Summary
本手稿详细介绍了一种直接斑点印迹法定量的腺相关病毒 (AAV) 的效价及其应用研究组装活化蛋白 (AAPs) 的作用, 一种新型的非结构化病毒蛋白在所有 AAV 发现血清型, 促进衣壳的组装从同源和异源 AAV 血清型。
Abstract
虽然腺相关病毒 (AAV) 被广泛接受为一种有吸引力的基因治疗载体, 但它也作为一种了解病毒生物学的模型病毒。在后者方面, 最近发现一种非结构化的 AAV 蛋白 (称为组装活化蛋白), 已经为病毒衣壳副总裁蛋白质组装过程中所涉及的进程注入了新的光。虽然许多 AAV 血清型需要用于程序集, 我们最近报告说, AAV4, 5 和11是这个规则的例外。此外, 我们还证明了不同血清型的 AAPs 和组装衣壳不同的亚细胞间隔。这种意想不到的异质性的生物学性质和功能作用的 AAPs 之间的不同 AAV 血清学强调了研究的重要性, AAPs 来自不同的血清型。本手稿详细介绍了 AAV 定量的直接斑点印迹法及其在衣壳体组装中对其依赖性和血清型特异性的评估。为了证明这种斑点杂交化验的效用, 我们着手描述了蛇 AAV, 以前的 uncharacterized 爬行动物 AAV, 以及 AAV5 和 AAV9 的衣壳组装和儿科的依赖性, 这些以前被证明是独立于血清型, 分别。该化验结果显示, 蛇 AAV 衣壳组件需要蛇的 AAPs, 不能由 AAV5 和 AAV9 促进。该检测还表明, 不同于许多常见的血清 AAPs, 促进异种衣壳组装交叉互补, 蛇的儿科学会不促进组装 AAV9 衣壳。此外, 我们还表明, 核酸酶的选择对斑点印迹检测的读数有显著影响, 因此, 选择最佳酶对 AAV 滴度的成功评估是至关重要的。
Introduction
腺相关病毒 (AAV) 是一种小的、非封闭的单链 DNA 病毒, 其基因组约为 4.7 kilobases (kb)。AAV 基因组包含开放阅读框架 (码) 的代表和cap基因。在 2010年, 一个先前不明的结构性蛋白编码由 +1 帧转移的 ORF 在 AAV2帽基因中发现了报等, 并发现发挥关键作用, 在组装 AAV2 衣壳副总裁单体蛋白成病毒衣壳1。这种新的蛋白质被命名为组装活化蛋白 () 后, 它发挥作用, 促进衣壳组装1。
码 bioinformatically 在Dependoparvovirus的所有细小的基因组中被识别出来, 但不在细小病毒家族1、2的不同属的基因组中。本文首先从原型 AAV2 (AAP2) 对该蛋白的功能研究进行了初步研究, 确立了 AAP2 在靶向未组装 VP 蛋白对核仁的聚集和形成中的重要作用, 从而充分组装衣壳1,3,4。AAV2 衣壳无法在没有该表达式的情况下组装, 已由多个组独立确认, 包括我们的1、2、3、4、5.随后对 AAV 血清型1、8和9的研究证实了 AAPs 在衣壳组装中的关键作用, 因为 AAV1、8和9的 VP3 单体蛋白在没有联合表达的情况下无法形成完全组装的衣壳.
最近, 通过包括使用定量斑点杂交检测的方法, 我们研究了 AAV1 12 VP3 单体组装成衣壳的能力, 在缺乏表达和 AAP1 12 的能力, 以促进 VP3 单体组装异源血清型。这项研究表明, AAV4, 5 和 11 VP3 单体可以组装, 不用的。另外, 据发现, 我们研究的十二种血清蛋白中有八 (即除了 AAP4、5、11和 12) 显示了广泛的能力, 支持外源 AAV 血清型衣壳的衣壳组装, 而 AAP4, 5, 11 和12显示了极大的有限的能力在这方面6。这四种血清型是 phylogenetically 远离其他的儿科血清2,3。此外, 该研究发现不同 AAPs6的亚细胞定位有显著的异质性。此外, 研究还表明, 与组装的衣壳和核仁, AAV2 衣壳组装的标志紧密关联, 不一定可以扩展到其他血清型包括 AAV5, 8 和 9, 这显示核仁排除组装衣壳6。因此, 从研究任何特定的血清学杂志获得的信息并不广泛适用于所有的儿科生物学。此类令人费解的生物学特性突显出, 需要从规范和非规范的 AAV 血清型中研究每个标准的角色和功能。
通过测定人胚肾 (HEK) 293 细胞中所产生的完全包装的 AAV 病毒微粒滴度, 可以评估在衣壳组装中的生物作用, 其中最常用的细胞系为 AAV 向量生产, 有或没有蛋白表达。标准的 AAV 定量方法是定量 PCR (qPCR) 为基础的化验7,8和定量斑点杂交为基础的化验9。其他 AAV 病毒微粒定量的方法, 如酶联免疫吸附试验10,11或光学密度测量12不理想的样本来自许多不同的 AAV 血清学或样品被杂质污染 (粗裂解物或培养基), 通常是用于 AAV 研究的样品。目前, qPCR 被广泛应用于 AAV 定量;然而, 有必要承认 qPCR 的检测可能的警告, 因为该检测可能导致系统性错误和显著的效价变化13,14。基于 pcr 的化验受到一些潜在的混杂因素的影响, 例如在 pcr 模板中存在共价键闭合终端发夹, 抑制放大13。即使有经验的个体也可以在不知不觉的13中引入潜在的混杂因素到 qPCR 的检测中。相比之下, 定量斑点杂交检测是一种经典的分子生物学技术, 不涉及基因组扩增, 并使用一个简单的原理, 与 qPCR 的检测相比, 错误的风险最小。该方法在技术上缺乏挑战性;因此, 即使没有经验的人也能合理地重现化验结果。
在本报告中, 我们描述了一个定量斑点杂交检测的方法学细节, 我们经常使用 AAV 向量定量, 并提供了一个例子, 如何应用该方法来研究 AAPs 在共同的血清学 (AAV5 和 AAV9) 的组装促进作用和以前 uncharacterized 从蛇 AAV14。在自然界中, AAV vp 蛋白和蛋白的表达在 cis 从一个单一的基因 (即, 副总裁的 cis 互补), 而在这里描述的化验, vp 和儿科蛋白是从两个独立的质粒提供反相 (即, vp跨互补)。由于来自不同血清型的每种 vp 或蛋白都可以从每个独立的质粒中表达出来, 因此就有可能测试外源副总裁--在衣壳装配上的组合 (即, 副校长交叉互补)。简单地, AAV VP3 从不同的血清学表达在 HEK 293 细胞通过质粒 DNA 转染包裹一个 AAV 向量基因组在存在或没有同源血清学, 或在存在的异种血清学。继生产后, 培养基和细胞裂解物受到斑点印迹检测, 以量化在衣壳内的病毒基因组。斑点杂交法的第一步是用核酸酶处理样品, 去除污染的质粒 dna 和无包装的 AAV 基因组。如果不这样做, 将增加背景信号, 特别是当粗样品被检测。接下来是蛋白酶治疗, 以打破病毒衣壳和释放核酸酶病毒基因组的样本解决方案。其次, 病毒基因组变性, 在膜上涂抹, 并与病毒基因组特异的 DNA 探针杂交进行定量。在这里报告的例子化验中, 我们证明蛇 AAV VP3 需要蛇的电泳为衣壳装配, 并且蛇的附属程序不促进 AAV9 衣壳的汇编, 不同于由依赖于异源血清衣壳。最后, 我们报告了一个重要的告诫, qPCR 或斑点印迹为基础的 AAV 定量分析的选择核酸酶显着影响的化验结果。
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Protocol
注意:表 1提供了此协议所需的解决方案和缓冲区的配方。下面描述的协议是为副校长交叉互补斑点杂交试验研究的作用, 在衣壳组装的蛋白。对纯化 AAV 矢量滴定法进行了较为通用的定量斑点杂交试验, 并在代表性结果部分作了说明。
1. 构建 VP3、AAV2 和表达质粒的代表
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pCMV-AAVx-VP3 的构建 (x = 血清型)
- PCR-放大整个 VP3 ORF (1.6 kb) 使用高保真 DNA 聚合酶和以下底漆对: VP3 向前, CTAA-RE1-CACC-N25 (VP3 ORF 的前25核苷酸);VP3 反向, TCTT-RE2-N25 (最后25核苷酸 VP3 ORF)。
注: RE1 和 RE2 是用于克隆的限制酶 (REs) 的场所。CTAA 和 TCTT 是终端 5 ' 和 3 ' tetranucleotides 增加了促进限制酶消化接近末端的双链 DNA。CACC 是一个科扎克的共识序列。 - 克隆在哺乳动物表达载体对应的 re 地点之间的重新消化 PCR 产物, 即使用人巨细胞病毒立即-早期 (CMV-IE) 增强剂-促进者为高层次表达。
注: 对于分子克隆, 在最佳温度下, 在 4 U/µg DNA 浓度为1小时, 消化5µg 的主干质粒 DNA 与限制酶 (s)。对于 PCR 片段, 增加使用的酶的单位 (例如, 10 U/µg 1.6 kb VP3 PCR 产品) 和一个更长的潜伏期 (例如, 4 h) 由于限制酶识别站点的数量增加每单位长度。分子生物学酶和克隆过程中有用的信息, 包括细菌转化, 可以在别处找到15,16,17。
- PCR-放大整个 VP3 ORF (1.6 kb) 使用高保真 DNA 聚合酶和以下底漆对: VP3 向前, CTAA-RE1-CACC-N25 (VP3 ORF 的前25核苷酸);VP3 反向, TCTT-RE2-N25 (最后25核苷酸 VP3 ORF)。
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pCMV 旗 AAPx (x = 血清型) 的构建
- PCR-放大整个 CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N (0.6 kb) 除了第一个氨基酸使用高保真 DNA 聚合酶和以下底漆对: 前25 (25 核苷酸从第四核苷酸在ORF);反向, TCTT-RE2-N25 (最后25核苷酸的)。
注: GACTACAAGGACGACGATGACAAA 编码一个标志标记, 它已被证明没有有害影响4,5 , 但可以省略, 如果不必要的。 - 克隆在哺乳动物表达载体的相应地点之间的重新消化 PCR 产物与巨细胞病毒-IE 增强器-启动子15,16,17。
- PCR-放大整个 CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N (0.6 kb) 除了第一个氨基酸使用高保真 DNA 聚合酶和以下底漆对: 前25 (25 核苷酸从第四核苷酸在ORF);反向, TCTT-RE2-N25 (最后25核苷酸的)。
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建设 pHLP-代表
- 消化5µg 的 pAAV-RC2 质粒 (7.3 kb) 与20单位每 Xho i 和 Xcm i, 并纯化 dna 使用商业 dna 纯化试剂盒或苯酚-氯仿萃取。
注意: 从 7.3 kb pAAV-RC2 质粒中删除 1.8 kb Xho i Xcm 片段会导致衣壳副总裁蛋白表达丢失, 同时保留代表蛋白表达式。 - 钝 dna 末端与6个单位 T4 脱氧核糖核酸聚合酶, 琼脂糖凝胶-纯化 5.5 kb 脱氧核糖核酸片断, 并且自已结扎被纯化的片断使用50到 100 ng 脱氧核糖核酸和400个单位 T4 脱氧核糖核酸连接酶根据制造商的建议15。
- 按照步骤1.1.2 说明中引用的标准细菌转换过程进行操作。
- 消化5µg 的 pAAV-RC2 质粒 (7.3 kb) 与20单位每 Xho i 和 Xcm i, 并纯化 dna 使用商业 dna 纯化试剂盒或苯酚-氯仿萃取。
- 通过限制酶消化和顺序15,18验证质粒结构。
- 使用商用试剂盒进行质粒 minipreps 或 maxipreps, 以获得足够数量的质粒 DNA 进行下游 AAV 生产试验。
2. 用质粒 DNA 转染 (交叉互补法) 生产 HEK 293 细胞中的 AAV
- 培养 HEK 293 细胞在 Dulbecco 的改性鹰培养基 (DMEM)-高葡萄糖 (4.5 克/升) 补充10% 胎牛血清 (血清), 1% 青霉素 & 链霉素混合, 1 毫米 l-谷氨酰胺, 在37摄氏度孵化器与5% 二氧化碳 (CO2)。
注: AAV 的滴度因 HEK 293 细胞的来源而有显著差异。
注意: 虽然 AAV 可以在生物安全级别 1 (BSL1) 控制中进行处理, 但建议 HEK 293 细胞工作时 BSL2 包容。 - 在-1 天 (在转染之前24小时), 板材 6–7 x 105 HEK 293 个细胞/井在2毫升在台阶2.1 在6个好板材 (s) 描述的完全媒介。这通常达到90% 融合第二天。
-
0天: 转染
- DNA 转染的制备
- 确保细胞达到了90% 融合。
- 预热 DMEM 补充与1% 青霉素 & 链霉素混合和1毫米 l-谷氨酰胺, 但没有10% 的血清 (即无血培养基) 在37°c 水浴。
- 允许聚乙烯亚胺 (PEI) 溶液达到室温。
- 质粒 DNA 混合物的制备
- 在96µL 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中混合质粒, 不 CaCl2或氯化镁2 , 不育1.5 毫升离心管, 如表 2所示。DNA 的总数量是2µg/好。
注: 如果它们是标称的, 则可以忽略质粒 DNA 溶液的体积。如果质粒 DNA 溶液的总体积为≥10µL, 建议容积调整。
- 在96µL 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中混合质粒, 不 CaCl2或氯化镁2 , 不育1.5 毫升离心管, 如表 2所示。DNA 的总数量是2µg/好。
- 裴转染
- 将4µL 的裴溶液 (1 毫克/毫升) 添加到 PBS-质粒 DNA 组合中 (如上所述)。最后容量是大约100µL (文化媒介的5% 容量)。涡流管和孵化的 DNA: 裴混合物在室温下15分钟。
- 在等待15分钟孵化完成时, 用步骤2.3.1.2 中描述的 prewarmed 无血清培养基取代培养基。
- 一旦15分钟的 DNA 孵化: 裴合剂完成, 简要旋转管与离心收集液体到底部的管, 并添加 DNA: 裴混合物滴到培养基中的 HEK 293 培养板。轻轻搅动板, 并返回到37°c 孵化器与 5% CO2。
- 保持这种转染培养基中的细胞, 直到5天的收获 (不需要中等变化)。
- DNA 转染的制备
- 在1和2天, 观察在倒置荧光显微镜下转染的 pCMV-GFP 质粒的细胞, 以评估染电效率。
注: 对于荧光显微术, 本文采用了 10 x/0.25 数值孔径物镜与10×目镜相结合的方法, 采用了450–490纳米励磁带通滤波器和515–565纳米带通发射滤波器。上述条件通常产生70% 以上的转染效率。细胞可能表现出一些形态学的变化 (如细胞变得苗条) 由于无血清的条件。 - 在天 3–5, 继续培养转染细胞在37°c 孵化器与 5% CO2。
- 在5 天, 将细胞和含有病毒的介质收集到15毫升聚丙烯锥形管中, 吹打上下或用刮刀刮。
- 将样品存放在摄氏-80 摄氏度, 直到使用。
3. 斑点杂交法测定 AAV 定量
- 病毒微粒的恢复
- 在37摄氏度的水浴中迅速解冻冰冻的管子。将管子大力旋转1分钟, 以最大限度地从细胞中恢复 AAV。
- 将细胞碎片通过离心在 3700 x g 在4°c 为10分钟。取200µL 的上清从每管和转移到一个标记的离心管与螺钉帽的斑点印迹化验。
注: 将剩余的上清整除为离心管, 贮存于-80 摄氏度冷冻, 供日后使用。在这里, 使用的聚丙烯离心管连接螺钉帽和 O 形环。为了防止 AAV 和苯酚-氯仿的溢出, 需要严密的密封。
- 沙雷质限制性治疗
- 准备混合 a 和混合 B 试剂 (表 3)。添加10µL 混合 a 和10µL 混合 B 到每个管。涡流管为 5 s, 简要地旋转管收集液体到管子的底部和孵化管子在37°c 至少为 1 h。
注: 混合含有氢氧化钠, 并优化 pH 值治疗质限制性。混合 B 补充镁。质限制性在商业上可用的酶种群中的浓度可能有所不同。质限制性的体积需要相应调整, 以使 200 U/毫升后加入混合 A 和混合 B 成管在步骤3.2.1。
注: 潜伏期延长4小时, 可减少背景信号。 - 在孵化结束时, 用台式离心机简单地旋转管子, 从管子的顶端和两侧收集凝结和溶液。
注意: 协议可以在这里暂停。样品可以被存放冻结在-20 °c 或-80 °c。
- 准备混合 a 和混合 B 试剂 (表 3)。添加10µL 混合 a 和10µL 混合 B 到每个管。涡流管为 5 s, 简要地旋转管收集液体到管子的底部和孵化管子在37°c 至少为 1 h。
- 蛋白酶 K 治疗
- 准备混合 C 试剂 (表 3)。在每管中加入180µL 的混合 C。涡流管 5 s, 简要旋转管和孵化管在55°c 1 小时。
注: EDTA 在混合 C 试剂中螯合游离镁离子和钝化质限制性。 - 在孵化的最后, 允许样品达到室温, 并简要地旋转管与台式离心机收集冷凝和解决方案从顶部和两侧的管。
注意: 协议可以在这里暂停。样品可以被存放冻结在-20 °c 或-80 °c。要恢复该协议, 在55摄氏度处孵化出5至10分钟的管子, 完全溶解在缓冲器中的 SDS 晶体。
- 准备混合 C 试剂 (表 3)。在每管中加入180µL 的混合 C。涡流管 5 s, 简要旋转管和孵化管在55°c 1 小时。
- 苯酚-氯仿萃取与乙醇沉淀
- 在样品中加入200µL 苯酚-氯仿, 并将其涡旋1分钟. ≥16,100 x g 离心中的样品在室温下≥5最小。
注意: 苯酚-氯仿应在化学油烟机中处理, 并配备适当的个人防护设备 (PPE;例如, 丁腈橡胶手套, 护目镜或面罩, 和长袖的实验室大衣)。 - 将320µL 的水层 (160 µL 两次与 P200 吸管) 转移到一个新的标准离心管 (80% 的水中流体体积)。
注意: 在样品间取相同体积的水溶液是非常重要的, 否则化验结果就会失去定量的准确度。 - 准备混合 D 试剂 (表 3)。在每管中添加833µL 的混合 D。涡流管 5 s, 并孵化管在-80 °c 为≥20分钟。
注: 混合 D 是乙醇、醋酸钠和糖原的混合物, 用于方便乙醇沉淀 DNA。在这个步骤中, 样品可以存储在摄氏-80 摄氏度, 并且该协议可以在以后恢复。 - 离心样品与离心在≥16,100 x g 在4°c 为≥15极小. 在干净的纸巾上倒上清和涂抹一次。把大约500µL 70% 乙醇入每个管子, 漩涡管子为 5 s, 并且离心机管子与台式离心在≥16,100 x g 在4°c 为≥5分钟。
- 在干净的纸巾上倒上上清和涂抹一次。干颗粒在65°c;颗粒可以完全干燥。
注意: 不要使用吸管去除过量的乙醇, 在印迹后仍然残留。颗粒也可以在室温下干燥一夜。该协议可以暂停在这里, 干燥的 DNA 小球可以储存在室温下数天与管盖关闭。
- 在样品中加入200µL 苯酚-氯仿, 并将其涡旋1分钟. ≥16,100 x g 离心中的样品在室温下≥5最小。
- 病毒 DNA 在 TE 缓冲器中的泥沙
- 通过在室温下将每管30分钟的震动, 将120µL 中的 DNA 小球分解成1小时。
- 斑点印迹
- 质粒 DNA 标准的制备
- 稀释 AAV 载体基因组质粒 DNA 到水或三盐酸缓冲液中的10µL (10 毫米, pH 8.0)。采取25µL 的稀释和消化与适当的限制酶1小时进行线性化质粒 DNA, 在50µL 的反应量。
注意: 我们做了一组重复的消化 (见步骤 3.6.4.1)。适当的酶应该是切割斑点印迹探针结合区外的质粒 DNA 的一种。为方便起见, 稀释的质粒 DNA 可以 aliquoted (25 µL/管), 并储存在-20 摄氏度冷冻, 供将来使用。当试管在台阶3.5.1 时, 消化质粒 DNA。不要过度消化质粒 DNA 标准。 - 将450µL 的水或 TE 添加到含有消化质粒 DNA 标准的管中, 并进行彻底混合。将这种混合物的70µL 转移到一个新的1.5 毫升离心管, 1330 µL 水或 TE, 使稀释质粒标准 (25 pg/µL)。
- 按照表 4创建一组双折叠串行稀释 (600 µL/管)。将稀释彻底混合涡流5秒。
- 稀释 AAV 载体基因组质粒 DNA 到水或三盐酸缓冲液中的10µL (10 毫米, pH 8.0)。采取25µL 的稀释和消化与适当的限制酶1小时进行线性化质粒 DNA, 在50µL 的反应量。
- 标准和病毒 DNA 样本的变性
- 添加600µL 的2x 碱性溶液, 以每个标准稀释。混合涡流5至十年代. 室温孵育10分钟。
- 在每种病毒 DNA 样品中加入120µL 2x 碱性溶液。混合涡流5至十年代. 室温孵育10分钟。
- 设置斑点印迹装置
- 使用剪刀, 切割一个印迹 (如, 泽塔探针) 膜, 以适当的大小, 样本和标准的数量。将膜与水浸泡10分钟, 然后将其放置在斑点印迹装置上。覆盖膜设备上未使用的油井。
注: 用清洁镊子处理膜。为了覆盖空井, 可以使用与膜一起的浅蓝色保护片。在装订样品和标准之前, 不要让膜干燥。有关设备组装和使用的详细信息, 请参阅用户手册19。 - 将水添加到要装载样品的水井中。使用真空和拉水通过水井检查错误和重新测试时, 固定。在使用真空时重新拧紧螺钉以确保密封紧密。
注: 不完全密封可能导致井间样品渗漏。 - 一旦水完全通过, 完全释放真空 (即真空歧管应开放气压)。
- 使用剪刀, 切割一个印迹 (如, 泽塔探针) 膜, 以适当的大小, 样本和标准的数量。将膜与水浸泡10分钟, 然后将其放置在斑点印迹装置上。覆盖膜设备上未使用的油井。
- 对斑点印迹装置的装载标准和样品
- 将每个稀释质粒 DNA 标准的400µL 应用于各井, 并运行四道标准稀释。使用标准摘要的两个单独的整除数, 并将它们分别加载。应用每种病毒 DNA 样本的200µL/井。
注: 使用剩余的40µL 变性样品, 可以制备稀释的样品 (例如, 10 倍稀释样品使用20µL 样品加上180µL 1x 碱性溶液) 和涂抹, 如果必要的话。 - 应用柔和的真空, 通过井中提取 DNA 溶液。
注: 真空压力需要通过部分打开三路阀门来调整, 以便将真空压力应用于斑点印迹装置以及大气层 (即, 旋塞阀臂位于近似45°角度, 在那里它发出更响亮的吸入噪音)。 - 一旦所有的水井都清空, 通过调整三路阀门释放真空。添加400µL 的1x 碱性溶液, 每个井, 其中包含标准和样品。等待5分钟, 然后再应用真空, 以清空水井。
- 用同样的方法重新应用真空 (见步骤 3.6.4.2)。
- 在真空下拆卸斑点印迹装置, 取出膜, 并用 2x SSC 冲洗。将膜放在干净的纸巾上, 将 DNA 绑定面朝上移除多余的 2x SSC。
- 用适当的紫外交联剂将涂抹的 DNA 涂到膜上;膜现在已准备好进行杂交。
注: 湿膜可用于 UV 交联。干燥的 UV 交联膜可在室温下贮存。在材料表中可以找到进一步的信息。
- 将每个稀释质粒 DNA 标准的400µL 应用于各井, 并运行四道标准稀释。使用标准摘要的两个单独的整除数, 并将它们分别加载。应用每种病毒 DNA 样本的200µL/井。
- 质粒 DNA 标准的制备
- 杂交和洗涤
- 在65摄氏度的水浴中预热杂交缓冲。
- 酶标签一个 DNA 探针与放射性α-32P dCTP 和净化它使用商业可用的套件根据制造商的建议。
注意: 我们在病毒基因组中使用 0.5–2.0 kb 的长度的探针, 从增强启动子区域或蛋白质编码序列。尽管该协议使用32P 标记的放射性探针进行信号检测, 但也可以采用非放射性化学发光或荧光探针 (请参阅讨论部分)。 - 将膜放在一个杂交瓶与 DNA 绑定的一侧向上, 冲洗膜与5毫升 prewarmed 杂交缓冲, 并丢弃缓冲区。然后添加10毫升的 prewarmed 杂交缓冲, 并把瓶子放在一个旋转杂交烤箱设置在65摄氏度。旋转≥5分钟。
- 热变性20µL 10 毫克/毫升剪切鲱鱼或鲑鱼精子 DNA 溶液和32P 标记探针 (≥107 cpm) 为5分钟, 通过放置在一个热块设置在100°c。然后把它们放在冰上≥2分钟, 简单地旋转, 直到使用。
注意: 对于放射性 DNA 探针, 必须使用1.5 毫升的螺钉盖和 O 形环管。 - 快速将变性精子 DNA 和放射性探针添加到杂交瓶中的杂交缓冲中, 并在十年代将瓶子摇匀。将瓶子返回到65摄氏度烤箱, 并在65摄氏度的≥4上孵化瓶子。
- 一旦杂交完成, 停止旋转, 移除杂交瓶, 然后将放射性探针溶液倒入50毫升锥形管中, 并带有防漏塞密封盖。将探头存放在指定为放射性材料的冰箱中的适当容器中。
注: 使用的杂交缓冲器与探针存储在4°c 可以重新使用至少5次, 通过放置一个防漏插头密封盖, 其中包含杂交缓冲在100°c 水浴5分钟。 - 用洗涤缓冲器冲洗膜, 加热到65摄氏度。将20至30毫升的洗涤缓冲液添加到杂交瓶中, 旋转5分钟. 重复此洗涤2次。
注: 测量洗涤液的放射性, 并在当地研究所要求时记录。 - 洗膜时, 将荧光粉成像屏放在图像橡皮擦上5分钟。
- 第三次冲洗后, 将膜从杂交瓶中取出, 用纸巾去除膜上多余的缓冲液, 并将膜放在透明的塑料纸夹中。使用盖格计数器检查膜上的放射性信号。根据信号强度, 将拭除的荧光粉成像屏暴露在膜上10分钟至一夜。
- 使用荧光粉图像扫描系统扫描屏幕, 获取每个点的信号强度数据。
- 数据分析
- 使用电子表格和数据分析软件 (如Excel) 绘制标准曲线。
注: 对数对数线性回归用于绘制标准曲线。 - 通过插值确定每个病毒 DNA 样本的纳克当量 (ng-eq)。ng eq 是用来绘制标准曲线的质粒 dna 的数量, 相当于病毒 dna 分子的数量。当质粒 dna 的长度为 8000 bp 时, 单链 AAV 病毒 dna 1 的 ng eq 对应 2.275 x 108粒子。
注: 可通过以下方程式将 ng eq 转化为病毒粒子的数量:
AAV 粒子的数量通常被表达为 "vg" (向量基因组) 或 "DRP" (DNase 抗性粒子)。 - 计算起始物料的 AAV 浓度。因为被涂抹的病毒 dna 代表
66.7% 的病毒 dna 在起始材料, 1 ng eq 对应 1.7 x 109粒子/毫升
。
注意: 如果起始材料中包含的所有病毒 DNA 都在无损耗的膜上涂抹, 则不需要进行这种校正 (见图 1)。
- 使用电子表格和数据分析软件 (如Excel) 绘制标准曲线。
66.7% 的病毒 dna 在起始材料, 1 ng eq 对应 1.7 x 109粒子/毫升
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Representative Results
如图 1所示, 在大规模生产的纯化 AAV 矢量种群定量斑点印迹的一个代表性结果。用这种斑点杂交法测定了双绞股 AAV2G9-CMV-GFP 载体的滴度。用两轮氯化铯 (中海) 密度梯度离心和前述20的透析纯化了该载体。一般而言, 对于纯化的 AAV 向量股, 每 AAV 矢量股的三种不同体积 (例如, 0.3 µL、0.1 µL 和0.03 µL) 都受到上面描述的斑点杂交程序的重复修改。DNase I 酶 A 是用来代替S. 质限制性在步骤3.2 中, 和一个商业上可用的工具包提取和纯化病毒 DNA 在步骤3.4 中使用 (见材料表)。在图 1所示的示例中, 从每个质粒 dna 标准 (图 1A) 中获得的信号强度值 (任意单位) 都是根据已知的 dna 数量绘制的, 以绘制标准曲线 (图 1B), 显示了相关系数为0.998。利用这一标准曲线, 通过插值确定0.3、0.1 和0.03 µL 整除数的 AAV2G9 向量显示1.487 和 1.522 ng (0.3 µL), 0.487 和 0.507 ng eq (0.1 µL), 0.158 和 0.171 ng eq (0.03 µL)。这给出了以下六值: 4.957, 5.073, 4.870, 5.070, 5.267, 和 5.700 ng-eq/µL 为这个特定的 AAV2G9 向量股票, 导致平均 5.16 @ 0.27 ng-eq/µL (平均 @ SD)。由于作为标准的质粒的长度 (pEMBL-CMV) 是 5848 bp, 这个 AAV2G9 向量的效价根据等式 2在步3.8.2 被确定是 8.0 x 1011 vg/mL。这种检测至少重复两次, 以确定 AAV 向量种群的最终滴度。
图 2显示了通过交叉互补分析来评估 VP3 衣壳装配中的依赖分子和 AAPs 组装 VP3 蛋白质的能力。AAV 的体外研究往往不需要病毒纯化得出结论, 而使用粗病毒制剂如粗细胞裂解物和含病毒培养基的实验则足以产生有意义的结果。在本实验中, 从 AAV5、AAV9 和蛇 AAV 的所有可能的 AAV VP3-AAP 组合中评估了 AAV 病毒颗粒的产生, 其中包括 VP3-no 的复方, 采用定量斑点印迹法。在一组重复实验中获得的样品被涂抹在1x 和10x 稀释 (分别设置 a 和 B,图 2A)。图 2B所示的图总结了点的定量分析。结果表明: (1) AAV5VP3 装配无论是在反式中提供的, (2) AAP5 和 AAP9 可以促进 AAV9VP3 衣壳装配虽然 AAP5 功能不如 AAP9 有效, (3) AAP5 和 AAP9 都没有展示一个装配促进活动在蛇 AAV VP3, (4) 蛇只促进蛇 AAV VP3 组装。(1) 和 (2) 与以前的观测6一致, 但蛇 AAV 独特的 AAV VP3-AAP 相互作用是本实验的新发现。基于定量斑点杂交的交叉互补检测的一个缺点是, 负控制总是显示出可被完全消除的背景信号的可观水平。因此, 斑点杂交检测本身不能排除的可能性, 衣壳组装到一个水平低于敏感性的检测。在这方面, 应该指出, 为了产生负面的控制, 使用一个条件, AAV 病毒基因组在没有衣壳 VP3 蛋白的情况下成倍地复制。这种负控制可以由转染 HEK 293 细胞产生, pAAV-记者, pHLP 代表, pHelper (表 2), 并用于减少误报。
DNase 我已经被广泛地用作斑点杂交和 qPCR 的核酸酶, 以 AAV 定量去除残留的质粒 dna 和无包装病毒基因组, 已污染 AAV 制剂。这些污染物否则会导致过高的滴度;因此, 核酸酶消化是准确量化病毒基因组滴度的一个非常重要的步骤。DNase 我的酶可从各种制造商和商业供应商;然而, 在 AAV 定量中选择 DNase I 的重要性似乎已被低估。为了调查核酸酶的选择如何影响斑点印迹检测的结果, 对以下三核酸进行了比较, 以使其能够从上述步骤2中所述的 AAV 向量培养基中去除背景信号。和 3: DNase i 酵素 A, DNase i 酵素 B, 并且S. 质限制性 (材料表)。发表的研究使用了前两个 DNase I 酶13,21,22,23,24 , 我们一直在使用S. 质限制性在以前和当前研究。令我们吃惊的是, DNase i 酶 A 在各种条件下都不适合使用含有病毒的介质进行斑点印迹检测, 从而产生来自负控制的高背景信号, 而 DNase i 酶 B和s. 质限制性有效地减少了背景信号与 DNase I 酵素 B 是2倍比 S 更有效比质限制性 (图 3A, B)。DNase I 酶 C 也被发现是非常有效的减少背景信号 (没有显示的数据)。这些数据表明, 当酶反应在粗 AAV 制剂中进行的时候, 商业可用核酸中的酶活性有显著差异, 尽管核酸酶消化应该是有效的, 当一个小在优化条件下处理纯化病毒眼影的数量。因此, 这些数据突出了正确选择的核酸酶在检测时, 粗 AAV 制剂进行定量斑点杂交或 qPCR 化验的重要性。
图 1: 一个代表性斑点印迹分析, 以确定中海纯化 AAV 载体的效价.(a) HEK 293 细胞采用标准的无腺病毒三质粒转染法在大尺度上生产双股 AAV2G9-CMV-GFP 载体, 并经两轮中海中梯度离心纯化, 其次为透析。0.3、0.1、0.03 µL 的纯化 AAV 载体 (涂抹在最右侧的柱上) 均采用两套重复质粒 DNA 标准 (std) 重复进行定量斑点杂交试验。该印迹与32P 标记的 GFP 探针 (0.77 kb) 杂交, 并利用荧光粉图像扫描系统获得图像。(B) 显示已知质粒 DNA 数量 (ng eq、X 轴) 与点强度 (任意单位 (AU)、Y 轴) 之间关系的标准曲线。用荧光粉图像扫描系统得到了 Y 轴上的数字。R 表示皮尔逊的相关系数。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: AAV VP3-AAP 交叉互补斑点杂交法.对 AAV5、AAV9 和蛇 AAV 的 VP3 蛋白进行双链 AAV-CMV-GFP 矢量粒子的生产, 在它们同源 AAPs 的存在或缺失的情况下, 或在异源的 AAPs 存在下进行测试。(a) 该化验是在一组生物复制的实验 (设置 A 和组 B) 与S. 质限制性4小时的潜伏期, 并从每个组合获得的 AAV 矢效度由一个定量点确定在 "协议" 部分中描述的污点方法。每个点代表 2/3 (第五和第六行, 66.7%) 或 2/30 (第七和第八行, 6.7%) 的 DNA 从每200µL 从样本收集的培养基或阴性对照。前四行 (第一至第四行) 表示两套质粒 DNA 标准 (std 1 和 std 2) 被重复涂抹 (即线性化 pEMBL-cmv-gfp 质粒, 这是用于双链 AAV-cmv-gfp 载体生产的质粒)。用32P 标记的 GFP 探针探测斑点印迹膜。用圆角矩形表示的一对点是负控制。前两行 (std 1) 是从原始印迹的底部, 但已被切割和移动到顶端, 而不改变图像强度, 以显示质粒标准 (std 1 和性病 2) 并排。此操作用图中的黑线表示。(B) 用斑点印迹法测定 VP3 和蛋白质的组合蛋白的病毒滴度。图表示一组生物 quadruplicated 的数据, 两个从面板 a 和两个从另一个斑点印迹, 没有显示。误差线表示平均值 +/-SD (n = 4)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 粗 AAV 载体中不同核酸酶活性的比较.(a) 定量斑点印迹, 显示每种核酸酶治疗消除背景信号的有效性。采用 HEK 293 细胞转染质粒 dna, 对其进行了双链 AAV9-CMV-GFP 载体制备 (AAV9 载体) 和 "无衣壳控制", 并进行了试验。无衣壳控制不包含病毒微粒, 但包含指数放大无包装的 CMV-GFP 载体基因组。氯化镁2被补充了在一个或三次推荐的数量 (6 毫米和18毫米为 DNase i 酵素 A; 并且2.5 毫米和7.5 毫米为 DNase I 酵素 B), 不用考虑0.8 毫米 MgSO4当前在媒介。对于质限制性的治疗, 仅对协议部分描述的一个条件进行了测试。所有样品均以每核酸酶1小时处理。用32P 标记的 GFP 探针探测斑点印迹膜。右两列 (std 2) 是从原始印迹的左侧, 但已被切割和移动到右侧, 而不改变图像强度, 以显示质粒标准 (std 1 和性病 2) 并排。此操作用图中的一条细黑线表示。(B) A 组的无衣壳控制样本中的点被量化并显示为平均值, 即每个值均值 |。七在12个样品处理与 DNase I 酵素 A (用星号表明) 显示价值仅略高于最高的标准;因此, 它们被包含在这个图表中进行比较。请单击此处查看此图的较大版本.
| 沙雷质限制性缓冲区 | |
| 50毫米三盐酸 | |
| 2毫米氯化镁2 | |
| 用4米氢氧化钠调节 pH 值8.5。 | |
| 10x 蛋白酶 K 缓冲器 | |
| 100毫米三盐酸 pH 值8。0 | |
| 100毫米 EDTA pH 值8。0 | |
| 5% SDS | |
| 2x 碱性溶液 | |
| 800毫米氢氧化钠 | |
| 20毫米 EDTA | |
| 20x SSC (1L) | |
| 175.3 克氯化钠 | |
| 88.2 克柠檬酸钠三元 (Na3C6小时5O7) | |
| Denhardt 的解决方案 100x (50 毫升) | |
| 1克牛血清白蛋白 (分数 V) | 注: 过滤是至关重要的, 以消除小粒子, 因为它们导致背景杂交信号。 |
| 1克聚蔗糖400 | |
| 1克 Polyvinylpyrrolidone | |
| 溶解在20毫升水在55°c 水浴。 | |
| 调整最终音量为50毫升。 | |
| 过滤消毒用0.22 微米过滤器。 | |
| 杂交缓冲 | |
| 1% SDS | 注: 在使用前, 在4摄氏度和热至65摄氏度的水浴中贮存杂交缓冲器。 |
| 6x SSC | |
| 5x. Denhardt 的解决方案 | |
| 10毫米三盐酸 pH 值8。0 | |
| 洗涤缓冲器 | |
| 0.1% SDS | |
| 0.1x SSC | |
| 聚乙烯亚胺 (裴) 溶液 (1 毫克/毫升, 500 毫升) | |
| 在450毫升的水中加入500毫克的裴, 搅拌。 | 注: 对于较长的存储, 建议使用-80 摄氏度。 |
| 加入浓缩盐酸, 使 pH 值降低到 < 2.0 溶解裴 (约800µL 的 HCl 将需要)。 | |
| 加入10米氢氧化钠, 将 pH 值增加到 7.0 (大约需要500µL 的10米氢氧化钠)。 | |
| 调整体积为500毫升的水。 | |
| 过滤消毒用0.22 微米过滤器。 | |
| 整除和存储在-20 摄氏度。 | |
| 苯酚-氯仿 (1:1 混合) 定量斑点印迹 | |
| 在50毫升聚丙烯锥管中加入缓冲饱和苯酚 (pH 值 8.0) 和氯仿, 在1:1 的比例。 | 注: 覆盖有机层的缓冲物, 如果留在管中, 可以通过吹打进行取样管, 并可能使化验不准确。 |
| 把管子大力搅拌。 | |
| 允许离心相分离, 然后完全去除水层。 | |
| 存储在4摄氏度。 | |
表 1: 解决方案和缓冲食谱.用于完成量化点杂交协议所需的解决方案和缓冲区的配方。
| 质 粒 | (+) (微克) | (-) (微克) | 负控制 (微克) | 转染控制 (微克) |
| pCMV-AAVx-VP3 | 0。4 | 0。4 | ||
| pCMV 旗-AAPx | 0。4 | |||
| pAAV-记者 | 0。4 | 0。4 | 0。4 | |
| pHLP-代表 | 0。4 | 0。4 | 0。4 | |
| pHelper | 0。4 | 0。4 | 0。4 | |
| pCMV (空) | 0。4 | 0。8 | ||
| pCMV-GFP | 2。0 | |||
| 总 | 2。0 | 2。0 | 2。0 | 2。0 |
表 2: 以6井板格式进行的 AAV VP3-AAP 交叉互补试验的质粒组合.HEK 293 细胞转染在每个实验组中所用的质粒 dna 的组合。pCMV-AAVx-VP3, 一种表达 AAV 血清 x (x = 1, 2, 3等) VP3 蛋白在巨细胞病毒-IE 增强促进剂下的质粒;pCMV-AAPx, 一种表达 AAV 血清 x (x = 1, 2, 3等) 的质粒, 在巨细胞病毒-IE 增强剂-促进剂下的蛋白;pAAV-记者, 一种具有两个 AAV2 倒置终端重复 (ITRs) 的质粒, 用于重组 AAV 载体的生产;pHLP-代表, 表达 AAV2 代表蛋白的质粒;pHelper 腺病毒辅助质粒;pCMV (空), 用空质粒添加控制实验条件;pCMV-gfp, 一种表达荧光标记基因 (如gfp) 以验证成功转染的质粒。Transfections 在6井板中进行, 共使用2µg 质粒 dna。
| 混合一个 | 10管 (ul) |
| 沙雷质限制性缓冲区 | 91。2 |
| 0.1 米氢氧化钠 | 8。8 |
| 总 | 100 |
| 混合 B | 10管 (ul) |
| 沙雷质限制性缓冲区 | 91。2 |
| 1 M 氯化镁2 | 7.04 |
| 沙雷质限制性 (250 个单位/ul) | 0.176 |
| 总 | 100 |
| 混合 C | 10管 (ul) |
| 10x 蛋白酶 K 缓冲器 | 400 |
| 蛋白酶 K (20 毫克/毫升) | 100 |
| H2O | 1300 |
| 总 | 1800 |
| 混合 D | 10管 (ul) |
| 100% 乙醇 | 8000 |
| 3米醋酸钠 (pH 5.2) | 320 |
| 牡蛎糖原 (20 毫克/毫升) | 10 |
| 总 | 8330 |
表 3: 主混合试剂清单.混合 a 和混合 B 用于S. 质限制性治疗在步骤3.2。这两种混合物应分别制成, 以防止氢氧化镁的沉淀。混合 C 用于蛋白酶 K 处理在步骤3.3。混合 D 用于乙醇沉淀在台阶3.4.3。表中所示的体积为10管的主混合试剂。
| 质粒 DNA 标准 (ng) | 容量 (µL) 25 页/µL 质粒 DNA 标准溶液 | 水的容量 (µL) | 总容积 (µL) |
| 5 | 600 | 0 | 600 |
| 2。5 | 300 | 300 | 600 |
| 1.25 | 150 | 450 | 600 |
| 0.625 | 75 | 525 | 600 |
| 0.313 | 37。5 | 562。5 | 600 |
| 0.156 | 18。8 | 581。2 | 600 |
| 0.078 | 9。4 | 590。6 | 600 |
| 0.039 | 4。7 | 595。3 | 600 |
表 4: 定量斑点杂交质粒 DNA 标准.25页/µL 质粒 dna 标准溶液和水或 TE 制备质粒 dna 标准的必要体积为两倍的串行稀释 (600 µL/管)。质粒 dna 标准柱 (0.039 至 5) 的数量是每个质粒 dna 标准溶液的200µL 中 dna 的数量。
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Discussion
本文介绍了定量斑点杂交检测 AAV AAPs 的应用及其在衣壳装配中的作用。从这些研究中获得的知识可以对 AAV 衣壳组装过程中的先天差异和不同血清型间 AAPs 的功能作用提供详细的见解。在这方面, AAV VP3-AAP 交叉互补斑点杂交法揭示, 蛇 AAV VP3 显示了严格依赖于其同源的联合表达的衣壳组装和蛇, 不促进外源血清型衣壳组装.这一观察很有趣, 因为以前调查过的 AAV 血清型 (AAV1、2、3、6、7、8、9和 12) 都能够通过使用异源的方法, 至少在某种程度上处理组装.
定量斑点或缝隙杂交是一种传统的方法, 以定量的多种样品中的核酸同时在方便的方式25。该方法已广泛用于 DNA 和 RNA 定量, 直到 qPCR 流行在二十世纪九十年代26,27。虽然 qPCR 有优势比定量斑点杂交和其他基于杂交的化验在那 qPCR 陈列一个更高的灵敏度和更大的动态范围, 它也运载一个固有风险在不知不觉地增加的错误, 是情况对于由 qPCR13、23确定的 AAV 向量股的滴度。定量斑点杂交检测是很容易建立的成本低廉, 只要研究人员能够获得一个定量的分子成像系统, 可以获得与放射性探针杂交的斑点杂交膜信号, 或非放射性化学发光或荧光探针。尽管该协议利用32P 标记的放射性探针进行信号检测, 但其他人成功地使用了直接标有商用耐热碱性磷酸酶28的非放射性 DNA 探针。斑点杂交化验使用一个直截了当的原则, 而化验本身并不构成对表演者的技术挑战;因此, 即使没有经验的人, 结果也通常是可重现的。
除了这里描述的应用, 我们通常使用一个简化和加速版本的斑点印迹程序, 可以半定量 AAV 粒子快速。斑点印迹检测在这方面的优势包括: (1) 该化验不需要纯化或酶扩的病毒基因组需要数小时, (2) 热和碱性变性的结合足以打破样品中的 AAV 颗粒解决方案, 并释放变性病毒基因组到解决方案, 准备绑定到斑点杂交膜, (3) 在样品中高浓度盐的存在并没有显著影响化验结果。例如, 有可能半定量 AAV 颗粒在中海富的解决方案 (例如, 由中海密度梯度离心获得的分数), 把一个小的整除 (≤10µL) 的样品放入100µL 1x 碱性溶液, 加热100°C 为10分钟, 并涂抹在有或没有标准预先准备的膜上, 其次是15分钟杂交, 3 x 3 分钟洗涤和暴露在荧光粉成像屏幕上15分钟 (或更长的时候, 使用探针与减少的放射性)。当用户熟悉程序后, 整个过程可以在1小时内完成。我们使用这种快速方法, 我们通常称之为 "沸腾斑点杂交法", 以确定 AAV 颗粒丰富的中海馏分在媒介纯化过程中, 并粗略地确定纯化 AAV 的载体的效价, 然后开始广泛的向量特征的过程。因此, 虽然斑点杂交化验可能被视为一种过时的方法来量化核酸, 并已取代了各种 PCR 方法在广泛的科学学科, 还有许多优点, 这种方法, 应让研究人员考虑在实验室里使用它。
协议中最关键的一步是对样本的核酸酶处理。如果不在最佳条件下执行此步骤, 则会导致高背景信号。我们使用S. 质限制性而 DNase 不同来源的酶在其他实验室中被广泛应用于病毒 DNA 定量。牛胰腺起源的 DNase 是研究人员最广泛使用的。这部分是因为牛胰 DNase I 第一次鉴定和最广泛的特点生化29。目前从商业供应商那里获得的 DNase 酶是由几种不同的生物来源, 如毕赤酵母(DNase I 酶 A), 从牛胰腺纯化的原生形态 (例如, DNase I 酶 B), 和在酵母种或大肠杆菌中产生的重组酶 (DNase I 酶 C)。我们发现, 这些不同来源的三 DNase 酶已被用于 AAV 载体定量研究;然而, 据我们所知, 以前的研究都没有研究不同来源的酶是否同样有效地消化 AAV 载体制剂中的 DNA 分子。应该指出的是, DNase I 治疗 AAV 向量检测往往是在非优化条件下, 由于存在的杂质来自培养基和细胞。DNase I 酶 A 仅部分活跃于我们所使用的培养基中的观察, 对于设计 AAV 向量定量的斑点印迹和 qPCR 的检测有重要意义, 并提醒研究人员注意这一先前未确定的问题。在这方面,质限制性表达的大肠杆菌, 是一个理想的限制性, 不仅是为了制造 AAV 的载体, 但也为 AAV 向量定量。这是因为它的酶活性可以保留在广泛的 pH 值和镁离子和单价阳离子的浓度。由于这个原因, 而且因为s. 质限制性的价格比 DNase I 酶 B 的成本低2倍, 所以我们更愿意在常规的定量斑点杂交分析中使用s. 质限制性。
总之, 定量斑点杂交化验是一个相对简单的程序, 可以随时提供信息的能力, 在不同的条件下产生病毒粒子。与替代 titering 方法 (如 qPCR) 相比, 这种方法需要很少的优化。它也可以很容易地应用于任何血清型的向量, 并且可以用来在不修改协议的情况下, 对单和双链矢量进行效价。在 transfections 和收获的 AAV 载体样品 (培养基和/或细胞) 后, 整个协议可以在一天内完成, 从而迅速回答问题, 从不同的条件下产生病毒粒子的能力, 包括AAV VP3 和蛋白的各种组合。定量斑点印迹提供了一个权宜之计的方法来解决各种未回答的问题, 关于 VP 的相互作用及其在衣壳组装中的作用, 在各种不同的 AAV 血清型和分离株。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢小肖在北卡罗来纳大学教堂山为我们提供了 pEMBL-CMV-GFP 质粒。我们感谢克里斯托弗和塞缪尔. 黄对手稿的批判性阅读。这项工作得到公共卫生服务补助金 (NIH R01 NS088399 和 T32 EY232113) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benzonase | MilliporeSigma | 1016970001 | Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text. |
| DNase I | Roche | 4716728001 | Referred to as DNase I Enzyme A in the main text. |
| DNase I | Invitrogen | 18047019 | Referred to as DNase I Enzyme B in the main text. |
| DNase I | New England Biolabs | M0303L | Referred to as DNase I Enzyme C in the main text. |
| 1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes | Corning | 430909 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352097 | |
| 3 M Sodium Acetate | Teknova | S0298 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 430291 | |
| AAV-293 Cells | Agilent | 240073 | HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions. |
| AccuGENE 0.5 M EDTA Solution | Lonza | 51234 | |
| AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
| AccuGENE 10% SDS | Lonza | 51213 | |
| AccuGENE 1X TE Buffer | Lonza | 51235 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A3294 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Chloroform | MilliporeSigma | 372978 | |
| DNA Extractor Kit | Wako Pure Chemical Industries | 295-50201 | This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) | Lonza | 12-614F | |
| ElectroMAX DH10B Cells | Thermo Fisher Scientific | 18290015 | |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 1500-500 | |
| Ficoll 400 | Alfa Aesar | B22095 | Referred to as Polysucrose 400. |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axiovert 40 CFL | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Herring Sperm DNA | Invitrogen | 15634-017 | |
| Hybridization Tubes | Thermo Fisher Scientific | 13-247-150 | |
| ImageQuant TL | GE Healthcare Life Sciences | ImageQuant TL | |
| L-glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | MilliporeSigma | M0250 | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| Mini Quick Spin DNA Columns | MilliporeSigma | 11814419001 | |
| pAAV-RC2 Vector | Cell Biolabs Inc | VPK-422 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline | Lonza | 17-516F | |
| Phosphorimaging Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Phosphorimaging Screen | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 23966-2 | |
| Polyvinylpyrrolidone | MilliporeSigma | P5288 | |
| Prime-It II Random Primer Labeling Kit | Agilent Technologies | 300385 | |
| Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA CGACGATGACAAA-N25 |
MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Proteinase K Solution | Invitrogen | 25530-049 | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs | Various | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Serological Pipettes | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-10 | |
| Sodium Citrate Tribasic Dihydrate | MilliporeSigma | C8532 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| Thermal Cycler | Eppendorf | 6321000515 | |
| Tissue-culture Treated 6-well Plate | Corning | 353046 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28955809 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| UV Crosslinker | Spectroline | XLE-1000 | Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2. |
| Zeta-Probe Membrane | Bio-Rad | 162-0165 |
References
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