Summary
Esta tecnologia baseada em fluorescência recém-desenvolvido permite a monitoração a longo prazo da transcrição de genes do relógio circadiano no núcleo supraquiasmático (SCN) de movimentando-se livremente os ratos em tempo real e em uma alta resolução temporal.
Abstract
Esta técnica combina fibra óptica mediada por gravações de fluorescência com a entrega precisa de repórteres de gene recombinante vírus adeno-associado à base. Este novo e fácil de usar na vivo fluorescência sistema de vigilância foi desenvolvido para gravar o ritmo transcricional do gene do relógio, Cry1, no núcleo supraquiasmático (SCN) de ratos movimentando-se livremente. Para fazer isso, um repórter de fluorescência de transcrição Cry1 foi projetado e empacotado em vírus Adeno-associado. Vírus purificado, concentrado foi injetado o SCN seguido pela inserção de uma fibra óptica, que fixou-se então para a superfície do cérebro do rato. Os animais foram voltou para suas casa gaiolas e permitidos um período de recuperação pós-operatória de 1 mês para assegurar suficiente expressão de repórter. Fluorescência foi então gravada em movimentando-se livremente os ratos através de um na vivo monitoramento sistema que foi construído em nossa instituição. Para o na vivo sistema de gravação, um laser de 488 nm foi acoplado com um 1 × 4-divisor de feixe que divide a luz em quatro saídas de excitação do laser do poder igual. Esta configuração permitiu gravar a partir de quatro animais simultaneamente. Cada um dos sinais de fluorescência emitida foi coletado através de um tubo fotomultiplicador e uma placa de aquisição de dados. Em contraste à anterior bioluminescência na vivo gravação relógio circadiano técnica, esta fluorescência na vivo gravação sistema permitiu a gravação de expressão de gene relógio circadiano durante o ciclo de luz.
Introduction
Nos mamíferos, o núcleo supraquiasmático (SCN) rege o ritmo circadiano do todo o corpo para coordenar a resposta do indivíduo a mudanças ambientais exógenos (por exemplo, luz, temperatura, estresse, etc.)1. Componentes principais do relógio consistem de Per1-3, Cry1-2, relógioe Bmal1e desempenham um papel central na regulação do relógio circadiano de cada célula. O SCN cada célula contém o ativador transcricional, relógio/BMAL1, que atua como um heterodímero para induzir a expressão do PER e chorar. O PER / complexo de chorar então inibe a função de relógio/BMAL1 para formar um laço de realimentação de transcrição-tradução que leva cerca de 24 h para completo2,3.
Estudos anteriores sobre o SCN principalmente têm empregado a ex vivo SCN fatia cultura método4,5,6 , e, enquanto esta abordagem forneceu informações valiosas, suas limitações têm inibido a nossa capacidade de obter dados sobre a influência de outros núcleos do cérebro sobre o SCN, bem como o efeito de estímulos exógenos (por exemplo, luz) em células que residem nesta região crítica. Em 2001, o grupo de Hitoshi Okamura foi o primeiro a usar o sistema de bioluminescência da expressão gênica em vivo monitor relógio circadiano no SCN em ratos7movimentando-se livremente. Grupo do Ken-ichi Honma passou os últimos anos desenvolver a bioluminescência na vivo sistema de gravação no SCN8,9,10. Juntos, esses estudos forneceram os pesquisadores com a capacidade de monitorar o relógio circadiano na escuridão constante ou após um pulso de luz. No entanto, como bioluminescência é muito fraca para permitir a monitorização contínua durante o ciclo luz/escuridão, juntamente com o fato de que a luz é o sinal predominante necessário para o arrastamento de SCN-mediada de pulsos de disparo circadian11, há crescente demanda para o desenvolvimento de métodos experimentais que superar as limitações associadas com gravação de bioluminescência. O presente relatório descreve um sistema baseado em fluorescência, que foi construído para monitorar o relógio circadiano do SCN na vivo em ratos movimentando-se livremente. Este método fácil de usar permite a monitorização contínua durante o ciclo claro/escuro e permite a observação a longo prazo da transcrição de genes do relógio circadiano no SCN em tempo real e em alta resolução temporal.
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Protocol
Todos os procedimentos neste protocolo foram realizados com a aprovação do cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) do Instituto Nacional de ciências biológicas, Beijing, em conformidade com os regulamentos governamentais da China.
1. construção do repórter fluorescência Cry1
Nota: Estudos anteriores circadianos, usando o sistema de bioluminescência2,12,13 fusível um promotor circadiano com um desestabilizado luciferase (dLuc) para induzir a expressão rítmica dLuc . Para desenvolver um repórter de fluorescência, desestabilizado luciferase foi substituído com proteína de fluorescência desestabilizado (dVenus) para induzir a expressão rítmica dVenus . A geração do p (Cry1)-dVenus repórter é descrita a seguir, o conceito de que atualmente está sendo enviado para Addgene e estará disponível em breve para uso acadêmico.
- Amplifica o promotor de Cry1 funcional do rato (+328 a região de-1208 bp do gene Cry1 , local de início de transcrição designada como '-1 '). Usar a enzima PCR (KOD Plus Neo), as primeiras demão F1 e R1 (ver quadro 2), rato do genoma como um modelo e PCR do fabricante do protocolo para amplificar o fragmento de DNA de promotor Cry1 .
- Amplifica intrão 336 do gene Cry1 , que é importante para a função de relógio circadiano do Cry114. Use a enzima PCR, cartilhas de F2 e R2, genoma do rato como um modelo e protocolo PCR do fabricante para amplificar o fragmento de DNA intrão 336.
- Amplifica a Vênus. Use a enzima PCR, primeiras demão F3 e R3, pVENUS-N1 plasmídeo como um modelo e protocolo PCR do fabricante para amplificar o fragmento de DNA de Venus .
- Amplifica o fragmento de DNA de NLS-D2. Use a enzima PCR, primeiras demão F4 e R4, pcDNA3.3-d2eGFP do plasmídeo como um modelo e protocolo PCR do fabricante para amplificar o fragmento de DNA de NLS-D2.
- Sintetiza o fragmento de DNA 1 como exon 1.
- Sintetiza o fragmento de DNA 2 como o vinculador entre intrão 336 e o fragmento de DNA de Venus .
- Cortar o duplo pAAV-EF1a floxed-hChR2 (H134R) - mCherry - WPRE-plasmídeo vetor de HGHpA com as enzimas MluI e EcoRI. Use o Kit de extração do Gel para purificar o maior fragmento de DNA. Use o protocolo do fabricante.
- Usando uma mistura de montagem Gibson e seu protocolo padrão, reúna todos os fragmentos de DNA para produzir o repórter-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA pAAV-P (Cry1). Use o protocolo do fabricante.
2. produção de vírus Adeno-associado15
- Preparar o plasmídeo seguinte estoques de DNA: 31,25 µ g de pRV1, 31,25 µ g de pH21, 125 µ g de pFdelta6 e 62,5 µ g do pAAV-P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS - D2-WPRE-HGHpA.
- Prepare cinco pratos de 15 cm de 293T células e esperar até que as células se tornam confluente de 90%.
- Transfect os plasmídeos dentro das células 297T seguindo o protocolo de reagente de transfeccao. Para cada prato, use 6,25 µ g de pRV1, 6,25 µ g de pH21, 25 µ g de pFdelta6, 12,5 µ g do pAAV-P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA e 120 µ l de reagente de transfeccao.
- 72 h após a transfeccao, separar as células de cada prato usando uma arma de pipeta; Colha as células em dois tubos de 50 mL.
- As células a 800 x g por 10 min de pelotas e descartar o sobrenadante. Lavar as células, colocando-se 20 mL de tampão fosfato salino (PBS) para cada tubo; as células a 800 x g por 10 min de pelotas e descartar o sobrenadante.
- Resuspenda pelotas em 150 mM NaCl e 20 mM Tris solução, pH 8.0; Use 25 mL de solução/tubo. Adicione 1,25 mL de acabadas Deoxycholate do sódio de 10% (em dH2O) para cada tubo. Adicione benzonase nuclease para uma concentração final de 50 unidades / mL e misture bem. Incube a 37 ° C, durante 1 h.
- Remova restos celulares por centrifugação a 3000 x g, durante 15 min. Assegurar que todos os detritos foi removido, empurrando a mistura através de um filtro de seringa de 0,45 μm; Esta etapa irá ajudar a evitar o bloqueio das colunas de heparina.
- Configurar as colunas de heparina usando uma bomba peristáltica; Defina a taxa de fluxo de 1 mL/min, garantindo que não há bolhas de ar são introduzidas as colunas.
- Equilibrar as colunas com 10 mL, uma de 150 mM de NaCl, solução de Tris, pH 8.0 de 20 mM. Adicione a solução contendo o vírus para cada coluna. Lave as colunas com 20 mL de uma 100 mM NaCl, solução de Tris, pH 8.0 de 20 mM. Em seguida, usando uma seringa de 5 mL, lave as colunas com 1 mL de 200 mM NaCl e o 20 mM Tris solução pH 8.0, seguidas por 1 mL de 300 mM NaCl e solução de Tris de 20 mM, pH 8.0.
- Use uma seringa de 5 mL para Eluir o vírus com 3 mL de 400 mM NaCl, solução de Tris de 20 mM, pH 8.0, seguido de 4 mL de 450 mM NaCl, solução de Tris de 20 mM, pH 8.0 e finalmente por um 3 mL de um 500 mM NaCl , solução de Tris de 20 mM, pH 8.0. Colete os materiais extraídos.
- Para a concentração de vírus adeno-associado recombinante (rAAV), carrega os materiais extraídos, 4 mL de cada vez, em unidades de filtro centrífugo com um peso molecular 100.000 corte. Cada amostra de 4 mL a 2000 x g por 5 min à temperatura ambiente, descartando o fluxo através do centrifugador.
- Quando todos os materiais extraídos foram executados através das unidades de filtro centrífugo, adicione 4 mL de PBS e centrifugar a mistura em aproximadamente 250 μL. Remover rAAVs (título viral deve ser aproximadamente 2-8 x 1012 partículas virais por mililitro) de unidades de filtro centrífugo, alíquota e loja a-80 ° C até o uso. Nesta fase, o vírus pode ser armazenado por vários meses.
3. rAAV injeção e inserção de fibra óptica para o SCN de rato adulto
- Injeção de fluorescência circadian repórter de transporte rAAVs para o SCN
- Carregar 5 µ l de rAAV (o título do vírus é sobre 2-8 x 1012 partículas de vírus por mL) em uma microseringa.
- Anestesia um rato adulto (2 a 5-meses, C57BL/6 de fundo) com Nembutal (80 mg/kg) através da injeção intraperitoneal. Verifique se há suficiente profundidade da anestesia a falta de uma resposta de dedo-pinch.
- Use a tesoura para remover a pele da cabeça do rato e em seguida, montar o mouse em um aparelho estereotáxica. Fornece uma fonte de calor para animais anestesiados via um cobertor de água quente circulante ou outro dispositivo de aquecimento.
Nota: Como alternativa, use máquina de cortar cabelo elétrica ou creme depilatório para remover as peles. - Limpe o local cirúrgico com os agentes de desinfecção apropriados. Por exemplo, isso poderia incluir água estéril ou álcool e iodo, betadine, ou diluir clorexidina alternando esfrega. Repita pelo menos 3 vezes. Cubra o local cirúrgico.
- Use a tesoura para fazer uma incisão no couro cabeludo e expor o crânio.
- Ajustar o aparelho estereotáxica para que bregma e o lambda são no mesmo plano horizontal; Faça dois pontos simétricos de bregma no mesmo plano horizontal.
- Uso um cotonete estéril embebido em 4% H2O2/h2O para corroer o periósteo do cérebro. Em seguida, use um cotonete de algodão limpas e esterilizadas para limpar e secar a superfície do crânio.
- Usando uma broca de micro, fazer um buraco de cerca de 1 mm em diâmetro posterior 0,46 mm e 0,25 mm lateral para bregma.
- Fi Use um limpo com cotonete estéril com soro fisiológico para limpar fragmentos ósseos da superfície exposta do cérebro.
- Insira uma microseringa no cérebro, garantindo que a ponta da microseringa é 0,46 mm posterior e lateral de 0,25 mm de bregma e 5,7 mm de profundidade da superfície do crânio.
- Injetar 500 nL de rAAV (50 nL min-1) para o SCN, deixando a microseringa no lugar por 10 minutos após a injeção para assegurar a divulgação completa de rAAV.
- Retire lentamente a microseringa.
- Insira a fibra óptica para a área SCN.
- Usando uma faca de fibra óptica, cortar uma fibra 17 mm de comprimento, certificando-se que cada lado da fibra óptica é suave.
- Insira a fibra óptica a virola cerâmica e corrigir a fibra óptica para uma virola cerâmica com peróxido de metil etil cetona (colagem de AB), garantindo que as superfícies da fibra óptica e virola cerâmica estão alinhadas.
- Limpe a fibra com um óxido de etileno ou solução esterilizante frio.
- Após a injeção de rAAV (etapa 3.1.11), insira a fibra óptica cerâmica virola-contendo o SCN.
- Corrigir a virola cerâmica e fibra óptica para o crânio usando resina dentária e deixe para secar.
- Manche a superfície da resina dental com costas unha polonês. Repita os procedimentos descritos na 3.1.2 para 3.2.5, omitindo a injeção real de rAAV para controle.
- Cuidados pós-cirúrgicos
- Fornecer os ratos com analgésicos no pós-operatório, tais como a buprenorfina 2 mg/kg de peso corporal, por via subcutânea, duas vezes por dia.
- Coloque os ratos em uma gaiola de recuperação enquanto eles vêm da anestesia.
- Ratos de casa individualmente sob uma condição de claro/escuro de 12 h (intensidade da luz ~ 100 lux no fundo da gaiola) com comida/água disponível ad libitum. Antes de mais experimentação para permitir tempo de recuperação suficiente e para garantir a expressão de repórter de fluorescência ideal deve ser atribuídos a oito dias.
4. in vivo da fluorescência sinal monitoramento e coleta de dados
- Oito dias após a cirurgia, conectar-se a fibra na cabeça do rato com o monitor de sinal de fluorescência (EG., Gene Observer). Verificar o sinal de fluorescência no SCN de ratos controle para estabelecer o sinal de fundo. Realize a observação e medição deste sinal usando o monitor do sinal de fluorescência.
- Avalie o sinal de fluorescência do mouse experimental com a mesma operação do mouse controle. Exclua os ratos que receberam o vetor viral, mas que apenas exibir o sinal de fundo de análise, já que provavelmente indica que a ponta da fibra óptica perdeu o SCN. Após estas medidas iniciais, retorne os ratos de suas gaiolas para casa daqui a 3 semanas permitir que o sinal de fluorescência estabilizar.
- Após 3 semanas, conecte os ratos com o monitor de sinal de fluorescência. Medir a fluorescência por 15 s cada 10 min, com uma frequência de 100 Hz. Durante as medições, os ratos circulam livremente em suas gaiolas com comida/água disponível ad libitum. Use uma intensidade de luz na parte inferior da gaiola de ~ 100 lux e um a potência do laser na ponta da fibra óptica entre 15-20 µW.
- Após a conclusão de todas as gravações, perfundir ratos com paraformaldeído 4% e remover e cortar o cérebro para verificar a colocação da fibra óptica. Exclui os ratos análise se a ponta de fibra óptica não é corretamente implantada no SCN.
5. apresentação e análise de dados
- Sinal de fluorescência medida cada 10min para 15 s, com uma frequência de 100 Hz, para produzir 1500 pontos de dados. A média desses pontos 1500 traduz para o sinal de fluorescência em qualquer ponto do tempo determinado. Plotagem de várias médias ao longo do tempo produz uma curva de sinal-para-tempo que corresponde ao ritmo transcriptional do Cry1 sob uma condição de controle de luz no SCN de ratos movimentando-se livremente.
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Representative Results
Projeto de repórter de fluorescência do Cry1 foi mostrar na figura 1A. Usando a abordagem detalhados acima, 500 nL de rAAV-P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 com êxito foi injetado o SCN de um rato adulto e exibiu expressão de Venus robusto (figura 1B, 1C). Sinais de fluorescência gravados em condições de escuro/escuro (DD) (Figura 2) e 12h/12h claro/escuro (LD) renderam robusto ritmo circadiano em ambas as condições. Finalmente, o sinal de fluorescência foi gravado em condições de fotoperíodo curto e longo (Figura 3).
Figura 1. Fluorescência repórter o projeto e expressão no SCN
(A) o projeto de repórter de fluorescência do Cry1. (B) Fotomicrografia do cérebro do rato mostrando a expressão repórter 8 dias após a injeção do vírus. (C) a ampliação da área de box em vermelho sobre o Fotomicrografia mostrado em (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Fluorescência na vivo de gravação no SCN condições LD e DD
(A) fundo de fluorescência no SCN mostrando sem ritmo detectável em condições tanto LD e DD. As áreas brancas e cinzentas indicam luz-em períodos e de luz, respectivamente. (B) P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 expressão ao longo de 7 dias em uma condição de LD de 12-12 e 7 dias em uma condição DD. (C) análise do ritmo circadiano na condição de LD (~24.4 h); a linha vermelha indica o convergentes cabem na curva de seno (o resultado do ajuste será mostrado no painel a esquerda). (D) análise de ritmo circadiano na condição de DD (~23.25 h); a linha vermelha indica o convergentes cabem na curva de seno (o resultado do ajuste será mostrado no painel a esquerda). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Na vivo gravações de fluorescência no SCN sob 20-4 long e condições de fotoperíodo curto de 4-20
Exemplo de uma gravação de fluorescência de P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 expressão no SCN por 7 dias sob uma condição de LD de 12-12, seguido por 7 dias sob uma condição de longo fotoperíodo de 20-4, 3 dias sob uma condição DD, 3 dias sob uma condição de LD de 12-12, e Depois de 7 dias sob uma condição de fotoperíodo curto de 4-20. Áreas brancas e cinzentas indicam os luz-em períodos e de luz, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. Reagentes específicos necessários para o protocolo (ver Tabela de materiais)
| nome da primeira demão | sequência de | ||
| primeira demão F1 | cactaggggttcctgcggccgcACGCGTGTAAAGATGCACATGTG | ||
| primeira demão R1 | TTGTAACCTTGATACTTACCTACTTAGATCGCAGATCTCGTCCGG | ||
| primeira demão F2 | GTTATGACACAGTGTAGAAACTATGGCATAGGACAGATGACTGTG | ||
| primeira demão R2 | CATGGTCTTTGTAGTCCATGGTGGGTACCtCTTGACAGCTCTACC | ||
| primeira demão F3 | ctgtattttcagggcCCTGCAGGtGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG | ||
| primeira demão R3 | TACCTTTCTCTTCTTTTTTGGAGGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC | ||
| primeira demão F4 | GCATGGACGAGCTGTACAAGCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAG | ||
| primeira demão R4 | tgatatcgaattcGGATCCCTACACATTGATCCTAGCAGAAGCAC | ||
Tabela 2. Primeira demão usado no protocolo
Tabela 3. Sequência de DNA usada no protocolo clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Em contraste com o ex vivo métodos, tais como a fatia cultura4,5, RT-PCR16e em situ da hibridação17, que exigem que os animais mortos, o na vivo método de gravação permite investigadores para estudar a expressão gênica circadiano em um animal vivo. Como tal, esta tecnologia fornece a capacidade de avaliar o efeito de perturbações físicas diferentes (por exemplo, privação de sono, estresse, ingestão de alimentos, etc.) sobre o relógio circadiano neural. Em contraste com na vivo bioluminescência7,8,10 método que pode funcionar apenas em circunstâncias escuras constantes, a fluorescência na vivo de gravação método pode ser aplicado sob a luz condições-a principal vantagem da tecnologia como luz sinaliza re-arrastamento do SCN relógio circadiano18. Embora relativamente constante, robusto ritmo circadiano pode ser detectado com este método, deve-se mencionar que a tecnologia do repórter não fornece informações quantitativas e, portanto, não pode ser usada para medir os níveis de transcrição do gene e Tradução.
Há muitas etapas críticas do presente protocolo. O título de rAAV concentrado deve ser tão alto quanto 2-8 x 1012 partículas virais por mililitro; baixa concentração viral daria sinais de fluorescência ofuscante ou mesmo indetectável. Ao fixar a cabeça do mouse dentro do aparelho estereotáxica, certifique-se de que o crânio é horizontal para posicionamento exato seguro para implantação de injeção e de fibra óptica de vírus. Injeção do vírus deve ser feita lentamente (≤50 nL min-1) para garantir que o vírus permanece no SCN. A virola cerâmica e fibra óptica devem ser firmemente fixados no crânio e resina dentária não deve entrar em contato com a pele. Se a virola cerâmica e fibra óptica não são adequadamente reparados, eles gradualmente desanexar da cabeça do rato.
Esta técnica pode ser ampliada para incluir outros repórteres do gene (por exemplo, Per2, Bmal1, c-Fos, Pomc, etc.), alterando o promotor e o correspondente intrão19. Invertendo a fita bandeira-inton336-Venus-NLS-D2 com duas sequências de salmão invertida e combinando o repórter com uma linha de rato Cre, esta tecnologia pode ser usada para gravar a atividade nos neurônios específicos. Por exemplo, combinar esta abordagem com uma linha de rato Vip-cre permitiria para a gravação do Cry1 transcriptional ritmos nos vasoativas intestinais polypeptide-expressando neurônios o SCN. Esse método também pode empregar GCaMP6 como um indicador de Ca2 + para gravar o Ca2 + o ritmo circadiano no cérebro.
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Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a membros do laboratório de Zhang para fornecer estimular discussões e membros do laboratório de Zhan para prestação de assistência técnica. Esta pesquisa foi apoiada por subsídios 31500860 (para C.Z.) do NSFC, 2012CB837700 (para E.E.Z. e C.Z.) do programa 973 do M.O.S.T. da China e pelo financiamento do Governo Municipal de Pequim. E.E.Z. foi apoiado pelos chineses "Programa de recrutamento de peritos de juventude Global".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
References
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