Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Een kwantitatieve Dot Blot Assay voor AAV titratie en het gebruik ervan voor functionele beoordeling van het Adeno-associated Virus Assembly-activeren eiwitten

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56766
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

Summary

Dit manuscript details een eenvoudig punt vlek assay voor kwantificatie van adeno-associated virus (AAV) titers en de toepassing ervan op het bestuderen van de rol van de vergadering-activeren eiwitten (AAPs), een nieuwe klasse van niet-structurele virale eiwitten gevonden in alle AAV serotypen, bij het bevorderen van de vergadering van capsids afgeleid van cognaat en heterologe AAV serotypen.

Abstract

Terwijl adeno-associated virus (AAV) algemeen aanvaard wordt als een aantrekkelijke vector voor gentherapie, dient het ook als een virus model voor het begrip van de biologie van het virus. De laatste betreft, heeft de recente ontdekking van een niet-structurele AAV eiwit, genoemd vergadering-activeren eiwit (AAP), werpen nieuw licht op de processen die betrokken zijn bij de vergadering van de virale Eiwitmantel VP-eiwitten in een Eiwitmantel. Hoewel veel AAV serotypen AAP voor montage vereist, hebben we onlangs gemeld dat AAV4, 5 en 11 zijn uitzonderingen op deze regel. Bovendien, we laten zien dat AAPs en geassembleerde capsids van verschillende serotypes naar verschillende subcellular compartimenten lokaliseren. Deze onverwachte heterogeniteit in de biologische eigenschappen en functionele rollen van AAPs onder verschillende AAV serotypen onderstreept die het belang van studies over AAPs afgeleid van verschillende serotypen. Dit manuscript detailleert een eenvoudig punt vlek assay voor AAV kwantificatie en de toepassing ervan te beoordelen AAP afhankelijkheid en serotype specificiteit in Eiwitmantel vergadering. Om aan te tonen het nut van deze dot vlek assay, uiteengezet we te karakteriseren Eiwitmantel vergadering en AAP afhankelijkheid van Snake AAV, een eerder genfunctieonderzoek reptiel AAV, evenals AAV5 en AAV9, die eerder is aangetoond dat het onafhankelijk is van AAP en AAP-afhankelijke serotypen, respectievelijk. De test bleek dat Snake AAV Eiwitmantel vergadering Snake AAP vereist en kan niet worden bevorderd door AAPs van AAV5 en AAV9. De test toonde ook aan dat, in tegenstelling tot veel van de gemeenschappelijke serotype AAPs ter bevordering van heterologe Eiwitmantel vergadering door cross-complementatie, Snake AAP niet vergadering van AAV9 capsids bevordert. Bovendien laten we zien dat de keuze van de nuclease heeft grote invloed op de uitlezing van de stip vlek bepaling, en dus voor het kiezen van een optimale enzym is van cruciaal belang voor succesvolle beoordeling van AAV titers.

Introduction

Adeno-associated virus (AAV) is een kleine, niet-gehuld, single-stranded DNA-virus met een genoom van ongeveer 4,7 kilobases (kb). Het genoom van AAV bevat open-lezing frames (ORFs) voor de rep en cap genen. In 2010, werd een eerder onbekende nonstructural eiwit gecodeerd door een + 1 frame-verschoven ORF binnen het AAV2 GLB -gen ontdekt door Sonntag et al. en gevonden om te spelen een cruciale rol in de vergadering van AAV2 Eiwitmantel VP monomeer eiwitten in een virale Eiwitmantel1. Vergadering-activeren eiwit (AAP) is deze roman eiwit vernoemd naar de rol die het speelt bij het bevorderen van Eiwitmantel vergadering1.

De ORFs voor AAP geweest geïdentificeerde bioinformatically in het genoom van alle parvoviruses binnen het geslacht Dependoparvovirus, maar niet binnen het genoom van virussen van verschillende geslachten van het parvovirus familie1,2. Functionele studies van deze roman eiwit richtten zich aanvankelijk op de AAP van het prototype AAV2 (AAP2), die de essentiële rol van AAP2 in doelgerichtheid gedemonteerde VP eiwitten aan de nucleolus voor hun accumulatie en de vorming in volledig heeft vastgesteld capsids1,3,4gemonteerd. Het onvermogen van de capsids van de AAV2 te monteren in de afwezigheid van AAP expressie is onafhankelijk bevestigd door meerdere groepen, met inbegrip van ons1,2,3,4,5 . Latere studies op AAV serotypen 1, 8 en 9 bevestigd de kritische rol van AAPs in Eiwitmantel vergadering, als VP3 monomeer proteïnen van AAV1, 8, en 9 niet konden vormen een volledig geassembleerde Eiwitmantel bij gebrek aan mede uiting van AAP2.

Onlangs, door benaderingen die het gebruik van kwantitatieve dot omvatten blot testen, we onderzochten het vermogen van AAV1 om 12 VP3 monomeren te monteren in capsids in de afwezigheid van AAP expressie en het vermogen van AAP1 tot en met 12 ter bevordering van de vergadering van VP3 monomeren van heterologe serotypen. Deze studie is gebleken dat AAV4, 5 en 11 VP3 monomeren kunnen samenstellen zonder AAP. Bovendien bleek dat acht van de twaalf AAP serotypen we onderzocht (d.w.z.alles behalve AAP4, 5, 11 en 12) weergegeven van een brede mogelijkheid ter ondersteuning van Eiwitmantel vergadering van heterologe AAV serotype capsids, terwijl AAP4, 5, 11 en 12 weergegeven een aanzienlijk beperkte capaciteit in deze verwijzing6. Deze vier serotypen zijn fylogenetisch ver van de andere AAP serotypen2,3verwijderd. Bovendien heeft de studie significante heterogeniteit in subcellular lokalisaties van verschillende AAPs6ontdekt. Bovendien, het onderzoek heeft voorgesteld dat de strakke vereniging van AAP met gemonteerde capsids en de nucleolus, hét waarmerk van AAV2 Eiwitmantel vergadering, noodzakelijkerwijs kan niet worden uitgebreid tot andere serotypes met inbegrip van AAV5, 8, en 9, die weer nucleolar uitsluiting van geassembleerde capsids6. Dus, de gegevens die u uit de studie van eventuele bijzondere serotype AAP geldt niet in het algemeen voor alle AAP biologie. Deze raadselachtige karakter van AAP biologie onderstreept de noodzaak te onderzoeken van de rol en functie van elke AAP uit zowel de canonieke en de niet-canonieke AAV serotypen.

De biologische rol van AAP in Eiwitmantel vergadering kan worden beoordeeld door het bepalen van dat de volledig-verpakt AAV virale deeltjes titers geproduceerd in menselijke embryonale nier (HEK) 293 cellen, de meest gebruikte cellijn voor de productie van de vector van AAV, met of zonder AAP eiwit expressie. De standaardmethoden voor AAV kwantificatie zijn kwantitatieve PCR (qPCR)-gebaseerd testen7,8 en kwantitatieve dot vlek gebaseerde testen9. Andere methoden voor AAV virale deeltjes kwantificatie zoals enzyme-linked immunosorbent assay10,11 of optische dichtheid meting12 zijn niet ideaal voor afgeleid van vele verschillende AAV serotypen monsters of besmet met onzuiverheden (ruwe lysates of voedingsbodems), die vaak de monsters gebruikt voor AAV onderzoek. Op dit moment is qPCR meest gebruikte voor AAV kwantificatie; het is echter noodzakelijk te erkennen potentiële valkuilen van de qPCR gebaseerde bepaling, als de bepaling kunnen leiden tot systematische fouten en significante titer variaties13,14. PCR-gebaseerde testen worden beïnvloed door een aantal potentieel verstorende factoren, zoals de aanwezigheid van covalent gesloten terminal haarspelden in PCR sjablonen die een remmende werking amplificatie13. Zelfs een ervaren persoon kan introduceren potentieel storende factoren in een op qPCR gebaseerde assay onbewust13. Kwantitatieve dot blot testen zijn daarentegen een klassieke moleculaire biologie-techniek die geen genoom versterking en maakt gebruik van een veel eenvoudiger principe met een minimaal risico van fouten ten opzichte van de qPCR gebaseerde tests. De methode is minder technisch uitdagende; de test-resultaten zijn dus redelijk reproduceerbare zelfs door onervaren individuen.

In dit verslag beschrijven we de methodologische details van een kwantitatieve dot vlek assay we regelmatig gebruiken voor AAV vector kwantificatie en bieden een voorbeeld van hoe toe te passen de bepaling om te bestuderen van de vergadering-bevordering van rol van AAPs gemeen serotypen (AAV5 en AAV9) en een eerder genfunctieonderzoek AAP van Snake AAV14. In de natuur, AAV VP eiwitten en AAP eiwitten worden uitgedrukt in cis uit een enkel gen (dat wil zeggen, VP-AAP cis-complementatie), terwijl in de hier beschreven test, VP en AAP eiwitten worden geleverd in trans uit twee aparte plasmiden (d.w.z., VP-AAP trans-complementatie). Aangezien elke VP of AAP proteïne uit verschillende serotypen kan van elke onafhankelijke plasmide worden uitgedrukt, wordt het mogelijk om te testen van heterologe VP-AAP combinaties voor Eiwitmantel vergadering (d.w.z., VP-AAP Kruis-complementatie). Kort, AAV VP3 uit verschillende serotypen wordt uitgedrukt in HEK 293 cellen door plasmide DNA transfectie voor het inpakken van een genoom AAV vector in de aan- of afwezigheid van het cognaat serotype AAP, of in de aanwezigheid van een heteroloog serotype AAP. Na productie, cultuurmedia en cel lysates worden onderworpen aan een kwantitatieve analyse van dot, vlek te kwantificeren van het virale genoom binnen de Eiwitmantel-shell. De eerste stap van de stip blot test is voor de behandeling van de monsters met een nuclease verwijderen van contaminerende plasmide ANI's en onverpakte AAV genoom in monsters. Niet te doen zou het verhogen van de signalen van de achtergrond in het bijzonder wanneer ongezuiverde monsters zijn vehiculumcontrolegroep. Dit wordt dan gevolgd door een protease-behandeling te breken van virale capsids en introductie nuclease-resistente virale genoom in monsteroplossingen. Volgende, virale genoom worden gedenatureerd, bevlekt op een membraan en gekruist met een virale genoom-specifieke DNA sonde voor de kwantificatie. In het voorbeeld assay gemeld hier, we laten zien dat de slang AAV VP3 Snake AAP voor Eiwitmantel vergadering vereist en dat Snake AAP is niet bevorderlijk voor de vergadering van AAV9 capsids in tegenstelling tot veel van de AAPs afgeleid van AAP-afhankelijke serotypen die ook vergadering van bevorderen kunnen heterologe serotype capsids. Tot slot brengen wij verslag een belangrijk voorbehoud qPCR of dot vlek gebaseerde AAV kwantificatie testen dat de keuze van de nuclease heeft grote invloed op de resultaten van de test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: Recepten voor de oplossingen, en buffers die nodig zijn voor dit protocol zijn opgenomen in tabel 1. Het protocol die hieronder beschreven is voor de VP-AAP Kruis-complementatie dot vlek assay te bestuderen van de rollen van de eiwitten van de AAP in Eiwitmantel vergadering. De methode voor de meer algemene kwantitatieve dot vlek assay voor gezuiverde AAV vector titratie wordt uitgelegd in de sectie Vertegenwoordiger resultaten .

1. bouw van VP3, AAP en AAV2 Rep uiting van plasmiden

  1. Bouw van pCMV-AAVx-VP3 (x = serotypen)
    1. PCR-versterken de hele VP3 ORF (1.6 kb) met behulp van een polymerase van DNA van hifi- en de volgende paar van de primer: VP3 forward, CTAA-RE1-CACC-N25 (de eerste 25 nucleotiden van het VP3-ORF); VP3 omgekeerde, TCTT-RE2-N25 (de laatste 25 nucleotiden van het VP3-ORF).
      Opmerking: RE1 en RE2 zijn sites voor enzymen van de beperking (REs) voor het klonen. CTAA en TCTT zijn de terminal 5' en 3' tetranucleotides toegevoegd aan het vergemakkelijken van de spijsvertering van het beperkingsenzym in de buurt van het einde van de double-stranded DNA. CACC is een opeenvolging van Kozak consensus.
    2. Kloon de RE-digested PCR producten tussen de corresponderende RE sites van een vector zoogdieren expressie die gebruikmaakt van de menselijke cytomegalovirus onmiddellijk-vroege (CMV-IE) enhancer-promotor voor op hoog niveau expressie.
      Opmerking: Voor het moleculaire klonen, verteren 5 µg van de ruggengraat plasmide DNA met een restriction enzyme(s) bij een concentratie van 4 U/µg DNA gedurende 1 uur bij een optimale temperatuur. Voor PCR fragmenten, verhoging van de eenheden van enzymen worden gebruikt (bijvoorbeeld10 U/µg voor het VP3 ORF PCR-product van 1.6 kb) en een langere incubatietijd (bijvoorbeeld4 h) als gevolg van een stijging van het aantal restrictie-enzym erkenning sites per eenheid lengte. Nuttige informatie in moleculaire biologie enzymen en klonen procedures met inbegrip van bacteriële transformatie kan worden gevonden elders15,16,17.
  2. Bouw van pCMV-vlag-AAPx (x = serotypen)
    1. PCR-versterken de hele AAP ORF (0.6 kb) met uitzondering van het eerste aminozuur met behulp van een polymerase van DNA van hifi- en de volgende paar van de primer: AAP forward, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (de 25 nucleotiden uit de 4e nucleotide in de AAP ORF); AAP omgekeerde, TCTT-RE2-N25 (de laatste 25 nucleotiden van de AAP ORF).
      Opmerking: GACTACAAGGACGACGATGACAAA codes een vlag-tag, die heeft aangetoond dat geen nadelige gevolgen4,5 , maar kan worden weggelaten als niet onnodig.
    2. De RE-digested PCR producten tussen de bijbehorende sites van een vector zoogdieren expressie met de CMV-IE enhancer-promotor15,16,17-kloon.
  3. Bouw van pHLP-Rep
    1. De pAAV-RC2 plasmide (7.3 kb) met 20 eenheden van Xho Digest 5 µg ik en Xcm ik, en het zuiveren van het DNA met behulp van een commerciële DNA zuivering kit of door fenol-chloroform extractie.
      Opmerking: Het verwijderen van de 1,8 kb Xho ik-Xcm, die ik uit de 7.3 kb pAAV-RC2 plasmide resulteert in een verlies van Eiwitmantel VP eiwit expressie fragment met behoud van de Rep eiwit expressie.
    2. Stomp het DNA eindigt met 6 eenheden van de Polymerase van het DNA van de T4, agarose gel-zuiveren het 5.5 kb DNA-fragment en zelf het afbinden van de gezuiverde fragment met behulp van 50 tot 100 ng van DNA en 400 eenheden van T4 DNA ligase volgens de fabrikant aanbeveling15.
    3. Volg de procedure van de standaard bacteriële transformatie waarnaar wordt verwezen in stap 1.1.2 opmerking.
  4. Controleer of dat de plasmide construeert door de spijsvertering van het beperkingsenzym en sequencing15,18.
  5. Plasmide-minipreps of maxipreps met behulp van commercieel beschikbare kits te verkrijgen van een voldoende hoeveelheid plasmide DNA voor de downstream AAV productie experimenten uitvoeren.

2. productie van AAV in HEK 293 cellen door plasmide DNA transfectie (Cross-complementatie Assay)

  1. Cultuur HEK 293 cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM)-hoge glucose (4.5 g/L) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 1%, penicilline en streptomycine Mix, en 1 mM L-glutamine, in een incubator 37 ° C met 5% kooldioxide (CO2).
    Opmerking: AAV titers aanzienlijk variëren, afhankelijk van de bron van HEK 293 cellen.
    Let op: Hoewel AAV kan worden afgehandeld op biosafety level 1 (BSL1)-insluiting, BSL2 insluiting wordt aanbevolen voor HEK 293 cel werk.
  2. Op dag -1 (24 h vóór transfectie), plaat 6-7 x 105 HEK 293 cellen per putje in 2 mL van het volledige medium beschreven in stap 2.1 in een 6-well plate(s). Dit over het algemeen bereikt confluentie ~ 90% de volgende dag.
  3. Dag 0: transfectie
    1. Voorbereiding voor DNA transfectie
      1. Zorg ervoor dat de cellen confluentie ~ 90% hebben bereikt.
      2. Opwarmen van DMEM aangevuld met 1% penicilline en streptomycine Mix en 1 mM L-glutamine maar zonder 10% FBS (d.w.z., middellange serumvrij) in een waterbad 37 ° C.
      3. Toestaan dat de polyethylenimine (PEI) oplossing tot kamertemperatuur.
    2. Voorbereiding van de plasmide DNA mengsel
      1. Meng de plasmiden in 96 µL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder CaCl2 of MgCl2 in steriele 1,5 mL microcentrifuge buizen zoals aangegeven in tabel 2. De totale hoeveelheid DNA is 2 µg per putje.
        Opmerking: De volumes naar plasmide DNA oplossing kunnen buiten beschouwing worden gelaten indien er nominale. Volumeregeling wordt aanbevolen als het totale volume van de plasmide DNA oplossingen ≥10 µL.
    3. PEI transfectie
      1. Voeg 4 µL van PEI oplossing (1 mg/mL) toe aan de mix van de PBS-plasmide DNA (opgesteld zoals hierboven). Het eindvolume is ongeveer 100 µL (5% volume van het kweekmedium). Vortex de buizen kort en het DNA: PEI mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
      2. Tijdens het wachten voor de 15 minuten incubatie te voltooien, vervang het kweekmedium met voorverwarmde serumvrij medium beschreven in stap 2.3.1.2.
      3. Eenmaal de 15-minuten incubatie van het DNA: PEI mengsel is voltooid, kort draaien de buizen met een microcentrifuge voor het verzamelen van de vloeistof naar de onderkant van de buizen en het mengsel van DNA: PEI ontkleuring toevoegen aan het kweekmedium in elk putje van de plaat HEK 293 cultuur. Zachtjes doorroeren van de platen en deze terugsturen naar een incubator 37 ° C met 5% CO2.
      4. De cellen in dit medium transfectie handhaven tot de oogst op dag 5 (geen middellange verandering is vereist).
  4. Op dag 1 en dag 2, observeren cellen transfected met pCMV-GFP plasmide onder een omgekeerde fluorescentie Microscoop om transfectie efficiëntie te beoordelen.
    Opmerking: voor fluorescentie microscopie, hier een 10 X / 0,25 numerieke diafragma doelstelling in combinatie met een 10 × oculair werd gebruikt, en 450 – 490 nm excitatie bandfilter filter en 515-565 nm bandpass emissie filter werkten. De bovenstaande voorwaarde levert normaal gesproken meer dan 70% transfectie efficiëntie. Cellen kunnen sommige morfologische veranderingen (bijvoorbeeld cellen zijn slank geworden) te wijten aan de serumvrij aandoening vertonen.
  5. Op 3-5 dagen, blijven de transfected cellen in een incubator 37 ° C met 5% CO2cultuur.
  6. Op dag 5, verzamelen zowel cellen en virus-bevattende medium in 15 mL polypropyleen conische buizen door pipetteren op en neer of door schrapen met een cel schraper.
  7. De monsters bij-80 ° C bewaren tot gebruik.

3. dot Blot Assay voor AAV Quantitation

  1. Herstel van virale deeltjes
    1. Snel ontdooien de bevroren buizen in een waterbad 37 ° C. Vortex de buizen krachtig gedurende 1 minuut om te maximaliseren van de terugwinning van AAV uit cellen.
    2. Pellet het puin van de cel door centrifugatie bij 3700 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Neem 200 µL van het supernatans van elke buis en breng dit in een gelabelde microcentrifuge buis met een schroefdop voor de dot vlek assay.
      Opmerking: Aliquot het resterende supernatant in microcentrifuge buizen en sla deze bevroren bij-80 ° C voor toekomstig gebruik. Hier, polypropyleen microcentrifuge buizen bevestigd met schroefdoppen en een O-ring werden gebruikt. Strak afdichting is vereist ter voorkoming van lekkages van AAV en fenol-chloroform.
  2. Behandeling met Serratia marcescens endonuclease
    1. Bereiden Mix A en Mix B reagentia (tabel 3). Voeg 10 µL van Mix A en 10 µL van Mix B in elke buis. Vortex de buizen voor 5 s, kort draaien de buizen voor het verzamelen van de vloeistof naar de onderkant van de buizen en de buizen bij 37 ° C ten minste Incubeer gedurende 1 uur.
      Opmerking: Mix A bevat NaOH en optimaliseert pH voor behandeling met S. marcescens endonuclease. Mix B vormt een aanvulling van magnesium. Concentratie van S. marcescens endonuclease in commercieel beschikbare enzyme voorraden variëren. Het volume van S. marcescens endonuclease moet dienovereenkomstig worden aangepast om 200 U/mL toevoeg Mix A en B van de Mix in buizen in stap 3.2.1.
      Opmerking: Een langere incubatietijd, omhoog tot 4 h, kan verminderen achtergrond signalen.
    2. Aan het eind van de incubatie, spin kort de buizen met een benchtop centrifuge voor het verzamelen van condensatie en oplossing van de bovenkant en zijkanten van de buizen.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De monsters kunnen worden opgeslagen bevroren bij-20 ° C of -80 ° C.
  3. Proteïnase K behandeling
    1. Bereiden de Mix C-reagens (tabel 3). Voeg 180 µL van Mix C in elke buis. Vortex de buizen voor 5 s, kort draaien de buizen en de buizen bij 55 ° C gedurende 1 uur uit te broeden.
      Opmerking: Het EDTA in het reagens Mix C chelateert gratis magnesium ionen en inactiveert S. marcescens endonuclease.
    2. Aan het eind van de incubatie, toestaan monsters bij kamertemperatuur en kort draaien de buizen met een benchtop centrifuge voor het verzamelen van condensatie en oplossing van de bovenkant en zijkanten van de buizen.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De monsters kunnen worden opgeslagen bevroren bij-20 ° C of -80 ° C. Incubeer om te hervatten het protocol, de buizen bij 55 ° C gedurende 5 tot 10 min te ontbinden SDS kristallen volledig opgenomen in de buffer.
  4. Fenol-chloroform extractie en ethanol neerslag
    1. Voeg toe 200 µL van fenol-chloroform aan de monsters en de vortex hen voor 1 min. draaien de monsters in een microcentrifuge op ≥16, 100 x g voor ≥5 min bij kamertemperatuur.
      Let op: Fenol-chloroform moet worden behandeld in een chemische zuurkast met passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM; dat wil zeggen, nitril handschoenen, veiligheidsbril of gelaatsscherm en laboratoriumjas met lange mouwen).
    2. 320 µL van de waterige laag (160 µL tweemaal met een pipet P200) overdragen aan een nieuwe standaard microcentrifuge buis (80% van de waterige vloeistof volume).
      Opmerking: Het is van vitaal belang om dezelfde hoeveelheid waterige oplossing tussen monsters, anders verliest de kwantitatieve analyse kwantitatieve nauwkeurigheid.
    3. Bereid het reagens Mix D (tabel 3). Voeg 833 µL van Mix D in elke buis. Vortex de buizen voor 5 s, en de buizen bij-80 ° C voor ≥20 min uit te broeden.
      Opmerking: Mix D is een mengsel van ethanol, natriumacetaat en glycogeen voor handige ethanol neerslag van DNA. Monsters kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C bij deze stap en later het protocol kan worden hervat.
    4. Centrifugeer steekproeven met een microcentrifuge op ≥16, 100 x g bij 4 ° C voor ≥15 min. Giet af supernatant en vlek eenmaal op een schone papieren handdoek. Zet ongeveer 500 µL van 70% ethanol in elke buis, vortex de buizen voor 5 s en centrifuge de buizen met een benchtop-microcentrifuge op ≥16, 100 x g bij 4 ° C voor ≥5 min.
    5. Giet af het supernatant en vlek eenmaal op een schone papieren handdoek. Droge korrels bij 65 ° C; pellets kunnen volledig worden gedroogd.
      Opmerking: Gebruik geen een pipet voor het verwijderen van overtollige ethanol die achterblijft nadat het bevlekken van de buizen. Pellets kunnen ook worden gedroogd bij kamertemperatuur 's nachts. Het protocol kan hier worden gepauzeerd en gedroogde DNA pellets kunnen worden opgeslagen op kamertemperatuur voor meerdere dagen buis garen met gesloten deksel.
  5. Resuspensie van viraal DNA in TE buffer
    1. De DNA-pellets in 120 µL van buffer TE ontbinden door elke buis voor 30 min tot 1 h schudden bij kamertemperatuur.
  6. Stip vlek
    1. Opstelling van plasmide DNA normen
      1. Verdun AAV vector genoom plasmide DNA naar 10 ng/µL in water of Tris-HCl buffer (10 mM, pH 8,0). Neem 25 µL van deze verdunning en verteren met een geschikte restrictie-enzym voor 1 h van de plasmide DNA, in een reactie volume van 50 µL linearize.
        Opmerking: We maken een dubbele set van spijsvertering (zie stap 3.6.4.1). Het juiste enzym moet een dat het plasmide-DNA buiten de stip vlek sonde-bindende regio snijdt. Voor het gemak, de verdunde plasmide-DNA kunnen aliquoted (25 µL/buis) en opgeslagen bevroren bij-20 ° C voor toekomstig gebruik. Het plasmide DNA verteren terwijl de buizen zijn schudden in stap 3.5.1. Niet overdreven het plasmide DNA standaard verteren.
      2. 450 µL van water of TE voegen aan de buis met het verteerd plasmide DNA standaard en meng. Breng 70 µL van dit mengsel tot een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge koker met 1330 µL van water of TE maken een verdunde plasmide standaard (25 pg/µL).
      3. Volg tabel 4 om een set van twee-voudige seriële verdunningen (600 µL/buis) te maken. Meng de verdunningen zorgvuldig vortexing voor 5 s.
    2. Denaturering van normen en virale DNA-monsters
      1. 600 µL van 2 x Alkaline oplossing toevoegen aan elke standaard verdunning. Meng goed door vortexing gedurende 5 tot 10 s. Incubate bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
      2. 120 µL van 2 x Alkaline oplossing toevoegen aan elk virale DNA-monster. Meng goed door vortexing gedurende 5 tot 10 s. Incubate bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    3. Instellen van het toestel van de vlek stip
      1. Met behulp van schaar, een membraan bevlekken (b.v., zeta-sonde) op een passende maat voor het aantal monsters en normen gesneden. Geniet van het membraan met water gedurende 10 minuten alvorens het te plaatsen op een stip vlek apparaat. Dekking van ongebruikte putjes op het membraan-apparaat.
        Opmerking: Omgaan met het membraan met een schone pincet. Ter dekking van lege wells, kan het blad van de licht blauwe bescherming die meegeleverd met het membraan wordt worden gebruikt. Laat niet het membraan te drogen voordat bindende monsters en standaarden. Raadpleeg voor meer informatie over de vergadering en het gebruik van het apparaat, de gebruiker handmatig19.
      2. Voeg water toe tot de putjes waarin monsters worden geladen. Vacuüm en haal water door de putten om te controleren op fouten en test u opnieuw bij de vaststelling van toepassing. Draai de schroeven opnieuw tijdens het toepassen van vacuüm om strak afdichting.
        Opmerking: Onvolledige verzegeling kan veroorzaken monster lekkage tussen de putten.
      3. Als water wordt volledig getrokken door, laat het vacuüm volledig (dat wil zeggen, de vacuüm variëteit moet openstaan voor luchtdruk).
    4. Laden van normen en monsters op de stip vlek apparatuur
      1. Breng 400 µL van elke verdunde plasmide DNA standaard aan elk putje en vier rijstroken standaard verdunningen worden uitgevoerd. Gebruik twee aparte aliquots van het standaard digest en laden elk in tweevoud. 200 µL per putje van elk virale DNA-monster van toepassing.
        Opmerking: Het gebruik van de resterende ~ 40 µL van gedenatureerde monsters, kunnen verdunde monsters worden bereid (bv10-fold verdunde monsters met 20 µL van monster plus 180 µL 1 x Alkaline oplossing) en wiste indien nodig.
      2. Toepassing zacht vacuüm te trekken van de DNA-oplossingen door middel van de put.
        Opmerking: Vacuüm druk moet worden aangepast door een drie-weg klep gedeeltelijk open zodat het vacuüm druk wordt toegepast op de stip vlek apparatuur evenals de sfeer (dat wil zeggen, met de armen van de afsluiter gepositioneerd op een hoek van ongeveer 45 ° waar het Zuig luider geluid maakt).
      3. Zodra alle de putjes hebt leeggemaakt, laat u het vacuüm door de drie-weg klep aan te passen. Voeg 400 µL 1 x Alkaline oplossing aan elk putje die normen en monsters. 5 min wachten alvorens opnieuw vacuüm om de putten leeg.
      4. Het vacuüm opnieuw op dezelfde manier toepassen (zie stap 3.6.4.2).
      5. Demonteren van het toestel van de vlek dot onder vacuüm, verwijder het membraan en spoel het na met 2 x SSC. Plaats het membraan op een schone papieren handdoek met de DNA-gebonden zijde naar boven om te verwijderen van de overtollige 2 x SSC.
      6. UV-dwarslijn dichtgelopen DNA aan het membraan met een passende UV crosslinker; het membraan is nu klaar voor hybridisatie.
        Opmerking: Natte membranen kunnen worden gebruikt voor UV crosslinking. De gedroogde, UV-kruisverwijzende membranen kunnen worden opgeslagen op kamertemperatuur. Verdere informatie vindt u in de Tabel van materialen.
  7. Hybridisatie en wassen
    1. Opwarmen van de kruising Buffer in een waterbad van 65 ° C.
    2. Enzymatisch label een DNA-sonde met radioactieve α -32P dCTP en zuiveren met behulp van commercieel beschikbare kits volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
      Opmerking: We gebruiken een sonde van 0,5 – 2.0 kb in lengte van een versterker-promotor regio of een sequentie van eiwit-codeert in het virale genoom. Hoewel dit protocol maakt gebruik van 32P-geëtiketteerden radioactieve sondes voor signaal detectie, kunnen ook niet-radioactieve chemiluminescentie of TL sondes worden gebruikt (Raadpleeg de sectie discussie ).
    3. Plaats het membraan in een fles van de kruising met de DNA-afhankelijke kant boven, spoel het membraan met 5 mL voorverwarmde hybridisatie Buffer en negeren van de buffer. Daarna voeg toe 10 mL voorverwarmde hybridisatie Buffer en plaats de fles in een roterende hybridisatie-oven, ingesteld op 65 ° C. Draaien voor ≥5 min.
    4. Warmte-denatureren 20 µL van 10 mg/mL geschoren haring of zalm sperma DNA oplossing en de 32P-geëtiketteerden sonde (≥107 cpm) voor 5 min door het plaatsen van de buizen op een warmte blok set bij 100 ° C. Vervolgens module-chill hen op ijs voor ≥2 min, draai kort, en houd op ijs tot gebruik.
      Let op: Voor radioactieve DNA-sondes, 1,5 mL buisjes met schroefdop en O-ring moeten worden gebruikt.
    5. Snel toevoegen de gedenatureerde sperma DNA en radioactieve sonde aan de hybridisatie Buffer in de kruising fles en schud de fles voor 10 s te mengen. De fles terug naar de 65 ° C-oven en de fles met rotatie bij 65 ° C gedurende ≥4 h uit te broeden.
    6. Zodra de kruising voltooid is, stoppen de rotatie, de kruising fles verwijderen en giet de radioactieve sonde-oplossing in een conische buis van 50 mL met een lekvrije plug zegel cap. Winkel de sonde in een geschikte container geplaatst in een koelkast aangewezen voor radioactieve materialen.
      Opmerking: Gebruikte hybridisatie Buffer met een sonde die is opgeslagen bij 4 ° C kan worden hergebruikt minstens 5 keer door het plaatsen van de conische tube van 50 mL met een lekvrije plug zegel cap die kruising Buffer in een waterbad van 100 ° C gedurende 5 minuten bevat.
    7. Wassen van het membraan met wassen Buffer verwarmd tot 65 ° C. 20 tot 30 mL was Buffer toevoegen aan de hybridisatie fles en roteren voor 5 min. Herhaal dit 2 vaker wassen.
      Opmerking: Meten van de radioactiviteit van wassen oplossingen en opnemen indien nodig door het lokale Instituut.
    8. Plaats tijdens het wassen het membraan, een fosfor imaging scherm op een afbeelding gum gedurende 5 minuten.
    9. Na de derde wash, verwijder het membraan uit de kruising fles verwijderen overtollige buffer op het membraan met keukenpapier en plaats het membraan in een doorzichtige plastic rolhouder. Controleer radioactieve signalen op het membraan met behulp van een geigerteller. Bloot het gewiste fosfor imaging scherm naar de membraan voor 10 min naar girale afhankelijk van de intensiteit van het signaal.
    10. Scannen van het scherm met behulp van een beeld van de fosfor systeem scannen en verkrijgen van de gegevens over de signaalsterkte van elke dot.
  8. Data-analyse
    1. Een standaard curve softwarematig werkblad en data analyse (bijvoorbeeldExcel) tekenen.
      Opmerking: Log-log lineaire regressie werd gebruikt om een standaard curve tekenen.
    2. Bepalen nanogramgebied-equivalent (ng-eq) voor elk van de virale DNA-monsters door interpolatie. De ng-eq is het bedrag van de plasmide DNA gebruikt bij het tekenen van een standaard curve die gelijk is aan het aantal virale DNA-moleculen. Wanneer de lengte van de plasmide DNA is 8000 bp, 1 ng-eq single-stranded AAV viraal DNA correspondeert 2.275 x 108 deeltjes.
      Opmerking: De ng-eq kan worden geconverteerd naar het getal van virale deeltjes door de volgende vergelijkingen:
      Equation 1
      Equation 2
      Het aantal AAV deeltjes worden conventioneel uitgedrukt als "vg" (vector genomes) of "DRP" (DNase ik-resistente deeltjes).
    3. Bereken de AAV concentraties van de grondstoffen. Omdat de volgelopen viraal DNA vertegenwoordigt op 66,7% Equation 3 het viraal DNA in de grondstoffen, 1 ng-eq correspondeert met 1,7 x 109 deeltjes/mL Equation 4 .
      Opmerking: Deze correctie is niet nodig als het virale DNA vervat in de grondstof is bevlekt op een membraan zonder verlies (Zie Figuur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een representatief resultaat kwantitatieve dot blots voor kwantificatie van gezuiverde AAV vector voorraden geproduceerd op grote schaal is afgebeeld in Figuur 1. Met dit punt vlek assay, werd de titer van een double-stranded AAV2G9-CMV-GFP vector voorraad vastgesteld. De vector werd gezuiverd door twee rondes van cesium chloride (CsCl) dichtheid-verloop ultracentrifugatie gevolgd door dialyse als eerder beschreven20. In het algemeen, voor gezuiverde AAV vector bestanden, worden drie verschillende volumes van elk AAV vector bestand (b.v., 0,3 µL 0.1 µL en 0.03 µL) onderworpen aan de in tweevoud met een wijziging hierboven beschreven procedure voor de vlek van dot. DNase I enzym A wordt gebruikt in plaats van S. marcescens endonuclease in stap 3.2, en een commercieel beschikbare kit te extraheren en te zuiveren van viraal DNA wordt gebruikt in stap 3.4 (Zie Tabel van materialen). In het voorbeeld in Figuur 1, werden signaal intensiteitswaarden (willekeurige eenheid), verkregen uit elke plasmide DNA-standaard (figuur 1A) uitgezet tegen de bekende DNA hoeveelheden tot het opstellen van een standaard curve (figuur 1B), tonen een correlatie coëfficiënt van 0.998. Met behulp van deze standaard curve, werd vastgesteld door interpolatie dat 0,3, 0.1 en 0.03 µL aliquots van het AAV2G9 vector 1.487 en 1.522 ng-eq (0,3 µL), 0.487 en 0.507 ng-eq (0.1 µL) en 0.158 en 0.171 ng-eq (0.03 µL toonde). Dit gaf de volgende zes waarden: 4.957, 5.073, 4.870, 5.070, 5.267 en ng-eq/µL van de 5.700 voor deze bijzondere AAV2G9 vector voorraad, leidt tot een gemiddelde van 5.16 ± 0,27 ng-eq/µL (gemiddelde ± SD). Sinds de lengte van de plasmide gebruikt als de standaard (pEMBL-CMV-GFP) 5,848 is bp, de titer van deze vector AAV2G9 werd bepaald als 8.0 x 1011 vg/mL volgens vergelijking 2 in stap 3.8.2. Deze test wordt ten minste tweemaal herhaald om te bepalen van de uiteindelijke titers van AAV vector bestanden.

Een representatief resultaat van cross-complementatie tests te beoordelen van de afhankelijkheid van de AAP in VP3 Eiwitmantel vergadering en de mogelijkheid voor AAPs te monteren VP3 proteïnen van heterologe oorsprong is weergegeven in Figuur 2. In vitro studies van AAV vaak vereisen geen virus zuivering te maken van de conclusies en experimenten met behulp van ongezuiverde virus preparaten zoals ruwe cel lysates en virus-bevattende voedingsbodems volstaan om zinvolle resultaten opleveren. In dit experiment evalueerden AAV virale deeltjes productie van alle mogelijke combinaties van AAV VP3-AAP tussen AAV5, AAV9 en slang AAV met inbegrip van VP3-no AAP combinaties door een kwantitatieve dot vlek assay. De monsters in een dubbele set van een experiment werden uitgewist in 1 x en 10 x verdunningen (verzameling A en B instellen in figuur 2A, respectievelijk). De grafiek wordt weergegeven in figuur 2B bevat een overzicht van de kwantitatieve analyse van de stippen. De resultaten tonen aan dat: (1) AAV5VP3 assembleert ongeacht of AAP werd verstrekt in trans, (2) AAP5 en AAP9 AAV9VP3 Eiwitmantel vergadering bevorderen kunnen hoewel AAP5 minder effectief dan AAP9, (3 functioneert) AAP5 noch AAP9 vertoont een vergadering bevordering van activiteit Snake AAV VP3, en (4) slang AAP bevordert alleen vergadering van Snake AAV VP3. (1) en (2) zijn in overeenstemming met eerdere opmerkingen6, maar de unieke specifieke AAV VP3-AAP interactie in slang AAV is een nieuwe ontdekking in dit experiment. Een zwak punt van de bepaling van de Kruis-complementatie gebaseerd op kwantitatieve dot vlek is dat de negatieve controle altijd toont aanzienlijke niveaus van achtergrond signalen die niet kunnen volledig geëlimineerd worden. Dus, de kwantitatieve analyse van dot, vlek vanzelf de mogelijkheid niet uitsluiten dat Eiwitmantel assembleert tot op een niveau onder de gevoeligheid van de test. In dit verband moet worden opgemerkt dat een voorwaarde voor het genereren van de negatieve controles, onder welke AAV virale genoom exponentieel repliceren in het ontbreken van de Eiwitmantel VP3 eiwit wordt gebruikt. Dergelijke negatieve controles kunnen worden gegenereerd door het transfecting HEK 293 cellen met pAAV-Reporter, pHLP-Rep en pHelper (tabel 2), en worden gebruikt om valse positieven.

DNase ik is wijd verbeid gebruikt als een nuclease in dot vlek en qPCR gebaseerde tests voor AAV kwantificatie te verwijderen van de resterende plasmide ANI's en onverpakte virale genoom dat AAV preparaten hebben besmet. Deze verontreinigingen zou anders leiden tot een overschatting van de titers; de spijsvertering van de nuclease is daarom een zeer belangrijke stap voor het virale genoom titers nauwkeurig te kwantificeren. DNase ik enzymen zijn verkrijgbaar bij verschillende fabrikanten en commerciële leveranciers; echter, het belang van de selectie van DNase ik in AAV kwantificatie lijkt te hebben zijn ondergewaardeerde. Om te onderzoeken hoe de keuze van de nuclease van invloed kan zijn op de resultaten van de bepaling van de vlek dot, werden de volgende drie nucleasen vergeleken voor hun vermogen om signalen van de achtergrond van de AAV vector-bevattende voedingsbodems bereid zoals hierboven beschreven in stap 2 en 3: DNase I enzym A, DNase I enzym B en S. marcescens endonuclease (Tabel van materialen). Gepubliceerde studies hebben gebruik gemaakt van de voormalige twee DNase ik enzymen13,21,22,23,24 , en we zijn geweest using S. marcescens endonuclease in vorige en huidige studies. Tot onze verrassing, werd het geïdentificeerd dat DNase I enzym A helemaal niet een goede keuze voor de dot vlek assay met behulp van de virus-bevattende media in de verschillende omstandigheden getest is, wat resulteert in hoge achtergrond signalen van de negatieve controle, terwijl DNase I enzym B en S. marcescens endonuclease effectief verminderd de signalen van de achtergrond met DNase I enzym B wordt ~ 2-fold effectiever is dan S. marcescens endonuclease (figuur 3A, B). DNase I enzym C bleek ook te zeer effectief zijn om de achtergrond signalen (gegevens niet worden weergegeven). Deze gegevens blijkt dat er aanzienlijke verschillen in enzym activiteiten onder verkrijgbare nucleasen wanneer de enzym reacties zijn uitgevoerd in ongezuiverde AAV preparaten, hoewel nuclease spijsvertering moet doeltreffend wanneer een klein hoeveelheid gezuiverde virale preps wordt behandeld onder een geoptimaliseerde voorwaarde. Dus, deze gegevens wijzen op het belang van de juiste keuze van de nuclease in de bepaling wanneer ongezuiverde AAV preparaten ondergaan een kwantitatieve dot vlek of qPCR bepaling.

Figure 1
Figuur 1: een representatieve dot vlekkenanalyse om te bepalen van de titer van een vector CsCl-gezuiverd AAV. (A) Double-stranded AAV2G9-CMV-GFP vector werd geproduceerd in HEK 293 cellen door een standaard drie adenovirus-vrije methode van de transfectie van de plasmide op grote schaal, en gezuiverd door twee rondes van de kleurovergang ultracentrifugatie CsCl, gevolgd door dialyse. 0,3, 0.1 en 0.03 µL van het gezuiverde AAV vector bestand (bevlekt op de meest rechtse kolom) werden onderworpen aan de kwantitatieve dot vlek bepaling in tweevoud met twee sets van dubbele plasmide DNA normen (SOA's). De vlek werd gekruist met een 32P-geëtiketteerden GFP sonde (0.77 kb), en het beeld werd verkregen met behulp van een beeld van de fosfor systeem scannen. (B) een standaard curve toont de relatie tussen bekende plasmide DNA hoeveelheden (ng-eq, x-as) en stip intensiteiten (willekeurige eenheid (AU), y-as). De nummers op de y-as werden verkregen met de afbeelding van de fosfor systeem scannen. R geeft aan de Pearson-correlatiecoëfficiënt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: AAV VP3-AAP Kruis-complementatie dot vlek assay. Double-stranded AAV-CMV-GFP vector deeltje productie werd getest voor het VP3-eiwitten uit de AAV5, AAV9 en slang AAV in de aan- of afwezigheid van hun cognaat AAPs of in aanwezigheid van AAPs van heterologe oorsprong. (A) de bepaling in een biologisch gedupliceerde set van experimenten (verzameling A en B instellen) met 4 uur incubatietijd met S. marcescens endonuclease werd uitgevoerd, en de AAV vector titer verkregen elke combinatie werd bepaald door een kwantitatieve stip methode beschreven in de sectie Protocol van de vlek. Elke stip vertegenwoordigt tweederde (de 5e en 6e rijen, 66,7%) of twee-thirtieths (de 7e en 8e rij, 6,7%) van DNA verhaald van elke 200 µL van medium verzameld uit de monsters of de negatieve controle. De bovenste vier rijen (1e tot 4e rijen) vertegenwoordigen twee sets van plasmide DNA normen (STD 1 en 2 van de STD) uitgewist in tweevoud (d.w.z., gelineariseerde pEMBL-CMV-GFP plasmide, oftewel het plasmide gebruikt voor de productie van de vector van double-stranded AAV-CMV-GFP). De stip vlek membraan was gesondeerd met een 32P-geëtiketteerden GFP-sonde. Het paar puntjes aangegeven met afgeronde rechthoeken zijn negatieve controles. De bovenste twee rijen (STD 1) zijn zijn vanaf de onderkant van de oorspronkelijke vlek maar gesneden en verplaatst naar de top zonder te veranderen van de intensiteit van de afbeelding om beide plasmide-normen (STD 1 en 2 van de STD) naast elkaar weer te geven. Deze manipulatie wordt aangeduid met een zwarte lijn in de figuur. (B) virale titer werd vastgesteld voor de combinaties van VP3 en AAP eiwitten door de stip vlek assay. De grafiek hieronder geeft een biologisch quadruplicated set van gegevens, twee van paneel A en twee uit een ander dot vlek die niet wordt weergegeven. Foutbalken geeft gemiddelde +/-SD (n = 4). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: een vergelijking van enzymatische activiteiten van verschillende nucleasen in ongezuiverde AAV vector preparaten. (A) A kwantitatieve dot vlek tonen de effectiviteit van de behandeling van elke nuclease bij het uitbannen van signalen van de achtergrond. Een double-stranded AAV9-CMV-GFP vector-houdende preparaat ("AAV9-vector") en een "neen-Eiwitmantel control" werden geproduceerd door HEK 293 cel transfectie met plasmide Ani, en onderworpen aan de bepaling. De neen-Eiwitmantel besturingselement bevatte geen virale deeltjes, maar exponentieel versterkte onverpakte CMV-GFP vector genoom opgenomen. MgCl2 werd aangevuld op één of drie-keer de aanbevolen hoeveelheden (6 mM en 18 mM voor DNase I enzym A; en 2,5 mM en 7.5 mM voor DNase I enzym B) zonder rekening te houden met de 0.8 mM MgSO4 aanwezig in het medium. Voor de behandeling met S. marcescens endonuclease, werd slechts één voorwaarde beschreven in de sectie Protocol getest. Alle monsters werden behandeld met elke nuclease gedurende 1 uur. De stip vlek membraan was gesondeerd met een 32P-geëtiketteerden GFP-sonde. De recht twee kolommen (STD 2) zijn zijn vanaf de linkerkant van de oorspronkelijke vlek maar gesneden en naar rechts verplaatst zonder de intensiteit van de afbeelding wijzigen om beide plasmide normen (STD 1 en 2 van de STD) naast elkaar weer te geven. Deze manipulatie wordt aangeduid met een dunne zwarte lijn in de figuur. (B) stippen in de neen-Eiwitmantel controlemonsters in deelvenster A zijn gekwantificeerd en weergegeven als gemiddelde ± | elke waarde — gemiddelde waarde |. Zeven van de 12 degustaties neiging met DNase I enzym A (aangeduid met een sterretje) tonen waarden alleen iets hoger dan de hoogste norm; ze zijn daarom opgenomen in deze grafiek voor vergelijking. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Serratia marcescens Endonuclease Buffer
50 mM Tris-HCl
2 mM MgCl2
Aangepast aan de pH 8,5 met 4 M NaOH.
10 x proteïnase K Buffer
100 mM Tris-HCl pH 8,0
100 mM EDTA pH 8,0
5% SDS
2 x Alkaline oplossing
800 mM NaOH
20 mM EDTA
20 x SSC (1 L)
175.3 g NaCl
88,2 g Natriumcitraat TRIBASISCH (Na3C6H5O7)
Denhardt de oplossing 100 x (50 mL)
1 g bovien serumalbumine (deel V) Opmerking: Filteren is van cruciaal belang om het verwijderen van kleine deeltjes zoals ze achtergrond hybridisatie signalen veroorzaken.
1 g Polysucrose 400
1 g Polyvinylpyrrolidon
Oplossen in 20 mL water in een waterbad van 55 ° C.
Aanpassen van uiteindelijke volume op 50 mL.
Filter-steriliseren met een 0,22 μm-filter.
Hybridisatie Buffer
1% SDS Opmerking: De Buffer van de kruising van het winkel bij 4 ° C en warmte tot 65 ° C in een water bad voorafgaand aan het gebruiken.
6 x SSC
5 x Denhardt de oplossing
10 mM Tris-HCl pH 8,0
Wassen van de Buffer
0,1% SDS
0,1 x SSC
Polyethylenimine (PEI) oplossing (1 mg/mL, 500 mL)
Voeg 500 mg PEI in 450 mL water toe en roer. Opmerking: Voor langere opslag,-80 ° C wordt aanbevolen.
Toevoegen van geconcentreerde HCl pH omlaag te brengen < 2.0 te ontbinden PEI (ongeveer 800 µL van HCl zal worden vereist).
Toevoegen van 10 M NaOH brengen pH maximaal 7.0 (ongeveer 500 µL van 10 M NaOH zal worden vereist).
Stel het volume in op 500 mL water.
Filter-steriliseren met een 0,22 μm-filter.
Aliquot en winkel bij-20 ° C.
Fenol-chloroform (1:1 mix) voor kwantitatieve dot bevlekken
Voeg buffer-verzadigd fenol (pH 8.0) en op een 1:1 verhouding in een polypropyleen conische tube 50 mL chloroform. Opmerking: De buffer die betrekking hebben op de organische laag, als in de buis, in monster buizen via pipetteren kan worden overgedragen en kan de bepaling onjuist.
Vortex de buis krachtig te mengen.
Geschikt voor fase-separatie zichtbaar door middel van centrifugeren en verwijder de waterige laag volledig.
Bewaren bij 4 ° C.

Tabel 1: oplossing en recepten van de Buffer. Recepten voor oplossingen en buffers die nodig is om de kwantitatieve stip vlek protocol.

Plasmide AAP(+) (μg) AAP(-) (μg) Negatieve controle (μg) Controle van de transfectie (μg)
pCMV-AAVx-VP3 0.4 0.4
pCMV-vlag-AAPx 0.4
pAAV-Reporter 0.4 0.4 0.4
pHLP-Rep 0.4 0.4 0.4
pHelper 0.4 0.4 0.4
pCMV (leeg) 0.4 0.8
pCMV-GFP 2.0
Totaal 2.0 2.0 2.0 2.0

Tabel 2: plasmide combinaties voor AAV VP3-AAP Kruis-complementatie assay uitgevoerd in een 6-well plaat formaat. Combinaties van de plasmide ANI's moet worden gebruikt voor HEK 293 cel transfectie in elke experimentele groep worden weergegeven. pCMV-AAVx-VP3, een uiting van AAV serotype plasmide x (x = 1, 2, 3, etc.) VP3 eiwit onder de CMV-IE enhancer-promotor; pCMV-vlag-AAPx, een uiting van AAV serotype plasmide x (x = 1, 2, 3, etc.) AAP eiwit onder de CMV-IE enhancer-promotor; pAAV-verslaggever, een plasmide die heeft twee AAV2 omgekeerd terminal herhalingen (ITRs) en is ontworpen voor de productie van recombinante AAV-vector; pHLP-Rep, een plasmide uitdrukken AAV2 Rep eiwit; pHelper, een adenovirus helper plasmide; pCMV (leeg), een lege plasmide toegevoegd waarmee de proefomstandigheden; pCMV-GFP, een plasmide die een fluorescentie marker-gen uitdrukt (bijvoorbeeldGFP) om te controleren of de succesvolle transfectie. Transfections zijn uitgevoerd in 6-Wells-platen, en een totaal van 2 µg plasmide ANI's gebruiken.

Mix A Voor 10 buizen (l)
Serratia marcescens Endonuclease Buffer 91,2
0,1 M NaOH 8.8
Totaal 100
Mix B Voor 10 buizen (l)
Serratia marcescens Endonuclease Buffer 91,2
1 M MgCl2 7.04
Serratia marcescens Endonuclease (250 eenheden/μl) 0.176
Totaal 100
Mix C Voor 10 buizen (l)
10 x proteïnase K Buffer 400
Proteïnase K (20 mg/mL) 100
H2O 1.300
Totaal 1.800
Mix D Voor 10 buizen (l)
100% ethanol 8.000
3 M Natriumacetaat (pH 5.2) 320
Oester glycogeen (20 mg/mL) 10
Totaal 8,330

Tabel 3: lijst van master mix reagentia. Mix-A en B van de Mix worden gebruikt voor de behandeling van de endonuclease S. marcescens in stap 3.2. Deze twee mengsels moeten afzonderlijk worden gemaakt om te voorkomen dat neerslag van magnesiumhydroxide. Mix C wordt gebruikt voor de behandeling van het proteïnase K in stap 3.3. Mix-D wordt gebruikt voor ethanol neerslag in stap 3.4.3. De in de tabel aangegeven hoeveelheden zijn voor master mix reagentia voor 10 buizen.

Plasmide DNA standaard (ng) Hoeveelheid (µL) 25 pg/µL plasmide DNA standaardoplossing Hoeveelheid (µL) water Totaalvolume (µL)
5 600 0 600
2.5 300 300 600
1,25 150 450 600
0.625 75 525 600
0.313 37,5 562.5 600
0.156 18,8 581.2 600
0.078 9.4 590.6 600
0.039 4.7 595.3 600

Tabel 4: kwantitatieve dot vlek plasmide DNA normen. Benodigde hoeveelheid 25 pg/µL plasmide DNA standaardoplossing en water of TE te bereiden plasmide DNA normen door twee-voudige seriële verdunningen (600 µL/buis) worden weergegeven. De getallen in de plasmide DNA standaard kolom (0.039 tot en met 5 ng) zijn van de hoeveelheid DNA in 200 µL van elke plasmide DNA-standaardoplossing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit verslag, wordt het nut van kwantitatieve dot blot testen om te studeren AAV AAPs en hun rol in Eiwitmantel vergadering beschreven. Kennis die is opgedaan met deze studies kan gedetailleerde inzicht verwerven in de aangeboren verschillen in het proces van AAV Eiwitmantel vergadering en de functionele rol van AAPs tussen verschillende serotypen. In dit opzicht de AAV VP3-AAP Kruis-complementatie stip blot test bleek dat Snake AAV VP3 een strikte afhankelijkheid op de co uitdrukking van haar cognaat AAP voor Eiwitmantel vergadering weergegeven en dat de slang AAP Eiwitmantel vergadering van heterologe serotypes is niet bevorderlijk . Deze constatering is intrigerend, omdat de AAP-afhankelijke AAV die serotypen eerder werden onderzocht (AAV1, 2, 3, 6, 7, 8, 9 en 12) zijn allen kunnen verwerken vergadering ten minste tot op zekere hoogte met behulp van een heteroloog AAP6.

Kwantitatieve stip of sleuf vlek kruising is een traditionele methode voor kwantificatie van nucleïnezuren opgenomen in meerdere monsters tegelijk in een handige wijze25. De methode had wijd gebruikt voor DNA en RNA kwantificatie tot qPCR werd wijd verspreid is in de jaren 199026,27. Hoewel qPCR voordelen ten opzichte van kwantitatieve dot vlek heeft en andere kruising gebaseerde testen in die qPCR vertoont een hogere gevoeligheid en een bredere dynamische waaier, voert zij ook een risico van een exponentieel zijvlakken van fouten onbewust, dat het geval was voor titers van AAV vector voorraden bepaald door qPCR13,23. Kwantitatieve dot blot testen gemakkelijk instellen met de kosten van een goedkope en gemakkelijk uitgevoerd zolang onderzoekers toegang hebben tot een kwantitatieve moleculaire beeldvorming systeem dat signalen van dot vlek membranen gekruist met ofwel een radioactieve sonde kan verwerven of een niet-radioactieve chemiluminescentie of TL sonde. Hoewel dit protocol maakt gebruik van 32P-geëtiketteerden radioactieve sondes voor signaal detectie, anderen met succes gebruiken niet-radioactieve DNA-sondes rechtstreeks met het label met een commercieel beschikbare thermostable alkalische fosfatase-28. Stip blot testen gebruiken een eenvoudig principe en de bepaling zelf zorgt niet voor een technische uitdaging aan artiesten; de resultaten zijn dus over het algemeen reproduceerbare zelfs door onervaren individuen.

Naast de toepassingen die hier worden beschreven, we routinematig een vereenvoudigde en versnelde versie van de stip vlek procedure die semi-kwantificeren AAV deeltjes snel kunt gebruiken. Voordelen van dot vlek tests in dit verband zijn onder meer: (1) de bepaling vereist niet zuivering of enzymatische versterking van het virale genoom waarin uur, (2) een combinatie van warmte en alkalische denaturatie volstaat om te breken AAV deeltjes in een monster oplossing en release gedenatureerd virale genoom in de oplossing die bereid zijn te binden aan een stip vlek membraan, en (3) de aanwezigheid van zout bij hoge concentraties in monsters heeft geen aanzienlijk invloed op de resultaten van de test. Het is bijvoorbeeld mogelijk te semi-kwantificeren AAV deeltjes in CsCl-rijke oplossingen (b.v., breuken verkregen door CsCl dichtheid-verloop ultracentrifugatie) door de invoering van een kleine hoeveelheid (≤10 µL) van monsters in 100 µL van 1 x Alkaline oplossing, Verwarming op 100 ° C gedurende 10 min, en op een membraan met of zonder normen van tevoren bereid, gevolgd door een 15 min hybridisatie, 3 x 3 min wast en blootstelling aan een fosfor imaging scherm voor 15 min (of langer bij gebruik van een sonde met verminderde radioactiviteit) bevlekken. De hele procedure kan worden uitgevoerd in 1 h de gebruiker eenmaal bekend bent met de procedure. We gebruiken deze versnelde methode, die we gewoonlijk "kokend dot vlek aanroept", te identificeren van AAV deeltje-rijke CsCl breuken tijdens de vector zuivering verwerken en ongeveer bepalen titers van gezuiverde AAV vector bestanden voordat u begint met de uitgebreide processen voor de karakterisering van de vector. Dus, hoewel dot blot testen kunnen worden beschouwd als een achterhaalde methode zijn al vervangen door verschillende PCR-gebaseerde methoden in een breed scala aan wetenschappelijke disciplines te kwantificeren van nucleïnezuren, er zijn nog een aantal voordelen aan deze methode dat moet maken voor wetenschappers beschouwen het dienst in hun laboratoria.

De meest kritische stap in het protocol is de nuclease behandelingvan monsters. Als deze stap is niet uitgevoerd in een optimale conditie, het zou leiden tot hoge achtergrond signalen. We gebruiken S. marcescens endonuclease terwijl DNase ik enzymen van verschillende bronnen worden veel gebruikt in andere laboratoria voor virale DNA kwantificering. De DNase I van boviene alvleesklier oorsprong heeft meest wijd verbeid gebruikt door onderzoekers. Dit komt gedeeltelijk doordat de boviene alvleesklier DNase ik werd voor het eerst geïdentificeerd en meest uitgebreid biochemically29 gekenmerkt. De DNase ik enzymen die momenteel beschikbaar zijn van commerciële leveranciers zijn vervaardigd uit verschillende biologische bronnen zoals Pichia pastoris (DNase I enzym A), de inheemse vorm gezuiverd van de boviene alvleesklier (bijvoorbeeldDNase I enzym B), en recombinante enzymen geproduceerd in een gist soorten of Escherichia coli (DNase I enzym C). We hebben geconstateerd dat de DNase ik enzymen uit alle drie van deze verschillende bronnen zijn gebruikt in gepubliceerde AAV vector kwantificatie studies; echter, om onze kennis, geen van de vorige studies hebben onderzocht of de enzymen uit verschillende bronnen even effectief zijn in contaminerende DNA moleculen bij AAV vector voorbereidingen verteren. Opgemerkt moet worden dat DNase ik behandeling van AAV vector assays wordt vaak uitgevoerd onder niet-geoptimaliseerde omstandigheden als gevolg van de aanwezigheid van onzuiverheden afkomstig van kweekmedium en cellen. De constatering dat DNase I enzym A is slechts gedeeltelijk actief in het kweekmedium we gebruikten heeft aanzienlijke gevolgen bij het ontwerpen van de assay voor AAV vector kwantificatie door dot vlek en qPCR, en waarschuwt onderzoekers dit eerder onbekend probleem. S. marcescens endonuclease uitgedrukt in E. coli, is in dit opzicht een ideaal endonuclease niet alleen met het oog op de productie van AAV vectoren, maar ook voor AAV vector kwantificatie. Dit is omdat de enzymatische activiteit over een breed scala van pH-waarden en concentraties van magnesium ionen en monovalent caties kan worden gehandhaafd. Om deze reden, en omdat S. marcescens endonuclease ongeveer 2 keer goedkoper dan DNase I enzym B op basis van de per eenheid is, we liever met S. marcescens endonuclease in routine kwantitatieve dot vlek analyses.

In het kort zijn kwantitatieve dot blot testen een relatief eenvoudige procedure die gemakkelijk informatie over het vermogen verschaffen kan te produceren van virale deeltjes onder wisselende omstandigheden. In vergelijking met alternatieve titering benaderingen, zoals qPCR, vereist deze benadering weinig of geen, optimalisatie. Het kan ook gemakkelijk worden toegepast op de vectoren van elk serotype en kan worden gebruikt om de titer zowel single - en double-stranded vectoren zonder wijziging van het protocol. Na de transfections en de oogst van AAV vector-bevattende monsters (kweekmedium en/of cellen), het hele protocol kan worden afgerond in een dag, dus snel beantwoorden van vragen over het vermogen te produceren van virale deeltjes van uiteenlopende omstandigheden, met inbegrip van verschillende combinaties van AAV VP3 en AAP eiwitten. Kwantitatieve dot blots bieden een doelmatige methode om verschillende onbeantwoorde vragen in verband met VP-AAP interacties en hun rollen in Eiwitmantel vergadering in een breed scala aan verschillende AAV serotypen en isolaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Xiao Xiao aan de Universiteit van North Carolina te Chapel Hill voor het verstrekken van ons met de pEMBL-CMV-GFP plasmide. Wij danken Christopher Cheng en Samuel J. Huang voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd gesteund door Public Health Service verleent (NIH R01 NS088399 en T32 EY232113).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase MilliporeSigma 1016970001 Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text.
DNase I Roche 4716728001 Referred to as DNase I Enzyme A in the main text.
DNase I Invitrogen 18047019 Referred to as DNase I Enzyme B in the main text.
DNase I New England Biolabs M0303L Referred to as DNase I Enzyme C in the main text.
1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes Corning 430909
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Polypropylene Conical Tube Corning 352097
3 M Sodium Acetate Teknova S0298
50 mL Polypropylene Conical Tube Corning 430291
AAV-293 Cells Agilent 240073 HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions.
AccuGENE 0.5 M EDTA Solution Lonza 51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 Lonza 51238
AccuGENE 10% SDS Lonza 51213
AccuGENE 1X TE Buffer Lonza 51235
Bio-Dot Apparatus Bio-Rad 1706545
Bovine Serum Albumin MilliporeSigma A3294
Cell Lifter Corning 3008
Chloroform MilliporeSigma 372978
DNA Extractor Kit Wako Pure Chemical Industries 295-50201 This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) Lonza 12-614F
ElectroMAX DH10B Cells Thermo Fisher Scientific 18290015
Ethanol 200 Proof Decon Labs 2716
Fetal Bovine Serum VWR 1500-500
Ficoll 400 Alfa Aesar B22095 Referred to as Polysucrose 400.
Fluorescence Microscope Zeiss Axiovert 40 CFL
Glycogen Roche 10901393001
Herring Sperm DNA Invitrogen 15634-017
Hybridization Tubes Thermo Fisher Scientific 13-247-150
ImageQuant TL GE Healthcare Life Sciences ImageQuant TL
L-glutamine 200 mM Lonza 17-605E
Magnesium Chloride Hexahydrate MilliporeSigma M0250
MicroPulser Electroporator Bio-Rad 1652100
Mini Quick Spin DNA Columns MilliporeSigma 11814419001
pAAV-RC2 Vector Cell Biolabs Inc VPK-422
Penicillin/Streptomycin 10K/10K Lonza 17-602E
Phosphate Buffered Saline Lonza 17-516F
Phosphorimaging Exposure Cassette GE Healthcare Life Sciences Various
Phosphorimaging Screen GE Healthcare Life Sciences Various
Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162
Platinum Pfx DNA Polymerase Invitrogen 11708013
Polyethylenimine Polysciences Inc 23966-2
Polyvinylpyrrolidone MilliporeSigma P5288
Prime-It II Random Primer Labeling Kit Agilent Technologies 300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		 MilliporeSigma Custom Primer
Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Proteinase K Solution Invitrogen 25530-049
Restriction Enzymes New England Biolabs Various
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15632011
Serological Pipettes Thermo Fisher Scientific 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-10
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate MilliporeSigma C8532
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203L
Thermal Cycler Eppendorf 6321000515
Tissue-culture Treated 6-well Plate Corning 353046
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-5
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28955809
UltraPure Buffer-Saturated Phenol Invitrogen 15513-047
UV Crosslinker Spectroline XLE-1000 Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2.
Zeta-Probe Membrane Bio-Rad 162-0165

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
  2. Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
  3. Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
  4. Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
  5. Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).
  6. Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
  7. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  8. Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  9. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
  10. Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
  11. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  12. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
  13. Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
  14. Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
  15. NEB, 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , New England Biolabs. 302-368 (2017).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Addgene. Bacterial Transformation. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017).
  18. Addgene. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid. , Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017).
  19. Bio-Rad. Bio-Dot® microfiltration apparatus instruction manual. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf (2017).
  20. Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
  21. Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
  22. Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
  23. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  24. Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
  25. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  26. Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
  27. Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
  28. Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
  29. Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).

Tags

Biologie kwestie 136 Adeno-associated virus (AAV) assemblage-activeren eiwit (AAP) cross-complementatie kwantitatieve dot vlek assay virale titer gentherapie
Een kwantitatieve Dot Blot Assay voor AAV titratie en het gebruik ervan voor functionele beoordeling van het Adeno-associated Virus Assembly-activeren eiwitten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Powers, J. M., Chang, X. L., Song,… More

Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins. J. Vis. Exp. (136), e56766, doi:10.3791/56766 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter