Summary
تمكن هذه التكنولوجيا المطورة حديثا على أساس fluorescence الرصد طويل الأجل لنسخ جينات الإيقاعية على مدار الساعة في نواة suprachiasmatic (SCN) بحرية التحرك الفئران في الوقت الحقيقي وعالية دقة زمنية.
Abstract
يجمع هذا الأسلوب بين الألياف الضوئية بوساطة fluorescence التسجيلات مع إيصال الدقيق من الفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلف على أساس الجينات الصحفيين. هذا جديدة وسهلة الاستخدام في فيفو fluorescence رصد وضع النظام لتسجيل إيقاع النسخي الجينات على مدار الساعة، Cry1، في نواة suprachiasmatic (SCN) تتحرك بحرية الفئران. للقيام بذلك، صمم مراسل fluorescence نسخ Cry1 وتعبئتها في الفيروسات المرتبطة بالغدد. تم حقن المنقي، يتركز فيروس الماوس العقدة التي تليها الإدراج الألياف البصرية، التي كانت ثابتة ثم على سطح الدماغ. أعيدت إلى اقفاصها منزل الحيوانات ويسمح بفترة انتعاش بعد العمليات الجراحية 1-شهر لضمان التعبير مراسل كافية. ثم سجلت الأسفار في الانتقال بحرية الفئران عن طريق في فيفو رصد النظام الذي شيد في مؤسستنا. في فيفو نظام تسجيل، اقترن 488 نانومتر ليزر بشعاع 1 × 4-تقسيم التي تنقسم على ضوء الليزر الإثارة النواتج الأربعة من سلطة متساوية. هذا الإعداد مكنتنا من تسجيل من الحيوانات الأربعة في وقت واحد. كل الإشارات المنبعثة من الأسفار التي جمعت عن طريق أنبوب ضوئي وبطاقة الحصول على بيانات. وفي المقابل للإضاءة الحيوية السابقة في فيفو تقنية تسجيل الإيقاعية على مدار الساعة، هذه الأسفار في فيفو نظام تسجيل يسمح تسجيل التعبير الجيني الإيقاعية على مدار الساعة أثناء دورة خفيفة.
Introduction
في الثدييات، يحكم نواة suprachiasmatic (SCN) إيقاع circadian في الجسم كله لتنسيق استجابة الفرد للتغيرات البيئية الخارجية (مثلاً، والضوء، ودرجة الحرارة، والإجهاد، إلخ)1. المكونات الأساسية على مدار الساعة وتتكون من Per1-3, Cry1-2، على مدار الساعة، و Bmal1، وتلعب دوراً محوريا في تنظيم الإيقاعية عقارب الساعة لكل خلية. يحتوي كل خلية في اللجنة الفرعية للتغذية على المنشط النسخي، ساعة/BMAL1، الذي يعمل بوصفه هيتيروديمير للحث على التعبير عن في والبكاء. في/مجمع صرخة ثم يحول دون وظيفة على مدار الساعة/BMAL1 لتشكيل حلقة مفرغة نسخ-ترجمة التي تستغرق حوالي 24 ساعة ل إكمال2،3.
الدراسات السابقة في اللجنة الفرعية للتغذية قد استخدمت أساسا السابقين فيفو العقدة شريحة الثقافة الأسلوب4،،من56 ، وفي حين أن هذا النهج قد قدمت معلومات قيمة، القيود حالت دون قدرتنا على الحصول على بيانات بشأن تأثير نويات الدماغ الأخرى في اللجنة الفرعية للتغذية، فضلا عن تأثير المنبهات الخارجية (مثلالضوء) على خلايا المقيمين في هذه المنطقة الحرجة. وفي عام 2001، كان الفريق هيتوشي اوكامورا الأول من استخدام نظام الإضاءة الحيوية للتعبير الجيني في فيفو رصد الإيقاعية على مدار الساعة في اللجنة الفرعية للتغذية في الانتقال بحرية الفئران7. وأنفقت المجموعة كين-آشي Honma في السنوات القليلة الماضية زيادة تطوير الإضاءة الحيوية في فيفو نظام التسجيل في العقدة8،،من910. وقدمت هذه الدراسات معا، الباحثين مع القدرة على مراقبة على مدار الساعة الإيقاعية في الظلام المستمر أو بعد نبضة خفيفة. ومع ذلك، نظراً لأن الإضاءة الحيوية قاتمة جداً للسماح للمراقبة المستمرة خلال دورة الضوء/الظلام، إلى جانب حقيقة أن الضوء هو إشارة الغالبة المطلوبة للرائعة العقدة بوساطة من الساعات الإيقاعية11، هناك الطلب المتزايد على تطوير أساليب تجريبية والتغلب على القيود المرتبطة بتسجيل الإضاءة الحيوية. ويصف التقرير الحالي نظام قائم على الأسفار التي تم بناؤها لمراقبة على مدار الساعة الإيقاعية للعقدة في فيفو في الانتقال بحرية الفئران. هذه طريقة سهلة لاستخدام تصاريح المراقبة المستمرة خلال دورة الضوء/الظلام ويسمح للمراقبة الطويلة الأمد لنسخ جينات الإيقاعية على مدار الساعة في اللجنة الفرعية للتغذية في الوقت الحقيقي والزمنية بدقة عالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع الإجراءات في هذا البروتوكول بالموافقة على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) من "الوطني معهد للعلوم البيولوجية"، بكين، وفقا للوائح الحكومية في الصين.
1-تشييد للمراسل Fluorescence Cry1
ملاحظة: الدراسات الإيقاعية السابقة باستخدام نظام الإضاءة الحيوية2،12،13 الصمامات مروج الإيقاعية بزعزعة استقرار لوسيفراس (دلوك) للحث على التعبير الإيقاعي دلوك . وضع مراسل الأسفار، استعيض عن زعزعة استقرار لوسيفراس بزعزعة استقرار fluorescence البروتين (دفينوس) للحث على التعبير الإيقاعي دفينوس . توليد P (Cry1)-دفينوس مراسل يرد أدناه، والبناء الذي يقدم حاليا إلى أدجيني، وسوف تكون متاحة قريبا للاستخدام الأكاديمي.
- تضخيم المروج Cry1 الماوس الوظيفية (+328 للمنطقة-1208 bp الجينات Cry1 ، موقع بدء النسخ سمي ''-1 إنش). استخدام الإنزيم بكر (رمز بالإضافة إلى المحافظين الجدد)، كبسولة تفجير F1 و R1 (انظر الجدول 2)، الفأر الجينوم كقالب وبكر الصانع بروتوكول لتضخيم الجزء الحمض النووي مروج Cry1 .
- تضخيم إنترون 336 الجينات Cry1 ، هو أمر مهم لوظيفة Cry114ساعة الإيقاعية. استخدام الإنزيم بكر، كبسولة تفجير F2 و R2، الجينوم الماوس كقالب وبروتوكول PCR الخاص بالشركة المصنعة لتضخيم الجزء إنترون 336 الحمض النووي.
- تضخيم فينوس. استخدام الإنزيم بكر، كبسولة تفجير F3 و R3، بلازميد بفينوس-N1 كقالب وبروتوكول PCR الخاص بالشركة المصنعة لتضخيم الجزء الحمض النووي فينوس .
- تضخيم الجزء NLS-D2 "الحمض النووي". استخدام الإنزيم بكر، كبسولة تفجير F4 و R4، pcDNA3.3-d2eGFP بلازميد كقالب وبروتوكول PCR الخاص بالشركة المصنعة لتضخيم الجزء NLS-D2 "الحمض النووي".
- توليف الحمض النووي جزء 1 إكسون 1.
- توليف الحمض النووي جزء 2 كالرابط بين إنترون 336 ويفتت الحمض النووي فينوس .
- قص باف-EF1a-مزدوج فلوكسيد-hChR2 (H134R)-مشري-وبر-بلازميد متجه هغبا مع الإنزيمات ملوي واكوري. استخدام "أدوات استخراج هلام" لتنقية الحمض النووي الجزء الأكبر. استخدام البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- باستخدام مزيج الجمعية جيبسون وبروتوكول قياسي، قم بتجميع كافة أجزاء الحمض النووي معا لإنتاج المراسل-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA باف-P (Cry1). استخدام البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
2-إنتاج الفيروسات المرتبطة بالغدد15
- إعداد الأرصدة الحمض النووي بلازميد التالية: 31.25 ميكروغرام من pRV1 31.25 ميكروغرام من pH21، 125 ميكروغرام من pFdelta6 وميكروغرام 62.5 باف-ف (Cry1)-intron336-فينوس-NLS-D2-وبر-هغبا.
- إعداد خمسة صحون 15 سم من الخلايا 293T والانتظار حتى تصبح روافد 90% من الخلايا.
- ترانسفيكت البلازميدات في أعقاب البروتوكول كاشف تعداء الخلايا 297T. لكل طبق، استخدم 6.25 ميكروغرام من pRV1، 6.25 ميكروغرام pH21، 25 ميكروغرام من pFdelta6، 12.5 ميكروغرام من باف-P (Cry1)-ميليلتر intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA، و 120 من كاشف تعداء.
- ح 72 بعد تعداء، فصل الخلايا من كل لوح باستخدام بندقية ماصة؛ حصاد الخلايا إلى أنبوبين 50 مل.
- بيليه الخلايا في 800 x ز لمدة 10 دقائق، وتجاهل المادة طافية. غسل الخلايا بوضع 20 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) إلى كل أنبوبة؛ بيليه الخلايا في 800 x ز لمدة 10 دقائق، وتجاهل المادة طافية.
- ريسوسبيند الكريات في كلوريد الصوديوم 150 و 20 ملم تريس الحل، pH 8.0; استخدام 25 مل من الحل/الأنبوبة. إضافة 1.25 مل الطازجة deoxycholate الصوديوم 10% (في dH2س) لكل أنبوبة. إضافة نوكلاس بينزوناسي بتركيز 50 وحدة كل مل نهائي، ومزيج دقيق. احتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
- إزالة الحطام الخلوية التي سينتريفوجينج في ز x 3000 لمدة 15 دقيقة. كذلك التأكد من أن جميع الأنقاض قد أزيلت عن طريق دفع الخليط من خلال عامل تصفية حقنه 0.45 ميكرومتر؛ سوف تساعد هذه الخطوة على منع تجميد الأعمدة الهيبارين.
- إعداد أعمدة الهيبارين استخدام مضخة تمعجية؛ تعيين معدل التدفق إلى 1 مل/دقيقة، ضمان أن يتم إدخال لا فقاعات الهواء في الأعمدة.
- حجته الأعمدة مع 10 مل من 150 مم كلوريد الصوديوم، 20 مم تريس الحل، pH 8.0. إضافة حل الذي يحتوي على الفيروس لكل عمود. غسل الأعمدة مع 20 مل من 100 ملم كلوريد الصوديوم، 20 مم تريس الحل، pH 8.0. ثم، باستخدام حقنه 5 مللي، يغسل الأعمدة مع 1 مل من 200 ملم كلوريد الصوديوم وعيار 20 ملم تريس الحل pH 8.0، تليها 1 مل من 300 مم كلوريد الصوديوم والحل تريس 20 مم، الرقم الهيدروجيني 8.0.
- استخدم حقنه 5 مل الوت الفيروس مع 3 مل من 400 مم كلوريد الصوديوم، الحل تريس 20 ملم، ودرجة الحموضة 8.0، تليها 4 مل من 450 مم كلوريد الصوديوم، الحل تريس 20 ملم، ودرجة الحموضة 8.0، وأخيراً من مل 3 من 500 مم كلوريد الصوديوم ، حل تريس 20 مم، الرقم الهيدروجيني 8.0. جمع المواد المستخرجة.
- لتركيز الفيروس المرتبط بالغدة المؤتلف (راف)، تحميل المواد المستخرجة، 4 مل في كل مرة، إلى وحدات الطرد المركزي تصفية مع وزن الجزيئي 100,000 الانقطاع. الطرد المركزي كل عينة 4 مل في 2000 غ س لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، التخلص من التدفق عبر.
- عندما تم تشغيل جميع المواد المستخرجة من خلال وحدات الطرد المركزي تصفية، إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي المخلوط إلى حوالي 250 ميكروليتر. إزالة رافس (عيار الفيروسية ينبغي أن يكون حول 2-8 × 1012 الجسيمات الفيروسية كل مل) من وحدات الطرد المركزي تصفية وقاسمه ومخزن في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام. وفي هذه المرحلة، يمكن تخزين الفيروس لعدة أشهر.
3-راف الحقن و "إدخال الألياف البصرية" في "العقدة الماوس الكبار"
- ضخ رافس مراسل يحمل الأسفار الإيقاعية في اللجنة الفرعية للتغذية
- تحميل 5 ميليلتر من راف (عيار الفيروس حول 2-8 × 10 جزيئات الفيروس12 كل مل) في الدقيقة-محقن.
- تخدير ماوس الكبار (2 إلى 5-شهرا، خلفية C57BL/6) مع نيمبوتال (80 ملغ/كغ) عن طريق الحقن داخل. الاختيار للعمق الكافي للتخدير بسبب عدم استجابة تو-قرصه.
- استخدام مقص لإزالة الفراء من رأس الماوس ومن ثم تحميل الماوس في جهاز ستيريوتاكسيك. توفير مصدر حرارة للحيوانات تخديره عبر تعميم بطانية ماء الساخن أو جهاز تدفئة آخر.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدام مقص الشعر الكهربائية أو كريم مزيل الشعر لإزالة الفراء. - تنظيف الموقع الجراحي مع وكلاء مطهر مناسب. على سبيل المثال، وهذا يمكن أن تشمل الماء المعقم أو الكحول واليود، وتدين، أو تمييع الكلورهيكسيدين في التناوب يدعك. كرر 3 مرات على الأقل. ثني موقع الجراحية.
- استخدام المقص لجعل شق في فروة الرأس وفضح الجمجمة.
- ضبط جهاز ستيريوتاكسيك، حيث تكون بريجما وامدا في نفس الطائرة الأفقي؛ جعل نقطتين متناظرة من بريجما في نفس الطائرة الأفقي.
- استخدام مسحه القطن معقمة غارقة في 4 ٪ ح2س2/H2س تآكل سمحاق الدماغ. ثم استخدم مسحه القطن نظيف، معقم لمسح وتجفيف سطح الجمجمة.
- استخدام حفر صغيرة، جعل ثقب حوالي 1 ملم في القطر 0.46 الخلفي و 0.25 مم الأفقي إلى بريجما.
- وأي فأي استخدم مسحه القطن نظيفة معقمة بحل المحلول الملحي الفسيولوجي لمسح شظايا العظام من سطح مكشوف من المخ.
- إدراج الصغرى-حقنه في الدماغ، والتأكد من أن تلميح الصغرى-المحاقن 0.46 مم الخلفي والجانبي 0.25 مم بريجما، والبالغ 5.7 مم من سطح الجمجمة.
- حقن 500 nL راف (مين nL 50-1) إلى اللجنة الفرعية للتغذية، تاركاً الصغرى-حقنه في المكان لمدة 10 دقائق بعد الحقن لضمان اكتمال نشر راف.
- ببطء الانسحاب الجزئي-المحاقن.
- إدراج الألياف الضوئية في مجال التغذية.
- استخدام سكين ألياف الضوئية، قطع من ألياف 17 ملم في الطول، والتأكد من أن كل جانب من الألياف البصرية السلس.
- إدراج الألياف البصرية في التسليح السيراميك وإصلاح الألياف البصرية للتسليح سيراميك مع الميثيل إثيل كيتون بيروكسيد (AB الغراء)، ضمان تدفق السطوح من الألياف الضوئية والتسليح السيراميك.
- تنظيف الألياف مع أكسيد الإيثيلين أو حل التعقيم بارد.
- بعد حقن راف (الخطوة 3.1.11)، إدراج الألياف البصرية السيراميك المحتوية على التسليح في اللجنة الفرعية للتغذية.
- إصلاح التسليح السيراميك والألياف الضوئية على الجمجمة باستخدام راتنج الأسنان والسماح لتجف.
- تشويه سطح الراتنج الأسنان مع طلاء الأظافر إلى الوراء. تكرار الإجراءات المبينة في 3.1.2 إلى 3.2.5، إهمال حقن راف للسيطرة الفعلية.
- الرعاية بعد الجراحة
- توفر الفئران مع مسكنات الألم بعد العمليات الجراحية، مثل البوبرينورفين 2 مغ/كغ من وزن الجسم، تحت الجلد، مرتين في يوم.
- وضع الفئران في قفص انتعاش في حين أنها تأتي من التخدير.
- بيت الفئران على حدة وفقا لشرط ضوء/الظلام ح 12 (شدة الضوء lux ~ 100 في الجزء السفلي من القفص) مع الغذاء والمياه المتاحة libitum الإعلانية. وينبغي تخصيص ثمانية أيام قبل مزيد من التجريب للسماح بوقت كاف في الانتعاش وضمان التعبير مراسل fluorescence الأمثل.
4. في فيفو Fluorescence إشارة الرصد وجمع البيانات
- ثمانية أيام بعد الجراحة، وتوصيل الألياف على رأسه الماوس مع مراقبة إشارة الأسفار (على سبيل المثال-، المراقب الجينات). التحقق من إشارة fluorescence في اللجنة الفرعية للتغذية لمكافحة الفئران لوضع الإشارات الخلفية. إجراء المراقبة والقياس لهذه الإشارات باستخدام مراقب إشارة الأسفار.
- تقييم إشارة fluorescence التجريبية بالماوس مع نفس العملية للتحكم الماوس. استبعاد الفئران التي تلقت ناقلات الأمراض الفيروسية ولكن الذي عرض فقط إشارة خلفية من التحليل، كما يرجح أن هذا يشير إلى أن غيض الألياف البصرية وقد غاب عن اللجنة الفرعية للتغذية. بعد هذه التدابير الأولية، تعود الفئران إلى اقفاصها منزل لآخر 3 أسابيع للسماح للأسفار إشارة إلى استقرار.
- بعد 3 أسابيع، قم بتوصيل الفئران مع مراقبة إشارة الأسفار. قياس الأسفار لمدة 15 ثانية كل 10 دقائق، على تردد 100 هرتز. خلال هذه القياسات، الفئران تتحرك بحرية في اقفاصها بالأغذية والمياه المتاحة libitum الإعلانية. تستخدم كثافة ضوء في الجزء السفلي من القفص ~ 100 لوكس، وقوة الليزر في غيض الألياف البصرية بين 15-20 µW.
- بعد الانتهاء من جميع التسجيلات، نتخلل الفئران مع بارافورمالدهيد 4%، وإزالة وشريحة العقل المدبر الاختيار والتنسيب الألياف البصرية. استبعاد الفئران من التحليل إذا لم هو تلميح الألياف البصرية مزروع بشكل صحيح في اللجنة الفرعية للتغذية.
5-بيانات التحليل والعرض التقديمي
- الأسفار التدبير إشارة كل 10 دقائق لمدة 15 ثانية، بتردد 100 هرتز، أن تسفر عن نقاط البيانات 1500. متوسط هذه النقاط 1500 يترجم إلى إشارة fluorescence في أي نقطة زمنية معينة. وتنتج منحنى إشارة إلى الوقت الذي يتوافق مع إيقاع Cry1 النسخي تحت شرط خفيفة تحكم في العقدة من الانتقال بحرية الفئران التآمر المتوسطات متعددة على مر الزمن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تصميم مراسل fluorescence Cry1 كان تظهر في الشكل 1A. استخدام النهج المفصلة أعلاه، 500 nL راف-P (Cry1)-intron336-فينوس-NLS-D2 تم حقن بنجاح في اللجنة الفرعية للتغذية الماوس الكبار، وأظهرت قوة فينوس التعبير (الشكل 1B، ج 1). الأسفار الإشارات المسجلة تحت ح 12/12 ح الضوء/الظلام (دينار) وظروف الظلام/الظلام (دد) (الشكل 2) أسفرت عن إيقاع circadian قوية في كل الظروف. وأخيراً، سجلت إشارة الأسفار في ظروف كبيرة طويلة وقصيرة (الشكل 3).
الشكل 1. تصميم مراسل الأسفار وذلك التعبير في اللجنة الفرعية للتغذية
(أ) تصميم Cry1مراسل الأسفار. (ب) الصورة المجهرية الدماغ الماوس يظهر التعبير مراسل 8 أيام بعد حقن الفيروس. (ج) التكبير من منطقة محاصر باللون الأحمر في الصورة المجهرية المبينة في (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 2. الأسفار في فيفو التسجيل في اللجنة الفرعية للتغذية تحت ظروف LD و DD
(أ) الخلفية الفلورية في اللجنة الفرعية للتغذية عرض لا إيقاع يمكن كشفها تحت ظروف LD و DD. مجالات الأبيض والرمادي تشير إلى فترات الضوء على وإيقاف الضوء، على التوالي. (ب) ف (Cry1)-intron336-فينوس-NLS-D2 التعبير على مدى 7 أيام في حالة LD 12-12 و 7 أيام في حالة DD. (ج) تحليل لإيقاع circadian في الشرط دينار (ح ~24.4)؛ الخط الأحمر يشير إلى تناسب المتقاربة في منحنى الجيب (نتيجة يصلح لتظهر في اللوحة اليمنى). (د) تحليل لإيقاع circadian في الشرط DD (ح ~23.25)؛ الخط الأحمر يشير إلى تناسب المتقاربة في منحنى الجيب (نتيجة يصلح لتظهر في اللوحة اليمنى). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. في فيفو تسجيلات fluorescence في اللجنة الفرعية للتغذية تحت طويل 20-4 وظروف كبيرة قصيرة 4-20
مثال لتسجيل الأسفار ف (Cry1)-intron336-فينوس-NLS-التعبير D2 في اللجنة الفرعية للتغذية لمدة 7 أيام تحت شرط 12-12 دينار، تليها 7 أيام تحت شرط كبيرة طويلة 20-4, 3 أيام تحت شرط DD، 3 أيام تحت شرط LD 12-12، و ثم 7 أيام تحت شرط كبيرة قصيرة 4-20. الأبيض والرمادي المناطق تشير إلى فترات الضوء على وإيقاف الضوء، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1. محددة الكواشف اللازمة لبروتوكول (انظر الجدول للمواد)
| اسم الدليل | التسلسل | ||
| التمهيدي F1 | كاكتاجججتككتجكجككجكاكجكجتجتااجاتجكاكاتجتج | ||
| التمهيدي R1 | تجتاككتجاتاكتاككتاكتاجاتكجكاجاتكتكجتككج | ||
| التمهيدي F2 | جتاتجاكاكاجتجتاجااكتاتجكاتاجاكاجاتجاكتجتج | ||
| التمهيدي R2 | كاتجتكتتجتاجتككاتجتججتاككتكتجاكاجكتكتاكك | ||
| التمهيدي F3 | كتجتاتتتكاججكككتجكاجتجتجاجكاججكجاجاجكتج | ||
| التمهيدي R3 | تاككتتكتكتكتتتتتجاجكتجتاكاجكتكجتككاتجكك | ||
| التمهيدي F4 | جكاتجاكجاجكتجتاكاجككتككاااااجاجاجااجتاج | ||
| التمهيدي R4 | تجاتاتكجاتكجاتكككتاكاكاتجاتككتاجكاجاجكاك | ||
الجدول 2. التمهيدي المستخدمة في البروتوكول
الجدول 3. تسلسل الحمض النووي المستخدمة في البروتوكول اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على النقيض من السابقين فيفو الأساليب، مثل شريحة الثقافة4،5، الرايت-بكر16و في الموقع التهجين17، التي تتطلب أن يكون قتل الحيوانات، في فيفو تسجيل أسلوب يسمح المحققين لدراسة التعبير الجيني الإيقاعية في الحيوانات حية. على هذا النحو، توفر هذه التكنولوجيا القدرة على تقييم تأثير الاضطرابات البدنية مختلفة (مثلاً، والحرمان من النوم، والإجهاد، وتناول الطعام، إلخ) على مدار الساعة الإيقاعية العصبية. على النقيض في فيفو الإضاءة الحيوية7،8،10 الأسلوب الذي يمكن أن تعمل إلا في ظروف مظلمة ثابتة، الأسفار في فيفو تسجيل طريقة يمكن تطبيقها تحت الضوء الشروط الميزة الرئيسية لهذه التكنولوجيا كضوء الإشارات الرائعة إعادة عقارب الساعة الإيقاعية العقدة18. على الرغم من أن يمكن كشف إيقاعات circadian ثابتة نسبيا وقوية مع هذا الأسلوب، تجدر الإشارة إلى أن التكنولوجيا مراسل لا توفر المعلومات الكمية و ولذلك لا يمكن استخدامها لقياس مستويات النسخ الجيني و الترجمة.
وهناك العديد من الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول. عيار راف مركزة ينبغي أن يصل إلى 2-8 × 1012 الجسيمات الفيروسية كل مل؛ وسيعطي التتر الفيروسية أقل إيقاف الإشارات fluorescence خافت أو حتى غير قابلة للكشف. عند تحديد رأس الماوس إلى جهاز ستيريوتاكسيك، تأكد من أن الجمجمة أفقي لتحديد المواقع الدقيقة آمنة لزرع الفيروسات حقن والألياف الضوئية. وينبغي أن يتم حقن الفيروس ببطء (دي فايف زيرو nL دقيقة-1) التأكد من أن الفيروس لا يزال في اللجنة الفرعية للتغذية. التسليح السيراميك والألياف الضوئية ينبغي أن تكون ثابتة بشكل أمن في الجمجمة والأسنان راتنج ينبغي عدم الاتصال الجلد. إذا كان التسليح السيراميك والألياف البصرية ليست ثابتة على نحو كاف، سوف فصل تدريجيا من رأس الماوس.
هذا الأسلوب يمكن أن توسع لتشمل الصحفيين الجينات الأخرى (مثلاً، Per2، Bmal1، ج-المنحدر، بومكو ما إلى ذلك) عن طريق تغيير المروج و إنترون الموافق19. بعكس كاسيت العلم-inton336-فينوس-NLS-D2 مع تسلسلين عكس لوكس والجمع بين المراسل مع خط ماوس لجنة المساواة العرقية، يمكن استخدام هذه التكنولوجيا لتسجيل النشاط في الخلايا العصبية المحددة. على سبيل المثال، الجمع بين هذا النهج مع خط ماوس كبار الشخصيات-لجنة المساواة العرقية أن يسمح بتسجيل إيقاعات Cry1 النسخي فعال في الأوعية المعوية معربا عن ببتيد في الخلايا العصبية في اللجنة الفرعية للتغذية. يمكن استخدام هذا الأسلوب أيضا GCaMP6 كمؤشر2 + Ca لتسجيل إيقاع Ca2 + سيركاديان في المخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر أعضاء في مختبر تشانغ لتوفير حفز المناقشات وأعضاء في مختبر زان لتوفير المساعدة التقنية. وكان يؤيد هذا البحث بمنح 31500860 (إلى C.Z.) من تشرف، 2012CB837700 (إلى E.E.Z. و C.Z.) لبرنامج 973 من M.O.S.T. الصين، وتمويل من "حكومة بلدية بكين". وأيد E.E.Z. الصينية "برنامج التوظيف للخبراء من الشباب العالمي".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
References
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).
- Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system. European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).
- Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Yamaguchi, S., et al. Gene expression: View of a mouse clock gene ticking. Nature. 409, 684-684 (2001).
- Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice. Science Reports. 5, 12310 (2015).
- Ono, D., Honma, S., Honma, K. Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms. European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).
- Ono, D., et al. Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).
- Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).
- Ukai-Tadenuma, M., et al. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).
- Yamaguchi, Y., et al. Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag. Science. 342, 85-90 (2013).
- Nagano, M., et al. An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center. Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).
- Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. Physiology of Circadian Entrainment. Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
