져야 한다 (≤50 nL 분-1) 바이러스는 SCN에 남아 있도록. 세라믹 아무와 광섬유 안전 하 게 두개골에 고정 되어야 한다 그리고 치과 수 지에 문의 피부. 경우 세라믹 아무와 광섬유는 적절 하 게 고정 되어 있지 않으며, 그들은 점차적으로 마우스 머리에서 분리할 것입니다.
이 기술은 다른 유전자 기자를 포함 하도록 확장 될 수 있습니다 (예를 들어, Per2, Bmal1, c Fos, Pomc, 등) 발기인 및 해당 intron19변경 하 여. 두 반전된 lox 시퀀스 플래그-inton336-금성-NLS-D2 카세트 반전 Cre 마우스 선 기자를 결합 함으로써,이 기술은 특정 신경에 있는 활동을 기록 하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어 Vip-cre 마우스에이 접근을 결합 Cry1 polypeptide 표현 뉴런 vasoactive 창 자는 SCN에에서 transcriptional 리듬의 기록 하게된다. 이 메서드는 또한 두뇌에 Ca2 + circadian 리듬을 기록 하기 위해 Ca2 + 표시기로 GCaMP6 고용 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
우리는 기술 지원을 제공 하기 위한 자극 토론 및 Zhan 연구소에서 회원을 제공 하기 위한 장 연구소에서 회원을 감사 합니다. 이 연구는 NSFC, 중국의 M.O.S.T.에서 973 프로그램의 (E.E.Z. C.Z.)를 2012CB837700의 31500860 (C.Z.)를 부여 하 고 베이징 시 정부에서 자금에 의해 지원 되었다. E.E.Z.는 "채용 프로그램 글로벌 청소년 전문가" 중국 사람에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
References
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