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Biology

AAV 적정 및 Adeno 관련 바이러스 어셈블리 활성화의 기능 평가 대 한 그것의 사용에 대 한 양적 점 오 점 분석 결과 단백질

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56766
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

Summary

이 원고 내용을 adeno 관련 바이러스 (AAV) titers 및 어셈블리 활성화의 역할을 연구의 응용의 정량에 대 한 간단한 점 오 점 분석 결과 단백질 (AAPs), 모든 AAV에 구조 비 바이러스 성 단백질의 새로운 클래스 serotypes capsids 동족과 분리 AAV serotypes에서 파생 된의 어셈블리를 홍보에.

Abstract

Adeno 관련 바이러스 (AAV)은 유전자 치료를 위한 매력적인 벡터로 널리 허용 된다, 그러나 그것은 또한 바이러스 생물학을 이해 하기 위한 모델 바이러스 역할. 후자의 점에서 어셈블리 활성화 단백질 (AAP), 불리는 비 구조 AAV 단백질의 최근 발견은 capsid에 바이러스 성 capsid 부사장 단백질의 조립에 관련 된 프로세스에 새로운 빛을 발산 하 고. 많은 AAV serotypes 어셈블리에 대 한 AAP를 필요, 우리는 최근 보고는 AAV4, 5, 11는이 규칙에 예외. 또한, 우리는 AAPs 및 다른 serotypes의 조립된 capsids 다른 subcellular 구획을 지역화 설명 했다. 생물 학적 속성 및 다른 AAV 중 AAPs의 기능적인 역할에이 예기치 않은 serotypes 밑줄 다양 한 serotypes에서 파생 된 AAPs에 대 한 연구의 중요성 이 원고는 AAV 정량 및 capsid 어셈블리에서 AAP 종속성 및 serotype 특이성을 평가 하는 응용 프로그램에 대 한 간단한 점 오 점 분석 결과 자세히 설명 합니다. 이 점 오 점 분석 결과의 유틸리티를 보여, 우리가 밖으로 설정 capsid 어셈블리 및 AAP 종속성 뱀 AAV 이전 새롭거나 파충류 AAV로 AAV5, AAV9, AAP 독립 및 AAP 종속 이전에 표시의 특성 serotypes, 각각. 분석 결과 뱀 AAV capsid 어셈블리 뱀 AAP를 요구 한다 AAV5와 AAV9에서 AAPs에 의해 승진 될 수 없습니다 밝혔다. 분석 결과 또한, 많은 일반적인 serotype AAPs 상호 보완성으로 분리 capsid 어셈블리를 홍보 하는, 달리 뱀 AAP 홍보 하지 않습니다 AAV9 capsids의 다는 것을 보여주었다. 또한, 우리 nuclease의 선택은 크게 점 오 점 분석 결과의 판독에 영향을 하 고 따라서, 최적의 효소를 선택 하는 것은 AAV titers의 성공적인 평가 위해 매우 중요 표시.

Introduction

Adeno 관련 바이러스 (AAV) 작은, 비 싸여, 단일 가닥 DNA 바이러스 게놈의 약 4.7 kilobases (kb)입니다. AAV 게놈 오픈-독서 프레임 (ORFs) 담당자 와 모자 유전자에 대 한 포함 되어 있습니다. 2010 년 이전 미확인된 nonstructural 단백질 AAV2 모자 유전자 내에서 + 1 프레임 이동 ORF 의해 월요일 외 에 의해 발견 되었고 발견 바이러스에 AAV2 capsid 부사장 단위체 단백질의 조립에 중요 한 역할을 capsid1. 이 비 발한 단백질은 capsid 어셈블리1을 추진에서 역할 그것 후 어셈블리 활성화 단백질 (AAP) 선정 되었습니다.

ORFs AAP에 대 한 모든 parvoviruses 속 Dependoparvovirus, 내만 내 parvovirus 가족1,2의 다른 속의 바이러스의 게놈의 유전자 확인 된 bioinformatically 되었습니다. 이 비 발한 단백질의 기능 연구는 AAP AAV2 프로토 타입에서 (AAP2), AAP2의 필수적인 역할에 완전히 그들의 축적과 형성에 대 한 핵소체 unassembled 부사장 단백질을 대상으로 설립에 초점을 처음 했다 조립 capsids1,,34. 압 식의 부재에 조립 하는 AAV2 capsids의 무 능력은 독립적으로 되어1,2,,34,5 우리를 포함 한 여러 그룹에 의해 확인 . AAV serotypes 1, 8, 및 9에 대 한 후속 연구 capsid 어셈블리, AAV1, 8의 VP3 단위체 단백질에에서 AAPs의 중요 한 역할을 뒷받침 9 AAP2의 공동 식의 부재에서 완벽 하 게 조립된 capsid를 형성 하지 못했습니다.

최근, 양적 점의 사용을 포함 하는 접근 방법을 통해 분석 실험을 오 점, 우리 조사 수 AAV1의 12 VP3 단위체에서 VP3 단위체의 홍보 12 capsids 압 식의 부재와 AAP1의 능력으로 조립 분리 serotypes입니다. 이 연구는 밝혔다 그 AAV4, 5, 및 11 VP3 단위체 AAP 없이 어셈블할 수 있습니다. 또한, 그것은 8 12 AAP serotypes 우리가 검사에서 발견 되었다 (즉, 모든 AAP4, 하지만 5, 11 및 12) AAP4, 5, 11 및 12에 표시 하는 동안 분리 AAV serotype capsids capsid 집합을 지원 하기 위해 광범위 한 능력을 표시는 실질적으로 이 관계6제한 된 능력입니다. 이 4 개의 serotypes phylogenetically 먼 다른 AAP serotypes2,3에서 있습니다. 또한, 연구는 다른 AAPs6의 subcellular 지 방화에서 중요 한이 발견 했다. 또한, 연구는 조립된 capsids과 핵소체, AAV2 capsid 어셈블리의 특징 AAP의 단단한 협회 AAV5를 포함 하 여 다른 serotypes에 반드시 확장할 수 없습니다 제안 했다 8, 및 9의 nucleolar 제외 표시 조립된 capsids6. 따라서, 어떤 특정 serotype AAP의 연구 로부터 얻은 정보는 모든 AAP 생물학에 광범위 하 게 적용 되지 않습니다. 압 하 고 생물학의 수수께끼 같은 자연 밑줄 정규 및 비정규 AAV serotypes에서 각 AAP의 기능과 역할을 조사 하는 필요.

Capsid 어셈블리에서 AAP의 생물학 역할 완전 포장 AAV 바이러스 성 입자 titers에서에서 생산 인간 미 발달 신장 (HEK) 293 세포, AAV 벡터 생산, 또는 AAP 단백질 없이 가장 일반적으로 사용 되 셀 라인을 확인 하 여 평가 될 수 있다 식입니다. AAV 정량의 표준 방법으로는 정량적 PCR (정량)-근거한 분석 실험7,8 및 양적 점 오 점 기반 분석 실험9. 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과10,11 등 광학 밀도 측정12 AAV 바이러스 성 입자 정량에 대 한 다른 방법 많은 다른 AAV serotypes에서 파생 된 시료에 적합 하지 않습니다. 불순물 (원유 lysates 또는 문화 미디어), AAV 연구에 사용 되는 예제는으로 오염. 현재, 정량은 가장 널리 사용 되 AAV 정량; 그러나, 그것은 잠재적인 주의 정량 기반 분석 결과, 분석 결과로 체계적 오류 및 중요 한 titer 유사13,14귀 착될 수 있다 인정 하는 데 필요한. PCR 기반 분석 실험은 잠재적으로 혼동 요인, 증폭13을 억제 하는 PCR 서식 파일에서 covalently 닫힌된 터미널 헤어핀의 존재 등의 숫자에 의해 영향을 받습니다. 심지어 경험이 개인 잠재력을 소개 수 정량 기반으로 혼동 요인 시험13의 무의식적으로. 반면, 양적 점 오 점 분석은 게놈 증폭을 포함 하지 않는 매우 간단한 원리를 사용 하 여 정량 기반 분석 실험에 비해 오류의 위험을 최소화 하는 고전 분자 생물학 기술. 방법은 덜 기술적으로 도전; 따라서, 시험 결과 미숙한 개인에 의해 합리적으로 재현.

이 보고서에서 우리는 양적 점 오 점 분석 결과 우리가 일상적으로 AAV 벡터 정량에 대 한 사용 하 고 어떻게 공통 AAPs의 어셈블리 홍보 역할 연구 분석 결과 적용 하려면 serotypes (AAV5 및 AAV9) 및의 예를 제공의 방법론 세부 설명 뱀 AAV14에서 이전 새롭거나 AAP 자연, AAV 부사장 단백질 및 AAP 단백질 단일 유전자 (즉, 부사장-AAP cis-보완성), 동안 여기서 설명 하는 분석 결과에서에서 cis에서 표현 됩니다, 그리고 부사장 및 AAP 단백질 (즉, 부사장-압 하 고 두 개의 별도 플라스 미드에서 트랜스에서 공급 된다 트랜스-보완성)입니다. 이후 다른 serotypes에서 각 부사장 또는 AAP 단백질 각 독립적인 플라스 미드에서 표현 될 수 있다, 그것은 capsid 어셈블리 (즉, 부사장-AAP 크로스-보완성) 분리 부사장 AAP 조합을 테스트할 수 된다. 간단히, 다양 한 serotypes에서 AAV VP3 HEK 293 세포 존재 또는 부재의 동족 serotype AAP, 또는 분리 serotype AAP의 존재는 AAV 벡터 게놈을 포장 하는 플라스 미드 DNA transfection에 의해 표현 된다. 생산, 다음 문화 미디어와 세포 lysates capsid 셸 내 바이러스 성 게놈을 계량 점 오 점 분석 결과를 받게 됩니다. 점 오 점 분석 결과의 첫 번째 단계 샘플 샘플에 오염 플라스 미드 DNAs 및 비포장된 AAV 게놈을 제거 하는 nuclease 치료 하는 것입니다. 이렇게 하지 않으면 것 증가 배경 신호 특히 unpurified 샘플 분석. 이것 다음 바이러스 성 capsids 휴식과 샘플 솔루션으로 nuclease 내성 바이러스 성 게놈을 풀어 효소 처리에 의해 선행 된다. 다음, 바이러스 성 게놈 변성, 막에 얼룩이 고 정량에 대 한 바이러스 성 게놈 관련 DNA 프로브 때 교배. 여기 보고 예제 분석 결과 보여 줍니다 뱀 AAV VP3 capsid 어셈블리에 대 한 뱀 AAP를 요구 하 고 뱀 압 달리의 홍보 또한 수 AAP 종속 serotypes에서 파생 된 AAPs의 많은 AAV9 capsids 어셈블리를 홍보 하지 않습니다. 분리 serotype capsids입니다. 마지막으로, 우리 정량 하는 중요 한 경고를 보고 또는 점 오 점 기반 AAV 정량 분석 실험 nuclease의 크게 시험 결과 영향을.

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Protocol

참고: 솔루션 및이 프로토콜에 대 한 필요한 버퍼 조리법은 표 1에 제공 됩니다. 아래에 설명 된 프로토콜 capsid 어셈블리에서 AAP 단백질의 역할을 연구 부사장 AAP 상호 보완성 점 오 점 분석 결과입니다. 순화 AAV 벡터 적정에 대 한 보다 일반적인 양적 점 오 점 분석 결과 대 한 방법은 대표 결과 섹션에서 설명 합니다.

1. 건설 VP3, AAP, 플라스 미드를 표현 하는 AAV2 담당자

  1. PCMV-AAVx-VP3 (x = serotypes)의 건설
    1. 고 충실도 DNA 중 합 효소와 다음 뇌관 쌍을 사용 하 여 전체 VP3 ORF (1.6 kb) PCR 증폭: VP3 앞으로, CTAA-RE1-CACC-N25 (VP3 ORF의 처음 25 뉴클레오티드); VP3 역, TCTT-RE2-N25 (VP3 ORF의 마지막 25 뉴클레오티드).
      참고: RE1 및 RE2는 복제에 대 한 제한 효소 (REs)에 대 한 사이트. CTAA와 TCTT는 터미널 5' 그리고 3' tetranucleotides 금지 효소 소화를 촉진에 추가 이중 가닥 DNA의 끝 근처. CACC는 Kozak 합의 순서입니다.
    2. 인간의 세포 즉시 초기 (CMV-IE) 증강-발기인을 사용 하 여 높은 수준의 식 포유류 표정 벡터의 사이트 다시 해당 사이 RE-digested PCR 제품을 복제.
      참고: 분자 클로닝을 위해 최적의 온도에서 1 h 4 U / µ g의 DNA의 농도에 금지와 백본 플라스 미드 DNA의 5 µ g 다이제스트. PCR 파편, 단위 길이 당 제한 효소 인식 사이트의 수의 증가로 인해 효소 사용 (예를 들어, 1.6 kb VP3 ORF PCR 제품의 10 U / µ g)와 긴 부 화 시간 (예를 들어, 4 h)의 단위를 증가. 분자 생물학 효소와 세균 변화를 포함 하 여 복제 프로시저에 유용한 정보 다른 곳에서15,,1617찾을 수 있습니다.
  2. PCMV-플래그-AAPx (x = serotypes)의 건설
    1. 고 충실도 DNA 중 합 효소와 다음 뇌관 쌍을 사용 하 여 첫 번째 아미노산을 제외 하 고 전체 AAP ORF (0.6 kb) PCR 증폭: 압 하 고 앞으로, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (에 4 뉴클레오티드에서 25 뉴클레오티드는 AAP ORF); AAP 역, TCTT-RE2-N25 (AAP ORF의 마지막 25 뉴클레오티드).
      참고: GACTACAAGGACGACGATGACAAA 코드 플래그 태그 아무 해로운 효과4,5 를가지고 표시 되었습니다 하지만 불필요 한 경우 생략할 수 있습니다.
    2. CMV IE 증강 발기인15,,1617포유류 표정 벡터의 해당 사이트 간에 RE-digested PCR 제품을 복제.
  3. PHLP 담당자의 건설
    1. 20 단위 각 Xho pAAV RC2 플라스 미드 (7.3 kb)의 다이제스트 5 µ g 어 Xcm, 상업 DNA 정제 키트를 사용 하 여 DNA를 정화 또는 페 놀-클로 프롬 적 출.
      참고: 1.8 kb Xho 나-Xcm Rep 단백질 표정 유지 하면서 capsid 부사장 단백질 식의 7.3 kb pAAV RC2 플라스 미드 결과 손실에서에서 파편의 제거.
    2. 무딘 DNA 6 단위 T4 DNA 중 합 효소의 끝나는, agarose 젤 5.5 kb DNA 파편을 정화 하 고 자기 위하여 순화 된 조각 50 ~ 100을 사용 하 여 제조업체의 추천15에 따라 T4 DNA 리가의 400 단위 및 DNA의 ng.
    3. 1.1.2 단계에서 참조 표준 세균성 변환 절차 참고.
  4. 금지 효소 소화와 시퀀싱15,18여 플라스 미드 구성 확인 하십시오.
  5. 플라스 미드 minipreps 또는 maxipreps 충분 한 양의 다운스트림 AAV 생산 실험에 대 한 플라스 미드 DNA 상업적으로 사용할 수 있는 키트를 사용 하 여 수행 합니다.

2. 생산 HEK 293에서에서 AAV의 플라스 미드 DNA Transfection (상호 보완성 분석 결과)에 의해 세포

  1. HEK 293 세포에서 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 문화-페니실린 & 스 믹스, 높은 포도 당 (4.5 g/L) 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1%와 5% 이산화탄소 (CO2)와 함께 37 ° C 배양 기에서 1 m m L-글루타민.
    참고: AAV titers HEK 293 세포의 원본에 따라 크게 다릅니다.
    주의: AAV에 처리할 수 있지만 biosafety 수준 1 (BSL1) 포함, BSL2 포함 HEK 293 세포 작업에 대 한 것이 좋습니다.
  2. 주-(24 h transfection 이전) 1, 6-잘 plate(s)에서 2.1 단계에 설명 된 완전 한 매체의 105 HEK 293 세포/음 2 ml에서 x 6-7 접시. 이 일반적으로 다음 날 ~ 90 %confluency 달성 한다.
  3. 하루 0: Transfection
    1. DNA transfection에 대 한 준비
      1. 셀 confluency ~ 90%에 도달 했습니다 확인 하십시오.
      2. DMEM 않고 10%와 1% 페니실린 & 스 믹스 1 mM L-글루타민 보충 워밍업 FBS (즉, 혈 청 무료 중간) 37 ° C 물 목욕에서.
      3. 실내 온도 도달 polyethylenimine (페이) 솔루션을 수 있습니다.
    2. 플라스 미드 DNA 혼합물의 준비
      1. 표 2에 표시 된 대로 CaCl2 또는 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 MgCl2 없이 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 96 µ L에서 플라스 미드를 믹스. DNA의 총 금액은 2 µ g/잘.
        참고: 만약 그들이 명목상 플라스 미드 DNA 솔루션에 대 한 볼륨 무시 될 수 있습니다. 볼륨 조절 하는 것이 좋습니다 경우 플라스 미드 DNA 솔루션의 전체 볼륨은 ≥10 µ L.
    3. 페이 transfection
      1. (준비 위) PBS-플라스 미드 DNA에 페이 솔루션 (1 mg/mL)의 4 µ L를 추가 합니다. 마지막 볼륨은 약 100 µ L (문화 매체의 5% 볼륨). 소용돌이 관 짧게 고 실 온에서 15 분 동안 DNA: 페이 혼합물을 품 어.
      2. 완료 하는 데 15 분 부 화를 기다리는 동안 2.3.1.2 단계에서 설명 하는 prewarmed 혈 청 무료 매체와 문화 매체를 교체 합니다.
      3. 일단 DNA의 15 분 부 화: 페이 혼합 완료 짧게 회전 튜브는 튜브의 바닥에 액체를 수집 하는 microcentrifuge 이며, HEK 293 문화 판의 각 잘 문화 매체에 dropwise DNA: 페이 혼합물을 추가. 부드럽게 접시를 선동 하 고 5% CO2와 37 ° C 배양 기에 그들을 반환 합니다.
      4. 하루 5 (중간 변화가 필요)에서 수확까지이 transfection 매체에 세포를 유지 합니다.
  4. 주 1 와 주 2, 세포 transfection 효율을 평가 하는 거꾸로 형광 현미경 pCMV GFP 플라스 미드와 페 관찰 합니다.
    참고: 형광 현미경 검사 법, 10 배는 여기에 대 한 / 0.25 숫자 조리개 목표 10 × 접 안 렌즈와 함께에서 사용 되었다, 및 450-490 nm 여기 대역 통과 필터와 515-565 nm 대역 방출 필터 채택 되었다. 위의 조건에 일반적으로 70 %transfection 효율 보다 더 얻을 수 있습니다. 셀 형태 론 적 변화 (예: 셀 슬림 되고있다) 혈 청 자유로운 상태로 인해 전시 수 있습니다.
  5. 일 3-5, 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 transfected 세포 문화를 계속 합니다.
  6. 5 일째, 세포와 바이러스를 포함 하는 매체 15 mL 원뿔 튜브를 폴 리 프로필 렌으로 아래로 pipetting으로 또는 수집 셀 스 크레이 퍼와 된다고 하 여.
  7. 사용까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.

3. 점 오 점 분석 결과 AAV 정량에 대 한

  1. 바이러스 성 입자의 복구
    1. 신속 하 게 녹여 37 ° C 물 욕조에 냉동된 관. 소용돌이 1 분 셀에서 AAV의 복구를 최대화 하기 위해 적극적으로 튜브.
    2. 10 분 동안 4 ° C에서 3700 x g에서 centrifuging 여 셀 파편을 펠 렛. 각 관에서 상쾌한의 200 µ L을 스크류 캡 점 오 점 분석 결과 대 한 레이블된 microcentrifuge 튜브로 전송.
      참고: 약 수 microcentrifuge에 나머지 상쾌한 튜브 하 고 나중에 사용-80 ° C에서 냉동 보관. 여기, 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브 연결 나사 모자와 O-ring을 사용 했다. 꽉 봉인은 AAV 및 페 놀-클로 프롬의 유출을 방지 하기 위해 필요 합니다.
  2. Serratia marcescens endonuclease 치료
    1. 혼합 A 및 혼합물 B 시 약 (표 3)를 준비 합니다. 10 µ L의 혼합 및 각 관으로 혼합 b 10 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 관 5 s, 짧게 튜브는 튜브의 바닥에 액체를 수집 하 고 적어도 1 시간에 대 한 37 ° C에서 튜브를 품 어를 스핀.
      참고: 혼합 A NaOH를 포함 하 고 pH S. marcescens endonuclease 치료에 대 한 최적화. 혼합 B 마그네슘 보충. 상업적으로 이용 가능한 효소 주식에 S. marcescens endonuclease의 농도가 달라질 수 있습니다. S. marcescens endonuclease의 볼륨 믹스 A와 혼합 B 단계 3.2.1에서에서 튜브로 추가한 후 200 U/mL을 적절 하 게 조정 될 필요가 있다.
      참고: 더 이상 보육 시간 최대 4 h, 줄일 수 있습니다 배경 신호.
    2. 외피의 끝에, 짧게 위쪽 및 튜브의 측면에서 응축 및 솔루션을 수집 하는 벤치탑 원심 분리기와 튜브를 회전 합니다.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 샘플-20 ° C 또는-80 ° C에 얼어 저장 될 수 있다
  3. 가수분해 K 치료
    1. 혼합 C 시 (표 3)를 준비 합니다. 각 관으로 혼합 c 180 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 관 5 s, 짧게 튜브를 회전 시키고 1 h 55 ° C에서 튜브를 품 어.
      참고: 혼합 C 시에 EDTA chelates 자유로운 마그네슘 이온 및 S. marcescens endonuclease 생긴다.
    2. 외피의 끝에, 실내 온도 도달 하는 샘플을 허용 하 고 짧게 위쪽 및 튜브의 측면에서 응축 및 솔루션을 수집 하는 벤치탑 원심 분리기와 튜브를 회전.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 샘플-20 ° C 또는-80 ° C에 얼어 저장 될 수 있다 다시 시작 하려면 프로토콜, 해산 SDS 결정 완전히 버퍼에 포함 된 5 ~ 10 분 55 ° C에서 튜브를 품 어.
  4. 페 놀-클로 프롬 추출 및 에탄올 강 수
    1. 샘플 및 그들 1 분 ≥16, 실 온에서 ≥5 분 x 100g에 microcentrifuge에서 샘플을 회전 하는 소용돌이를 페 놀-클로 프롬의 200 µ L를 추가 합니다.
      주의: 페 놀-클로 프롬은 적절 한 개인 보호 장비 (PPE;를 가진 화학 증기 두건에서 처리 되어야 합니다. 즉,니트 릴 장갑, 고글 또는 얼굴 방패을 긴 소매와 실험실 외 투).
    2. 새로운 표준 microcentrifuge 튜브 (수성 액체 볼륨의 80%)을 수성 층 (P200 피 펫을 두 번 160 µ L)의 320 µ L를 전송 합니다.
      참고: 샘플 사이 수성 해결책의 동일한 볼륨을 vitally 중요 한, 그렇지 않으면 분석 결과 양적 정확도 잃는다.
    3. 혼합 D 시 (표 3)를 준비 합니다. 각 관으로 믹스 d 833 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 관 5 s, 그리고 ≥20 분-80 ° C에서 튜브를 품 어.
      참고: 혼합 D 에탄올, 아세트산 나트륨, 및 DNA의 편리한 에탄올 강수량에 대 한 글 리 코겐의 혼합물 이다. 샘플은이 단계에서-80 ° C에 저장 될 수 있다 고 프로토콜은 나중에 다시 시작할 수 있습니다.
    4. 원심 분리기 샘플 ≥16에서 microcentrifuge, ≥15 분 4 ° C에서 100 x g을 부 어 상쾌한 고 깨끗 한 종이 타월에 한 번 오 점. 각 관, 70% 에탄올의 약 500 µ L를 넣고 소용돌이 5 s, 및 원심 분리기 튜브 벤치탑 microcentrifuge ≥16, ≥5 분 4 ° C에서 100 x g에 튜브.
    5. 상쾌한 오프와 깨끗 한 종이 타월에 한 번 오 점. 65 ° C;에 건조 펠 릿 펠 릿 완전히 건조 될 수 있습니다.
      참고: 튜브 blotting 후 남아 있는 초과 에탄올을 제거 하는 피 펫을 사용 하지 마십시오. 펠 릿 수 또한 건조 실 온에서 하룻밤. 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다 그리고 말린된 DNA 펠 릿 튜브 뚜껑 닫힌 몇 일 동안 실내 온도에 저장할 수 있습니다.
  5. 물의 Resuspension 테 버퍼에서 바이러스 성 DNA의
    1. 실 온에서 1 시간 30 분 각 튜브를 떨고 하 여 120 µ L 각 테 버퍼에서 DNA 펠 릿을 디졸브.
  6. 점 오 점
    1. 플라스 미드 DNA 표준의 준비
      1. AAV 벡터 게놈 플라스 미드 DNA 물 또는 Tris HCl 버퍼 (10 m m, pH 8.0) 10 ng / µ L를 희석. 이 희석의 플라스 미드 DNA, 50 µ L의 반응 볼륨에서 선형화를 1 시간에 대 한 적절 한 제한 효소로 다이제스트 25 µ L를 가져가 라.
        참고: 우리는 소화의 중복된 집합을 만들 (단계 3.6.4.1 참조). 적절 한 효소 점 오 점 프로브 바인딩 영역 밖으로 플라스 미드 DNA를 인하 하는 것 이어야 한다. 편의 위해 희석된 플라스 미드 DNA aliquoted (25 µ L/튜브) 될 수 있으며 저장 된 미래 사용을 위한-20 ° C에서 냉동. 튜브 단계 3.5.1에서에서 떨고는 동안 플라스 미드 DNA를 소화. -플라스 미드 DNA 표준 소화 하지 않습니다.
      2. 소화 플라스 미드 DNA 표준 포함 된 튜브에 물 또는 테의 450 µ L을 추가 하 고 철저 하 게 혼합. 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브 물 또는 희석된 플라스 표준 (25 세 / µ L) 만들려고 테 1,330 µ L에이 혼합물의 70 µ L를 전송.
      3. 표 4 두 배 직렬 희석 (600 µ L/튜브)의 집합을 만드는 따르십시오. 5 vortexing에 의해 철저 하 게는 희석 혼합 s.
    2. 표준 및 바이러스 성 DNA 샘플의 변성 시키기
      1. 각 표준 희석에 알칼리 성 해결책 x 2의 600 µ L를 추가 합니다. 10 분 동안 실 온에서 5 ~ 10 미 품에 대 한 vortexing에 의해 잘 혼합.
      2. 각 바이러스 성 DNA 샘플을 알카라인 솔루션 x 2의 120 µ L를 추가 합니다. 10 분 동안 실 온에서 5 ~ 10 미 품에 대 한 vortexing에 의해 잘 혼합.
    3. 점 오 점 장치를 설정
      1. 샘플 및 기준의 수에 대 한 적절 한 크기 (예를 들어, 제타-프로브) blotting 막 잘라가 위를 사용 하 여. 점 오 점 장치에 그것을 배치 하기 전에 10 분 동안 물으로 막 담근 다. 멤브레인 장치에 사용 되지 않는 우물을 커버.
        참고: 깨끗 한 핀셋으로 멤브레인을 처리 합니다. 커버 하기 위해 빈 우물, 멤브레인와 함께 제공 되는 밝은 파란색 보호 시트를 사용할 수 있습니다. 샘플 및 표준 바인딩 전에 건조 막을 허용 하지 않습니다. 에 대 한 자세한 내용은 어셈블리 및 기구의 사용, 사용자 수동19를 참조 하십시오.
      2. 샘플 로드 될 우물에 물을 추가 합니다. 진공 및 풀 물 우물 오류를 확인 하 고 고정 될 때 다시 테스트를 통해 적용 됩니다. 다시 꽉 씰링을 보장 하기 위해 진공을 적용 하는 동안 나사를 조입니다.
        참고: 불완전 한 씰링 우물 사이 샘플 누설이 될 수 있습니다.
      3. 물을 가져온 완전히, 일단 완전히 진공을 해제 (즉, 진공 매니폴드 열려 있어야 공기 압력).
    4. 표준 및 샘플 점 오 점 장치를 로드
      1. 각 잘 각 희석된 플라스 미드 DNA 표준의 400 µ L 적용 하 고 표준 희석의 4 개의 차선을 실행 합니다. 표준 다이제스트의 두 개의 별도 aliquots를 사용 하 고 각 중복에서 로드. 각 바이러스 성 DNA 샘플의 200 µ L/잘 적용 됩니다.
        참고: 변성된 샘플의 나머지 ~ 40 µ L를 사용 하 여 희석된 샘플 수 있습니다 (예를 들어, 사용 하 여 샘플의 20 µ L 플러스 알카라인 솔루션 x 1의 180 µ L의 희석된 샘플 10 개) 준비 되며 필요한 경우 얼룩이.
      2. DNA 솔루션을 잘 이겨낼 부드러운 진공을 적용 합니다.
        참고: 부분적으로 진공 압력 점을에 적용 되도록 3 방향 밸브를 열어 조정 진공 압력 요구 되 리 분위기 뿐 아니라 장치 (즉, 자 지 팔에 위치는 약 45 ° 각도 어디 그것 크게 흡입 소음을) 합니다.
      3. 일단 모든 우물을 비우지는, 3 방향 밸브를 조정 하 여 진공을 해제. 표준 및 샘플을 포함 하는 각 음에 알칼리 성 해결책 x 1의 400 µ L를 추가 합니다. 다시 빈 우물에 진공을 적용 하기 전에 5 분 기다립니다.
      4. 다시 같은 방식으로 진공을 적용 (단계 3.6.4.2 참조).
      5. 진공에서 점 오 점 기구를 분해, 멤브레인를 제거 하 고 2로 그것을 씻어 x SSC. DNA 바인딩 면이 초과 2를 제거 하는 깨끗 한 종이 타월에 막 배치 x SSC.
      6. UV-crosslink 적절 한 UV crosslinker;와 막에 blotted DNA 막 이제 교 잡에 대 한 준비입니다.
        참고: 젖은 막 자외선 가교에 대 한 사용할 수 있습니다. 건조, 자외선 가교 화 막 저장 될 수 실내 온도에. 자세한 내용은 테이블의 자료에서 찾을 수 있습니다.
  7. 교 잡 및 세척
    1. 워밍업-65 ° C 물 목욕에서 교 잡 버퍼.
    2. 효소 방사성 α-32P dCTP와 DNA 프로브를 레이블 하 고 제조자의 권고에 따라 상용 키트를 사용 하 여 그것을 정화.
      참고: 우리가 사용 하는 0.5-2.0의 프로브 길이 증강 발기인 지역 또는 바이러스 성 게놈에 단백질 코딩 순서에서 kb. 이 프로토콜 활용 신호 검출에 대 한 P 라는 방사성 조사 32, 비록 비 방사능 chemiluminescent 또는 형광 프로브 사용할 수 있습니다 ( 토론 섹션을 참고 하십시오).
    3. DNA 바인딩 측을 가진 교 잡 병에 막 장소, 린스 5 mL와 함께 막 prewarmed 교 잡 버퍼, 버퍼를 삭제. 그런 다음 prewarmed 교 잡 버퍼의 10 mL을 추가 하 고 65 ° c.에 설정 회전 교 잡 오븐에 병을 배치 ≥5 분 회전 합니다.
    4. 100 ° c.에서 열 블록 세트에 튜브를 삽입 하 여 20 µ L 10 mg/mL 전단 청 어 나 연어 정자 DNA 솔루션 및 32P 표시 된 프로브 (≥107 cpm) 5 분의 열 변성 그런 다음 스냅인-≥2 분, 짧게, 스핀에 대 한 얼음에 그들 감기 고 사용까지 얼음에 계속.
      주의: 방사성 DNA 프로브에 대 한 스크류 캡 및 o-링 1.5 mL 튜브 사용 해야 합니다.
    5. 병 변성된 정자 DNA와 방사성 프로브는 교 잡에서 교 잡 버퍼를 신속 하 게 추가할 10 병을 흔들어 혼합 하는 s. 65 ° C 오븐에 병을 반환 하 고 ≥4 h 65 ° C에서 회전 병 품 어.
    6. 교 잡 완료 되 면 회전을 중지 하 고 교 잡 병을 제거 한 다음 누출 방지 플러그 물개 모자와 함께 50 mL 원뿔 관으로 방사성 프로브 솔루션을 붓는 다. 방사성 물질에 대 한 지정 냉장고에 배치 하는 적절 한 컨테이너에 프로브를 저장 합니다.
      참고: 사용된 교 잡 버퍼 4 ° C에서 저장 된 프로브를 사용할 수 있습니다 다시 5 번 이상 5 분 동안 100 ° C 물 목욕에서 교 잡 버퍼를 포함 하는 누출 방지 플러그 인감 모자 50 mL 원뿔 튜브를 배치 하 여.
    7. 워시 버퍼 65 ° c 온수로 막 씻어 교 잡 병을 20 ~ 30 mL의 워시 버퍼를 추가 하 고 5 분이 세척 2 번 더 반복에 대 한 회전.
      참고: 세척 솔루션의 방사능을 측정 하 고 현지 연구소에서 요구 하는 경우 그것을 기록 합니다.
    8. 막 세척 하는 동안 5 분에 대 한 이미지 지우개에 스크린 이미징 형광체를 놓습니다.
    9. 3 세척 후 교 잡 병에서 멤브레인을 제거 하 고 제거 종이 타 올, 멤브레인에 초과 버퍼에 투명 한 플라스틱 종이 홀더 막 장소. 가 거 카운터를 사용 하 여 막에 방사성 신호를 확인 하십시오. 신호 강도 따라 하룻밤 10 분 막에 지워진된 형광 이미징 화면을 표시 합니다.
    10. 시스템 스캔 및 이미지를 사용 하 여 화면을 검색 하 고 각 도트의 신호 강도 대 한 데이터를 얻을.
  8. 데이터 분석
    1. 스프레드시트 및 데이터 분석 소프트웨어 (예를 들어, Excel)을 사용 하 여 표준 곡선을 그립니다.
      참고: 로그 로그 선형 회귀 표준 곡선을 그리는 데 사용 되었다.
    2. 보간에 의해 바이러스 성 DNA 샘플의 각각에 대 한 나노 그램 (ng-eq)에 해당을 결정 합니다. Ng-eq DNA 바이러스 성 DNA 분자의 수에 해당 하는 표준 곡선을 그리는 데 사용 되는 플라스 미드의 금액입니다. 때 플라스 미드 DNA의 길이가 8000 혈압, 단일 가닥 AAV 바이러스 성 DNA의 1 ng-eq 2.275 108 입자 x에 해당.
      참고: ng-eq 변환할 수 바이러스 성 입자의 수는 다음 방정식에 의해:
      Equation 1
      Equation 2
      AAV 입자의 수는 전통적으로 "vg" (벡터 게놈) 또는 "DRP" (DNase I-저항 입자)로 표현 됩니다.
    3. 시작 자료의 AAV 농도 계산 합니다. Blotted 바이러스 성 DNA는 66.7%를 대표 하기 때문에 Equation 3 1 ng-eq 1.7 x 109 입자/mL에 해당 하는 시작 물자에 있는 바이러스 성 DNA의 Equation 4 .
      참고:이 수정 필요 하지 않습니다 시작 자료에 포함 된 모든 바이러스 성 DNA 손실 없이 막에 얼룩이 ( 그림 1참조).

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Representative Results

순화 AAV 벡터 주식 대규모 생산의 정량에 대 한 양적 도트도 말의 대표적인 결과 그림 1에 표시 됩니다. 이 점 오 점 분석 결과 함께 더블-좌초 AAV2G9-CMV-GFP 벡터 재고 titer 결정 했다. 벡터는 세 슘 염화 물 (CsCl) 밀도 그라데이션 ultracentrifugation 다음 앞에서 설명한20으로 투 석의 두 라운드 순화 되었다. 일반적으로, 순화 AAV 벡터 주식에 대 한 각 AAV 벡터 주식 (예를 들어, 0.3 µ L, 0.1 µ L, 그리고 0.03 µ L)의 3 개의 다른 볼륨 중복 수정에 위에서 설명한 점 오 점 절차를 받게 됩니다. DNase I 효소 A 단계 3.2, S. marcescens endonuclease 대신 사용 되 고 추출 하 고 바이러스 성 DNA를 정화 상용 키트 단계 3.4 ( 재료의 표참조)에서 사용 됩니다. 그림 1에 표시 된 예제에서 각 플라스 미드 DNA 표준 (그림 1A)에서 가져온 신호 강도 값 (임의 단위)을 그리는 표준 곡선 (그림 1B), 상관 관계를 보여주는 알려진된 DNA 수량에 대 한 플롯 했다 0.998의 계수입니다. 이 표준 곡선을 사용 하 여, 결정 했다 보간에 의해 AAV2G9 벡터의 0.3, 0.1 0.03 µ L aliquots 1.487 및 1.522 ng-eq (0.3 µ L), 0.487 및 0.507 ng-eq (0.1 µ L), 및 0.158 및 0.171 ng-eq (0.03 µ L) 보여주었다. 이 준 다음 6 개 값: 4.957, 5.073, 4.870, 5.070, 5.267, 및이 특정 AAV2G9에 대 한 5.700 µ L ng-eq/벡터 재고, 5.16 ±의 평균 0.27 ng-eq / µ L (평균 ± SD) 선도. 표준 (pEMBL-CMV-GFP)는 5,848을 사용 하는 플라스 미드의 길이부터 혈압이 AAV2G9 벡터의 titer 1011 vg/mL 식 2 에 따라 단계 3.8.2에에서 x 8.0을 결정 했다. 이 분석 결과 AAV 벡터 주식의 최종 titers를 확인을 두 번 이상 반복 됩니다.

분리 기원의 VP3 단백질 조립 VP3 capsid 어셈블리 AAPs에 대 한 능력에서 AAP 종속성을 평가 하기 위해 상호 보완성 분석 실험의 대표적인 결과 그림 2에 표시 됩니다. 생체 외에서 연구 AAV의 자주 바이러스 정화 결론, 할 필요 하지 않습니다 그리고 실험 조 세포 lysates 등 문화 미디어 바이러스 포함 된 unpurified 바이러스 준비를 사용 하 여 의미 있는 결과 얻을 수 충분 하다. 이 실험에서 AAV 바이러스 성 입자 생산 양적 점 오 점 분석 결과 의해 AAV5, AAV9와 뱀 AAV VP3-아니 AAP 조합을 포함 한 모든 가능한 AAV VP3 AAP 조합에서 평가 했다. 중복된 된 실험에서에서 얻은 샘플 1 x 10 x 희석에 얼룩이 했다 (Set A 및 그림 2A, B 세트 각각). 그래프 그림 2B 에 표시 된 점 들의 정량 분석을 요약 합니다. 결과: AAV5VP3 (1) 압 트랜스에서 (2) AAP5 및 AAP9를 홍보할 수 있습니다 AAV9VP3 capsid 어셈블리 비록 AAP5 AAP9, (3) 보다 효과적으로 적은 기능 제공 여부에 관계 없이 조립 AAP5도 AAP9 전시 활동 홍보 어셈블리 뱀 AAV VP3, 및 (4) 뱀 AAP만 뱀 AAV VP3의 촉진. (1) 및 (2)는 이전 관측6, 그러나 유일 하 게 특정 AAV VP3 AAP 라인 뱀 AAV 상호 작용은이 실험에서 소설 발견 이다. 양적 점 오 점에 따라 상호 보완성 분석 결과의 한 약점은 부정적인 제어는 항상 완전히 제거 될 수 없는 배경 신호의 감지할 수준을 보여 줍니다. 따라서, 자체적으로 점 오 점 분석 결과 가능성을 제외 수 없습니다 그 capsid 분석 결과의 감도 아래 단계로 조립. 이와 관련, 부정적인 컨트롤을 생성 하는 상태는 AAV 바이러스 성 게놈 capsid VP3 단백질의 부재에 기 하 급수적으로 복제에서 사용 됩니다 주목 한다. 이러한 부정적인 통제 transfecting pAAV 기자, pHLP-담당자, 그리고 pHelper (표 2), HEK 293 세포에 의해 생성 될 수 있습니다 하 고 가양성을 줄이기 위해 사용 됩니다.

DNase 나 널리 이용 되는 점 오 점 및 AAV 정량에 대 한 정량 기반 분석 nuclease로 잔여 플라스 미드 DNAs 및 비포장된 바이러스 성 게놈 AAV 준비를 오염 제거 하. 이러한 오염 물질 이어질 것이 그렇지 않으면 titers;의 과대평가 따라서, nuclease 소화 바이러스 성 게놈 titers를 정확 하 게 측정을 위한 매우 중요 한 단계입니다. DNase I 효소는 다양 한 제조 업체와 상업용 공급 업체;에서 사용할 수 그러나, DNase의 선택의 중요성 AAV 정량에 나 나타납니다 받는 되었습니다. 어떻게 nuclease 선택 점 오 점 분석 결과의 결과 영향을 미칠 수 조사, 다음 세 가지 nucleases AAV 벡터에 포함 된 문화 미디어에서 2 단계에서 설명한 대로 준비 배경 신호를 제거 하는 그들의 기능에 대 한 비교 했다 3: DNase I 효소 A, DNase I 효소 B 및 S. marcescens endonuclease (자료 테이블). 출판된 연구는 사용 전 두 DNase I 효소13,,2122,,2324 와 우리가 사용 하 고 이전에 S. marcescens endonuclease 및 전류 연구입니다. 놀랍게도, 그것은 DNase I 효소 A는 모든 테스트, 다양 한 조건에서 바이러스를 포함 하는 미디어를 사용 하 여 점 오 점 분석 결과 대 한 적절 한 선택 인 높은 배경 신호는 부정적인 컨트롤, DNase I 효소 B를에서 확인 했다 S. marcescens endonuclease 효과적으로 감소 되는 DNase I 효소 B 배경 신호 ~ 2-fold S. marcescens endonuclease (그림 3A, B) 보다 효과적. DNase I 효소 C 또한 배경 신호 (데이터 표시 되지 않음)을 줄이기 위해 매우 효과적인 것으로 발견 되었습니다. 이러한 데이터 보여 비록 nuclease 소화 때 작은 효과적 이어야 한다 효소 반응 unpurified AAV 준비에서 수행 될 때 상용 nucleases 중 효소 활동에 중요 한 차이 양의 순화 바이러스 preps는 최적화 된 조건 하에서 처리 됩니다. 따라서, 이러한 데이터 unpurified AAV 준비 양적 점 오 점 또는 정량 분석 결과 받을 때 nuclease 분석 결과에 올바른 선택의 중요성을 강조.

Figure 1
그림 1: CsCl 정화 AAV 벡터의 titer를 결정 하는 대표적인 점 오 점 분석. (A) 더블-좌초 AAV2G9-CMV-GFP 벡터 표준 큰 규모로 3 아 데 노 바이러스 무료 플라스 미드 transfection 방법 HEK 293 세포에서 생산 되었고 CsCl 그라데이션 ultracentrifugation, 뒤에 투 석의 두 라운드 정화. 0.3, 0.1 0.03 µ L의 순화 AAV 벡터 (맨 오른쪽 열에 얼룩이) 중복 중복된 플라스 미드 DNA 표준 (성병)의 두 세트와 함께 양적 점 오 점 분석 결과를 받게 되었다. 오 점 32P 표시 된 GFP 프로브 (0.77 kb) 때 교배 했다 그리고 이미지 시스템 스캔 및 이미지를 사용 하 여 얻은 했다. (B) 표준 곡선 알려진된 플라스 미드 DNA 수량 (ng-eq, x 축)과 점 농도 (임의의 단위 (AU), y 축)의 관계를 보여주는. Y 축에 있는 숫자는 시스템 스캔 및 이미지와 함께 얻은 했다. R는 Pearson의 상관 계수를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: AAV VP3 AAP 상호 보완성 점 오 점 분석 결과. 더블-좌초 AAV-CMV-GFP 벡터 입자 생산 유무 그들의 동족 AAPs의 또는 분리 기원의 AAPs 존재에 AAV5, AAV9, 및 뱀 AAV VP3 단백질을 위해 시험 되었다. (A) 분석 결과 실험 (세트 A와 B 설정) 4 h 보육 시간 S. marcescens endonuclease의 생물학적 복제 세트에서 수행 하 고 각 조합에서 얻은 AAV 벡터 titer 양적 도트에 의해 결정 되었다 오 점 프로토콜 섹션에서 설명 하는 방법. 각 점 대표 2/3 (5와 6 행, 66.7%) 또는 2-thirtieths (7, 8 행, 6.7%)에서 샘플 이나 부정적인 컨트롤 수집 매체의 각 200 µ L에서 복구 된 DNA의. 상위 4 개의 행 (1 일 4 행) 대표 플라스 미드 DNA 표준 (STD 1과 성병 2)의 두 세트 중복 (즉, 선형화 pEMBL-CMV-GFP 플라스 미드, 플라스 미드 더블-좌초 AAV-CMV-GFP 벡터 생산에 사용 되는)에 얼룩이. 점 오 점 막 32P 표시 된 GFP 프로브와 함께 조사 했다. 둥근된 사각형으로 표시 하는 점의 쌍은 부정적인 컨트롤입니다. 상위 2 행 (표준 1)는 원래 오 점 하단에서 하지만 잘라 고 되었습니다 모두 플라스 미드 표준 (STD 1과 성병 2)를 나란히 표시 하려면 이미지 강도 변경 하지 않고 상단으로 이동. 이 조작 그림에서 검은 선으로 표시 됩니다. (B) 바이러스 titer VP3의 조합에 대 한 결정은 고 점이 AAP 단백질 얼룩 분석 결과. 그래프의 데이터, 두 개의 패널 A에서에서 2에서 표시 되지 않는 다른 점 오 점 생물학 quadruplicated 집합을 나타냅니다. 오차 막대는 SD + 의미를 나타냅니다 (n = 4). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 다른 nucleases unpurified AAV 벡터 준비에서의 효소 활동의 비교. (A) A 양적 점 오 점 제거 배경 신호에 각 nuclease 치료의 효능을 보여주는. 더블-좌초 AAV9-CMV-GFP 벡터 포함 된 준비 ("AAV9 벡터")와 "아니 capsid 제어"는 HEK 293 세포 transfection 플라스 미드 DNAs 함께 제작한 분석 결과를 받게. 아니 capsid 제어 바이러스 입자를 포함 하지 않았다 그러나 기하급수적으로 증폭된 비포장된 CMV GFP 벡터 게놈을 포함. MgCl2 는 0.8 m m MgSO4 매체에 있는 존재를 고려 하지 않고 하나 또는 3 배 (6 m m DNase I 효소 A; 18 m m 및 2.5 m m 및 7.5 m m DNase I 효소 b) 권장된 금액에서 보충 되었다. S. marcescens endonuclease와 치료에 대 한 프로토콜 섹션에 설명 된 단 하나의 조건 테스트를 했다. 모든 샘플은 1 시간에 대 한 각 nuclease로 치료 했다. 점 오 점 막 32P 표시 된 GFP 프로브와 함께 조사 했다. 바로 두 개의 열 (성병 2) 원래 오의 왼쪽에서는 하지만 잘라 고 되었습니다 이미지 강도 변경 하지 않고 모두 플라스 미드 기준 (STD 1과 성병 2) 나란히 표시 하려면 오른쪽으로 이동. 이 조작 그림에 얇은 검은 선으로 표시 됩니다. 패널 A에에서 노 capsid 제어 샘플 점 들 (B) 계량 및 평균 ± 표시 | 각 값-값 의미 |. 12 샘플 DNase I 효소 A (별표 표시)으로 치료 중 7만 높은 표준; 보다 약간 높은 값을 표시 따라서, 그들은 비교를 위해이 그래프에 포함 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Serratia marcescens Endonuclease 버퍼
50 mM Tris HCl
2 mM MgCl2
4 M NaOH로 pH 8.5 조정 합니다.
가수분해 K 버퍼 x 10
100 mM Tris HCl pH 8.0
100 mM EDTA pH 8.0
5% SDS
알카라인 솔루션 x 2
800 m NaOH m
20 mM EDTA
20 x SSC (1 리터)
175.3 g NaCl
88.2 g 나트륨 시트르산 tribasic (나3C6H5O7)
Denhardt의 솔루션 100 (50 mL) x
1 g 소 혈 청 알 부 민 (분수 V) 참고: 필터링이 배경 교 잡 신호를 일으킬 작은 입자를 제거 하기 위해 중요 합니다.
1 g Polysucrose 400
1 g Polyvinylpyrrolidone
55 ° C 물 욕조에 물 20 mL에 용 해.
50 mL를 최종 볼륨을 조정 합니다.
필터-0.22 μ m 필터 소독.
교 잡 버퍼
1% SDS 참고: 4 ° C 고 열 물 목욕 전에 사용에 65 ° c에서 저장 교 잡 버퍼입니다.
6 x SSC
Denhardt의 솔루션 x 5
10 mM Tris HCl pH 8.0
워시 버퍼
0.1% SDS
0.1 x SSC
Polyethylenimine (페이) 솔루션 (1 mg/mL, 500 mL)
물 450 mL에 500 mg 페이 추가 하 고 저 어. 참고: 저장을 위해-80 ° C는 권장 됩니다.
아래로 전화를가지고 집중된 HCl를 추가 < 페이 해산 2.0 (HCl의 약 800 µ L 해야 합니다).
가지고 pH 7.0까지 10 M NaOH 추가 (10의 약 500 µ L M NaOH 해야 합니다).
물 500 mL를 볼륨을 조정 합니다.
필터-0.22 μ m 필터 소독.
약 수와-20 ° c.에 게
페 놀-클로 프롬 (1:1 믹스) 양적 점 blotting에 대 한
버퍼 포화 페 놀 (pH 8.0)를 추가 하 고 폴 리 프로필 렌 50 mL 원뿔 튜브에 1:1 비율에서 클로 프롬. 참고: 유기 레이어를 포함 하는 버퍼 튜브에 남아 있는 경우 pipetting 통해 샘플 튜브를 통해 실행 될 수 있다 고 분석 결과 부정확 할 수 있습니다.
소용돌이를 적극적으로 섞어 튜브입니다.
원심 분리에 의해 단계 분리에 대 한 허용 하 고 수성 층을 완전히 제거.
4 ° c.에 게

표 1: 솔루션 및 버퍼 조리법. 솔루션 및 양적 점 완료 하는 데 필요한 버퍼 조리법 프로토콜 오 점.

플라스 미드 AAP(+) (μ g) AAP(-) (μ g) 부정적인 통제 (μ g) Transfection 제어 (μ g)
pCMV-AAVx-VP3 0.4 0.4
pCMV-플래그-AAPx 0.4
pAAV-기자 0.4 0.4 0.4
pHLP 담당자 0.4 0.4 0.4
pHelper 0.4 0.4 0.4
pCMV (비어 있음) 0.4 0.8
pCMV-GFP 2.0
총 2.0 2.0 2.0 2.0

표 2: AAV VP3 AAP 상호 보완성 분석 결과 대 한 플라스 미드 조합 6 잘 플레이트 형식에서 수행. 플라스 미드 DNAs HEK 293 세포 transfection 각 실험 그룹에서 사용할 수의 조합이 표시 됩니다. pCMV-AAVx-VP3, AAV serotype 표현 플라스 미드 x (x = 1, 2, 3, 등) CMV IE 증강-발기인; 아래 VP3 단백질 pCMV-플래그-AAPx, AAV serotype 표현 플라스 미드 x (x = 1, 2, 3, 등) CMV IE 증강-발기인; 아래 AAP 단백질 pAAV-기자, 두 거꾸로 하는 AAV2 단말기 반복 (ITRs) 및 재조합 형 AAV 벡터 생산;를 위한 플라스 미드 pHLP-담당자, 플라스 미드 표현 AAV2 Rep 단백질; pHelper, 아 데 노 바이러스 도우미 플라스 미드; pCMV (비어 있음), 실험 조건; 제어에 추가 하는 빈 플라스 미드 pCMV GFP, 형광 표식 유전자 성공적인 transfection를 확인 (예를 들어, GFP)를 표현 하는 플라스 미드 Transfections 6 잘 플레이트에서 실시 하 고 플라스 미드 DNAs의 2 µ g의 총을 사용 하 여.

혼합 A 10 튜브 (μ)에 대 한
Serratia marcescens Endonuclease 버퍼 91.2
0.1 M NaOH 8.8
총 100
혼합 B 10 튜브 (μ)에 대 한
Serratia marcescens Endonuclease 버퍼 91.2
1 M MgCl2 7.04
Serratia marcescens Endonuclease (250 단위/μ) 0.176
총 100
혼합 C 10 튜브 (μ)에 대 한
가수분해 K 버퍼 x 10 400
가수분해 K (20 mg/mL) 100
H2O 1300
총 1800
혼합 D 10 튜브 (μ)에 대 한
100% 에탄올 8000
3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.2) 320
굴 glycogen (20 mg/mL) 10
총 8,330

표 3: 마스터 혼합 시 약의 목록. 믹스와 혼합 B S. marcescens endonuclease 치료 단계 3.2에서에서 사용 됩니다. 이 2 개의 혼합물은 마그네슘 수 산화물의 강 수를 방지 하기 위해 별도로 여야 한다. 혼합 C 단계 3.3에서에서 가수분해 K 치료에 사용 됩니다. 혼합 D 단계 3.4.3 강 수 에탄올 사용 됩니다. 테이블에 표시 된 볼륨은 마스터 혼합 시 약 10 튜브에 대 한.

플라스 미드 DNA 표준 (ng) 25 세 / µ L 플라스 미드 DNA 표준 솔루션의 볼륨 (µ L) 물의 볼륨 (µ L) 총 볼륨 (µ L)
5 600 0 600
2.5 300 300 600
1.25 150 450 600
0.625 75 525 600
0.313 37.5 562.5 600
0.156 18.8 581.2 600
0.078 9.4 590.6 600
신제품 개발: 0.039 4.7 595.3 600

표 4: 양적 점 오 플라스 미드 DNA 표준. 25 세 / µ L 플라스 미드 DNA 표준 솔루션 및 물 또는 두 배 직렬 희석 (600 µ L/튜브)에 의해 플라스 미드 DNA 표준을 준비 하 테의 필요한 볼륨 표시 됩니다. 플라스 미드 DNA 표준 열에 숫자 (신제품 개발: 0.039 5 ng)는 200 µ L의 표준 솔루션을 각 플라스 미드 DNA에 DNA의 수량.

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Discussion

이 보고서에서 AAPs AAV capsid 어셈블리에서 그들의 역할을 공부 하 고 양적 점 오 점 분석 실험의 유틸리티를 설명 합니다. 이러한 연구에서 얻은 지식을 AAV capsid 어셈블리 과정에서 타고 난 차이 다른 serotypes 사이 AAPs의 기능적인 역할에 대 한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 점에서 AAV VP3 AAP 상호 보완성 점 얼룩 뱀 AAV VP3 capsid 어셈블리에 대 한 그것의 동족 AAP의 공동 식에 엄격한 종속성 표시 그리고 뱀 AAP의 분리 serotypes capsid 어셈블리를 홍보 하지 않습니다 분석 결과 . 이 관측은 흥미로운 AAP 종속 AAV serotypes에 있기 때문에 이전 조사 되었다 (AAV1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 12)는 모두 분리 압6을 이용 하 여 어느 정도 이상 어셈블리를 처리할 수.

양적 점 또는 슬롯 오 점 교 잡의 편리한 방식으로25에서 동시에 여러 개의 샘플에 포함 된 핵 산 정량에 대 한 전통적인 방법입니다. 메서드를 사용 하면 DNA와 RNA 정량에 대 한 정량 되었다 1990 년대26,27에 널리 사용 되었습니다 했다. 정량 양적 점 오 점 이점이 있지만 그 정량에 다른 교 잡 기반 분석 실험 전시 높은 감도 넓은 동적 범위, 그것은 또한 경우 기 하 급수적으로 무의식적으로, 오류를 보강의 고유한 위험을 운반 정한 정량13,23AAV 벡터 주식의 titers에 대 한. 양적 점 오 점 분석 실험은 쉽게 저렴 한 비용으로 설정 하 고 쉽게으로 연구자 중 방사성 프로브 때 교배 점 오 점 막에서 신호를 수집할 수 있는 양적 분자 이미징 시스템에 대 한 액세스 실시 또는 비 방사성 chemiluminescent 또는 형광 프로브. 이 프로토콜 활용 신호 검출에 대 한 P 라는 방사성 조사 32, 비록 다른 사람 성공적으로 상용 내 알칼리 성 인산 가수분해 효소28직접 표시 하는 비 방사성 DNA 프로브를 사용 합니다. 점 오 점 분석 실험 사용 간단한 원리와 자체 분석 결과 수행자;에 게 기술적인 도전 포즈를 하지 않습니다. 따라서, 결과 미숙한 개인에 의해 일반적으로 재현.

여기에 설명 된 응용 프로그램 외 우리는 정기적으로 반 계량 AAV 입자를 신속 하 게 할 수 있는 점 오 점 절차의 단순화와 신속한 버전을 사용 합니다. 이런이 맥락에서 점 오 점 분석의 장점: (1) 분석 결과 정화를 요구 하지 않는다 또는 시간, (2) 열과 알칼리 성 변성의 조합 걸리는 바이러스 성 게놈의 효소 증폭은 샘플에서 AAV 입자를 충분 솔루션 및 릴리스 점 오 점 막, 그리고 (3) 높은 소금의 존재를 바인딩할 준비가 솔루션으로 바이러스 성 게놈을 변성 농도 샘플에 크게 영향을 주지 않습니다 분석 결과 결과. 예를 들어 그것은 CsCl 풍부한 솔루션 (예를 들어, 분수 CsCl 밀도 그라데이션 ultracentrifugation 여) 반 계량 수 AAV 입자 작은 약 수 (≤ 10 µ L)을 넣어 100 ° 난방 알카라인 솔루션 x 1의 100 µ L로 샘플의 10 분을 또는 사전에 준비, 15 분 교 잡, 3 x 3 분 세척 및 15 분 동안 화면을 이미징 하는 형광체에 노출 뒤 (이상 감소 방사능 프로브를 사용 하는 경우) 기준 없이 막에 더럽혀 C. 일단 사용자 되는 절차에 익숙한 1 시간에 모든 절차를 완료할 수 있습니다. 우리 우리가 부르는 관례 "끓는 점 오 점 방법"이 빠른된 메서드를 사용 하 여, AAV 식별 하 벡터 정화 중 입자 풍부한 CsCl 분수 처리 하 고 대략 광범위 한 시작 하기 전에 정화 AAV 벡터 주식의 titers 결정 벡터 특성에 대 한 처리 합니다. 따라서, 점 오 점 분석은 핵 산을 계량 하 고 다양 한 과학 분야에서에서 다양 한 PCR 기반 방법으로 교체 하는 구식된 방법으로 볼 수 있습니다, 비록 거기 지금도 많은 해야 합니다이 방법에 장점이 그들의 실험실에서 그것을 채용 고려 하는 연구를 확인 합니다.

프로토콜의 가장 중요 한 단계 샘플 nuclease 치료입니다. 경우이 단계는 최적의 조건에서 실시 하지, 그것은 높은 배경 신호를 발생할 것입니다. 우리가 사용 하는 DNase 동안 S. marcescens endonuclease 나 다른 소스의 효소는 바이러스 성 DNA 정량화에 대 한 다른 실험실에서 널리 이용 된다. DNase 소 췌 근원의 연구자에 의해 가장 널리 이용 되는. 이것은 내가 처음 소 췌 장 DNase 식별 하 고 가장 광범위 하 게29화학적 특징 때문에 부분 에서입니다. DNase I Pichia pastoris (DNase I 효소 A), (예를 들어, DNase I 효소 B), 소 췌 장에서 정화 네이티브 양식 등 여러 다른 생물 소스에서 현재 상업용 공급 업체에서 사용할 수 있는 효소 생산 및 재조합 효소 효 모 종 또는 대장균 (DNase I 효소 C)에서 생산. 우리는 DNase 발견 나 효소 세가 서로 다른 소스에서 출판된 AAV 벡터 정량 연구;에 사용 되었습니다 그러나, 우리의 지식, 연구의 서로 다른 소스에서 효소는 소화 AAV 벡터 준비에 오염 DNA 분자에 동등 하 게 효과적인 여부 조사 있다. 주목 해야 한다 그 DNase 난 AAV 벡터 분석 실험에 대 한 치료는 종종 문화 매체와 셀에서 파생 된 불순물의 존재로 인해 최적화 되지 않은 조건 하에서 수행. DNase I 효소 A는 부분적으로 우리가 사용 하는 문화 매체에서 활성만 관찰 점 오 점 및 정량, AAV 벡터 정량에 대 한 분석 결과 설계 하는 데 중요 한 영향을 미칩니다 그리고이 이전 미확인 문제 연구원을 경고. 이와 관련, S. marcescens endonuclease 대장균, 표현 AAV 벡터 제조 목적 뿐만 아니라 AAV 벡터 정량에 대 한 이상적인 endonuclease가입니다. 이 때문에 그것의 효소 활동은 다양 한 pH 값 및 마그네슘 이온과 여러차례 양이온의 농도 유지 될 수 있습니다. 이러한 이유로, S. marcescens endonuclease DNase I 효소 B 단위 기준 보다 약 2 배 덜 비싼 있기 때문에, 우리 S. marcescens endonuclease 일상적인 양적 점 오 점 분석에서 사용 하 여 선호.

요약, 양적 점 오 점 분석은 다양 한 조건에서 바이러스 성 입자를 생성 하는 기능에 쉽게 정보를 제공할 수 있는 비교적 간단한 절차. 정량, 등 대체 titering 방식에 비해이 접근 필요 있는 경우에, 작은 최적화를 합니다. 그것은 어떤 serotype의 벡터에도 쉽게 적용 될 수 있습니다 고 titer 프로토콜을 수정 하지 않고 모두 단일 및 더블-좌초 벡터를 사용할 수 있습니다. 다음 transfections와 AAV 벡터에 포함 된 샘플 (문화 매체 또는 세포)의 수확, 전체 프로토콜 완료 될 수 있다, 하루에 따라서 급속 하 게 포함 하 여 다양 한 조건에서 바이러스 성 입자를 생산 하는 능력에 대 한 질문에 대답 AAV VP3 및 AAP 단백질의 다양 한 조합입니다. 양적 점 오 점 부사장 AAP 상호 작용으로 다양 한 문의 다양 한 다른 AAV serotypes 및 격리에서에서 capsid 어셈블리에서 그들의 역할을 해결 하는 편법 방법을 제공 합니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

아오 아오 채 플 힐에서 북캐롤라이나의 대학에는 pEMBL-CMV-GFP 플라스 미드와 함께 우리를 제공 하는 감사 합니다. 우리는 원고의 중요 한 독서에 대 한 크리스토퍼 쳉과 사무엘 제이 황 감사합니다. 이 작품에 의해 지원 되었다 공중 보건 서비스 부여 (NIH R01 NS088399 T32 EY232113).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase MilliporeSigma 1016970001 Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text.
DNase I Roche 4716728001 Referred to as DNase I Enzyme A in the main text.
DNase I Invitrogen 18047019 Referred to as DNase I Enzyme B in the main text.
DNase I New England Biolabs M0303L Referred to as DNase I Enzyme C in the main text.
1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes Corning 430909
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Polypropylene Conical Tube Corning 352097
3 M Sodium Acetate Teknova S0298
50 mL Polypropylene Conical Tube Corning 430291
AAV-293 Cells Agilent 240073 HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions.
AccuGENE 0.5 M EDTA Solution Lonza 51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 Lonza 51238
AccuGENE 10% SDS Lonza 51213
AccuGENE 1X TE Buffer Lonza 51235
Bio-Dot Apparatus Bio-Rad 1706545
Bovine Serum Albumin MilliporeSigma A3294
Cell Lifter Corning 3008
Chloroform MilliporeSigma 372978
DNA Extractor Kit Wako Pure Chemical Industries 295-50201 This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) Lonza 12-614F
ElectroMAX DH10B Cells Thermo Fisher Scientific 18290015
Ethanol 200 Proof Decon Labs 2716
Fetal Bovine Serum VWR 1500-500
Ficoll 400 Alfa Aesar B22095 Referred to as Polysucrose 400.
Fluorescence Microscope Zeiss Axiovert 40 CFL
Glycogen Roche 10901393001
Herring Sperm DNA Invitrogen 15634-017
Hybridization Tubes Thermo Fisher Scientific 13-247-150
ImageQuant TL GE Healthcare Life Sciences ImageQuant TL
L-glutamine 200 mM Lonza 17-605E
Magnesium Chloride Hexahydrate MilliporeSigma M0250
MicroPulser Electroporator Bio-Rad 1652100
Mini Quick Spin DNA Columns MilliporeSigma 11814419001
pAAV-RC2 Vector Cell Biolabs Inc VPK-422
Penicillin/Streptomycin 10K/10K Lonza 17-602E
Phosphate Buffered Saline Lonza 17-516F
Phosphorimaging Exposure Cassette GE Healthcare Life Sciences Various
Phosphorimaging Screen GE Healthcare Life Sciences Various
Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162
Platinum Pfx DNA Polymerase Invitrogen 11708013
Polyethylenimine Polysciences Inc 23966-2
Polyvinylpyrrolidone MilliporeSigma P5288
Prime-It II Random Primer Labeling Kit Agilent Technologies 300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		 MilliporeSigma Custom Primer
Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Proteinase K Solution Invitrogen 25530-049
Restriction Enzymes New England Biolabs Various
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15632011
Serological Pipettes Thermo Fisher Scientific 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-10
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate MilliporeSigma C8532
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203L
Thermal Cycler Eppendorf 6321000515
Tissue-culture Treated 6-well Plate Corning 353046
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-5
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28955809
UltraPure Buffer-Saturated Phenol Invitrogen 15513-047
UV Crosslinker Spectroline XLE-1000 Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2.
Zeta-Probe Membrane Bio-Rad 162-0165

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References

  1. Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
  2. Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
  3. Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
  4. Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
  5. Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).
  6. Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
  7. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  8. Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  9. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
  10. Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
  11. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  12. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
  13. Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
  14. Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
  15. NEB, 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , New England Biolabs. 302-368 (2017).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Addgene. Bacterial Transformation. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017).
  18. Addgene. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid. , Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017).
  19. Bio-Rad. Bio-Dot® microfiltration apparatus instruction manual. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf (2017).
  20. Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
  21. Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
  22. Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
  23. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  24. Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
  25. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  26. Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
  27. Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
  28. Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
  29. Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).

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생물학 문제 136 Adeno 관련 바이러스 (AAV) 어셈블리 활성화 단백질 (AAP) 크로스-보완성 양적 점 오 점 분석 결과 바이러스 titer 유전자 치료
AAV 적정 및 Adeno 관련 바이러스 어셈블리 활성화의 기능 평가 대 한 그것의 사용에 대 한 양적 점 오 점 분석 결과 단백질
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Powers, J. M., Chang, X. L., Song,… More

Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins. J. Vis. Exp. (136), e56766, doi:10.3791/56766 (2018).

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