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Biology

Una quantitativa Dot Blot Assay AAV titolazione e suo uso per la valutazione funzionale di Virus Adeno-associato Assembly-attivazione proteine

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56766
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

Summary

Questo manoscritto dettagli un saggio di macchia semplice puntino per quantificazione dei titoli del virus adeno-associato (AAV) e la sua applicazione per studiare il ruolo dell'Assemblea-attivazione proteine (AAP), una nuova classe di proteine virali non strutturali, trovate tutte le AAV sierotipi, nel promuovere l'assemblaggio di capsidi derivato da sierotipi AAV cognati ed eterologi.

Abstract

Mentre virus adeno-associato (AAV) è ampiamente accettata come un vettore di attraente per la terapia genica, serve anche come un virus di modello per la comprensione della biologia del virus. Sotto questo aspetto, la recente scoperta di una proteina AAV non strutturali, chiamata proteina d'attivazione assembly (AAP), ha gettato nuova luce sui processi coinvolti nell'assemblaggio delle proteine del capside virale VP in un capside. Anche se molti sierotipi AAV richiedono AAP per assemblaggio, recentemente abbiamo riferito che AAV4, 5, e 11 sono eccezioni a questa regola. Inoltre, abbiamo dimostrato che AAPs e assemblati capsidi di diversi sierotipi di localizzano a diversi compartimenti subcellulari. Questa eterogeneità imprevista nella proprietà biologiche e ruoli funzionali di AAPs tra diversi AAV sierotipi sottolinea che l'importanza degli studi su AAPs derivata da diversi sierotipi. Un saggio di macchia semplice puntino per quantificazione AAV e la sua applicazione per valutare la specificità di dipendenza e sierotipo AAP nell'assembly del capsid i dettagli di questo manoscritto. Per dimostrare l'utilità di questo test di dot blot, abbiamo precisato per caratterizzare capside assembly e AAP dipendenza di serpente AAV, un rettile precedentemente atipico AAV, così come AAV5 e AAV9, che precedentemente sono stati indicati per essere indipendente dalla AAP e AAP-dipendente sierotipi, rispettivamente. L'analisi ha rivelato che il serpente AAV capside assembly richiede serpente AAP e non può essere promosso da AAPs da AAV5 e AAV9. L'analisi inoltre ha mostrato che, a differenza di molti il comune sierotipo AAPs che promuovere l'Assemblea del capside eterologo da cross-complementazione, serpente AAP non promuovere l'Assemblea di capsidi AAV9. Inoltre, ci mostra che la scelta di nucleasi influisce in modo significativo la lettura del test dot blot, e così, scegliendo un enzima ottimo è fondamentale per una valutazione positiva dei titoli di AAV.

Introduction

Virus adeno-associato (AAV) è un virus a DNA piccolo, senza involucro, a singolo filamento con un genoma di circa 4,7 kilobasi (kb). Il genoma AAV contiene Apri-reading frame (ORF) per i geni rep e cap . Nel 2010, una precedentemente non identificata nonstructural proteina codificata da un ORF + 1 telaio-spostato all'interno del gene di tappo AAV2 fu scoperto da Sonntag et al e trovata a giocare un ruolo critico nell'assemblaggio di proteine monomeriche AAV2 del capside VP in un virale capside1. Questa nuova proteina è stata nominata proteina d'attivazione assembly (AAP) dopo il suo ruolo nella promozione del capsid assemblaggio1.

ORFs per AAP sono stati identificati bioinformatically nel genoma dei tutti i parvovirus del genere Dependoparvovirus, ma non all'interno del genoma dei virus dei diversi generi del parvovirus famiglia1,2. Studi funzionali di questa proteina romanzo erano inizialmente concentrati sull'AAP dal prototipo AAV2 (AAP2), che ha istituito il ruolo essenziale della AAP2 nel targeting completamente smontate proteine VP per il nucleolo per il loro accumulo e la formazione in assemblati capsidi1,3,4. L'incapacità dei capsidi AAV2 di assemblare in assenza di espressione di AAP è stato indipendentemente confermato da più gruppi, compreso il nostro1,2,3,4,5 . Studi successivi su sierotipi AAV 1, 8 e 9 ha confermato il ruolo critico di AAPs nell'assembly del capsid, come proteine monomeriche VP3 di AAV1, 8, e 9 erano in grado di formare un capside completamente assemblato in assenza di co-espressione di AAP2.

Recentemente, attraverso approcci che includono l'uso di quantitativi dot blot analisi, abbiamo studiato la capacità di AAV1 di 12 VP3 monomeri per assemblare in capsidi in assenza di espressione di AAP e la capacità di AAP1 al 12 di promuovere l'Assemblea del VP3 monomeri da sierotipi eterologi. Questo studio ha rivelato che AAV4, 5 e 11 VP3 monomeri possono montare senza AAP. Inoltre, è stato trovato che otto dei dodici sierotipi AAP abbiamo esaminato (cioè, tutti, ma AAP4, 5, 11 e 12) visualizzata una vasta capacità di supportare Assembleia capside eterologhe capsidi di sierotipo AAV, mentre AAP4, 5, 11 e 12 visualizzato un sostanzialmente capacità limitata a questo proposito6. Questi quattro sierotipi sono filogeneticamente distanti dagli altri AAP sierotipi2,3. Inoltre, lo studio ha scoperto significativa eterogeneità nelle localizzazioni subcellulari di diversi AAPs6. Inoltre, lo studio ha suggerito che la stretta associazione di AAP con capsidi assemblati e il nucleolo, il segno distintivo dell'Assemblea di capside AAV2, necessariamente non può essere estesa ad altri sierotipi inclusi AAV5, 8 e 9, che visualizzano nucleolar esclusione di capsidi assemblato6. Così, le informazioni ottenute dallo studio di qualsiasi particolare sierotipo AAP non sono ampiamente applicabile a tutti i biologia AAP. Tale natura sconcertante della biologia AAP sottolinea la necessità di indagare il ruolo e la funzione di ogni AAP da sierotipi AAV sia canonici e non canoniche.

Il ruolo biologico di AAP nell'assembly capside può essere valutato determinando che i titoli di particella virale AAV completamente confezionato prodotta in cellule embrionali umane del rene (HEK) 293 cellule, la linea cellulare più comunemente utilizzati per la produzione di vettore AAV, con o senza proteine AAP espressione. I metodi standard per la quantificazione di AAV sono PCR quantitativa (qPCR)-base saggi7,8 e quantitativa dot blot-based assays9. Altri metodi per la quantificazione della particella virale AAV come analisi enzima-collegata dell'immunosorbente10,11 o densità ottica misura12 non sono ideali per campioni o campioni provenienti da molti diversi sierotipi di AAV contaminata da impurità (lisati grezza o terreni di coltura), che sono spesso i campioni utilizzati per la ricerca AAV. Attualmente, qPCR è più ampiamente usato per la quantificazione dell'AAV; Tuttavia, è necessario riconoscere potenziali avvertimenti del dosaggio qPCR-basato, come l'analisi possono provocare errori sistemici e significativo titolo variazioni13,14. Analisi PCR-based sono interessate da una serie di fattori, quali la presenza di forcine covalentemente chiusi terminale nei modelli di PCR che inibiscono amplificazione13potenzialmente di confusione. Anche un individuo esperto può introdurre potenziali fattori di confondimento in una base di qPCR inconsapevolmente dosaggio13. Al contrario, analisi di quantitativi dot blot sono una tecnica di biologia molecolare classica che non riguarda l'amplificazione del genoma e utilizza un principio molto semplice con un rischio minimo di errori rispetto alle analisi qPCR-based. Il metodo è meno tecnicamente impegnativi; di conseguenza, i risultati del saggio sono ragionevolmente riproducibili anche da individui inesperti.

In questo rapporto, descriviamo i dettagli metodologici di analisi quantitativa dot macchia usiamo ordinariamente per quantificazione di vettore AAV e fornire un esempio di come applicare il dosaggio per studiare il ruolo di promozione di assemblaggio di AAPs in comune con sierotipi (AAV5 e AAV9) e un' in precedenza atipici AAP dal serpente AAV14. In natura, AAV VP e proteine AAP sono espressi in cis da un singolo gene (cioè, VP-AAP cis-complementazione), mentre nel test qui descritto, proteine VP e AAP sono fornite in trans da due plasmidi separati (cioè, VP-AAP Trans-complementazione). Poiché ogni proteina VP o AAP da sierotipi diversi può essere espressa da ogni plasmide indipendente, diventa possibile testare eterologa VP-AAP combinazioni di assemblaggio del capside (cioè, VP-AAP cross-complementazione). Brevemente, AAV VP3 da vari sierotipi è espresso in cellule HEK 293 di transfezione del DNA del plasmide per assemblare un genoma di vettore AAV in presenza o assenza del sierotipo cognato AAP, o in presenza di un sierotipo eterologo AAP. A seguito di produzione, terreni di coltura e lisati cellulari sono sottoposti ad un'analisi della macchia di dot per quantificare il genoma virale all'interno della shell di capside. Il primo passo del dot blot test è quello di trattare i campioni con una nucleasi per rimuovere contaminanti plasmide DNAs e non imballati AAV genomi in campioni. In caso contrario aumenterebbe i segnali di sfondo in particolare quando non purificata i campioni sono analizzati. Ciò allora è seguita da un trattamento con proteasi per rompere capsidi virali e rilasciare nucleasi-resistente genomi virali in soluzioni campione. Genomi virali, prossimi sono denaturati, cancellati su una membrana e ibridati con una sonda di DNA specifico del genoma virale per quantificazione. Con il test di esempio segnalato qui, dimostriamo che serpente AAV VP3 richiede serpente AAP per l'assemblaggio del capside e che serpente AAP non promuovere l'Assemblea del AAV9 capsidi a differenza di molti di AAPs derivato da sierotipi di AAP-dipendente che possono anche promuovere l'Assemblea del capsidi sierotipo eterologa. Infine, segnaliamo un avvertimento importante per qPCR o quantificazione di dot blot-based AAV saggi che la scelta di nucleasi influenza in modo significativo i risultati del saggio.

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Protocol

Nota: Le ricette per le soluzioni e il buffer necessario per questo protocollo sono fornite nella tabella 1. Il protocollo descritto di seguito è per il saggio di macchia VP-AAP cross-complementazione puntino a studiare i ruoli delle proteine AAP nell'assemblaggio del capside. Il metodo per il dosaggio di macchia quantitativa puntino più generico per la titolazione di vettore AAV purificata è spiegato nella sezione Risultati rappresentante .

1. costruzione di VP3, AAP e Rep AAV2 esprimendo plasmidi

  1. Costruzione di pCMV-AAVx-VP3 (x = sierotipi)
    1. PCR-amplificare l'intero ORF VP3 (1,6 kb) utilizzando una polimerasi del DNA di alta fedeltà e la seguente coppia di primer: VP3 in avanti, CTAA-RE1-CACC-N25 (i primi 25 nucleotidi del ORF VP3); VP3 inversa, TCTT-RE2-N25 (le ultime 25 nucleotidi del ORF VP3).
      Nota: RE1 e RE2 sono siti per enzimi di restrizione (REs) per la clonazione. CTAA e TCTT sono il terminale 5' e 3' tetranucleotidi aggiunti per facilitare la digestione degli enzimi di restrizione verso la fine di DNA double-stranded. CACC è una sequenza di consenso di Kozak.
    2. Clonare i prodotti di PCR di RE-digested tra il corrispondente RE siti di un vettore di espressione che utilizza il citomegalovirus umano immediatamente-precoce (CMV-IE) enhancer-promotore per l'espressione ad alto livello.
      Nota: Per la clonazione molecolare, digerire 5 µ g di DNA del plasmide la spina dorsale con un restriction enzyme(s) ad una concentrazione di 4 U / µ g di DNA per 1 h ad una temperatura ottimale. Frammenti PCR, di aumentare le unità di enzimi utilizzati (ad esempio, 10 U / µ g del prodotto di PCR di ORF VP3 1,6 kb) e un tempo di incubazione più lungo (ad es., 4h) a causa di un aumento del numero di siti di riconoscimento degli enzimi di limitazione per unità di lunghezza. Informazioni utili in biologia molecolare degli enzimi e delle procedure di clonazione tra cui trasformazione batterica possono essere trovati altrove15,16,17.
  2. Costruzione di pCMV-bandiera-AAPx (x = sierotipi)
    1. PCR-amplificare l'intero AAP ORF (0,6 kb) fatta eccezione per il primo amminoacido utilizzando una polimerasi del DNA di alta fedeltà e la seguente coppia di primer: AAP in avanti, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (i 25 nucleotidi dal nucleotide 4th nella AAP ORF); AAP inversa, TCTT-RE2-N25 (le ultime 25 nucleotidi del ORF AAP).
      Nota: GACTACAAGGACGACGATGACAAA codici una bandierina, che ha dimostrata di avere alcun effetti nocivi4,5 , ma può essere omesso se non è necessario.
    2. Clonare i prodotti di PCR di RE-digested tra i siti corrispondenti di un vettore di espressione dei mammiferi con il CMV-IE enhancer-promotore15,16,17.
  3. Costruzione di pHLP-Rep
    1. Digest 5 µ g del plasmide pAAV-RC2 (7,3 kb) con 20 unità ogni di Xho io e Xcm e purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione di DNA commerciale o mediante estrazione con fenolo-cloroformio.
      Nota: Rimozione dei 1,8 kb Xho io-Xcm che io frammento dal 7,3 kb pAAV-RC2 plasmide provoca una perdita di espressione della proteina del capside VP preservando l'espressione della proteina Rep.
    2. Smussato il DNA termina con 6 unità di T4 DNA polimerasi, agarosio gel-purificare il frammento di DNA di 5,5 kb e auto-legare il frammento purificato utilizzando 50-100 ng di DNA e di 400 unità di ligasi del DNA T4 secondo la raccomandazione15 del produttore.
    3. Seguire la procedura standard di trasformazione batterica viene fatto riferimento nel passaggio 1.1.2 Nota.
  4. Verificare che il plasmide si costruisce tramite digestione degli enzimi di restrizione e sequenziamento15,18.
  5. Eseguire plasmide minipreps o maxipreps con kit disponibili in commercio per ottenere una quantità sufficiente di DNA del plasmide per gli esperimenti di produzione di AAV a valle.

2. produzione di AAV in HEK 293 cellule dalla transfezione del DNA del plasmide (Cross-complementazione Assay)

  1. Coltura di cellule HEK 293 in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM)-alto glucosio (4,5 g/L) completati con 10% siero bovino fetale (FBS), 1%, penicillina e streptomicina Mix e 1 mM L-Glutammina, in un incubatore a 37 ° C con 5% di anidride carbonica (CO2).
    Nota: I titoli AAV variano significativamente a seconda dell'origine delle cellule HEK 293.
    Attenzione: Anche se AAV possono essere gestiti a livello di biosicurezza 1 (BSL1) contenimento, contenimento BSL2 è raccomandato per il lavoro delle cellule HEK 293.
  2. Il giorno -1 (24 h prima di transfezione), piastra 6 – 7 x 105 HEK 293 cellule/pozzetto in 2 mL di terreno completo descritto al punto 2.1, in un 6-pozzetti di piastre. Questo generalmente raggiunge confluency di ~ 90% il giorno successivo.
  3. Giorno 0: transfezione
    1. Preparazione per la transfezione del DNA
      1. Assicurarsi che le cellule hanno raggiunto confluency di ~ 90%.
      2. Scaldare DMEM completate con 1% penicillina e streptomicina Mix e 1 mM L-Glutammina, ma senza 10% FBS (cioè, privo di siero medio) in bagnomaria a 37 ° C.
      3. Lasciare la soluzione di polyethylenimine (PEI) a temperatura ambiente.
    2. Preparazione della miscela di DNA del plasmide
      1. Mescolare i plasmidi in 96 µ l di tampone fosfato salino (PBS) senza CaCl2 o MgCl2 in provette per microcentrifuga da 1,5 mL sterili, come indicato nella tabella 2. La quantità totale di DNA è di 2 µ g/pozzo.
        Nota: I volumi per la soluzione di DNA del plasmide possono essere ignorati se sono nominali. Regolazione del volume è consigliata se il volume totale delle soluzioni di DNA del plasmide è ≥ 10 µ l.
    3. Transfezione di PEI
      1. Aggiungere 4 µ l di soluzione di PEI (1 mg/mL) per il mix di PBS-plasmide DNA (preparato come sopra). Il volume finale è di circa 100 µ l (5% del volume di terreno di coltura). Vortex le provette brevemente e incubare la miscela di DNA: PEI per 15 min a temperatura ambiente.
      2. Durante l'attesa per l'incubazione di 15 minuti completare, è possibile sostituire il terreno di coltura con preriscaldati medium senza siero, descritto al punto 2.3.1.2.
      3. Una volta l'incubazione di 15 min del DNA: PEI miscela è completa, brevemente girare i tubi con una microcentrifuga per raccogliere il liquido sul fondo delle provette e aggiungere la miscela di DNA: PEI goccia a goccia al terreno di coltura in ciascun pozzetto della piastra di coltura di HEK 293. Delicatamente agitare le piastre e restituirli a incubatore a 37 ° C con 5% CO2.
      4. Mantenere le cellule in questo mezzo di transfezione fino al raccolto al giorno 5 (nessun cambiamento medio è richiesto).
  4. Giorno 1 e giorno 2, osservare le cellule transfected con il plasmide pCMV-GFP sotto un microscopio a fluorescenza invertito per valutare l'efficienza di trasfezione.
    Nota: per microscopia di fluorescenza, qui un 10x / 0,25 apertura numerica obiettivo in combinazione con un oculare 10 × è stata usata, e filtro passa-banda di eccitazione di 450-490 nm e 515 – 565 nm passa-banda filtro di emissione sono stati impiegati. La suddetta condizione normalmente produce più di efficienza di trasfezione di 70%. Le cellule possono esibire alcuni cambiamenti morfologici (ad es. le cellule sono diventato sottile) dovuto lo stato privo di siero.
  5. Nei giorni 3-5, continuare a coltura le cellule transfettate in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2.
  6. Il giorno 5, raccogliere sia le cellule e contenenti virus medio in provette coniche da 15 mL in polipropilene pipettando su e giù o raschiando con un raschietto di cella.
  7. Conservare i campioni a-80 ° C fino all'utilizzo.

3. dot Blot Assay per quantificazione AAV

  1. Recupero di particelle virali
    1. Scongelare rapidamente i tubi congelati in bagnomaria a 37 ° C. Vortice i tubi energicamente per 1 min massimizzare il recupero di AAV dalle cellule.
    2. Pellet i detriti cellulari mediante centrifugazione a 3.700 x g a 4 ° C per 10 min. Prendere 200 µ l del surnatante da ciascuna provetta e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga etichettati con tappo a vite per il dosaggio di macchia del puntino.
      Nota: Aliquota il surnatante rimanente in microcentrifuga tubi e conservarli congelati a-80 ° C per un uso futuro. Qui, in polipropilene per microcentrifuga associati con tappi a vite e un o-ring sono stati usati. A tenuta ermetica è necessaria per prevenire sversamenti di AAV e fenolo-cloroformio.
  2. Trattamento con i marcescens del Serratia endonucleasi
    1. Preparare i reagenti Mix A e Mix B (tabella 3). Aggiungere 10 µ l della miscela A e 10 µ l di Mix B in ciascuna provetta. Vortex le provette per 5 s, brevemente girare i tubi per raccogliere il liquido sul fondo delle provette e incubare le provette a 37 ° C almeno per 1 h.
      Nota: Miscela A contiene NaOH e ottimizza pH per trattamento con endonucleasi marcescens dello s . Mix B integratori di magnesio. Concentrazione di endonucleasi marcescens dello S. in scorte di enzima commercialmente disponibili può variare. Il volume dei marcescens dello S. endonucleasi deve essere regolata per fare 200 U/mL dopo l'aggiunta di Mix A e Mix B nelle provette al punto 3.2.1.
      Nota: Un tempo di incubazione più lungo, fino a 4 h, possa diminuire segnali di fondo.
    2. Al termine dell'incubazione, girare brevemente i tubi con una centrifuga da banco per raccogliere la condensa e soluzione dalla parte superiore e i lati dei tubi.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. I campioni possono essere conservati congelati a-20 ° C o -80 ° C.
  3. Trattamento di proteinasi K
    1. Preparare il reagente di Mix C (tabella 3). Aggiungere 180 µ l di Mix C in ogni provetta. Vortex le provette per 5 s, brevemente girare i tubi e incubare le provette a 55 ° C per 1 h.
      Nota: L'EDTA nel reagente C Mix chelata ioni magnesio libero ed inattiva dell'endonucleasi marcescens dello s .
    2. Al termine dell'incubazione, permetta che i campioni raggiungano la temperatura ambiente, quindi brevemente ruota i tubi con una centrifuga da banco per raccogliere la condensa e soluzione dalla parte superiore e i lati dei tubi.
      Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. I campioni possono essere conservati congelati a-20 ° C o -80 ° C. Per riprendere il protocollo, incubare le provette a 55 ° C per 5/10 minuti sciogliere i cristalli di SDS completamente contenute nel buffer.
  4. Precipitazione di estrazione ed etanolo fenolo-cloroformio
    1. Aggiungere 200 µ l di fenolo-cloroformio per i campioni e il vortice li per un minimo di 1 rotazione i campioni in un microcentrifuge a ≥ 16, 100 x g per ≥ 5 min a temperatura ambiente.
      Attenzione: Fenolo-cloroformio deve essere gestita in una cappa chimica con appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE; cioè, guanti in nitrile, occhiali o visiera e camice con maniche lunghe).
    2. Trasferire 320 µ l dello strato acquoso (160 µ l due volte con una pipetta P200) ad un nuovo tubo del microcentrifuge standard (80% del volume di fluido acquoso).
      Nota: È estremamente importante prendere lo stesso volume di soluzione acquosa tra campioni, altrimenti il test perde accuratezza quantitativa.
    3. Preparare il reagente di Mix D (tabella 3). Aggiungere 833 µ l di Mix D in ogni provetta. Vortex le provette per 5 s, incubare le provette a-80 ° C per ≥ 20 min.
      Nota: Mix D è una miscela di etanolo, acetato di sodio e glicogeno per precipitazione dell'etanolo conveniente del DNA. I campioni possono essere conservati a-80 ° C a questo passaggio e il protocollo può essere ripresa successivamente.
    4. Centrifugare i campioni con un microcentrifuge a ≥ 16, 100 x g a 4 ° C per un minimo di ≥ 15 Pour sovranatante e asciugare una volta su un tovagliolo di carta pulito. Mettere circa 500 µ l di etanolo al 70% in ogni tubo, vortex le provette per 5 s e centrifugare le provette con una microcentrifuga da banco presso ≥ 16, 100 x g a 4 ° C per ≥ 5 min.
    5. Versare il sovranatante e macchia una volta su un tovagliolo di carta pulito. Asciugare il pellet a 65 ° C; pellet può essere asciugata completamente.
      Nota: Non utilizzare una pipetta per eliminare l'etanolo in eccesso che rimane dopo macchiare i tubi. Pellet anche possono essere essiccati a temperatura ambiente durante la notte. Il protocollo può essere messo in pausa qui e secchi pellet di DNA può essere conservato a temperatura ambiente per diversi giorni con il coperchio del tubo chiuso.
  5. Risospensione di DNA virale nel buffer di TE
    1. Sciogliere i pellet di DNA in 120 µ l di tampone di TE agitando ogni tubo per 30 min a 1 h a temperatura ambiente.
  6. Macchia del puntino
    1. Preparazione di campioni di DNA del plasmide
      1. Diluire il DNA del plasmide genoma vettore AAV a 10 ng / µ l in acqua o in tampone Tris-HCl (10 mM, pH 8.0). Prendere 25 µ l di questa diluizione e digest con un enzima di restrizione appropriato per 1 h a linearizzare il plasmide DNA, in un volume di reazione di 50 µ l.
        Nota: Facciamo un set duplicato della digestione (vedi passo 3.6.4.1). L'enzima appropriato dovrebbe essere uno che taglia il DNA del plasmide di fuori della regione di sonda-associazione dot blot. Per comodità, il DNA del plasmide diluito può essere aliquotati (25 µ l/tubo) e conservati congelati a-20 ° C per un uso futuro. Digerire il DNA del plasmide mentre i tubi tremano al punto 3.5.1. Non sovra-digerire il plasmide DNA standard.
      2. Aggiungere 450 µ l di acqua o TE nella provetta contenente il plasmide digerito DNA standard e mescolare accuratamente. Trasferimento 70 µ l di questa miscela ad un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL con 1.330 µ l di acqua o TE per rendere un plasmide diluito standard (25 pg / µ l).
      3. Seguire la tabella 4 per creare una serie di diluizioni seriali (600 µ l/tubo). Mescolare accuratamente le diluizioni nel Vortex per 5 s.
    2. Denaturazione di standard e campioni di DNA virali
      1. Aggiungere 600 µ l di soluzione alcalina: 2x per ogni diluizione normale. Mescolare bene su vortex per 5-10 s. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
      2. Aggiungere 120 µ l di soluzione alcalina: 2x per ciascun campione di DNA virale. Mescolare bene su vortex per 5-10 s. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
    3. Impostazione dell'apparato di macchia del puntino
      1. Utilizzando le forbici, tagliare una membrana macchiare (ad es., zeta-sonda) su una dimensione appropriata per il numero di campioni e standard. Mettere a bagno la membrana con acqua per 10 min prima di posizionarlo su un apparato di macchia del puntino. Coprire i pozzetti non utilizzati sull'apparato di membrana.
        Nota: Maneggiare la membrana con pinzette pulite. Per coprire i pozzetti vuoti, il foglio di protezione dalla luce blu che viene fornito con la membrana può essere utilizzato. Non consentono la membrana ad asciugare prima all'associazione di campioni e standard. Per maggiori dettagli sul montaggio e l'uso dell'apparato, fare riferimento al manuale utente19.
      2. Aggiungere acqua per i pozzi a cui verranno caricati i campioni. Applicare il vuoto e tirare acqua attraverso pozzi per controllare gli errori e ripetere il test quando fissa. Serrare nuovamente le viti durante l'applicazione di vuoto per garantire la tenuta ermetica.
        Nota: Chiusura incompleta può causare perdite di campione tra i pozzetti.
      3. Una volta che l'acqua è completamente tirato attraverso, rilasciare completamente il vuoto (cioè, il collettore del vuoto dovrebbe essere aperto alla pressione atmosferica).
    4. Caricamento standard e campioni all'apparato di dot blot
      1. Applicare 400 µ l di ogni standard di DNA del plasmide diluito in ciascun pozzetto ed eseguire quattro corsie di diluizioni standard. Utilizzare due aliquote separate del digest standard e caricare ciascuna in duplice copia. Applicare 200 µ l/pozzetto di ciascun campione di DNA virale.
        Nota: Utilizzando il restante ~ 40 µ l di campioni denaturati, campioni diluiti possono essere preparati (ad esempio, 10 volte campione diluito usando 20 µ l di campione più 180 µ l di soluzione alcalina: 1x) e cancellati se necessario.
      2. Applicare il vuoto delicato per tirare le soluzioni di DNA attraverso il pozzo.
        Nota: Ha bisogno di pressione di vuoto di essere regolata aprendo parzialmente una valvola a tre vie in modo che la pressione di vuoto viene applicata al puntino della macchia apparato così come l'atmosfera (cioè, con le braccia di rubinetto posizionato a un angolo di circa 45 ° dove si fa un rumore di aspirazione più forte).
      3. Una volta che tutti i pozzetti siano vuoti, è possibile rilasciare il vuoto regolando la valvola a tre vie. Aggiungere 400 µ l di soluzione alcalina: 1x in ciascun pozzetto contenente campioni e standards. Attendere 5 minuti prima di ri-applicazione di vuoto per svuotare i pozzetti.
      4. Ri-applicare il vuoto nello stesso modo (vedi passo 3.6.4.2).
      5. Smontare l'apparato di macchia del puntino sotto vuoto, rimuovere la membrana e sciacquarlo con 2 x SSC. Posizionare la membrana su un panno di carta con il lato di DNA associato rivolto verso l'alto per rimuovere l'eccesso 2 x SSC.
      6. UV-crosslink blotted DNA alla membrana con un appropriato crosslinker UV; la membrana è ora pronta per l'ibridazione.
        Nota: Membrane bagnate possono essere utilizzate per reticolazione UV. I secchi, UV-reticolati membrane possono essere conservate a temperatura ambiente. Ulteriori informazioni possono essere trovate nella Tabella materiali.
  7. Ibridazione e lavaggio
    1. Scaldare il tampone di ibridazione in un bagno di acqua di 65 ° C.
    2. Enzimaticamente etichettare una sonda di DNA con radioattivo α -32P dCTP e purificarla utilizzando kit commercialmente disponibili secondo la raccomandazione del costruttore.
      Nota: Utilizziamo una sonda di 0,5 – 2,0 kb in lunghezza da una regione enhancer-promotore o una sequenza di proteina-codificazione del genoma virale. Anche se questo protocollo utilizza 32P-identificato sonde radioattive per rilevazione del segnale, possono essere utilizzate anche non radioattivo sonde fluorescenti o chemiluminescente (fare riferimento alla sezione di discussione ).
    3. Posizionare la membrana in una bottiglia di ibridazione con il lato di DNA associato a, risciacquare la membrana con 5ml preriscaldata tampone di ibridazione e scartare il buffer. Aggiungere 10 mL di tampone di ibridazione preriscaldati, quindi posizionare la bottiglia in un forno rotante di ibridazione a 65 ° C. Ruotare per ≥ 5 min.
    4. Calore-denaturare 20 µ l di 10 mg/mL Tosato aringhe o soluzione di DNA di sperma di salmone e la sonda marcata con P 32(≥ 107 cpm) per 5 min inserendo i tubi su un insieme di blocchi di calore a 100 ° C. Poi snap-chill sul ghiaccio per ≥ 2 min, spin brevemente e tenere il ghiaccio fino all'utilizzo.
      Attenzione: Per le sonde di DNA radioattive, provette da 1,5 mL con tappo a vite e o-ring devono essere utilizzate.
    5. Aggiungere rapidamente il DNA denaturato sperma e la sonda radioattiva per il tampone di ibridazione l'ibridazione in bottiglia e agitare il flacone per 10 s a mescolare. Riportare la bottiglia per il forno di 65 ° C ed incubare la bottiglia con rotazione a 65 ° C per ≥ 4 h.
    6. Una volta completata l'ibridazione, fermare la rotazione, rimuovere la bottiglia di ibridazione e poi versare la soluzione di sonda radioattiva in una provetta conica 50 mL con tappo a sigillo tappo di tenuta. Conservare la sonda in un apposito contenitore disposto in un frigorifero indicato per materiali radioattivi.
      Nota: Usate tampone di ibridazione con una sonda che è conservata a 4 ° C possono essere riutilizzati almeno 5 volte ponendo la provetta conica da 50 mL con un tappo a tenuta tenuta spina contenente tampone di ibridazione in bagnomaria a 100 ° C per 5 min.
    7. Lavare la membrana con Buffer lavare riscaldato a 65 ° C. Aggiungere 20-30 mL di tampone di lavaggio per la bottiglia di ibridazione e ruotare per 5 min, Ripeti questo lavare 2 volte.
      Nota: Misurare la radioattività di soluzioni di lavaggio e registrarlo se richiesto dall'istituto locale.
    8. Mentre ci si lava la membrana, posizionare un fosforo imaging schermo su una gomma di immagine per 5 min.
    9. Dopo il terzo lavaggio, rimuovere la membrana dalla bottiglia ibridazione, rimuovere il tampone in eccesso sulla membrana con asciugamani di carta e posizionare la membrana in un supporto di carta in plastica trasparente. Controllare i segnali radioattivi sulla membrana utilizzando un contatore di Geiger. Esporre lo schermo imaging di fosforo cancellati alla membrana per 10 min a tutta la notte a seconda dell'intensità di segnale.
    10. Scansione sullo schermo utilizzando una sistema di scansione delle immagini fosforo e ottenere i dati sull'intensità di segnale di ogni punto.
  8. Analisi dei dati
    1. Disegnare una curva standard utilizzando software di analisi dati e foglio di calcolo (ad esempio, Excel).
      Nota: Log-log regressione lineare è stata usata per disegnare una curva standard.
    2. Determinare nanogrammo-equivalente (ng-eq) per ciascuno dei campioni del DNA virali mediante interpolazione. La ng-eq è la quantità del plasmide DNA usato per disegnare una curva standard che equivale al numero di molecole di DNA virale. Quando la lunghezza del DNA del plasmide è 8.000 bp, 1 ng-eq del DNA virale di single-stranded AAV corrisponde a 2.275 x 108 particelle.
      Nota: Ng-eq può essere convertito in numero di particelle virali con le seguenti equazioni:
      Equation 1
      Equation 2
      Il numero di particelle AAV è convenzionalmente espressi come "vg" (vector genomi) o "DRP" (particelle dnasi I-resistente).
    3. Calcolare le concentrazioni di AAV di materie. Perché il DNA virale blotted rappresenta 66,7% Equation 3 del DNA virale nei materiali di partenza, 1 ng-eq corrisponde a 1,7 x 109 particelle/mL Equation 4 .
      Nota: Questa correzione non è necessaria se è cancellato tutto il DNA virale contenuto nel materiale di partenza su una membrana senza perdita (Vedi Figura 1).

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Representative Results

Un risultato rappresentativo dei quantitativi dot blot per quantificazione delle scorte di vettore AAV purificate prodotta su larga scala è illustrato nella Figura 1. Con questa analisi di macchia del puntino, il titolo di uno stock di vettore di double-stranded AAV2G9-CMV-GFP è stato determinato. Il vettore è stato purificato mediante due turni di cloruro di cesio (CsCl) ultracentrifugazione di pendenza di densità seguita da dialisi come descritto in precedenza20. In generale, per gli stock di vettore AAV purificati, tre volumi differenti di ogni stock di vettore AAV (ad es., 0,3 µ l, 0,1 µ l e 0,03 µ l) sono sottoposti alla procedura di macchia del puntino sopra descritta in duplice copia con una modifica. Dnasi I enzima A viene utilizzato al posto dell'endonucleasi marcescens dello S. al punto 3.2, e un kit disponibile in commercio per estrarre e purificare il DNA virale è utilizzato nel passaggio 3.4 (Vedi Tabella materiali). Nell'esempio illustrato nella Figura 1, i valori di intensità di segnale (unità arbitrarie) ottenuti da ogni plasmide DNA standard (Figura 1A) sono stati tracciati contro la quantità note di DNA per disegnare una curva standard (Figura 1B), mostrando una correlazione coefficiente di 0.998. Utilizzando questa curva standard, è stato determinato mediante interpolazione che 0,03 e 0,1 e 0,3 aliquote µ l del vettore AAV2G9 ha mostrato 1.487 e 1.522 ng-eq (0,3 µ l), 0,487 e 0,507 ng-eq (0.1 µ l) e 0,158 e 0,171 ng-eq (0.03 µ l). Questo ha dato i seguenti sei valori: 4.957, 5.073, 4.870, 5.070, 5.267 e 5.700 ng-eq / µ l per questo particolare AAV2G9 vector stock, che conduce ad una media di 5,16 ± 0.27 ng-eq / µ l (media ± SD). Poiché la lunghezza del plasmide usato come lo standard (pEMBL-CMV-GFP) è 5.848 bp, il titolo di questo vettore di AAV2G9 è stata determinata per essere 8.0 x 1011 vg/mL secondo l'equazione 2 nel passaggio 3.8.2. Questo test viene ripetuto almeno due volte per determinare i titoli finali delle scorte di vettore AAV.

Nella Figura 2viene visualizzato un risultato rappresentativo di cross-complementazione saggi per valutare la dipendenza AAP nell'Assemblea del capsid VP3 e la capacità per AAPs per assemblare VP3 proteine eterologhe origini. In vitro gli studi di AAV spesso non richiedono purificazione di virus per trarre conclusioni, ed esperimenti utilizzando preparazioni di virus non purificata come lisati cellulari grezza e terreni di coltura contenenti virus sono sufficienti per produrre risultati significativi. In questo esperimento, AAV particella virale produzione è stata valutata da tutte le possibili combinazioni di AAV VP3-AAP tra AAV5, AAV9 e serpente AAV comprese combinazioni di AAP VP3-no da un'analisi di macchia del puntino quantitativa. I campioni ottenuti in un set di duplicati di un esperimento furono cancellati a 1x e 10 x diluizioni (serie A e serie B in Figura 2A, rispettivamente). Il grafico mostrato nella Figura 2B riassume l'analisi quantitativa dei puntini. I risultati mostrano che: (1) AAV5VP3 assembla indipendentemente dal fatto se AAP è stato fornito in trans, (2) AAP5 e AAP9 possono promuovere l'Assemblea del capside AAV9VP3 anche se AAP5 funzioni meno efficacemente di AAP9, (3) né AAP5 né AAP9 esibisce un assembly promuovere attività il serpente AAV VP3 e (4) serpente AAP promuove solo assemblaggio di serpente AAV VP3. (1) e (2) sono in linea con precedenti osservazioni6, ma l'unico specifico AAV VP3-AAP interazione in serpente AAV è una romanzo scoperta in questo esperimento. Una debolezza del cross-complementazione dosaggio basato su macchia del puntino quantitativa è che il controllo negativo sempre Mostra livelli apprezzabili di segnali di fondo che non possono essere eliminati totalmente. Pertanto, il dosaggio di dot blot di per sé non può escludere la possibilità che capside assembla ad un livello inferiore alla sensibilità del dosaggio. A questo proposito, si deve osservare che, per generare i controlli negativi, una condizione viene utilizzata sotto cui genomi virali AAV esponenzialmente replicati in assenza del capside VP3 proteina. Tali controlli negativi possono essere generati da trasfezione le cellule HEK 293 con pAAV-Reporter, pHLP-Rep e pHelper (tabella 2) e vengono utilizzati per ridurre i falsi positivi.

Dnasi è stato ampiamente utilizzato come una nucleasi a dot blot e analisi qPCR-based per la quantificazione di AAV per rimuovere residui plasmide DNAs e non imballati genomi virali che hanno contaminato i preparativi AAV. Questi contaminanti altrimenti porterebbero a una sovrastima dei titoli; di conseguenza, la digestione di nucleasi è un passo molto importante per quantificare con precisione i titoli del genoma virale. Dnasi gli enzimi sono disponibili da diversi produttori e venditori commerciali; Tuttavia, l'importanza della selezione della dnasi I in quantificazione AAV sembra sono stati sottovalutati. Per studiare come la scelta di nucleasi potrebbe influenzare i risultati del dosaggio dot blot, le nucleasi di tre seguenti sono state confrontate per la loro capacità di rimuovere sfondo segnali da AAV vettore contenenti terreni di coltura preparato come descritto in precedenza nei passaggi 2 e 3: dnasi I enzima A, dnasi I enzima B e S. marcescens endonucleasi (Tabella materiali). Gli studi pubblicati hanno utilizzato la dnasi due ex ho enzimi13,21,22,23,24 e ci sono state utilizzando s. marcescens endonucleasi in precedente e corrente studi. Con nostra sorpresa, è stato identificato che enzima dnasi I A non è affatto una scelta appropriata per il dosaggio di dot blot utilizzando i supporti contenenti virus nelle varie condizioni testate, con conseguente elevato background segnali dal controllo negativo, mentre dnasi I enzima B e S. marcescens endonucleasi ridotto efficacemente i segnali di sfondo con dnasi I enzima B essere ~ 2 volte più efficace di endonucleasi marcescens dello S. (Figura 3A, B). Dnasi I enzima C inoltre è stato trovato per essere molto efficace per ridurre i segnali di sfondo (dati non mostrati). Questi dati dimostrano che ci sono differenze significative nelle attività enzimatiche tra nucleasi commercialmente disponibile quando le reazioni enzimatiche vengono eseguite nelle preparazioni di AAV non purificate anche digestione nuclease dovrebbe essere efficace quando un piccolo quantità di preparazioni virale purificate viene trattato sotto una condizione ottimizzata. Così, questi dati sottolineano l'importanza della corretta selezione delle nucleasi nell'analisi quando non purificate preparazioni di AAV subiscono un'analisi quantitativa puntino di macchia o qPCR.

Figure 1
Figura 1: un'analisi della macchia punto rappresentativo per determinarne il titolo di un vettore AAV purificato di CsCl. (A) Double-stranded vector AAV2G9-CMV-GFP è stato prodotto in cellule HEK 293 da standard metodo di transfezione del plasmide dell'adenovirus-libero tre su larga scala e purificato da due turni di ultracentrifugazione di pendenza di CsCl, seguita da dialisi. 0,3, 0,1 e 0,03 µ l dello stock di vettore AAV purificato (cancellati sulla colonna a destra) sono stati sottoposti per l'analisi della macchia di dot quantitativa in duplice copia con due set di standard di DNA duplicato plasmide (malattie sessualmente trasmissibili). La macchia è stata ibridata con una sonda GFP con etichetta P 32(0,77 kb), e l'immagine è stata ottenuta utilizzando una sistema di scansione delle immagini fosforo. (B) una curva standard mostrano il rapporto tra quantità di DNA plasmidico noto (ng-eq, asse x) e intensità di dot (unità arbitrarie (AU), asse y). I numeri sull'asse y sono stati ottenuti con l'immagine di fosforo sistema di scansione. R indica il coefficiente di correlazione di Pearson. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: analisi della macchia AAV VP3-AAP cross-complementazione dot. Produzione di particelle di Double-stranded AAV-CMV-GFP vector è stato testato per le proteine di VP3 da AAV5, AAV9 e serpente AAV in presenza o in assenza di loro AAPs cognate o in presenza di AAPs delle origini eterologhe. (A), il test è stato effettuato in un insieme biologicamente duplicato degli esperimenti (serie A e serie B) con tempo di incubazione di 4 h con s. marcescens endonucleasi e il titolo di vettore AAV ottenuto da ogni combinazione è stato determinato da un punto quantitativo asciugare il metodo descritto nella sezione protocollo. Ogni punto rappresenta due terzi (le righe 5 e 6, 66,7%) o due-trentesimi (le righe 7 e 8, 6,7%) di DNA recuperato da ogni 200 µ l di terreno raccolti dai campioni o il controllo negativo. Le prime quattro righe (1 ° al 4 righe) rappresentano due insiemi di norme di DNA del plasmide (STD 1 e 2 STD) cancellati in duplice copia (vale a dire, linearizzato plasmide pEMBL-CMV-GFP, che è il plasmide usato per la produzione di vettore di double-stranded AAV-CMV-GFP). Membrana della macchia del puntino è stata sondata con una sonda GFP con etichetta P 32. La coppia di punti indicati con rettangoli arrotondati è controlli negativi. Le prime due righe (STD 1) sono nella parte inferiore della macchia originale ma sono state tagliate e spostate verso l'alto senza alterare l'intensità di immagine per visualizzare entrambe le norme plasmide (STD 1 e 2 STD) fianco a fianco. Questa manipolazione è indicata con una linea nera nella figura. Titolo virale (B) è stata determinata per le combinazioni di VP3 e proteine AAP dal dot blot assay. Il grafico rappresenta un biologicamente quadruplicated set di dati, due da pannello A e due da un'altra macchia del puntino che non viene mostrata. Barre di errore indica la media + /-SD (n = 4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: un confronto delle attività enzimatiche di nucleasi differenti in preparazioni di vettore AAV impura. Macchia del puntino quantitativa di (A) A che mostra l'efficacia di ogni trattamento di nucleasi eliminare segnali di fondo. Preparazione di una doppia elica AAV9-CMV-GFP vector-contenente ("vettore di AAV9") e un "no-capside controllo" erano prodotta dalla transfezione delle cellule HEK 293 con il plasmide DNAs e sottoposto a test. Il controllo di no-capside non contiene particelle virali ma conteneva esponenzialmente amplificati genomi di vettore CMV-GFP non imballati. MgCl2 è stato completato in uno o tre volte le quantità raccomandate (6 mM e 18 mM per la dnasi I enzima A; e 2,5 mM e 7.5 mM per dnasi I enzima B) senza prendere in considerazione il 0,8 mM MgSO4 presente nel terreno. Per il trattamento con endonucleasi marcescens dello S. , è stata testata solo una condizione descritta nella sezione protocollo. Tutti i campioni sono stati trattati con ogni nucleasi per 1 h. Membrana della macchia del puntino è stata sondata con una sonda GFP con etichetta P 32. In due colonne (STD 2) sono da sinistra della macchia originale ma sono state tagliate e spostate a destra senza alterare l'intensità di immagine da visualizzare entrambi standard di plasmide (STD 1 e 2 STD) fianco a fianco. Questa manipolazione è indicata con una sottile linea nera nella figura. (B) punti nei campioni di controllo no-capside nel pannello A sono quantificati e visualizzate come media ± | ogni valore — valore medio |. Sette dei 12 campioni trattati con dnasi I enzima A (indicato con un asterisco) mostrano valori solo leggermente superiori al livello piu alto; Pertanto, sono inclusi in questo grafico per il confronto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Serratia marcescens Endonucleasi Buffer
50 mM Tris-HCl
2 mM MgCl2
Regolare il pH 8,5 con 4 M NaOH.
Proteinasi K tampone 10x
100 mM Tris-HCl a pH 8.0
pH di 100 mM EDTA 8.0
5% SDS
2 x soluzione alcalina
800 mM NaOH
20 mM EDTA
20 x SSC (1 L)
175,3 g NaCl
88,2 g sodio citrato tribasico (Na3C6H5O7)
Soluzione di Denhardt 100 x (50 mL)
1 g albumina bovina (frazione V) Nota: Il filtro è fondamentale al fine di rimuovere le particelle piccole come causano segnali di ibridazione di fondo.
1 g 400 di Polysucrose
1g polivinilpirrolidone
Sciogliere in 20 mL di acqua in una vasca di acqua di 55 ° C.
Regolare il volume finale di 50 mL.
Filtro-sterilizzare con un filtro di 0,22 μm.
Tampone di ibridazione
1% SDS Nota: Il tampone di ibridazione di Store a 4 ° C e calore a 65 ° C in un prima vasca acqua di usarla.
6 x SSC
Soluzione di Denhardt: 5x
10 mM Tris-HCl a pH 8.0
Tampone di lavaggio
0,1% SDS
0.1 x SSC
Soluzione di polyethylenimine (PEI) (1 mg/mL, 500 mL)
Aggiungere 500 mg PEI in 450 mL di acqua e mescolare. Nota: Per una conservazione più lunga, è consigliabile-80 ° C.
Aggiungere HCl concentrato per portare il pH down a < 2.0 per sciogliere PEI (circa 800 µ l di HCl sarà richiesto).
Aggiungere 10 M NaOH per portare il pH fino a 7.0 (circa 500 µ l di 10 M NaOH sarà richiesto).
Regolare il volume a 500 mL di acqua.
Filtro-sterilizzare con un filtro di 0,22 μm.
Aliquotare e conservare a-20 ° C.
Fenolo-cloroformio (miscela 1:1) per macchiare del puntino quantitativa
Aggiungere tampone saturo fenolo (pH 8.0) e cloroformio con un rapporto di 1:1 in un tubo conico in polipropilene da 50 mL. Nota: Il buffer che copre lo strato organico, se lasciato nel tubo, possa essere riportato nelle provette campione attraverso il pipettaggio e può rendere il test inesatti.
Vortice del tubo energicamente per mescolare.
Consentire per separazione di fase mediante centrifugazione e quindi rimuovere completamente lo strato acquoso.
Conservare a 4 ° C.

Tabella 1: soluzione e ricette del Buffer. Ricette per le soluzioni e buffer necessari per completare il punto quantitativo della macchia protocollo.

Plasmide AAP(+) (μg) AAP(-) (μg) Controllo negativo (μg) Controllo di transfezione (μg)
pCMV-AAVx-VP3 0.4 0.4
pCMV-bandiera-AAPx 0.4
pAAV-Reporter 0.4 0.4 0.4
pHLP-Rep 0.4 0.4 0.4
pHelper 0.4 0.4 0.4
pCMV (vuoto) 0.4 0,8
pCMV-GFP 2.0
Totale 2.0 2.0 2.0 2.0

Tabella 2: combinazioni di plasmide per l'analisi di cross-complementazione AAV VP3-AAP eseguita in un formato di piastra a 6 pozzetti. Combinazioni del plasmide DNAs da utilizzarsi per la transfezione delle cellule HEK 293 in ogni gruppo sperimentale sono indicate. pCMV-AAVx-VP3, un plasmide esprimente sierotipo AAV x (x = 1, 2, 3, ecc.) VP3 proteina sotto il rinforzatore di CMV-IE-promotore; pCMV-bandiera-AAPx, un plasmide esprimente sierotipo AAV x (x = 1, 2, 3, ecc.) della proteina AAP sotto il rinforzatore di CMV-IE-promotore; pAAV-Reporter, un plasmide che ha due ripetizioni di terminal AAV2 invertito (ITRs) ed è progettato per la produzione di vettore AAV ricombinante; pHLP-Rep, un plasmide esprimente la proteina Rep AAV2; pHelper, un plasmide di helper dell'adenovirus; pCMV (vuoto), un plasmide vuoto aggiunto per controllare le condizioni sperimentali; pCMV-GFP, un plasmide esprimente un gene marcatore di fluorescenza (ad es., GFP) per verificare il successo di transfezione. Transfezioni sono condotte in piastre da 6 pozzetti e utilizzano un totale di 2 µ g del plasmide DNAs.

Mix A Per 10 provette (μL)
Serratia marcescens Endonucleasi Buffer 91,2
0.1 NaOH M 8.8
Totale 100
Mix B Per 10 provette (μL)
Serratia marcescens Endonucleasi Buffer 91,2
1 M MgCl2 7.04
Serratia marcescens Endonucleasi (250 unità/μL) 0,176
Totale 100
Mix C Per 10 provette (μL)
Proteinasi K tampone 10x 400
Proteinasi K (20 mg/mL) 100
H2O 1.300
Totale 1.800
Mix D Per 10 provette (μL)
100% etanolo 8.000
Acetato di sodio 3 M (pH 5.2) 320
Glicogeno Oyster (20 mg/mL) 10
Totale 8.330

Tabella 3: elenco dei reagenti di mix master. Mix A e Mix B sono utilizzati per il trattamento di endonucleasi marcescens dello S. al punto 3.2. Questi due miscele dovrebbero essere fatto separatamente per impedire la precipitazione dell'idrossido di magnesio. Mix C viene utilizzato per il trattamento di proteinasi K in fase 3.3. Mix D è usato per la precipitazione dell'etanolo nel passaggio 3.4.3. I volumi indicati in tabella sono per mix master reagenti per 10 provette.

Standard di DNA del plasmide (ng) Volumi (µ l) di 25 pg / µ l plasmide DNA standard soluzione Volumi (µ l) di acqua Volume totale (µ l)
5 600 0 600
2.5 300 300 600
1.25 150 450 600
0.625 75 525 600
0,313 37.5 562.5 600
0.156 18,8 581.2 600
0,078 9.4 590.6 600
0,039 4.7 595.3 600

Tabella 4: gli standard quantitativi dot blot plasmide DNA. Necessari volumi di 25 soluzione standard per il DNA del plasmide pg / µ l e acqua o TE per preparare plasmide DNA gli standard di diluizioni seriali (600 µ l/tubo) vengono visualizzati. I numeri nella colonna standard del DNA del plasmide (0.039 a 5 ng) sono la quantità di DNA in 200 µ l di ciascuna soluzione standard di DNA plasmidico.

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Discussion

In questo rapporto, l'utilità di analisi blot quantitativo dot per studiare AAV AAPs e il loro ruolo nell'assembly del capsid è descritto. Conoscenze acquisite da questi studi possono fornire approfondimenti dettagliati nelle differenze innate nel processo di assemblaggio del capside AAV ed il ruolo funzionale di AAPs tra diversi sierotipi. A questo proposito, il punto croce-complementazione AAV VP3-AAP blot analisi ha rivelato che serpente AAV VP3 visualizzato una rigorosa dipendenza il co-espressione di sue cognate AAP per l'assemblaggio del capside e che serpente AAP non promuovere l'Assemblea del capside dei sierotipi eterologi . Questa osservazione è intrigante perché l'AAV AAP-dipendente dei sierotipi che sono stati precedentemente studiati (AAV1, 2, 3, 6, 7, 8, 9 e 12) sono tutti in grado di elaborare assembly almeno in una certa misura utilizzando un eterologa AAP6.

Ibridazione della macchia del puntino o in scanalatura quantitativa è un metodo tradizionale per la quantificazione degli acidi nucleici contenute in campioni multipli allo stesso tempo in un modo conveniente di25. Il metodo era stato ampiamente usato per la quantificazione di DNA e RNA finché qPCR divenne prevalente nell'1990s26,27. Anche se qPCR presenta i vantaggi sopra la macchia del puntino quantitativa ed altri saggi basati su ibridazione in quel qPCR esibisce una maggiore sensibilità e una gamma dinamica più ampia, comporta anche un rischio intrinseco di esponenzialmente aumentando errori inconsapevolmente, che era il caso per i titoli delle scorte di vettore AAV determinate da qPCR13,23. Analisi di quantitativi dot blot sono impostare facilmente con un costo economico e facilmente effettuate, purché i ricercatori avranno a disposizione un sistema di imaging molecolare quantitativo che può acquisire segnali da dot blot membrane ibridate con una sonda o radioattiva o una sonda fluorescente o chemiluminescente non radioattivo. Anche se questo protocollo utilizza 32P-identificato sonde radioattive per rilevazione del segnale, altri utilizzano con successo le sonde del DNA non radioattivo direttamente etichettate con una fosfatasi alcalina termostabile commercialmente disponibili28. Analisi di dot blot sfruttano un principio semplice e il dosaggio di per sé non costituisce una sfida tecnica agli esecutori; Pertanto, i risultati sono generalmente riproducibili anche da individui inesperti.

Oltre alle applicazioni descritte qui, usiamo ordinariamente una versione semplificata e accelerata della procedura dot blot che può semi-quantificare particelle AAV rapidamente. Vantaggi dell'analisi blot puntino in questo contesto includono: (1) il test non richiede purificazione o amplificazione enzimatica di genomi virali che richiede ore, (2) una combinazione di calore e denaturazione alcalina è sufficiente per rompere le particelle AAV in un campione soluzione e rilascio denaturato genomi virali nella soluzione che sono pronti per associare a una membrana di macchia del puntino e (3) la presenza di sale alle alte concentrazioni nei campioni non influenzino significativamente i risultati del saggio. Ad esempio, è possibile semi-quantificare particelle AAV in soluzioni ricche CsCl (ad es., frazioni ottenute dall'ultracentrifugazione di pendenza di densità di CsCl) mettendo una piccola aliquota (≤ 10 µ l) di campioni in 100 µ l di soluzione alcalina, riscaldamento a 100 °: 1x C per 10 min e macchiare su una membrana con o senza campioni preparati in anticipo, seguite da un'ibridazione di 15 min, min 3 x 3 lavaggi e l'esposizione a un fosforo imaging schermo per 15 min (o più a lungo quando si utilizza una sonda con radioattività in diminuzione). L'intera procedura può essere completata in 1 h, una volta che l'utente diventa familiarità con la procedura. Usiamo questo metodo accelerato, che noi abitualmente chiamiamo "metodo della bollitura dot blot", per identificare AAV frazioni di CsCl ricche di particelle durante la purificazione di vettore di processo e determinano approssimativamente i titoli delle scorte di vettore AAV purificate prima di iniziare il vasto processi per la caratterizzazione di vettore. Così, anche se analisi di dot blot potrebbero essere visto come un metodo obsoleto per quantificare gli acidi nucleici e già sono stati sostituiti con vari metodi basati sulla PCR in una vasta gamma di discipline scientifiche, ci sono ancora una serie di vantaggi a questo metodo che dovrebbe fanno i ricercatori a considerare che impiegano nei loro laboratori.

La fase più critica nel protocollo è il trattamento di nucleasi di campioni. Se questo passaggio non avviene in una condizione ottima, causerebbe segnali di alta priorità bassa. Usiamo i marcescens dello S. endonucleasi mentre dnasi I enzimi delle diverse fonti sono ampiamente usati in altri laboratori per la quantificazione del DNA virale. La dnasi I d'origine pancreas bovino è stato più ampiamente utilizzato dai ricercatori. Questo è in parte perché la dnasi pancreatica bovina sono stato il primo identificato e più estesamente caratterizzato biochimicamente29. La dnasi I enzimi attualmente disponibili da fornitori commerciali sono prodotti da varie fonti biologiche quali Pichia pastoris (dnasi I enzima A.), il modulo nativo purificato dal pancreas bovino (ad es., dnasi I enzima B), e enzimi ricombinanti prodotte in una specie di lievito o Escherichia coli (dnasi I enzima C). Abbiamo trovato che la dnasi I enzimi da tutte e tre queste diverse fonti sono stati utilizzati negli studi di quantificazione vettore AAV pubblicati; Tuttavia, a nostra conoscenza, nessuno degli studi precedenti hanno studiato se gli enzimi da diverse fonti sono ugualmente efficaci nella digestione di molecole di DNA contaminante nelle preparazioni di vettore AAV. Dovrebbe essere notato quella dnasi ho trattamento per le analisi di vettore AAV è spesso effettuato in condizioni non ottimizzato per la presenza di impurità derivate da cellule e terreno di coltura. L'osservazione che è parzialmente attivo nel terreno di coltura che abbiamo usato solo enzima dnasi I A ha implicazioni significative nel progettare il dosaggio per quantizzazione vettoriale AAV di qPCR e dot blot e avvisa i ricercatori a questo problema precedentemente non identificato. A questo proposito, S. marcescens endonucleasi espressa in e. coli, è un'endonucleasi ideale non solo per la fabbricazione di vettori AAV, ma anche per la quantificazione di vettore AAV. Questo è perché la sua attività enzimatica può essere mantenuto sopra una vasta gamma di valori di pH e concentrazioni di ioni di magnesio e cationi monovalenti. Per questo motivo, e poiché endonucleasi marcescens dello S. sono circa 2 volte meno costoso di dnasi I enzima B su base unitaria, preferiamo usare endonucleasi marcescens dello S. in analisi di routine quantitativa dot blot.

In sintesi, l'analisi di quantitativi dot blot sono una procedura relativamente semplice che può fornire prontamente informazioni sulla capacità di produrre particelle virali nelle varie condizioni. Rispetto ad approcci alternativi titolazione, quali qPCR, questo approccio richiede poco, se del caso, ottimizzazione. Esso può essere facilmente applicato anche ai vettori di qualsiasi sierotipo e può essere utilizzato a titolo sia singolo - e double-stranded file vettoriale senza modificare il protocollo. In seguito transfezioni e raccolta di campioni di contenenti vettore AAV (terreno di coltura e/o cellule), l'intero protocollo può essere completato in un giorno, così rapidamente rispondendo alle domande circa la capacità di produrre particelle virali da diverse condizioni, tra cui varie combinazioni di proteine AAV VP3 e AAP. Quantitativa dot blot offrono un metodo vantaggioso per affrontare le varie domande senza risposta per quanto riguarda le interazioni di VP-AAP e loro ruoli nell'assembly del capsid in un'ampia varietà di diversi sierotipi AAV e isolati.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Vi ringraziamo di averci fornito il plasmide pEMBL-CMV-GFP Xiao Xiao presso la University of North Carolina a Chapel Hill. Ringraziamo Christopher Cheng e Samuel J. Huang per una lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal servizio di sanità pubblica concede (NIH R01 NS088399 e T32 EY232113).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase MilliporeSigma 1016970001 Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text.
DNase I Roche 4716728001 Referred to as DNase I Enzyme A in the main text.
DNase I Invitrogen 18047019 Referred to as DNase I Enzyme B in the main text.
DNase I New England Biolabs M0303L Referred to as DNase I Enzyme C in the main text.
1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes Corning 430909
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Polypropylene Conical Tube Corning 352097
3 M Sodium Acetate Teknova S0298
50 mL Polypropylene Conical Tube Corning 430291
AAV-293 Cells Agilent 240073 HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions.
AccuGENE 0.5 M EDTA Solution Lonza 51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 Lonza 51238
AccuGENE 10% SDS Lonza 51213
AccuGENE 1X TE Buffer Lonza 51235
Bio-Dot Apparatus Bio-Rad 1706545
Bovine Serum Albumin MilliporeSigma A3294
Cell Lifter Corning 3008
Chloroform MilliporeSigma 372978
DNA Extractor Kit Wako Pure Chemical Industries 295-50201 This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) Lonza 12-614F
ElectroMAX DH10B Cells Thermo Fisher Scientific 18290015
Ethanol 200 Proof Decon Labs 2716
Fetal Bovine Serum VWR 1500-500
Ficoll 400 Alfa Aesar B22095 Referred to as Polysucrose 400.
Fluorescence Microscope Zeiss Axiovert 40 CFL
Glycogen Roche 10901393001
Herring Sperm DNA Invitrogen 15634-017
Hybridization Tubes Thermo Fisher Scientific 13-247-150
ImageQuant TL GE Healthcare Life Sciences ImageQuant TL
L-glutamine 200 mM Lonza 17-605E
Magnesium Chloride Hexahydrate MilliporeSigma M0250
MicroPulser Electroporator Bio-Rad 1652100
Mini Quick Spin DNA Columns MilliporeSigma 11814419001
pAAV-RC2 Vector Cell Biolabs Inc VPK-422
Penicillin/Streptomycin 10K/10K Lonza 17-602E
Phosphate Buffered Saline Lonza 17-516F
Phosphorimaging Exposure Cassette GE Healthcare Life Sciences Various
Phosphorimaging Screen GE Healthcare Life Sciences Various
Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162
Platinum Pfx DNA Polymerase Invitrogen 11708013
Polyethylenimine Polysciences Inc 23966-2
Polyvinylpyrrolidone MilliporeSigma P5288
Prime-It II Random Primer Labeling Kit Agilent Technologies 300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		 MilliporeSigma Custom Primer
Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Proteinase K Solution Invitrogen 25530-049
Restriction Enzymes New England Biolabs Various
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15632011
Serological Pipettes Thermo Fisher Scientific 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-10
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate MilliporeSigma C8532
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203L
Thermal Cycler Eppendorf 6321000515
Tissue-culture Treated 6-well Plate Corning 353046
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-5
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28955809
UltraPure Buffer-Saturated Phenol Invitrogen 15513-047
UV Crosslinker Spectroline XLE-1000 Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2.
Zeta-Probe Membrane Bio-Rad 162-0165

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References

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Biologia problema 136 virus Adeno-associato (AAV) proteina d'attivazione assembly (AAP) cross-complementazione quantitativa dot blot test titolo virale la terapia genica
Una quantitativa Dot Blot Assay AAV titolazione e suo uso per la valutazione funzionale di Virus Adeno-associato Assembly-attivazione proteine
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Powers, J. M., Chang, X. L., Song,… More

Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins. J. Vis. Exp. (136), e56766, doi:10.3791/56766 (2018).

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