Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

In Vivo Övervakning av dygnsrytm klocka genuttryck i mus suprachiasmatiska kärnan med hjälp av fluorescens reportrar

Published: July 4, 2018 doi: 10.3791/56765

Summary

Denna nyutvecklade fluorescens-baserad teknik möjliggör långsiktig övervakning av transkriptionen av dygnsrytm klocka gener i suprachiasmatiska kärnan (SCN) av fritt rörliga möss i realtid och med hög temporal upplösning.

Abstract

Denna teknik kombinerar optisk fiber medierad fluorescens inspelningar med exakt leverans av rekombinant adeno-associerade virus baserat gen reportrar. Detta nya och lätt att använda i vivo fluorescens övervakning system har utvecklats för att registrera transkriptionell rytmen av genen klocka, Cry1, i suprachiasmatiska kärnan (SCN) i fritt rörliga möss. Att göra så, Cry1 transkription fluorescens reporter var konstruerade och förpackade i Adeno-associerade virus. Renat, koncentrerad virus injicerades i musen SCN följt av införandet av en optisk fiber, som var då fast på ytan av hjärnan. Djuren var återvände till sina hem burar och får en 1 månad postoperativ återhämtningsperiod att säkerställa tillräcklig reporter uttryck. Fluorescens spelades sedan in fritt rörliga möss via en in-vivo övervakningssystem som konstruerades på vår institution. För in-vivo inspelning system, var en 488 nm laser förenat med en 1 × 4-stråldelare som uppdelat ljuset i fyra laser excitation utgångar lika makt. Denna inställning kunde vi spela in från fyra djur samtidigt. Var och en av utsläppta fluorescens signaler samlades in via ett fotomultiplikatorn röret och ett datakort för förvärvet. I kontrast till den tidigare Mareld i vivo dygnsrytm klocka inspelningsteknik tillåtna denna fluorescens i vivo inspelning system inspelningen av dygnsrytm klocka genuttryck under lätta cykeln.

Introduction

Hos däggdjur reglerar suprachiasmatiska kärnan (SCN) hela kroppens dygnsrytm för att samordna individens svar på exogena miljöförändringar (t.ex., ljus, temperatur, stress, etc.)1. Klockan kärnkomponenter består av Per1-3, Cry1-2, klockaoch Bmal1, och spelar en central roll i regleringen av dygnsrytm klocka i varje cell. Varje cell i SCN innehåller transkriptionell aktivator, klocka/BMAL1, som fungerar som en heterodimer inducera uttrycket av PER och gråta. PER / CRY komplex sedan hämmar funktionen av klocka/BMAL1 att bilda en transkription-översättning feedbackloop som tar ca 24 h till komplett2,3.

Tidigare studier på SCN har huvudsakligen sysselsatt ex vivo SCN slice kultur metod4,5,6 och, medan detta synsätt har gett värdefull information, dess begränsningar har hämmade vår förmåga att Hämta data om påverkan av andra hjärnan kärnor på SCN, liksom effekten av yttre stimuli (t.ex., ljus) på celler som är bosatta i denna viktiga region. 2001 var Hitoshi Okamuras grupp först med att använda systemets Mareld att i vivo genuttryck monitor dygnsrytm klockan i SCN i fritt rörliga möss7. Ken-ichi Honmas grupp har tillbringat de senaste åren ytterligare utveckla den Mareld i vivo inspelning system i SCN8,9,10. Tillsammans har dessa studier försett forskare med förmåga att övervaka dygnsrytm klockan i konstant mörker eller efter en ljuspuls. Men eftersom Mareld är för svagt för att möjliggöra kontinuerlig övervakning under cykel ljus/mörk tillsammans med det faktum att ljus är den dominerande signal som krävs för den SCN-medierad övningsprovet dygnsrytm klockor11, finns ökande efterfrågan på utveckling av experimentella metoder som övervinna de begränsningar som är associerade med Mareld inspelning. Den aktuella rapporten beskriver ett fluorescens-baserat system som konstruerades för att övervaka dygnsrytm klockan i SCN i vivo i fritt rörliga möss. Den här lätt-till-använda metoden tillåter kontinuerlig övervakning under ljus/mörk cykeln och möjliggör långsiktiga observationen av transkriptionen av dygnsrytm klocka gener i SCN i realtid och med hög temporal upplösning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden i detta protokoll genomfördes med godkännande av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av nationella institutet för biologiska vetenskaper, Peking, enligt statliga bestämmelser av Kina.

1. konstruktion av Cry1 fluorescens Reporter

Obs: Tidigare dygnsrytm studier använda Mareld system2,12,13 säkring en dygnsrytm arrangören med en destabilisering luciferas (dLuc) att inducera rytmiska dLuc uttryck. För att utveckla fluorescens reporter, ersattes destabiliserat luciferas med destabiliserat fluorescens-protein (dVenus) för att inducera rytmiska dVenus uttryck. Generering av P (Cry1)-dVenus reporter är beskrivs nedan, konstruktionen som läggs för närvarande till Addgene och kommer att vara tillgänglig snart för akademisk användning.

  1. Förstärka funktionell mus Cry1 arrangören (+328 till-1208 bp regionen av Cry1 genen, transkription startwebbplats betecknas som '' -1 ''). Använda enzymet PCR (KOD Plus Neo), primers F1 och R1 (se tabell 2), mus genomet som en mall och tillverkarens PCR-protokoll för att förstärka det Cry1 arrangören DNA-fragmentet.
  2. Förstärka intron 336 av Cry1 genen, vilket är viktigt för klockfunktionen dygnsrytm Cry114. Använda enzymet PCR, primers F2 och R2, mus genomet som en mall och tillverkarens PCR-protokoll att förstärka det intron 336 DNA-fragmentet.
  3. Förstärka Venus. Använda enzymet PCR, primers F3 och R3, pVENUS-N1 plasmiden som en mall och tillverkarens PCR-protokoll att förstärka de Venus DNA-fragmentet.
  4. Förstärka det NLS-D2 DNA-fragmentet. Använda enzymet PCR, primers F4 och R4, pcDNA3.3-d2eGFP plasmid som en mall och tillverkarens PCR-protokoll att förstärka det NLS-D2 DNA-fragmentet.
  5. Syntetisera DNA-fragment 1 som exon 1.
  6. Syntetisera DNA-fragment 2 som länkaren mellan intron 336 och de Venus DNA-fragmentet.
  7. Skär den pAAV-EF1a-dubbel floxed-hChR2 (H134R) - mCherry - WPRE-HGHpA vector plasmid med MluI och mina enzymer. Använd gelen utvinning Kit för att rena det större DNA-fragmentet. Använda tillverkarens protokollet.
  8. Använda en Gibson församlingen mix och dess standardprotokoll, montera alla DNA fragment tillsammans för att producera pAAV-P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA reporter. Använda tillverkarens protokollet.

2. produktion av Adeno-associerade Virus15

  1. Förbereda de följande plasmiden DNA bestånd: 31.25 µg pRV1, 31.25 µg av pH21, 125 µg av pFdelta6 och 62,5 µg av pAAV-P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS - D2-WPRE-HGHpA.
  2. Förbereda fem 15 cm rätter av 293T celler och vänta tills cellerna blir 90% konfluenta.
  3. Transfect plasmidsna in i de 297T cellerna efter protokollet transfection reagens. För varje maträtt, Använd 6,25 µg pRV1, 6,25 µg av pH21, 25 µg av pFdelta6, 12,5 µg av pAAV-P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA och 120 µL transfection reagens.
  4. 72 h efter transfection, lossa cellerna från varje platta med en pipett pistol; skörda cellerna i två 50 mL rör.
  5. Pellet cellerna vid 800 x g i 10 min och Kassera supernatanten. Tvätta cellerna genom att placera 20 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) i varje rör; pellet cellerna vid 800 x g i 10 min, och kasta bort supernatanten.
  6. Återsuspendera pellets i 150 mM NaCl och 20 mM Tris lösning, pH 8,0; Använd 25 mL lösning/tube. Tillsätt 1,25 mL nyberedd 10% natriumdeoxikolat (i dH2O) till varje rör. Lägg bensonas nuclease till en slutkoncentration av 50 enheter per mL och blanda. Inkubera vid 37 ° C i 1 h.
  7. Ta bort cellulära skräp genom centrifugering vid 3000 x g i 15 min. Ytterligare säkerställa att alla skräp har tagits bort genom att trycka blandningen genom ett 0,45 μm spruta filter; Detta steg kommer att förhindra blockering av heparin kolumner.
  8. Ställa in heparin kolumnerna använder en Peristaltisk pump; ställa in flödet till 1 mL/min, se till att inga luftbubblor införs i kolumnerna.
  9. Temperera kolonnerna med 10 mL av en 150 mM NaCl, 20 mM Tris lösning, pH 8,0. Lägg till lösningen innehållande viruset till varje kolumn. Tvätta kolonnerna med 20 mL av en 100 mM NaCl, 20 mM Tris lösning, pH 8,0. Sedan, med en 5 mL spruta, tvätta kolonnerna med 1 mL av en 200 mM NaCl och 20 mM Tris lösning pH 8,0, följt av 1 mL av en 300 mM NaCl och 20 mM Tris lösning, pH 8,0.
  10. Använd en 5 mL spruta för att eluera viruset med 3 mL av en 400 mM NaCl, 20 mM Tris lösning, pH 8,0, följt av 4 mL en 450 mm NaCl, 20 mM Tris lösning, pH 8,0, och slutligen en 3 ml av en 500 mM NaCl , 20 mM Tris lösning, pH 8,0. Samla de extraherade material.
  11. För rekombinant adeno-associerade virus (rAAV) koncentration, Fyll på de extraherade material, 4 mL i taget, i centrifugal filteraggregat med 100.000 molekylvikt cutoff. Centrifugera varje 4 mL prov vid 2000 x g i 5 min i rumstemperatur, kasta genomflöde.
  12. När alla extraherade material har körts genom de centrifugal filteraggregat, tillsätt 4 mL PBS och centrifugera blandningen till cirka 250 μL. Ta bort rAAVs (viral titer bör handla om 2-8 x 1012 viruspartiklar per mL) från centrifugal filteraggregat, delprov och förvaras vid-80 ° C fram till användning. I detta skede, kan viruset lagras i flera månader.

3. rAAV injektion och optisk Fiber införande i vuxen mus SCN

  1. Injektion av dygnsrytm fluorescens reporter-bära rAAVs i SCN
    1. Ladda 5 µL rAAV (virus titern är om 2-8 x 1012 viruspartiklar per mL) i en mikro-spruta.
    2. Söva en vuxen mus (2 till 5-månader gammal, C57BL/6 bakgrund) med Nembutal (80 mg/kg) via intraperitoneal injektion. Kontrollera om tillräckligt djup anestesi genom bristen på en tå-nypa svar.
    3. Använd sax för att ta bort päls från chefen för musen och montera sedan musen i en stereotaxic apparat. Ge en värmekälla till sövda djur via en cirkulerande varmvatten filt eller annan värmekälla.
      Obs: Alternativt använda hårborttagningsprodukter grädde eller elektriska hårklippningsmaskiner ta bort pälsen.
    4. Rengöra den kirurgiska platsen med lämplig desinficering agenter. Detta kan till exempel omfatta sterilt vatten eller alkohol och jod, betadine eller späd klorhexidin i omväxlande scrubs. Upprepa minst 3 gånger. Drapera operationsområdet.
    5. Använda saxen gör ett snitt i hårbotten och exponera skallen.
    6. Justera stereotaxic apparaten så att bregma och lambda är i samma horisontella plan; gör två symmetriska punkter av bregma i samma horisontella plan.
    7. Använd en steril bomullspinne indränkt i 4% H2O2h2O att korrodera hjärnan periostet. Sedan använda en ren, steril bomullspinne för att rensa och torka ytan av skallen.
    8. Använder en micro borr, gör ett hål ca 1 mm i diameter 0,46 mm posteriort och 0,25 mm laterala till bregma.
    9. Fi Använd en ren bomullstopp steril fysiologisk koksaltlösning lösning för att rensa benfragment från den exponerade ytan av hjärnan.
    10. Infoga en mikro-spruta i hjärnan, se till att spetsen på mikro-sprutan är 0,46 mm posteriort och 0,25 mm i sidled till bregma och 5,7 mm djup från ytan av skallen.
    11. Injicera 500 nL av rAAV (50 nL min-1) i SCN, lämnar mikro-sprutan på plats under 10 minuter efter injektionen för att säkerställa fullständig diffusion av rAAV.
    12. Dra sakta upp på mikro-sprutan.
  2. Infoga den optiska fibern i området SCN.
    1. Använda en optisk fiber kniv, skär en fiber 17 mm i längd, se till att varje sida av optisk fiber är slät.
    2. Infoga den optisk fibern i den keramiska bussningen och fixa den optisk fiber till en keramisk bleck med metyletylketon peroxid (AB lim), se till att ytorna av optisk fiber och keramiska bleck är infälld.
    3. Ren fiber med en kall steriliserande lösning eller eten oxid.
    4. Efter rAAV infoga injektion (steg 3.1.11), den keramiska bleck-innehållande optisk fibern i SCN.
    5. Fixa keramiska Bleck och optisk fiber över skallen använda dental harts och låt torka.
    6. Smeta på ytan av dental kådan med tillbaka nagellack. Upprepa de procedurer som beskrivs i 3.1.2 till 3.2.5, utelämna den faktiska injektionen av rAAV för kontroll.
  3. Postoperativ vård
    1. Förse möss med postoperativ analgetika, såsom buprenorfin 2 mg/kg kroppsvikt, subkutant, två gånger om dagen.
    2. Placera möss i en återhämtning bur medan de kommer ut ur anestesi.
    3. Hus möss individuellt under en 12 h ljus/mörk skick (ljusintensiteten ~ 100 lux på botten av buren) med mat/vatten tillgängliga ad libitum. Åtta dagar bör tilldelas innan ytterligare experiment att möjliggöra tillräcklig tid för återhämtning och att säkerställa optimal fluorescens reporter uttryck.

4. in vivo fluorescens Signal övervakning och datainsamling

  1. Åtta dagar efter operation, ansluta fibern på mus huvudet med fluorescens signal bildskärm (t.ex., Gene Observer). Kontrollera signalen fluorescens i SCN kontroll möss att fastställa bakgrunden signalen. Genomföra observation och mätning av denna signal med hjälp av fluorescens signal monitor.
  2. Utvärdera fluorescens signalen av experimentella mus med samma operation kontroll musen. Utesluta möss som har fått den virala vektorn men som endast Visa bakgrunden signalen från analys, eftersom detta indikerar sannolikt att spetsen på den optisk fibern har missat SCN. Efter dessa inledande åtgärder, återvända möss till deras hem burar i ytterligare 3 veckor att tillåta fluorescens signalen att stabilisera.
  3. Efter 3 veckor, ansluta möss med fluorescens signal monitorn. Mäta fluorescensen för 15 s varje 10 min, en frekvens på 100 Hz. Under dessa mätningar är mössen fritt rörliga i sina burar med mat/vatten tillgängliga ad libitum. Använda en ljusintensitet på botten av buren ~ 100 Lux, och en laser kraften på spetsen av den optiska fibern mellan 15-20 µW.
  4. Efter slutförandet av alla inspelningar, BEGJUTA möss med 4% paraformaldehyd, och ta bort och skiva hjärnor för att kontrollera placeringen av optisk fiber. Utesluta möss från analys om optisk fiber spetsen inte är korrekt implanteras i SCN.

5. dataanalys och Presentation

  1. Åtgärd fluorescens signalera varje 10 min för 15 s, en frekvens på 100 Hz, ge 1500 datapunkter. Medelvärdet av dessa 1500 poäng översätts till fluorescens signalen vid någon given tidpunkt. Rita flera medelvärden över tid producerar en signal-till-tid-kurvan som motsvarar Cry1 transkriptionell rytm under en kontroll ljus villkoret i SCN fritt rörliga möss.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fluorescens reporter utformningen av Cry1 var show i figur 1A. Använda metoden beskrivs i detalj ovan, 500 nL rAAV-p (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 injicerades framgångsrikt i SCN av en vuxen mus och uppvisade robust Venus uttryck (figur 1B, 1 C). Fluorescens-signaler som registrerats under 12h / 12h ljus och mörker (LD) och mörk/mörk (DD) villkor (figur 2) gav robust dygnsrytmen i båda villkoren. Slutligen, fluorescens signalen spelades i lång och kort fotoperiod förhållanden (figur 3).

Figure 1
Figur 1. Fluorescens reporter design och det uttryck i SCN
(A) fluorescens reporter utformningen av Cry1. (B) Photomicrograph av mus hjärnan visar reporter uttryck 8 dagar efter virus injektionen. (C) förstoring av området förpackade i rött på det photomicrograph visas i (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Fluorescens i vivo som inspelning i SCN LD och DD villkor
(A) bakgrund fluorescens i SCN visar ingen påvisbar rytm både LD och DD villkor. De vita och grå områdena anger ljus på- och ljus-off perioder, respektive. (B), P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 uttryck under loppet av 7 dagar i 12-12 LD skick och 7 dagar i DD skick. (C) analys av dygnsrytmen i villkoret LD (~24.4 h). den röda linjen visar den konvergerade passar i sinus kurvan (resultatet av passformen visas i den vänstra panelen). (D) analys av dygnsrytmen i DD skick (~23.25 h). den röda linjen visar den konvergerade passar i sinus kurvan (resultatet av passformen visas i den vänstra panelen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. In vivo fluorescens inspelningar i SCN under 20-4 lång och 4-20 kort fotoperiod villkor
Exempel på en fluorescens inspelning av P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 uttryck i SCN i 7 dagar under en 12-12 LD skick, följt av 7 dagar under en 20-4 lång fotoperiod skick, 3 dagar under ett DD tillstånd, 3 dagar under en 12-12 LD skick, och sedan 7 dagar under en 4-20 kort fotoperiod skick. Vita och grå områden anger ljus på- och ljus-off perioder, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1. Särskilda reagenser krävs för protokoll (se Tabell för material)

primer namn sekvens
primer F1 cactaggggttcctgcggccgcACGCGTGTAAAGATGCACATGTG
primer R1 TTGTAACCTTGATACTTACCTACTTAGATCGCAGATCTCGTCCGG
primer F2 GTTATGACACAGTGTAGAAACTATGGCATAGGACAGATGACTGTG
primer R2 CATGGTCTTTGTAGTCCATGGTGGGTACCtCTTGACAGCTCTACC
primer F3 ctgtattttcagggcCCTGCAGGtGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG
primer R3 TACCTTTCTCTTCTTTTTTGGAGGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC
primer F4 GCATGGACGAGCTGTACAAGCCTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAG
primer R4 tgatatcgaattcGGATCCCTACACATTGATCCTAGCAGAAGCAC

Tabell 2. Primer som används i protokollet

Tabell 3. DNA-sekvensen som används i protokollet vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I motsats till ex vivo metoder, såsom slice kultur4,5, RT-PCR-16och i situ hybridisering17, som kräver att djur dödas, tillåter de i vivo inspelning metod utredarna att studera dygnsrytm genuttryck i ett levande djur. Som sådan, ger denna teknik möjlighet att utvärdera effekten av olika fysiska störningar (t.ex., sömnbrist, stress, födointag, etc.) på neurala dygnsrytm klockan. I motsats till den i vivo Mareld7,8,10 metod som kan bara arbeta i konstant mörka förhållanden, fluorescens i vivo inspelning metod kan tillämpas under ljus villkor-en viktig fördel av tekniken som ljus signaler re övningsprovet av SCN dygnsrytm klockan18. Även om relativt konstant, robust dygnsrytmen kan upptäckas med denna metod, det bör nämnas att reportern tekniken ger inte kvantitativ information och kan därför inte användas att mäta nivåerna av gentranskription och översättning.

Det finns många kritiska steg i detta protokoll. Koncentrerad rAAV titern bör vara så hög som 2-8 x 1012 viruspartiklar per mL. lägre viral titrar skulle ge bort dim eller ens omätbara fluorescens signaler. När fastställande huvudet av musen in i stereotaxic apparaten, säkerställa att skallen är horisontella som säkert exakt positionering för virus injektion och optisk fiber implantation. Injektion av viruset bör ske långsamt (≤50 nL min-1) att säkerställa att viruset kvar i SCN. De keramiska Bleck och optisk fiber bör fastställas säkert på skallen och dental harts kontaktar inte huden. Om den keramiska Bleck och optisk fiber inte är tillräckligt fast, kommer de gradvis loss från mus huvudet.

Denna teknik kan utökas med andra gen reportrar (t.ex., Per2, Bmal1, c-Fos, Pomc, etc.) genom att ändra promotorn och det motsvarande intron19. Genom att vända flaggan-inton336-Venus-NLS-D2 kassetten med två omvända lox sekvenser och kombinera reportern med en Cre mus linje, kan denna teknik användas för att registrera aktivitet i specifika nervceller. Till exempel skulle kombinera detta synsätt med en Vip-cre mus linje möjliggöra inspelningen av Cry1 transkriptionell rytmer i vasoaktiv intestinal polypeptid-uttryckande nervcellerna i SCN. Denna metod kan också anställa GCaMP6 som en Ca2 + indikator för att spela in Ca2 + dygnsrytmen i hjärnan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar medlemmar i Zhang labbet för att ge stimulerande diskussioner och medlemmar i Zhan labbet för att tillhandahålla tekniskt bistånd. Denna forskning stöddes av bidrag 31500860 (till C.Z.) av NSFC, 2012CB837700 (till E.E.Z. och C.Z.) av 973 programmet från M.O.S.T. av Kina, och finansiering från Beijing kommunstyrelsen. E.E.Z. stöddes av kinesiska ”rekrytering Program av Global Youth experter”.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD Plus Neo TOYOBO KOD-401 Reagent
pVENUS-N1 addgene #61854 Plasmid
pcDNA3.3_d2eGFP addgene #26821 Plasmid
pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA addgene #20297 Plasmid
MluI Thermo Scientific FD0564 Reagent
EcoRI Thermo Scientific FD0274 Reagent
Gibson Assembly Mix NEB E2611s Reagent
Lipofectamine 2000 Thermo Scientific 12566014 Reagent
Syringe Filter EMD Millipore SLHV033RS 0.45 µm 
HiTrap heparin columns gelifesciences 17-0406-01 1 mL 
Amicon ultra-4 centrifugal filter EMD Millipore  UFC810024 100,000 MWCO
Benzonase nuclease Sigma-Aldrich E1014 Reagent
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D5670 Make fresh solution for each batch
mouse stereotaxic apparatus B&E TEKSYSTEMS LTD #SR-5M/6M Equipment
pentobarbital SigmaAldrich #1507002 Reagent
mouse stereotaxic apparatus B&E TEKSYSTEMS LTD #SR-5M/6M Equipment
Hydrogen peroxide solution SigmaAldrich #216763 Reagent
Optical Fiber Thorlabs FT200EMT 0.39 NA, Ø200 µm
microsyringe pump Nanoliter 2000 Injector, WPI Equipment
ceramic ferrule Shanghai Fiblaser 230 μm I.D., 2.5 mm O.D.
Gene Observer BiolinkOptics Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).
  2. Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).
  3. Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).
  4. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).
  5. Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system. European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).
  6. Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
  7. Yamaguchi, S., et al. Gene expression: View of a mouse clock gene ticking. Nature. 409, 684-684 (2001).
  8. Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice. Science Reports. 5, 12310 (2015).
  9. Ono, D., Honma, S., Honma, K. Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms. European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).
  10. Ono, D., et al. Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).
  11. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
  12. Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).
  13. Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).
  14. Ukai-Tadenuma, M., et al. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
  15. McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).
  16. Yamaguchi, Y., et al. Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag. Science. 342, 85-90 (2013).
  17. Nagano, M., et al. An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center. Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).
  18. Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. Physiology of Circadian Entrainment. Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).
  19. Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).

Tags

Denna månad i JoVE fråga 137 dygnsrytm klocka suprachiasmatiska kärnan fluorescens In vivo klocka gen Cry1 fritt rörliga
<em>In Vivo</em> Övervakning av dygnsrytm klocka genuttryck i mus suprachiasmatiska kärnan med hjälp av fluorescens reportrar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mei, L., Zhan, C., Zhang, E. E.More

Mei, L., Zhan, C., Zhang, E. E. In Vivo Monitoring of Circadian Clock Gene Expression in the Mouse Suprachiasmatic Nucleus Using Fluorescence Reporters. J. Vis. Exp. (137), e56765, doi:10.3791/56765 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter