Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

مقايسة دوت كمية وصمة عار لمعايرة إف واستخدامها لتقييم وظيفي للفيروسات المرتبطة بالغدة الجمعية-تفعيل البروتينات

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56766
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

Summary

تفاصيل هذه المخطوطة مقايسة دوت مباشرة وصمة عار كوانتيتيشن من التتر الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) وتطبيقه على دراسة دور الجمعية-تفعيل البروتينات (آبس)، فئة جديدة من البروتينات الفيروسية غير الهيكلية الموجودة في جميع إف اللقاح، في الترويج لجمعية كابسيدس المستمدة من اللقاح إف المشابهة ومغايرة.

Abstract

بينما الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) مقبول على نطاق واسع متجه جذابة للعلاج الجيني، أيضا بمثابة فيروس نموذجي لفهم البيولوجيا الفيروس. وفي الصدد، الاكتشاف الأخير للبروتين إف غير هيكلية، ووصف الجمعية-تفعيل البروتين (AAP)، ضوءا جديداً على العمليات التي ينطوي عليها جمعية البروتينات الفيروسية قفيصه نائب الرئيس إلى قفيصه. على الرغم من أن العديد من إف اللقاح يتطلب الوكالة الأسترالية للجمعية، أننا قد ذكرت مؤخرا أن AAV4، 5، و 11 استثناءات لهذه القاعدة. وعلاوة على ذلك، أثبتنا أن آبس وكابسيدس المجمعة من اللقاح مختلفة المعربة إلى مقصورات سوبسيلولار مختلفة. هذا التباين غير متوقعة في الخصائص البيولوجية والأدوار الوظيفية من آبس بين مختلف إف اللقاح يؤكد أهمية الدراسات في AAPs المستمدة من اللقاح المتنوعة. تفاصيل هذه المخطوطة مقايسة دوت مباشرة وصمة عار كوانتيتيشن إف وتطبيقه على تقييم الوكالة الأسترالية خصوصية الاتكال والنمط المصلي المسيطر في الجمعية قفيصه. وللتدليل على فائدة هذه المقايسة دوت وصمة عار، حددنا لتميز الجمعية قفيصه وتبعية الوكالة الأسترالية "إف ثعبان" وزواحف سابقا أونتشاراكتيريزيد إف، فضلا عن AAV5 و AAV9، التي ثبت سابقا أن تكون مستقلة عن الوكالة الأسترالية، وتعتمد على الوكالة الأسترالية اللقاح، على التوالي. المقايسة كشفت عن أن الجمعية قفيصه "إف ثعبان" يتطلب "الوكالة الأسترالية ثعبان" ولا يمكن تعزيزها آبس من AAV5 و AAV9. كما أظهرت المقايسة، خلافا للعديد من النمط المصلي المسيطر المشتركة آبس التي تعزز الجمعية قفيصه مغايرة بالتكامل عبر، "الوكالة الأسترالية الأفعى" لا تشجع جمعية كابسيدس AAV9. وباﻹضافة إلى ذلك، نعرض أن يؤثر اختيار نوكلاس كثيرا على قراءات للمقايسة وصمة عار دوت، وهكذا، اختيار إنزيم أمثل أمر حاسم لتقييم نجاح التتر إف.

Introduction

الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) فيروس الحمض النووي الصغيرة، غير المغلفة، واحد-الذين تقطعت بهم السبل مع جينوم لحوالي 4.7 كيلوبس (kb). جينوم إف يحتوي على إطارات مفتوحة القراءة (Orf) للجينات مندوب و كاب . في عام 2010، اكتشفت أم سونتاج et al. بروتين nonstructural سابقا مجهولة مرمزة بواسطة ORF تحول الإطار + 1 داخل الجينات كاب AAV2 ووجدت أن تلعب دوراً حاسما في جمعية AAV2 قفيصه نائب الرئيس مونومر البروتينات في الفيروسية 1من قفيصه. قد سمي هذا البروتين رواية الجمعية-تفعيل البروتين (AAP) بعد الدور الذي تؤديه في تعزيز قفيصه الجمعية العامة1.

وقد ORFs للوكالة الأسترالية بيوينفورماتيكالي التي تم تحديدها في الجينوم من جميع بارفوفيروسيس داخل جنس ديبيندوبارفوفيروس، ولكن ليس ضمن مورثات من فيروسات أجناس مختلفة من الأسرة1،البارفو2. الدراسات الفنية لهذا البروتين الرواية في البداية ركزت على الوكالة الأسترالية من النموذج AAV2 (AAP2)، التي أنشأت بالدور الأساسي ل AAP2 في استهداف البروتينات نائب الرئيس مفككة إلى نوية لتراكم وتكوين في كامل تجميع كابسيدس1،،من34. وقد عجز كابسيدس AAV2 التجمع في غياب التعبير الوكالة الأسترالية بشكل مستقل أكدت مجموعات متعددة، بما في ذلك بلدنا1،2،،من34،5 . الدراسات اللاحقة على اللقاح إف 1 و 8 و 9 يؤكد على الدور الحاسم آبس في الجمعية قفيصه، كالبروتينات مونومر VP3 من AAV1، 8، و 9 لم يتمكنوا من تشكيل من قفيصه مجمع بشكل كامل في غياب التعبير المشارك من الوكالة الأسترالية2.

في الآونة الأخيرة، من خلال النهج التي تشمل استخدام الكمية دوت لطخة فحوصات، نحن التحقيق في قدرة AAV1 على 12 VP3 مونومرات لتجميع إلى كابسيدس في غياب التعبير الوكالة الأسترالية، وقدرة AAP1 إلى 12 النهوض بجمعية مونومرات VP3 من اللقاح مغايرة. وقد كشفت هذه الدراسة أن AAV4، VP3 5، و 11، يمكن تجميع مونومرات دون الوكالة الأسترالية. بالإضافة إلى ذلك، قد تبين أن ثمانية من أصل اللقاح الوكالة الأسترالية اثنا عشر قمنا بفحص (أي، لكن كل AAP4، 5 و 11 و 12) عرض بقدرة واسعة لدعم الجمعية قفيصه من كابسيدس النمط المصلي المسيطر إف مغايرة، بينما AAP4، 5 و 11 و 12 عرض إلى حد كبير قدرة محدودة في هذا الصدد6. هذه الأنماط الأربعة فيلوجينيتيكالي بعيدة عن الآخر الوكالة الأسترالية اللقاح2،3. وعلاوة على ذلك، كشفت الدراسة تغايرية مهمة في تعريب سوبسيلولار مختلفة آبس6. وعلاوة على ذلك، وقد اقترحت الدراسة أن الرابطة ضيق من الوكالة الأسترالية مع كابسيدس المجمعة ونويه، السمة المميزة للجمعية قفيصه AAV2، بالضرورة لا يمكن أن تمتد للقاح الأخرى بما في ذلك AAV5، 8، و 9، الذي عرض استبعاد النوية كابسيدس المجمعة6. وبالتالي، المعلومات المكتسبة من دراسة أي النمط المصلي المسيطر خاصة الوكالة الأسترالية ليس نطاق واسع ينطبق على جميع الأحياء الوكالة الأسترالية. ويؤكد هذا الطابع المحير البيولوجيا الوكالة الأسترالية الحاجة إلى التحقيق في دور ووظيفة كل الوكالة الأسترالية من اللقاح إف كل المقبول وغير المقبول.

يمكن تقييم دور الوكالة الأسترالية البيولوجية في قفيصه الجمعية بتحديد التتر الجسيمات الفيروسية إف مغلفة تماما تنتج الكلي الجنينية البشرية (HEK) الخلايا 293، خط الخلية الأكثر استخداماً لإنتاج ناقلات إف، مع أو بدون البروتين الوكالة الأسترالية التعبير. هي الأساليب القياسية كوانتيتيشن إف PCR الكمي (qPCR)-استناداً إلى فحوصات7،8 ودوت الكمية على أساس وصمة عار فحوصات9. طرق أخرى إف كوانتيتيشن الجسيمات الفيروسية مثل المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم10،11 أو الكثافة الضوئية قياس12 ليست مثالية للعينات المستمدة من العديد من اللقاح إف مختلفة أو العينات ملوثة بالشوائب (ليساتيس النفط الخام أو ثقافة وسائل الإعلام)، التي غالباً ما تكون العينات المستخدمة للبحوث إف. حاليا، قبكر هو الأكثر استخداماً كوانتيتاتيون إف؛ ومع ذلك، من الضروري أن نعترف بالمحاذير المحتملة من مقايسة المستندة إلى قبكر، كما الفحص يمكن أن تؤدي الأخطاء النظامية وعيار كبير الاختلافات13،14. فحوصات على أساس PCR تتأثر بعدد من عوامل، مثل وجود دبابيس الشعر الطرفية تساهمي مغلقة في قوالب PCR التي تمنع التضخيم13التباس يحتمل أن تكون. حتى فرد ذوي خبرة يمكن أن يعرض إمكانات عوامل التباس في أساس qPCR الاعتداء تدري13. وفي المقابل، فحوصات وصمة عار دوت الكمية هي تقنية بيولوجيا الجزيئية كلاسيكية التي لا تنطوي على التضخيم الجينوم ويستخدم مبدأ أبسط بكثير مع الحد أدنى من مخاطر للأخطاء بالمقارنة مع الاختبارات المستندة إلى قبكر. الأسلوب أقل صعوبة من الناحية التقنية؛ ولذلك، نتائج التحليل يتم استنساخه بشكل معقول حتى من قبل الأفراد عديمي الخبرة.

في هذا التقرير، يصف لنا تفاصيل مقايسة وصمة عار دوت كمية نستخدمها بشكل روتيني لناقل إف كوانتيتيشن وتوفير مثال عن كيفية تطبيق التحليل دراسة دور تعزيز الجمعية آبس في عام اللقاح (AAV5 و AAV9)، والمنهجية أونتشاراكتيريزيد AAP سابقا من "ثعبان إف"14. في الطبيعة، يعبر عن "نائب الرئيس إف" البروتينات والبروتينات الوكالة الأسترالية في رابطة الدول المستقلة من جينة واحدة (أي، الوكالة الأسترالية نائب رئيس رابطة الدول المستقلة-التكامل)، بينما في مقايسة الموصوفة هنا، يتم توفير البروتينات نائب الرئيس والوكالة الأسترالية في ترانس من اثنين والبلازميدات منفصلة (أي، نائب الرئيس--الوكالة الأسترالية ترانس-التكامل). حيث يمكن التعبير عن كل البروتين نائب الرئيس أو الوكالة الأسترالية من اللقاح مختلفة من كل بلازميد مستقلة، يصبح من الممكن لاختبار تركيبات نائب الرئيس-الوكالة الأسترالية مغايرة للجمعية قفيصه (أي، نائب الرئيس--الوكالة الأسترالية عبر-التكامل). بإيجاز، VP3 إف من اللقاح مختلف أعرب عن في الخلايا HEK 293 تعداء بلازميد الحمض النووي حزمة جينوم ناقل إف في وجود أو غياب النمط المصلي المسيطر المشابهة الوكالة الأسترالية، أو حضور النمط المصلي المسيطر مغايرة الوكالة الأسترالية. وبعد الإنتاج، وسائط الثقافة وخلية ليساتيس يتعرضون مقايسة دوت وصمة عار التحديد الكمي للجينوم الفيروسي داخل shell قفيصه. الخطوة الأولى للمقايسة وصمة عار دوت التعامل مع عينات مع نوكلاس لإزالة تلويث بلازميد السلطات الوطنية المعينة وغير معبأة إف الجينوم في العينات. أن الفشل في القيام بذلك زيادة الإشارات الخلفية خاصة عندما يتم جزيئي عينات أونبوريفيد. ويعقب هذا ثم علاج مبطلات لكسر كابسيدس الفيروسية والإفراج عن الجينوم الفيروسي نوكلاس المقاوم في عينة حلول. الجينوم الفيروسية القادم، والتشويه والتحريف ومسح على غشاء وتهجين مع مجس الحمض النووي خاصة جينوم فيروسي كوانتيتيشن. في المقايسة المثال ذكرت هنا، نظهر أن يتطلب VP3 إف ثعبان ثعبان الوكالة الأسترالية للجمعية قفيصه وأن "الوكالة الأسترالية الأفعى" لا يروج لجمعية كابسيدس AAV9 خلافا للعديد من آبس المستمدة من اللقاح تعتمد على الوكالة الأسترالية التي يمكن أيضا أن تعزز الجمعية من كابسيدس النمط المصلي المسيطر مغايرة. أخيرا، نحن تقرير المحاذير هامة إلى قبكر أو فحوصات دوت كوانتيتيشن إف المستندة إلى وصمة عار أن اختيار نوكلاس يؤثر إلى حد كبير على نتائج التحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يتم توفير وصفات للحلول والمخازن المؤقتة اللازمة لهذا البروتوكول في الجدول 1. البروتوكول هو موضح أدناه للمقايسة وصمة عار دوت التكامل عبر نائب الرئيس-الوكالة الأسترالية لدراسة أدوار البروتينات الوكالة الأسترالية في الجمعية قفيصه. طريقة المقايسة دوت الكمية أكثر عمومية على وصمة عار لمعايرة ناقلات إف المنقي مفسرة في مقطع النتائج الممثل .

1-تشييد VP3، الوكالة الأسترالية، ومندوب AAV2 الإعراب عن البلازميدات

  1. بناء VP3-بكمف-آب (x = اللقاح)
    1. [بكر] تضخيم ORF VP3 كامل (1.6 كيلو بايت) باستخدام بوليميراز الدنا عالية الدقة وزوج التمهيدي التالية: VP3 إلى الأمام، كتا-RE1-كاكك-N25 (النيوكليوتيدات 25 أولاً من VP3 ORF)؛ VP3 العكسية، تكت-RE2-N25 (النيوكليوتيدات آخر 25 من VP3 ORF).
      ملاحظة: RE1 و RE2 مواقع لإنزيمات التقييد (REs) للاستنساخ. كتا وتكت هي المحطة 5 'و 3' تيترانوكليوتيديس إضافة إلى تسهيل الهضم إنزيم التقييد بالقرب من نهاية الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل. كاكك تسلسل توافق كوزاك.
    2. استنساخ منتجات PCR ريديجيستيد بين المقابلة إعادة المواقع ناقل التعبير الثدييات التي يستخدمها الفيروس المضخم للخلايا البشرية على الفور المبكر (CMV-IE) محسن-المروج للتعبير رفيعة المستوى.
      ملاحظة: للاستنساخ الجزيئي، هضم 5 ميكروغرام من الحمض النووي بلازميد العمود الفقري مع restriction enzyme(s) بتركيز 4 U/ميكروغرام الحمض الخلوي الصبغي ح 1 في درجة حرارة مثلى. لشظايا PCR، وزيادة وحدات الإنزيمات المستخدمة (مثلاً، 10 ش/ميكروغرام المنتج VP3 ORF PCR 1.6 كيلو بايت) وفترة حضانة أطول (مثلاً، ح 4) نظراً لزيادة عدد المواقع الاعتراف إنزيم التقييد كل وحدة طول. معلومات مفيدة في الإنزيمات البيولوجيا الجزيئية وإجراءات الاستنساخ بما في ذلك التحول البكتيري ويمكن الاطلاع على أماكن أخرى15،،من1617.
  2. بناء آبكس-بكمف-علامة (x = اللقاح)
    1. بكر-تضخيم ORF الوكالة الأسترالية كامل (0.6 كيلو بايت) باستثناء الأحماض الأمينية الأولى استخدام بوليميراز الدنا عالية الدقة وزوج التمهيدي التالية: الوكالة الأسترالية إلى الأمام، كتا-RE1-كاككاتجاكتاكاجاكجاكجاتجاكاا-N25 (النيوكليوتيدات 25 من النوكليوتيدات الرابعة في الوكالة الأسترالية ORF)؛ الوكالة الأسترالية عكس، تكت-RE2-N25 (النيوكليوتيدات 25 آخر من الوكالة الأسترالية ORF).
      ملاحظة: رموز جاكتاكاجاكجاكجاتجاكاا علامة علم، التي ثبت أن لها أي آثار ضارة4،5 ولكن يمكن حذفها إذا كانت غير ضرورية.
    2. استنساخ منتجات PCR ريديجيستيد بين المواقع المقابلة لناقل التعبير الثدييات مع CMV--أي محسن-المروج15،،من1617.
  3. بناء مندوب فلب
    1. ملخص 5 ميكروغرام من بلازميد باف RC2 (7.3 كيلو بايت) مع 20 وحدة من زهو و Xcm الأول، وتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات تنقية الحمض النووي تجاري أو عن طريق استخراج الفينول كلوروفورم.
      ملاحظة: إزالة 1.8 kb إكسهو أنا--Xcm أنا جزء من النتائج بلازميد RC2 باف 7.3 كيلو بايت في خسارة قفيصه التعبير البروتين نائب الرئيس مع الحفاظ على التعبير البروتين Rep.
    2. كليلة الحمض النووي ينتهي ب 6 وحدات من T4 دنا بوليميريز، [اغروس] هلام تطهير الجزء الحمض النووي 5.5 كيلو بايت، وذاتية سد جزء المنقي على استخدام 50 إلى 100 نانوغرام من الحمض النووي و 400 وحدة من ليجاسى T4 الحمض النووي وفقا للشركة المصنعة التوصية15.
    3. اتبع الإجراء التحول الجرثومي القياسية المشار إليها في الخطوة 1.1.2 علما.
  4. تحقق من بنيات بلازميد الهضم إنزيم التقييد وتسلسل15،18.
  5. أداء بلازميد مينيبريبس أو ماكسيبريبس باستخدام مجموعات المتاحة تجارياً للحصول على كمية كافية من بلازميد الحمض النووي لتجارب إنتاج إف المتلقين للمعلومات.

2-إنتاج إف في HEK 293 الخلايا التي بلازميد الدنا تعداء (التكامل عبر الفحص)

  1. الثقافة HEK 293 الخلايا في النسر المتوسط تعديل (دميم في دولبيكو)-ارتفاع الجلوكوز (4.5 غرام/لتر) وتستكمل مع 10% الجنيني البقري المصل (FBS)، 1% البنسلين & ميكس ستربتوميسين، و 1 مم حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون (CO2) ل الجلوتامين،.
    ملاحظة: التتر إف تختلف إلى حد كبير اعتماداً على مصدر الخلايا HEK 293.
    تنبيه: على الرغم من أن إف يمكن التعامل معها في السلامة الأحيائية من المستوى 1 (BSL1) الاحتواء، ويوصي بالاحتواء BSL2 HEK 293 خلية عمل.
  2. في يوم-1 (ح 24 قبل تعداء)، لوحة 6 – 7 × 105 HEK 293 الخلايا/بئر في 2 مل من المتوسط كاملة هو موضح في الخطوة 2، 1 في plate(s) 6-جيدا. وهذا يحقق عموما كونفلوينسي ~ 90% في اليوم التالي.
  3. اليوم 0: تعداء
    1. إعداد للحمض النووي تعداء
      1. تأكد من أن الخلايا قد وصلت إلى كونفلوينسي ~ 90%.
      2. الاحماء دميم تكملة مع 1% البنسلين & "ميكس ستربتوميسين" و 1 مم L-الجلوتامين ولكن دون 10% FBS (أيخالية من المصل المتوسط) في حمام مائي 37 درجة مئوية.
      3. تسمح حل بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد) تصل إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. إعداد خليط الحمض النووي بلازميد
      1. مزيج من البلازميدات في ميليلتر 96 من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) دون كاكل2 أو مجكل2 في أنابيب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل كما هو مبين في الجدول 2. المبلغ الإجمالي للحمض النووي 2 ميكروغرام/جيدا.
        ملاحظة: يمكن تجاهل وحدات التخزين للحل بلازميد الحمض النووي إذا كانت القيمة الاسمية. ويوصي بضبط مستوى الصوت إذا كان الحجم الإجمالي للحلول الحمض النووي بلازميد ميليلتر إيه وان زيرو.
    3. تعداء بي
      1. إضافة 4 ميليلتر من حل بي (1 ملغ/مل) لهذا المزيج PBS-بلازميد الحمض النووي (أعدت كما هو مذكور أعلاه). وحدة التخزين النهائي هو حوالي 100 ميليلتر (حجم 5% من متوسط الثقافة). دوامة الأنابيب بإيجاز واحتضان خليط الحمض النووي: بي لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      2. أثناء انتظار الاحتضان 15 دقيقة لإكمال، يستعاض المتوسطة الثقافة المتوسطة بريوارميد خالية من المصل هو موضح في الخطوة 2.3.1.2...
      3. 15-دقيقة مرة واحدة في الحضانة من الحمض النووي: خليط بي كاملة، بإيجاز تدور هذه الأنابيب مع ميكروسينتريفوجي لجمع السائل إلى الجزء السفلي من الأنابيب، وإضافة خليط الحمض النووي: بي dropwise إلى المتوسطة الثقافة في كل من لوحة الثقافة HEK 293 جيدا. بلطف تحرض اللوحات وإعادتها إلى حاضنة 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
      4. الحفاظ على الخلايا في هذه الوسيلة تعداء حتى موسم الحصاد في يوم 5 (أي تغيير المتوسطة مطلوب).
  4. وفي يوم 1 و 2 يوم، مراقبة الخلايا transfected مع بلازميد بكمف-التجارة والنقل تحت مجهر مقلوب الأسفار تقييم الكفاءة تعداء.
    ملاحظة: للأسفار مجهرية، هنا 10 X/استخدمت 0.25 الهدف الفتحة العددية في تركيبة مع العدسة 10 ×، ويعملن 450-490 نانومتر الإثارة ممر الموجه مرشح و 515 – 565 نانومتر ممر الموجه مرشح الانبعاثات. الشرط أعلاه عادة ينتج أكثر من الكفاءة تعداء 70%. الخلايا فقد يحمل بعض التغييرات السمات (مثل خلايا أصبحت ضئيلة) بسبب حالة خالية من المصل.
  5. 3 – 5 أيام، لا تزال الثقافة transfected الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO2.
  6. في يوم 5، جمع الخلايا والمتوسطة التي تحتوي على الفيروسات إلى أنابيب مخروطية البوليبروبيلين 15 مل بيبيتينج صعودا وهبوطاً أو بإلغاء مع مكشطة خلية.
  7. تخزين العينات في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3-دوت المقايسة وصمة عار كوانتيتاتيون إف

  1. استرداد جسيمات الفيروسية
    1. سرعة ذوبان الجليد أنابيب المجمدة في حمام مائي 37 درجة مئوية. دوامة الأنابيب بقوة عن 1 دقيقة إلى أقصى حد ممكن استعادة إف من الخلايا.
    2. بيليه الحطام خلية من سينتريفوجينج في 3,700 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تأخذ 200 ميليلتر من المادة طافية من كل أنبوبة وتحويلها إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مسمى بسداده ملولبة للمقايسة وصمة عار دوت.
      ملاحظة: قاسمة المادة طافية المتبقية في ميكروسينتريفوجي أنابيب وتخزينها في المجمدة في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. هنا، يعلق أنابيب البولي بروبلين ميكروسينتريفوجي مع الأغطية اللولبية واستخدمت الدائري. مطلوب الختم مشددة لمنع تسرب إف والفينول كلوروفورم.
  2. المعاملة مع endonuclease marcescens السراتية
    1. إعداد الكواشف مزيج أ وب مزيج (الجدول 3). إضافة 10 ميليلتر من مزيج أ و 10 ميليلتر من "المزيج ب" في كل أنبوب. دوامة الأنابيب ل 5 ق، تدور بإيجاز هذه الأنابيب لجمع السائل إلى الجزء السفلي من الأنابيب واحتضان هذه الأنابيب عند 37 درجة مئوية على الأقل ح 1.
      ملاحظة: مزيج A يحتوي على هيدروكسيد الصوديوم ويحسن درجة الحموضة للمعاملة مع اندونوكليسي S. marcescens . ب مزيج مكملات المغنيسيوم. قد تختلف تركيز endonuclease S. marcescens في مخزونات إنزيم المتاحة تجارياً. حجم endonuclease S. marcescens يحتاج إلى تعديل تبعاً لذلك جعل 200 يو/مليلتر بعد إضافة مزيج أ وب مزيج في أنابيب في خطوة 3.2.1.
      ملاحظة: فترة حضانة أطول، يصل إلى ح 4، يمكنك تقليل الإشارات الخلفية.
    2. في نهاية الحضانة، بإيجاز تدور الأنابيب مع benchtop أجهزة الطرد مركزي لجمع التكثيف والحل من الأعلى والجانبين من الأنابيب.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. ويمكن تخزين العينات المجمدة في-20 درجة مئوية أو-80 درجة مئوية.
  3. العلاج بروتيناز ك
    1. تحضير الكاشف "ج ميكس" (الجدول 3). إضافة ميليلتر 180 ج المزيج في كل أنبوب. دوامة الأنابيب ل 5 ق، تدور هذه الأنابيب بإيجاز واحتضان هذه الأنابيب في 55 درجة مئوية ح 1.
      ملاحظة: يدتا في الكاشف "ج ميكس" يخلب أيونات المغنيسيوم مجاناً ويحللها endonuclease S. marcescens .
    2. في نهاية الحضانة، تسمح العينات تصل إلى درجة حرارة الغرفة، وتدور بإيجاز الأنابيب مع benchtop أجهزة الطرد مركزي لجمع التكثيف والحل من الأعلى والجانبين من الأنابيب.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. ويمكن تخزين العينات المجمدة في-20 درجة مئوية أو-80 درجة مئوية. أن تستأنف في البروتوكول، احتضان هذه الأنابيب في 55 درجة مئوية لمدة 5 إلى 10 دقائق لإذابة بلورات مخزونات النشر الاستراتيجي الوارد في المخزن المؤقت تماما.
  4. هطول الأمطار، واستخراج الإيثانول الفينول كلوروفورم
    1. إضافة 200 ميليلتر من الفينول كلوروفورم للعينات ودوامه تدور لهم للحد الأدنى 1 العينات في ميكروسينتريفوجي في إيه وان سيكس، 100 غ س لإيه فايف دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      تنبيه: ينبغي التعامل مع الفينول كلوروفورم في غطاء الأبخرة كيميائية مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية؛ أيالنتريل القفازات، ونظارات أو درع الوجه ومعطف المعمل بأكمام طويلة).
    2. نقل 320 ميليلتر من الطبقة المائية (160 ميليلتر مرتين مع ماصة P200) إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي قياسية جديدة (80% حجم السوائل المائية).
      ملاحظة: من الأهمية بمكان أن تتخذ نفس الحجم من محلول مائي بين العينات، وخلاف ذلك يفقد الإنزيم دقة كمية.
    3. تحضير الكاشف "د مزيج" (الجدول 3). إضافة ميليلتر 833 د مزيج في كل أنبوب. دوامة الأنابيب ل 5 ق، واحتضان هذه الأنابيب في-80 درجة مئوية لمدة دقيقة إيه تو زيرو.
      ملاحظة: مزيج د خليط من الإيثانول، خلات الصوديوم، والجليكوجين لهطول الأمطار الإيثانول مريحة للحمض النووي. ويمكن تخزين العينات في-80 درجة مئوية في هذه الخطوة والبروتوكول يمكن أن تستأنف في وقت لاحق.
    4. عينات للطرد المركزي مع ميكروسينتريفوجي في إيه وان سيكس، 100 غرام x عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى إيه وان فايف من أجل إيقاف المادة طافية ولطخة مرة على منشفة ورقية نظيفة. وضع حوالي 500 ميليلتر من الإيثانول 70% في كل أنبوب، دوامة أنابيب 5 s، وأجهزة الطرد المركزي هذه الأنابيب مع ميكروسينتريفوجي benchtop في إيه وان سيكس، 100 غرام x عند 4 درجة مئوية لمدة دقيقة إيه فايف.
    5. من أجل إيقاف المادة طافية ولطخة مرة على منشفة ورقية نظيفة. الكريات الجافة عند 65 درجة مئوية؛ يمكن أن تجفف الكريات تماما.
      ملاحظة: لا تستخدم ماصة لإزالة الإيثانول الزائدة التي تبقى بعد النشاف الأنابيب. ويمكن أيضا المجففة الكريات في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا والمجففة الحمض النووي الكريات يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لعدة أيام مع غطاء أنبوب مغلق.
  5. استثارة للحمض النووي الفيروسي في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات
    1. حل الكريات الحمض النووي في ميليلتر 120 كل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات التي تهز كل أنبوبة مدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. اسطوانة دوت
    1. إعداد معايير الحمض النووي بلازميد
      1. تمييع إف ناقلات الجينوم بلازميد الحمض النووي إلى 10 نانوغرام/ميليلتر في الماء أو في المخزن المؤقت تريس-HCl (10 ملم، ودرجة الحموضة 8.0). يستغرق 25 ميليلتر من هذا التخفيف وهضم مع إنزيم التقييد ملائمة ح 1 لينيريزي بلازميد الحمض النووي، وفي حجم رد فعل من 50 ميليلتر.
        ملاحظة: نقدم مجموعة مكررة من الهضم (راجع الخطوة 3.6.4.1). إنزيم المناسبة ينبغي أن تكون تخفيضات بلازميد الحمض النووي خارج المنطقة ملزمة التحقيق دوت وصمة عار. للراحة، يمكن أن تكون الكوتيد (25 ميليلتر/أنبوب) الحمض النووي بلازميد المخفف وتخزينها مجمدة في-20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. هضم بلازميد الحمض النووي بينما تهز الأنابيب في خطوة 3.5.1. لا هضم الإفراط بلازميد الحمض النووي القياسية.
      2. إضافة 450 ميليلتر من الماء أو الشركة المصرية للاتصالات إلى أنبوب يحتوي على بلازميد هضم الحمض النووي القياسية ومزيج دقيق. نقل 70 ميليلتر من هذا الخليط إلى أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي جديدة مع 1,330 ميليلتر من الماء أو الشركة المصرية للاتصالات لجعل معيار بلازميد مخفف (25 جزء من الغرام/ميليلتر).
      3. اتبع الجدول 4 إنشاء مجموعة من شقين هما تخفيف المسلسل (600 ميليلتر في الأنبوب). مزيج تخفيف جيدا قبل فورتيكسينج ل 5 ق.
    2. يشوه المعايير وعينات الحمض النووي الفيروسي
      1. إضافة 600 ميليلتر من 2 × حل القلوية إلى تمييع كل معيار. مزيج جيد من قبل فورتيكسينج عن 5 إلى 10 س. إينكوباتي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
      2. إضافة ميليلتر 120 2 × حل القلوية لكل عينة الحمض النووي الفيروسي. مزيج جيد من قبل فورتيكسينج عن 5 إلى 10 س. إينكوباتي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    3. إعداد جهاز وصمة عار دوت
      1. باستخدام مقص، قص غشاء النشاف (مثلاً، زيتا-التحقيق) إلى حجم مناسب لعدد العينات والمعايير. نقع الغشاء بالماء لمدة 10 دقائق قبل وضعه على جهاز وصمة عار دوت. تغطية الآبار غير المستخدمة على جهاز الغشاء.
        ملاحظة: التعامل مع الغشاء بملاقط نظيفة. لتغطية الآبار فارغة، يمكن استخدام الضوء الأزرق حماية الورقة التي تأتي مع الغشاء. لا تسمح للغشاء لتجف قبل عينات والمعايير الملزمة. لمزيد من التفاصيل عن الجمعية واستخدام الجهاز، الرجاء الرجوع إلى دليل المستخدم19.
      2. إضافة المياه إلى الآبار التي سيتم تحميل عينات. تطبيق فراغ وسحب المياه عن طريق الآبار التحقق من وجود أخطاء وتجربتها عندما ثابتة. إعادة تشديد الخناق أثناء تطبيق فراغ لضمان ختم ضيق.
        ملاحظة: قد يسبب الختم ناقصة التسرب عينة بين الآبار.
      3. متى يتم سحب المياه تماما من خلال، الإفراج عن الفراغ تماما (أيالمتشعبة فراغ ينبغي أن يكون مفتوحاً لضغط الهواء).
    4. تحميل المعايير وعينات إلى جهاز وصمة عار دوت
      1. تطبيق 400 ميليلتر من كل المخفف بلازميد الحمض النووي القياسية لكل بئر، وتشغيل أربع حارات لتخفيف القياسية. استخدام مختبرين منفصلة اثنين من الخلاصة القياسية وتحميل كل تكرار. تطبيق من كل عينة الحمض النووي الفيروسي 200 ميليلتر/جيدا.
        ملاحظة: باستخدام ميليلتر ~ 40 المتبقية من عينات التشويه والتحريف، يمكن إعداد (مثلاً، إذ عينات المخفف باستخدام 20 ميكروليتر من عينة بالإضافة إلى ميليلتر 180 1 × حل القلوية) عينات المخفف ومسح إذا لزم الأمر.
      2. تطبيق لطيف فراغ لسحب الحلول الحمض النووي عن طريق البئر.
        ملاحظة: لطخة فراغ الضغط يحتاج إلى تعديل عن طريق فتح صمام ثلاثي جزئيا حتى يتم تطبيق الضغط فراغ للنقطة الجهاز فضلا عن الغلاف الجوي (أي، مع محبس الحنفية الأسلحة المتمركزة في زاوية 45 درجة تقريبا حيث أنها يجعل من ضوضاء شفط أعلى صوتا).
      3. بمجرد أن تفرغ جميع الآبار، الإفراج عن الفراغ بضبط صمام ثلاثي. إضافة 400 ميليلتر من 1 × حل القلوية لكل بئر التي تتضمن معايير والعينات. انتظر لمدة 5 دقائق قبل إعادة تطبيق فراغ لإفراغ الآبار.
      4. إعادة تطبيق الفراغ بنفس الطريقة (راجع الخطوة 3.6.4.2).
      5. تفكيك جهاز وصمة عار دوت تحت الفراغ وإزالة الغشاء وشطفه مع 2 x SSC. مكان الغشاء على منشفة ورقية نظيفة مع الجانب ربط الحمض النووي مواجهة لإزالة الزائدة 2 x SSC.
      6. الأشعة فوق البنفسجية-التشعب الحمض النووي بلوتيد للغشاء مع كروسلينكير الأشعة فوق البنفسجية ملائمة؛ الغشاء جاهز الآن التهجين.
        ملاحظة: يمكن استخدام الأغشية الرطبة للأشعة فوق البنفسجية كروسلينكينج. المجففة، يمكن تخزين الأغشية كروسلينكيد الأشعة فوق البنفسجية في درجة حرارة الغرفة. يمكن الاطلاع على المزيد من المعلومات في الجدول للمواد.
  7. التهجين والغسيل
    1. الاحماء "المخزن المؤقت التهجين" في حمام مائي 65 درجة مئوية.
    2. انزيماتيكالي تسمية مجس الحمض النووي مع32ف دكتب المشعة α-وتنقية باستخدام مجموعات المتاحة تجارياً وفقا لتوصية الشركة المصنعة.
      ملاحظة: نحن نستخدم تحقيق من 0.5-2.0 كيلو بايت في طول من منطقة مروج محسن أو تسلسل البروتين الترميز في الجينوم الفيروسي. على الرغم من أن هذا البروتوكول يستخدم 32ف المسمى المجسات المشعة للكشف عن إشارة، يمكن أيضا استخدام المسابير تشيميلومينيسسينت أو الفلورية غير مشعة (الرجاء الرجوع إلى قسم النقاش ).
    3. وضع الغشاء في زجاجة تهجين مع الجانب الحمض النووي زمنياً يصل، وشطف الغشاء مع 5 مل بريوارميد المخزن المؤقت التهجين، وتجاهل المخزن المؤقت. ثم أضف 10 مل من بريوارميد "التهجين المخزن المؤقت" ووضع الزجاجة في فرن تهجين الدورية المحددة عند 65 درجة مئوية. تدوير لدقيقة إيه فايف.
    4. الحرارة تؤذي 20 ميليلتر الرنجة 10 ملغ/مل المنفصمة أو الحيوانات المنوية السلمون الحمض النووي الحل و 32المسمى ف التحقيق (إيه وان زيرو7 cpm) لمدة 5 دقائق قبل وضع الأنابيب في مجموعة كتلة حرارة عند 100 درجة مئوية. ثم البرد المفاجئة لهم على الجليد إيه تو دقيقة، تدور بإيجاز، والحفاظ على الجليد حتى الاستخدام.
      تنبيه: لتحقيقات الحمض النووي المشعة، يجب استخدام أنابيب 1.5 مل مع سداده ملولبة والدائري.
    5. بسرعة إضافة الحمض النووي في الحيوانات المنوية التشويه والتحريف ومسبار المشعة إلى "المخزن المؤقت التهجين" في التهجين زجاجة ويهز الزجاجة 10 s المزيج. العودة الزجاجة للفرن 65 درجة مئوية واحتضان الزجاجة بالتناوب في 65 درجة مئوية ح إيه فور.
    6. بمجرد اكتمال التهجين، وقف التناوب وإزالة زجاجة التهجين، وثم صب الحل مسبار المشعة في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل مع غطاء ختم توصيل مانعة للتسرب. تخزين المسبار في حاوية مناسب وضعها في ثلاجة مخصصة للمواد المشعة.
      ملاحظة: يستخدم "المخزن المؤقت التهجين" مع تحقيق الذي يتم تخزينه على 4 درجة مئوية يمكن إعادة استخدام 5 مرات على الأقل بوضع أنبوب 50 مل مخروطية الشكل مع غطاء ختم توصيل مانعة للتسرب الذي يحتوي على "المخزن المؤقت التهجين" في حمام مائي 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    7. يغسل الغشاء مع "المخزن المؤقت ليغسل" تسخينها إلى 65 درجة مئوية. إضافة 20 إلى 30 مل من "المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي" إلى الزجاجة التهجين وتدوير لأدنى 5 تكرار هذا يغسل 2 مرات أكثر.
      ملاحظة: قياس النشاط الإشعاعي لحلول المياه والصرف الصحي، وأنه سجل إذا لزم الأمر بالمعهد المحلي.
    8. بينما غسل الغشاء، مكان فوسفور تصوير الشاشة على صورة ممحاة لمدة 5 دقائق.
    9. بعد يغسل الثالثة، إزالة الغشاء من زجاجة التهجين وإزالة المخزن المؤقت الزائدة على الغشاء مع مناشف ورقية ومكان الغشاء في حامل ورق بلاستيك الشفاف. فحص الإشارات الإشعاعية على الغشاء باستخدام عداد غايغر. تعرض الشاشة الفوسفور تمحى التصوير للغشاء لمدة 10 دقيقة بين عشية وضحاها اعتماداً على كثافة إشارة.
    10. مسح الشاشة باستخدام صورة فوسفور فحص النظام والحصول على البيانات المتعلقة بكثافة إشارة لكل نقطة.
  8. تحليل البيانات
    1. رسم منحنى قياسي باستخدام برمجيات تحليل البيانات وجداول البيانات (مثلExcel).
      ملاحظة: استخدم الانحدار الخطي سجل في سجل لرسم منحنى قياسي.
    2. تحديد نانوجرام المكافئ (نانوغرام مكافئ) لكل من عينات الحمض النووي الفيروسي بالاستيفاء. أن نانوغرام مكافئ هو مقدار بلازميد الحمض النووي يستخدم لرسم منحنى قياسي الذي يعادل عدد جزيئات الحامض النووي الفيروسي. عندما يكون طول بلازميد الحمض النووي 8,000 bp، 1 نانوغرام مكافئ واحد-الذين تقطعت بهم السبل إف الحمض النووي الفيروسي يناظر 2.275 × 108 الجسيمات.
      ملاحظة: يمكن تحويل نانوغرام مكافئ لعدد الجسيمات الفيروسية بالمعادلات التالية:
      Equation 1
      Equation 2
      عدد الجسيمات إف هي تقليديا معبراً عنها "جيد جداً" (ناقل الجينوم) أو "DRP" (الدناز أنا مقاومة الجزيئات).
    3. حساب تركيزات المواد انطلاق إف. لأن الحمض النووي الفيروسي بلوتيد تمثل 66.7 في المائة Equation 3 من الحمض النووي الفيروسي في مواد البدء، يناظر 1 نانوغرام مكافئ 1.7 × 109 جزيئات/مل Equation 4 .
      ملاحظة: هذا التصحيح غير مطلوب إذا كان يتم مسح جميع الحمض النووي الفيروسي الواردة في المواد انطلاق في غشاء دون فقدان (انظر الشكل 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد ممثل نتيجة البقع دوت الكمي كوانتيتيشن المنقي الأرصدة ناقل إف إنتاجها على نطاق واسع في الشكل 1. مع هذه المقايسة دوت وصمة عار، تم تحديد عيار مخزون ناقلات مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل AAV2G9-CMV-التجارة والنقل. وكان تنقية الموجه بجولتين من كلوريد السيزيوم (CsCl) تنبيذ فائق الكثافة--التدرج متبوعاً بغسيل الكلي كما هو موضح سابقا20. بشكل عام، لتنقية مخزونات ناقل إف، ثلاثة أحجام مختلفة لكل سهم متجه إف (مثلاً، ميليلتر 0.3، ميليلتر 0.1 و 0.03 ميليلتر) يتعرضون لدوت وصمة عار الإجراء الموضح أعلاه في تكرار مع تعديل. يتم استخدام إنزيم الدناز I A عوضاً عن S. marcescens endonuclease في الخطوة 3، 2، ويتم استخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً لاستخراج وتنقية الحمض النووي الفيروسي في الخطوة 3، 4 (انظر الجدول للمواد). في المثال الموضح في الشكل 1، تم رسم قيم الكثافة إشارة (وحدة التعسفي) التي تم الحصول عليها من كل بلازميد الحمض النووي القياسية (الشكل 1A) مقابل كميات الحمض النووي المعروف رسم منحنى المعياري (الشكل 1B)، يظهر ارتباط معامل 0.998. باستخدام هذا المنحنى المعياري، تحددها الاستيفاء أن مختبرين ميليلتر 0.3 و 0.1 0.03 ناقل AAV2G9 أظهرت 1.487 و 1.522 نانوغرام مكافئ (0.3 ميليلتر) و 0.487 و 0.507 نانوغرام مكافئ (0.1 ميليلتر) 0.158 و 0.171 نانوغرام مكافئ (0.03 ميليلتر). وهذا يعطي القيم الستة التالية: 4.957، 5.073، 4.870، 5.070، 5.267 و 5.700 نغ-مكافئ/ميليلتر لهذا AAV2G9 خاصة ناقلات الأسهم، مما أدى إلى متوسط 5.16 ± 0.27 نغ-مكافئ/ميليلتر (يعني ± التنمية المستدامة). منذ مدة بلازميد تستخدم المعيار (بيمبل-CMV-بروتينات فلورية خضراء) هو 5,848 bp، عيار هذا ناقل AAV2G9 عاقدة العزم على أن 8.0 × 1011 vg مليلتر وفقا المعادلة 2 في الخطوة 3.8.2. يتم تكرار هذا الفحص مرتين على الأقل لتحديد التتر النهائي من مخزونات ناقل إف.

يتم عرض نتيجة ممثل للتكامل عبر فحوصات لتقييم التبعية الوكالة الأسترالية في الجمعية قفيصه VP3 والقدرة على آبس لتجميع البروتينات VP3 من أصول مغايرة في الشكل 2. في المختبر الدراسات من إف غالباً ما لا تتطلب تنقية الفيروسات لجعل استنتاجات، وتجارب باستخدام التحضيرات فيروس أونبوريفيد مثل ليساتيس خلية النفط الخام ووسائط الثقافة التي تحتوي على الفيروسات وتكفي تسفر عن نتائج ذات مغزى. في هذه التجربة، تم تقييم إنتاج الجسيمات الفيروسية إف من كافة التركيبات الممكنة إف VP3-الوكالة الأسترالية بين AAV5 و AAV9 واف الأفعى بما في ذلك تركيبات الوكالة الأسترالية VP3-لا قبل مقايسة دوت كمية وصمة عار. تم مسح العينات التي تم الحصول عليها في مجموعة مكررة من تجربة في 1 x و 10 x تخفيف (مجموعة أ ومجموعة ب في الشكل 2 ألف، على التوالي). ويلخص الرسم البياني هو مبين في الشكل 2 التحليل الكمي للنقاط. تبين النتائج أن: (1) AAV5VP3 تجمع بغض النظر عن ما إذا كانت الوكالة الأسترالية شريطة في ترانس، (2) AAP5 و AAP9 ويمكن تعزيز الجمعية قفيصه AAV9VP3 رغم أن AAP5 وظائف أقل فعالية من AAP9، (3) لا AAP5 وﻻ AAP9 معارض جمعية تعزيز النشاط في VP3 إف ثعبان، و (4) "ثعبان الوكالة الأسترالية" إلا تشجع الجمعية من ثعبان إف VP3. (1) و (2) هي تمشيا مع الملاحظات السابقة6، ولكن شكل فريد محدد إف VP3-الوكالة الأسترالية التفاعل في "إف ثعبان" اكتشافا جديداً في هذه التجربة. إحدى نقاط الضعف للفحص عبر التكامل استناداً إلى الكمية دوت وصمة عار هو أن عنصر التحكم السلبي يظهر دائماً ملموس مستويات الإشارات الخلفية التي لا يمكن القضاء عليها كلياً. ولذلك المقايسة دوت وصمة عار بحد ذاته لا يمكن استبعاد إمكانية أن قفيصه تجمع إلى مستوى أقل حساسية المقايسة. وفي هذا الصدد، تجدر الإشارة إلى أنه شرط تستخدم لإنشاء عناصر التحكم السلبية، تحت الجينوم الفيروسي الذي إف تكرار أضعافاً مضاعفة في غياب قفيصه VP3 البروتين. هذه الضوابط السلبية يمكن إنشاؤها بواسطة ترانسفيكتينج HEK 293 الخلايا مع باف-مراسل ومندوب فلب فيلبر (الجدول 2)، وتستخدم للحد من إيجابيات كاذبة.

الدناز أنا استخدمت على نطاق واسع نوكلاس دوت وصمة عار وفحوصات على أساس qPCR كوانتيتيشن إف لإزالة بقايا بلازميد السلطات الوطنية المعينة والجينوم الفيروسي غير المعبأة التي قد لوثت الاستعدادات إف. إلا تؤدي هذه الملوثات إلى المبالغة في التتر؛ ولذلك، الهضم نوكلاس خطوة هامة جداً لدقة القياس الكمي التتر الجينوم الفيروسي. الدناز أنا الإنزيمات متاحة من مختلف المصنعين والموردين التجاريين؛ ومع ذلك، أهمية اختيار الدناز أنا في كوانتيتيشن إف يبدو قد تم لا تقدر حق قدرها. للتحقيق في كيفية اختيار نوكلاس قد يؤثر على نتائج الفحص وصمة عار دوت، قورنت nucleases الثلاثة التالية لقدرتها على إزالة الإشارات الخلفية من وسائط الثقافة التي تحتوي على ناقل إف إعداد كما هو موضح أعلاه في الخطوات 2 و 3: الدناز ألف إنزيم ب إنزيم الدناز I و S. marcescens endonuclease (جدول المواد). نشر دراسات استخدمت الدناز اثنين السابقة أنا تم استخدام الإنزيمات13،،من2122،،من2324 ونحن اندونوكليسي S. marcescens في السابق والحالي الدراسات. لدهشتنا، عرف أن إنزيم الدناز I A ليس على الإطلاق خياراً ملائماً للمقايسة وصمة عار دوت استخدام الوسائط التي تحتوي على الفيروس في مختلف الظروف اختبارها، أسفر عن إشارات خلفية عالية من المراقبة السلبية، بينما ب إنزيم الدناز I وفعالية خفض endonuclease S. marcescens الإشارات الخلفية مع يجري ب إنزيم الدناز I ~ 2-fold أكثر فعالية من مارسيسسينس س. اندونوكليسي (الشكل 3 أ، ب). ج إنزيم الدناز I وجد أيضا أن تكون فعالة جداً لتقليل الإشارات الخلفية (البيانات لا تظهر). تبين هذه البيانات أن هناك اختلافات كبيرة في نشاطات الإنزيم بين nucleases المتاحة تجارياً عند تنفيذ ردود فعل الإنزيم في أونبوريفيد إف الاستعدادات على الرغم من الهضم نوكلاس ينبغي أن يكون فعالاً عندما صغيرة يتم التعامل مع كمية من محضرات الفيروسية المنقاة تحت شرط أمثل. وهكذا، هذه البيانات تبرز أهمية الاختيار الصحيح نوكلاس في المقايسة عندما أونبوريفيد إف الاستعدادات الخضوع مقايسة دوت كمية وصمة عار أو qPCR.

Figure 1
رقم 1: إجراء تحليل لطخة دوت ممثل لتحديد عيار ناقل إف تنقية CsCl. (أ) مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل متجه AAV2G9-CMV-بروتينات فلورية خضراء تنتجها معيار بلازميد خالية من إتش ثلاثة تعداء الأسلوب على نطاق واسع في الخلايا HEK 293، وتنقيته قبل جولتين من تنبيذ فائق التدرج CsCl، متبوعاً بالغسيل الكلوي. 0.3، 0.1 وميليلتر 0.03 الأسهم ناقل إف المنقي (مسح في العمود الموجود في أقصى اليمين) تعرضوا للمقايسة وصمة عار دوت الكمية في تكرار مع مجموعتين من المعايير الحمض النووي بلازميد المكررة (الأمراض المنقولة جنسياً). تم تهجين وصمة عار مع تحقيق بروتينات فلورية خضراء المسمى ف 32(0.77 كيلو بايت)، وتم الحصول على الصورة باستخدام صورة فوسفور نظام مسح. (ب) المنحنى المعياري يبين العلاقة بين كميات الحمض النووي بلازميد المعروفة (نانوغرام مكافئ، المحور السيني) وكثافات دوت (وحدة التعسفي (الاتحاد الأفريقي)، المحور ص). وتم الحصول على الأرقام على المحور الصادي مع نظام مسح الصورة الفوسفور. R يشير إلى معامل Pearson للارتباط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: إف VP3-الوكالة الأسترالية دوت التكامل عبر وصمة عار المقايسة. تم اختبار إنتاج الجسيمات النواقل إف-CMV-بروتينات فلورية خضراء مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل للبروتينات VP3 من AAV5، AAV9، وثعبان إف في وجود أو عدم وجود تلك AAPs المشابهة أو حضور آبس من أصول مغايرة. (أ) الفحص أجريت في مجموعة بيولوجيا مكررة من التجارب (مجموعة أ ومجموعة ب) مع مرور الوقت في حضانة ح 4 مع اندونوكليسي S. marcescens ، وعيار ناقل إف التي تم الحصول عليها من كل تركيبة يحدده نقطة كمية لطخة الطريقة الموضحة في قسم البروتوكول. كل نقطة تمثل ثلثي (الخامسة والسادسة الصفوف، 66.7 في المائة) أو اثنين--ثيرتيثس (السابعة والثامنة الصفوف، 6.7%) من الحمض النووي تعافي من كل 200 ميليلتر من المتوسطة التي تم جمعها من العينات أو مراقبة سلبية. تمثيل (الصفوف من الأولى إلى الرابعة) أعلى أربعة صفوف مجموعتين من المعايير الحمض النووي بلازميد (1 الأمراض المنقولة جنسياً والأمراض المنقولة جنسياً 2) مسح في تكرار (أي، خطية بلازميد بيمبل-CMV-التجارة والنقل، وهو بلازميد المستخدمة لإنتاج ناقلات إف-CMV-بروتينات فلورية خضراء مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل). وكان سبر الغشاء وصمة عار دوت مع تحقيق بروتينات فلورية خضراء المسمى ف 32. زوج النقاط مع المستطيلات مستدير الزوايا عناصر سلبية. الصفين العلويين (STD 1) هي من الجزء السفلي من وصمة عار الأصلي ولكن تم قطع وانتقل إلى الأعلى دون تغيير كثافة الصورة لعرض كل المعايير بلازميد (1 الأمراض المنقولة جنسياً والأمراض المنقولة جنسياً 2) جنبا إلى جنب. تتم الإشارة إلى هذا التلاعب بخط أسود في الشكل. عيار الفيروسية (ب) مصممة للجمع بين VP3 والبروتينات الوكالة الأسترالية بالنقطة لطخة المقايسة. ويمثل الرسم البياني بيولوجيا كوادروبليكاتيد مجموعة من البيانات وهما من الفريق ألف واثنين من آخر نقطة وصمة عار أن لا يظهر. أشرطة الخطأ يشير إلى متوسط +/--SD (n = 4). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: مقارنة بين الأنشطة الانزيمية من نوكلياسيس مختلفة في الاستعدادات ناقل إف أونبوريفيد. (A) A لطخة دوت الكمية تظهر فعالية العلاج نوكلاس كل في إزالة الإشارات الخلفية. مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل AAV9-CMV-التجارة والنقل التي تحتوي على ناقل إعداد ("ناقل AAV9") وعنصر "تحكم لا قفيصه" أنتج HEK 293 تعداء الخلايا مع بلازميد السلطات الوطنية المعينة، وتخضع للفحص. عنصر التحكم لا قفيصه لا تحتوي على الجسيمات الفيروسية ولكن الوارد تضخيم أضعافاً مضاعفة الجينوم ناقل CMV-التجارة والنقل غير المعبأة. واستكملت مجكل2 في واحد أو ثلاثة مرات المبالغ الموصى بها (6 و 18 ملم الدناز I A الإنزيم؛ و 2.5 ملم و 7.5 ملم بانزيم الدناز I) دون مراعاة 0.8 مم MgSO4 الحالية في الأجل المتوسط. للعلاج مع اندونوكلياسي S. marcescens وتم اختبار شرط واحد فقط هو موضح في المقطع بروتوكول. جميع العينات تعامل مع كل نوكلاس ح 1. وكان سبر الغشاء وصمة عار دوت مع تحقيق بروتينات فلورية خضراء المسمى ف 32. حق العمودين (STD 2) هي من الزاوية اليسرى من وصمة عار الأصلي ولكن تم قطع وانتقل إلى اليمين دون تغيير كثافة الصورة لعرض كلا بلازميد المعايير (1 الأمراض المنقولة جنسياً والأمراض المنقولة جنسياً 2) جنبا إلى جنب. تتم الإشارة إلى هذا التلاعب بخط أسود رفيع في الشكل. النقاط (ب) في عينات مراقبة قفيصه لا في الفريق A هي كمياً وعرضها ك ± يعني | كل قيمة – يعني قيمة |. سبعة من أصل العينات 12 تعامل مع الدناز I A إنزيم (يشار إليه بعلامة نجمية) إظهار القيم فقط أعلى قليلاً من مستوى أعلى؛ ولذلك، يتم تضمينها في هذا الرسم البياني للمقارنة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

مارسيسسينس السراتية المخزن المؤقت اندونوكليسي
50 مم تريس-HCl
2 مم مجكل2
ضبط للأس الهيدروجيني 8.5 مع 4 م هيدروكسيد الصوديوم.
10 × بروتيناز ك المخزن المؤقت
100 مم تريس-HCl pH 8.0
100 مم يدتا pH 8.0
الحزب الديمقراطي الصربي 5%
2 × حل القلوية
800 مم هيدروكسيد الصوديوم
20 مم يدتا
20 x SSC (1 لتر)
ز 175.3 كلوريد الصوديوم
ز 88.2 سترات الصوديوم تريباسيك (غ3ج6ح5س7)
الحل في دينهارت 100 × (50 مل)
ألبومين المصل البقري ز 1 (جزء الخامس) ملاحظة: تصفية أمر بالغ الأهمية من أجل إزالة الجسيمات الصغيرة حيث أنها تتسبب في الخلفية التهجين إشارات.
ز 1 400 بوليسوكروسي
ز 1 بوفيدون
تذوب في 20 مل الماء في حمام مائي 55 درجة مئوية.
ضبط الحجم النهائي إلى 50 مل.
عامل التصفية-تعقيم مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
المخزن المؤقت التهجين
الحزب الديمقراطي الصربي 1% ملاحظة: تخزين "العازلة التهجين" في 4 درجات مئوية والحرارة إلى 65 درجة مئوية في حمام مياه مسبقة لاستخدام.
6 x SSC
5 x الحل دينهارت
10 ملم تريس-HCl pH 8.0
المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي
0.1 الحزب الديمقراطي الصربي %
0.1 x SSC
حل بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد) (1 ملغ/مل، 500 مل)
إضافة 500 mg برينس في 450 مل الماء ويقلب. ملاحظة: لتخزين أطول، ينصح-80 درجة مئوية.
إضافة HCl مركزة لتحقيق درجة الحموضة وصولاً إلى < 2.0 حل بي (سيلزم حوالي 800 ميليلتر من HCl).
إضافة هيدروكسيد الصوديوم م 10 لتحقيق درجة الحموضة تصل إلى 7.0 (حوالي 500 ميليلتر من 10 M هيدروكسيد الصوديوم سوف يلزم).
ضبط حجم الصوت إلى 500 مل الماء.
عامل التصفية-تعقيم مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
قاسمة ومخزن في-20 درجة مئوية.
الفينول كلوروفورم (ميكس 1:1) للنقطة الكمية النشاف
إضافة الفينول العازلة المشبعة (pH 8.0) وكلوروفورم بنسبة 1:1 في أنبوب 50 مل مخروطية البوليبروبيلين. ملاحظة: المخزن المؤقت الذي يغطي الطبقة العضوية، إذا ما تركت في الأنبوب، يمكن أن يتم ترحيلها إلى أنابيب عينة من خلال بيبيتينج وقد جعل الفحص غير دقيق.
دوامة الأنبوب بقوة مزيج.
السماح لمرحلة الفصل بالطرد المركزي ومن ثم إزالة الطبقة المائية تماما.
مخزن في 4 درجات مئوية.

الجدول 1: الحل ووصفات المخزن المؤقت- وصفات للحلول والمخازن المؤقتة اللازمة لإتمام النقطة الكمية لطخة البروتوكول.

بلازميد AAP(+) (ميكروغرام) AAP(-) (ميكروغرام) مراقبة سلبية (ميكروغرام) تعداء التحكم (ميكروغرام)
بكمف-آب-VP3 0.4 0.4
بكمف-علم-آب 0.4
مراسل باف 0.4 0.4 0.4
مندوب فلب 0.4 0.4 0.4
فيلبر 0.4 0.4 0.4
بكمف (فارغ) 0.4 0.8
بكمف--بروتينات فلورية خضراء 2.0
المجموع 2.0 2.0 2.0 2.0

الجدول 2: إجراء تركيبات بلازميد للمقايسة التكامل عبر إف VP3-الوكالة الأسترالية في شكل لوحة 6-جيدا- يتم عرض مجموعات من بلازميد السلطات الوطنية المعينة التي ستستخدم ل HEK 293 تعداء الخلايا في كل مجموعة تجريبية. VP3-بكمف-آب، وبلازميد معربا عن النمط المصلي المسيطر إف إكس (x = 1، 2، 3، إلخ) البروتين VP3 تحت محسن CMV-أي-المروج؛ بكمف-العلم-آب، وبلازميد معربا عن النمط المصلي المسيطر إف إكس (x = 1، 2، 3، إلخ) البروتين الوكالة الأسترالية تحت محسن CMV-أي-المروج؛ باف-مراسل، بلازميد اثنين AAV2 مقلوب يكرر المحطة الطرفية (الإسناد) وهو مصمم لإنتاج ناقلات إف المؤتلف؛ فلب--مندوب، بلازميد التعبير عن البروتين AAV2 Rep؛ فيلبر، بلازميد مساعد إتش؛ بكمف (فارغ)، بلازميد فارغ إضافة إلى التحكم في الظروف التجريبية؛ بكمف--بروتينات فلورية خضراء، بلازميد التعبير عن جين ماركر فلورية (مثلاً، التجارة والنقل) للتحقق من تعداء ناجحة. ترانسفيكشنز تجري في لوحات 6-جيدا، واستخدام ما مجموعة 2 ميكروغرام من بلازميد السلطات الوطنية المعينة.

مزيج أ للأنابيب 10 (ميكروليتر)
مارسيسسينس السراتية المخزن المؤقت اندونوكليسي 91.2
0.1 هيدروكسيد الصوديوم M 8.8
المجموع 100
ميكس ب للأنابيب 10 (ميكروليتر)
مارسيسسينس السراتية المخزن المؤقت اندونوكلياسي 91.2
مجكل م 12 7.04
مارسيسسينس السراتية Endonuclease (250 وحدات/ميكروليتر) 0.176
المجموع 100
ميكس ج للأنابيب 10 (ميكروليتر)
10 × بروتيناز ك المخزن المؤقت 400
بروتيناز ك (20 ملغ/مل) 100
ح2س 1,300
المجموع 1,800
ميكس د للأنابيب 10 (ميكروليتر)
100 ٪ إيثانول 8,000
خلات الصوديوم 3 م (pH 5.2) 320
محار الجليكوجين (20 ملغ/مل) 10
المجموع 8,330

الجدول 3: قائمة الكواشف مزيج الرئيسي- وتستخدم مزيج أ وب مزيج لعلاج اندونوكليسي S. marcescens في الخطوة 3، 2. ينبغي بذل هذه المخاليط اثنين بشكل منفصل لمنع ترسيب هيدروكسيد المغنسيوم. ج مزيج يستخدم لعلاج "ك البروتيناز" في الخطوة 3، 3. يستخدم الإيثانول هطول الأمطار في خطوة 3.4.3 "د مزيج". وحدات التخزين المشار إليها في الجدول الكواشف مزيج الرئيسي لأنابيب 10.

بلازميد الحمض الخلوي الصبغي القياسي (الحرس الوطني) وحدات تخزين (ميليلتر) 25 جزء من الغرام/ميليلتر بلازميد الحمض النووي الحل القياسية وحدات تخزين (ميليلتر) من الماء إجمالي الحجم (ميليلتر)
5 600 0 600
2.5 300 300 600
1.25 150 450 600
0.625 75 525 600
0.313 37.5 562.5 600
0.156 18.8 581.2 600
0.078 9.4 590.6 600
0.039 4.7 595.3 600

الجدول 4: دوت الكمية وصمة عار بلازميد الحمض النووي المعايير. يتم عرض وحدات التخزين اللازمة من 25 جزء من الغرام/ميليلتر بلازميد الحمض النووي الحل القياسية والمياه أو الشركة المصرية للاتصالات لإعداد معايير للحمض النووي بلازميد من شقين هما تخفيف المسلسل (600 ميليلتر في الأنبوب). الأرقام في العمود القياسية بلازميد الحمض النووي (0.039 إلى 5 نانوغرام) هي كمية الحمض النووي في 200 ميليلتر كل بلازميد الحمض النووي حل القياسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويرد في هذا التقرير، الأداة المساعدة لفحوصات وصمة عار دوت الكمية لدراسة "آبس إف" ودورهم في الجمعية قفيصه. يمكن أن توفر المعارف المكتسبة من هذه الدراسات التفصيلية ثاقبة الاختلافات الفطرية عملية الجمعية قفيصه إف ودور AAPs الوظيفية بين الأنماط المختلفة. وفي هذا الصدد، لطخة دوت عبر التكامل إف VP3-الوكالة الأسترالية المقايسة وكشفت عن أن الأفعى إف VP3 عرض تبعية صارمة على التعبير المشترك عن الوكالة الأسترالية المشابهة للجمعية قفيصه وأن "الوكالة الأسترالية الأفعى" لا تشجع الجمعية قفيصه للقاح مغايرة . هذه الملاحظة مثير للاهتمام لأنه serotypes إف تعتمد على الوكالة الأسترالية التي تم التحقيق فيها سابقا (AAV1، 2، 3، 6، 7، 8، 9، و 12) قادرين على كل عملية الجمعية العامة على الأقل إلى حد ما عن طريق استخدام الوكالة الأسترالية مغايرة6.

الكمية التهجين وصمة عار دوت أو فتحه الطريقة تقليدية كوانتيتيشن أحماض النووية الواردة في عينات متعددة في نفس الوقت في طريقة مريحة25. الأسلوب قد استخدمت على نطاق واسع للحمض النووي والجيش الملكي النيبالي كوانتيتيشن حتى قبكر أصبح سائدا في التسعينات26،27. على الرغم من أن qPCR مزايا أكثر من الكمية دوت وصمة عار ومعارض أخرى فحوصات المستندة إلى التهجين في ذلك qPCR حساسية أعلى ومجموعة ديناميكية أوسع، وهو يحمل أيضا خطر كامن لاطراد زيادة أخطاء تدري، الذي كان حالة التتر الأرصدة ناقل إف يحدده قبكر13،23. فحوصات وصمة عار دوت الكمية بسهولة إعداد بتكلفة رخيصة وتنفذ بسهولة طالما أن الباحثين يستطيعون الوصول إلى نظام تصوير جزيئي كمية التي يمكن الحصول على إشارات من الأغشية وصمة عار دوت المهجنة مع أما تحقيق مشعة أو تحقيق تشيميلومينيسسينت أو الفلورية غير مشعة. على الرغم من أن هذا البروتوكول يستخدم 32ف المسمى المجسات المشعة للكشف عن إشارة، الآخرين بنجاح استخدام المسابير الحمض النووي غير مشعة المسمى مباشرة مع متاحة تجارياً الفوسفاتيز قلوية الحرارة28. دوت وصمة عار فحوصات استخدام مبدأ مباشر والمقايسة بحد ذاتها لا تشكل تحديا تقنيا لفناني الأداء؛ ولذلك، النتائج استنساخه عموما حتى من قبل الأفراد عديمي الخبرة.

بالإضافة إلى التطبيقات الموضحة هنا، نستخدم بشكل روتيني نسخة مبسطة وسريعة الإجراء وصمة عار النقطة التي يمكن قياس شبه الجسيمات إف بسرعة. وتشمل مزايا دوت وصمة عار معبراً في هذا السياق: (1) التحليل لا يتطلب تنقية أو التضخيم الانزيمية الجينوم الفيروسي الذي يستغرق ساعات، (2) الجمع بين الحرارة وتمسخ القلوية كافية لكسر جزيئات إف في عينة الحل والإفراج عن التشويه والتحريف الجينوم الفيروسي في الحل التي على استعداد ربط غشاء وصمة عار دوت، و (3) وجود الملح في ارتفاع التركيزات في العينات لا تؤثر تأثيراً كبيرا على نتائج التحليل. على سبيل المثال، هو الممكن للتحديد الكمي لشبه إف الجسيمات في الحلول الغنية CsCl (مثلاً، الكسور التي حصل عليها تنبيذ فائق الكثافة--التدرج CsCl) عن طريق وضع قاسمة صغيرة (دي وان زيرو ميليلتر) من العينات إلى 100 ميليلتر من 1 × حل القلوية، وتدفئة في 100 ° (ج) 10 دقيقة، والنشاف على غشاء مع أو بدون معايير معدّة مسبقاً، متبوعاً تهجين 15 دقيقة ويغسل 3 × 3 دقيقة والتعرض فوسفور التصوير الشاشة لمدة 15 دقيقة (أو أطول عند استخدام تحقيق مع تناقص النشاط الإشعاعي). يمكن إكمال الإجراء بأكمله في ح 1 عندما يصبح المستخدم على دراية بالإجراءات. نحن نستخدم هذا الأسلوب المعجل، الذي نسميه عادة "أسلوب وصمة عار نقطة الغليان"، تحديد إف الغنية بالجسيمات CsCl الكسور أثناء تطهير ناقلات عملية وتحديد التتر الأرصدة ناقل إف المنقي تقريبا قبل البدء نطاق واسع العمليات الخاصة بتوصيف المتجهات. وهكذا، على الرغم من احتمال عرض فحوصات وصمة عار دوت كأسلوب عفا عليها الزمن التحديد الكمي للأحماض النووية، وقد تم استبدال الفعل مع مختلف الأساليب المستندة إلى بكر في طائفة واسعة من التخصصات العلمية، لا يزال هناك عددا من المزايا لهذا الأسلوب الذي ينبغي أن جعل الباحثين النظر في توظيف ذلك في مختبراتها.

أن الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هو العلاج نوكلاس العينات. إذا لم تتم هذه الخطوة في شرط أمثل، فإنه سوف يسبب إشارات خلفية عالية. نحن نستخدم endonuclease S. marcescens بينما الدناز أنا إنزيمات مصادر مختلفة تستخدم على نطاق واسع في مختبرات أخرى للتحديد الكمي الحمض النووي الفيروسي. الدناز الأول من أصل البنكرياس البقري قد استخدمت على نطاق واسع من الباحثين. هذا جزئيا الدناز البنكرياس البقري كان أول المحددة وتتميز أكثر استفاضة المتحلل29. الدناز أنا تنتج الإنزيمات المتوفرة حاليا من البائعين التجاريين من عدة مصادر بيولوجية مختلفة مثل بسطورس بيشيا (الدناز ط إنزيم A)، النموذج الأصلي تنقيته من البنكرياس البقري (مثلاً، ب إنزيم الدناز I)، و إنتاج الإنزيمات المؤتلف في الأنواع الخميرة أو الإشريكيّة القولونية (ج إنزيم الدناز I). وقد وجدنا أن الدناز أنا الإنزيمات من كل ثلاثة من هذه المصادر المختلفة التي استخدمت في دراسات منشورة إف كوانتيتيشن ناقلات الأمراض؛ ومع ذلك، على حد علمنا، أي من الدراسات السابقة حققت سواء الإنزيمات من مصادر مختلفة بنفس القدر من الفعالية في هضم تلويث جزيئات الحمض النووي في الاستعدادات ناقل إف. من الجدير أن الدناز أنا غالباً ما تجري المعاملة لفحوصات ناقل إف تحت ظروف غير الأمثل نظراً للوجود شوائب المستمدة من الثقافة المتوسطة والخلايا. ملاحظة أن إنزيم الدناز I A نشطاً جزئيا فقط في المتوسط الثقافة استخدمنا آثار هامة في تصميم المقايسة لناقل إف كوانتيتيشن بوصمة عار دوت وقبكر، وتنبيهات الباحثين لهذه المسألة التي لم تحدد سابقا. وفي هذا الصدد، هو اندونوكليسي S. marcescens المعرب عنها في كولاي، endonuclease مثالية غرض تصنيع ناقلات إف ليس فقط بل أيضا لناقل إف كوانتيتيشن. وهذا لأنه يمكن الاحتفاظ النشاط الأنزيمي عبر مجموعة واسعة من قيم الأس الهيدروجيني وتركيز أيونات المغنيسيوم والاتصالات الفموي الأحادي التكافؤ. لهذا السبب، ونظرا لأن اندونوكليسي S. marcescens حوالي 2 مرات أقل تكلفة من ب إنزيم الدناز I على أساس لكل وحدة، ونحن تفضل استخدام endonuclease S. marcescens في تحليلات وصمة عار دوت الكمية المعتادة.

وباختصار، فحوصات وصمة عار دوت الكمية هي إجراء بسيط نسبيا التي يمكن بسهولة أن يقدم المعلومات على القدرة على إنتاج الجزيئات الفيروسية تحت ظروف مختلفة. ويتطلب هذا النهج الأمثل القليل، أن وجد، مقارنة بالنهج البديلة تيتيرينج، مثل قبكر،. فإنه يمكن أيضا سهولة تطبيقها على ناقلات من أي النمط المصلي المسيطر ويمكن استخدامها لعيار متجهات كل واحد-ومزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل دون تعديل البروتوكول. وعقب ترانسفيكشنز والحصاد للعينات التي تحتوي على ناقل إف (الثقافة المتوسطة و/أو خلايا)، على البروتوكول كله يمكن أن تكتمل في يوم، وبالتالي سرعة الإجابة على الأسئلة حول القدرة على إنتاج جزيئات فيروسية من الظروف المتنوعة، بما في ذلك تركيبات مختلفة من البروتينات VP3 إف والوكالة الأسترالية. البقع دوت كمية العرض أسلوب المناسب للتصدي لمختلف الأسئلة دون إجابة فيما يتعلق بالتفاعلات بين الوكالة الأسترالية نائب الرئيس وأدوارها في الجمعية قفيصه في مجموعة متنوعة من مختلف الأنماط إف ويعزل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر شياو شياو في جامعة كارولينا الشمالية في تشابل هيل لتزويدنا بلازميد بيمبل-CMV-التجارة والنقل. ونشكر كريستوفر تشنغ وصمويل هوانغ جيه لقراءة نقدية من المخطوطة. أيد هذا العمل منح "دائرة الصحة العامة" (المعاهد الوطنية للصحة R01 NS088399 و T32 EY232113).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase MilliporeSigma 1016970001 Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text.
DNase I Roche 4716728001 Referred to as DNase I Enzyme A in the main text.
DNase I Invitrogen 18047019 Referred to as DNase I Enzyme B in the main text.
DNase I New England Biolabs M0303L Referred to as DNase I Enzyme C in the main text.
1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes Corning 430909
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Polypropylene Conical Tube Corning 352097
3 M Sodium Acetate Teknova S0298
50 mL Polypropylene Conical Tube Corning 430291
AAV-293 Cells Agilent 240073 HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions.
AccuGENE 0.5 M EDTA Solution Lonza 51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 Lonza 51238
AccuGENE 10% SDS Lonza 51213
AccuGENE 1X TE Buffer Lonza 51235
Bio-Dot Apparatus Bio-Rad 1706545
Bovine Serum Albumin MilliporeSigma A3294
Cell Lifter Corning 3008
Chloroform MilliporeSigma 372978
DNA Extractor Kit Wako Pure Chemical Industries 295-50201 This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) Lonza 12-614F
ElectroMAX DH10B Cells Thermo Fisher Scientific 18290015
Ethanol 200 Proof Decon Labs 2716
Fetal Bovine Serum VWR 1500-500
Ficoll 400 Alfa Aesar B22095 Referred to as Polysucrose 400.
Fluorescence Microscope Zeiss Axiovert 40 CFL
Glycogen Roche 10901393001
Herring Sperm DNA Invitrogen 15634-017
Hybridization Tubes Thermo Fisher Scientific 13-247-150
ImageQuant TL GE Healthcare Life Sciences ImageQuant TL
L-glutamine 200 mM Lonza 17-605E
Magnesium Chloride Hexahydrate MilliporeSigma M0250
MicroPulser Electroporator Bio-Rad 1652100
Mini Quick Spin DNA Columns MilliporeSigma 11814419001
pAAV-RC2 Vector Cell Biolabs Inc VPK-422
Penicillin/Streptomycin 10K/10K Lonza 17-602E
Phosphate Buffered Saline Lonza 17-516F
Phosphorimaging Exposure Cassette GE Healthcare Life Sciences Various
Phosphorimaging Screen GE Healthcare Life Sciences Various
Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162
Platinum Pfx DNA Polymerase Invitrogen 11708013
Polyethylenimine Polysciences Inc 23966-2
Polyvinylpyrrolidone MilliporeSigma P5288
Prime-It II Random Primer Labeling Kit Agilent Technologies 300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		 MilliporeSigma Custom Primer
Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Proteinase K Solution Invitrogen 25530-049
Restriction Enzymes New England Biolabs Various
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15632011
Serological Pipettes Thermo Fisher Scientific 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-10
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate MilliporeSigma C8532
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203L
Thermal Cycler Eppendorf 6321000515
Tissue-culture Treated 6-well Plate Corning 353046
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-5
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28955809
UltraPure Buffer-Saturated Phenol Invitrogen 15513-047
UV Crosslinker Spectroline XLE-1000 Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2.
Zeta-Probe Membrane Bio-Rad 162-0165

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
  2. Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
  3. Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
  4. Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
  5. Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).
  6. Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
  7. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  8. Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  9. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
  10. Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
  11. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  12. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
  13. Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
  14. Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
  15. NEB, 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , New England Biolabs. 302-368 (2017).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Addgene. Bacterial Transformation. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017).
  18. Addgene. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid. , Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017).
  19. Bio-Rad. Bio-Dot® microfiltration apparatus instruction manual. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf (2017).
  20. Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
  21. Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
  22. Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
  23. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  24. Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
  25. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  26. Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
  27. Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
  28. Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
  29. Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).

Tags

البيولوجيا، 136 قضية، الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف)، والجمعية-تفعيل البروتين (AAP)، المقايسة دوت عبر التكامل، والكمية وصمة عار، عيار الفيروسية، والعلاج الجيني
مقايسة دوت كمية وصمة عار لمعايرة إف واستخدامها لتقييم وظيفي للفيروسات المرتبطة بالغدة الجمعية-تفعيل البروتينات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Powers, J. M., Chang, X. L., Song,… More

Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins. J. Vis. Exp. (136), e56766, doi:10.3791/56766 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter