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Biology

AAV अनुमापन और Adeno के कार्यात्मक आकलन के लिए इसके उपयोग के लिए एक मात्रात्मक डॉट दाग परख-संबंधित वायरस विधानसभा-सक्रिय प्रोटीन

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56766

Summary

यह पांडुलिपि विवरण adeno के quantitation के लिए एक सीधी डॉट दाग परख-एसोसिएटेड वायरस (AAV) titers और उसके आवेदन के लिए विधानसभा की भूमिका-सक्रिय प्रोटीन (AAPs), गैर संरचनात्मक वायरल प्रोटीन के एक उपंयास वर्ग के अध्ययन के लिए सभी AAV में पाया serotypes, cognate और heterologous AAV serotypes से व्युत्पंन capsids के विधानसभा को बढ़ावा देने में ।

Abstract

जबकि adeno-एसोसिएटेड वायरस (AAV) व्यापक रूप से जीन थेरेपी के लिए एक आकर्षक वेक्टर के रूप में स्वीकार कर लिया है, यह भी वायरस जीव विज्ञान को समझने के लिए एक मॉडल वायरस के रूप में कार्य करता है । उत्तरार्द्ध में संमान, एक गैर संरचनात्मक AAV प्रोटीन की हाल ही की खोज, विधानसभा-प्रोटीन को सक्रिय (AAP), पर एक कैप्सिड में वायरल कैप्सिड उपाध्यक्ष प्रोटीन के विधानसभा में शामिल प्रक्रियाओं पर नए प्रकाश डाला है । हालांकि कई AAV serotypes विधानसभा के लिए AAP की आवश्यकता होती है, हम हाल ही में सूचना दी है कि AAV4, 5, और 11 इस नियम के अपवाद हैं । इसके अलावा, हम प्रदर्शन किया है कि AAPs और अलग serotypes के इकट्ठे capsids विभिंन उपसेलुलर डिब्बों को information । विभिन्न AAV serotypes के बीच जैविक गुणों और AAPs के कार्यात्मक भूमिकाओं में यह अप्रत्याशित विविधता विविध AAPs से व्युत्पंन serotypes पर अध्ययन के महत्व को रेखांकित करता है । यह पांडुलिपि विवरण AAV quantitation और उसके आवेदन के लिए एक सीधी बिंदी दाग परख के लिए AAP निर्भरता और कैप्सिड विधानसभा में सीरोटाइप विशिष्टता का आकलन । इस डॉट दाग परख की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, हम बाहर सेट के लिए कैप्सिड विधानसभा और सांप AAV, एक पहले से लक्षण साँप AAV, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से AAV5 और AAV9 है, जो पहले से दिखाया गया है के लिए aap निर्भरता की विशेषताएं-स्वतंत्र और aap-निर्भर serotypes, क्रमशः । परख से पता चला कि स्नेक AAV कैप्सिड असेंबली को सांप AAP की आवश्यकता है और AAV5 और AAV9 से AAPs से प्रमोट नहीं किया जा सकता । परख भी पता चला है कि, आम सीरोटाइप AAPs के कई के विपरीत है कि परस्पर पूरक द्वारा heterologous कैप्सिड विधानसभा को बढ़ावा देने, सांप AAP AAV9 capsids के विधानसभा का प्रचार नहीं करता है । इसके अलावा, हम बताते है कि nuclease की पसंद काफी डॉट दाग परख के readout को प्रभावित करता है, और इस प्रकार, एक इष्टतम एंजाइम का चयन AAV titers के सफल आकलन के लिए महत्वपूर्ण है ।

Introduction

Adeno-एसोसिएटेड वायरस (AAV) लगभग ४.७ kilobases (केबी) के जीनोम के साथ एक छोटा, गैर-ढंक हुआ, सिंगल-कतरा हुआ डीएनए वायरस है । AAV जीनोम के प्रतिनिधि और टोपी जीन के लिए खुले पढ़ने फ्रेम (ORFs) शामिल हैं । २०१० में, एक पहले से अज्ञात गैर संरचनात्मक एक + 1 फ्रेम द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन AAV2 कैप जीन के भीतर ओआरएफ स्थानांतरित Sonntag एट अल द्वारा की खोज की थी । और एक वायरल में AAV2 कैप्सिड वीपी मोनोमर प्रोटीन के विधानसभा में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा पाया कैप्सिड1. इस उपंयास प्रोटीन विधानसभा सक्रिय प्रोटीन का नाम दिया गया है (AAP) भूमिका के बाद यह कैप्सिड1विधानसभा को बढ़ावा देने में खेलता है ।

AAP के लिए ORFs जीनस Dependoparvovirusके भीतर सभी parvoviruses के जीनोम में bioinformatically की पहचान की गई है, लेकिन पीढ़ी परिवार के विभिन्न parvovirus के विषाणुओं के जीनोम के भीतर नहीं1,2. इस उपंयास प्रोटीन के कार्यात्मक अध्ययन शुरू में प्रोटोटाइप AAV2 (AAP2) है, जो अपने संचय और पूरी तरह से गठन के लिए nucleolus को जुदा वीपी प्रोटीन लक्ष्यीकरण में AAP2 की अनिवार्य भूमिका की स्थापना की है से AAP पर ध्यान केंद्रित किया गया इकट्ठे capsids,,. AAP अभिव्यक्ति के अभाव में इकट्ठे होने की AAV2 capsids की अक्षमता को स्वतंत्र रूप से अनेक समूहों द्वारा पुष्ट किया गया है, जिनमें हमारा1,2,3,4,5 . AAV serotypes 1, 8, और 9 पर अनुवर्ती अध्ययन कैप्सिड विधानसभा में AAPs की महत्वपूर्ण भूमिका पुष्टि, VP3, 8, और 9 के मोनोमर AAV1 प्रोटीन के रूप में AAP2की सह-अभिव्यक्ति के अभाव में एक पूरी तरह से इकट्ठे कैप्सिड बनाने में असमर्थ थे.

हाल ही में, दृष्टिकोण है कि मात्रात्मक डॉट दाग परख के उपयोग को शामिल करने के माध्यम से, हम AAV1 की क्षमता की जांच की 12 VP3 मोनोमर को AAP अभिव्यक्ति के अभाव में capsids में इकट्ठे और AAP1 की क्षमता 12 से VP3 मोनोमर के विधानसभा को बढ़ावा देने के लिए heterologous serotypes. इस अध् ययन से पता चला है कि AAV4, 5, और 11 VP3 मोनोमर बिना AAP को असेंबल कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, यह पाया गया कि बारह AAP serotypes में से आठ हम (यानी, सभी लेकिन AAP4, 5, 11 और 12) की जांच की एक व्यापक क्षमता heterologous AAV सीरोटाइप capsids, जबकि AAP4, 5, 11 और 12 के कैप्सिड विधानसभा का समर्थन करने के लिए प्रदर्शित एक काफी इस संबंध में सीमित क्षमता6. ये चार serotypes दूसरे AAP serotypes2,3से phylogenetically दूर हैं. इसके अलावा, अध्ययन के विभिंन AAPs6के उपसेलुलर स्थानीयकरण में महत्वपूर्ण विविधता का पर्दाफाश किया है । इसके अलावा, अध्ययन का सुझाव दिया है कि capsids के साथ AAP के तंग एसोसिएशन और nucleolus, AAV2 कैप्सिड विधानसभा की पहचान, जरूरी serotypes, 8, और 9, जो AAV5 अपवर्जन प्रदर्शन सहित अंय nucleolar के लिए नहीं बढ़ाया जा सकता है इकट्ठे capsids6. इस प्रकार, किसी भी विशेष सीरोटाइप aap के अध्ययन से प्राप्त जानकारी मोटे तौर पर सभी aap बायोलॉजी पर लागू नहीं होती है. aap जीव विज्ञान की ऐसी puzzling प्रकृति प्रत्येक aap की भूमिका और कार्य दोनों से विहित और गैर-विहित AAV serotypes की जांच करने की आवश्यकता को रेखांकित करता है.

कैप्सिड असेंबली में aap की जैविक भूमिका का निर्धारण करके आकलन किया जा सकता है पूरी तरह से पैक AAV वायरल कण titers में उत्पादित मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) २९३ कोशिकाओं, AAV वेक्टर उत्पादन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया सेल लाइन, के साथ या बिना AAP प्रोटीन अभिव्यक्ति. AAV quantitation के लिए मानक तरीकों मात्रात्मक पीसीआर (qPCR)-परख7,8 और मात्रात्मक डॉट दाग-परख9आधारित हैं । AAV वायरल कण quantitation के लिए अन्य तरीकों जैसे एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख10,11 या ऑप्टिकल घनत्व माप12 कई अलग AAV serotypes या नमूनों से व्युत्पंन नमूनों के लिए आदर्श नहीं हैं अशुद्धियों के साथ दूषित (क्रूड lysates या संस्कृति मीडिया), जो अक्सर AAV अनुसंधान के लिए इस्तेमाल किया नमूने हैं । वर्तमान में, qPCR सबसे व्यापक रूप से AAV quantitation के लिए प्रयोग किया जाता है; हालांकि, यह qPCR के संभावित निरंतर स्वीकार-परख आधारित आवश्यक है, के रूप में परख प्रणालीगत त्रुटियों और महत्वपूर्ण titer रूपांतरों में परिणाम कर सकते है13,14। पीसीआर आधारित परख संभावित कारकों की एक संख्या से प्रभावित हैं, ऐसी पीसीआर में covalently बंद टर्मिनल hairpins की उपस्थिति टेंपलेट्स कि13प्रवर्धन बाधित । यहां तक कि एक अनुभवी व्यक्ति एक qPCR में संभावित निराधार कारकों परिचय-परख अनजाने13आधारित कर सकते हैं । इसके विपरीत, मात्रात्मक डॉट दाग परख एक शास्त्रीय आणविक जीवविज्ञान तकनीक है कि जीनोम प्रवर्धन शामिल नहीं करता है और त्रुटियों का एक ंयूनतम जोखिम के साथ एक बहुत सरल सिद्धांत का उपयोग करता है के रूप में qPCR की तुलना में परख आधारित है । विधि कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है; इसलिए, परख परिणाम काफी reproducible भी अनुभवहीन व्यक्तियों द्वारा कर रहे हैं ।

इस रिपोर्ट में, हम एक मात्रात्मक डॉट दाग परख हम नियमित रूप से AAV वेक्टर quantitation के लिए उपयोग के methodological विवरण का वर्णन और कैसे परख विधानसभा का अध्ययन करने के लिए लागू करने का एक उदाहरण प्रदान करने के लिए आम serotypes में AAPs की भूमिका को बढ़ावा देने (AAV5 और AAV9) और एक पहले सांप AAV14में से unचरित्रहीन AAP । प्रकृति में, AAV वीपी प्रोटीन और aap प्रोटीन एक एकल जीन से सीआईएस में व्यक्त कर रहे हैं (यानी, उपाध्यक्ष-aap सीआईएस-पूरक), जबकि यहाँ वर्णित परख में, वीपी और aap प्रोटीन दो अलग plasmids से ट्रांस में आपूर्ति कर रहे हैं (यानी, उपाध्यक्ष-aap ट्रांस पूरक) । चूंकि प्रत्येक उपाध्यक्ष या अलग serotypes से aap प्रोटीन प्रत्येक स्वतंत्र प्लाज्मिड से व्यक्त किया जा सकता है, यह कैप्सिड विधानसभा के लिए heterologous उपाध्यक्ष-aap युग्म का परीक्षण करने के लिए संभव हो जाता है (यानी, उपाध्यक्ष-aap पार-पूरक). संक्षेप में, विभिंन serotypes से AAV VP3 HEK २९३ कोशिकाओं में व्यक्त की है प्लाज्मिड डीएनए अभिकर्मक द्वारा AAV cognate aap की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एक सीरोटाइप वेक्टर जीनोम पैकेज, या एक heterologous सीरोटाइप aap की उपस्थिति में । निंनलिखित उत्पादन, संस्कृति मीडिया और सेल lysates एक डॉट दाग परख के अधीन है कैप्सिड खोल के भीतर वायरल जीनोम यों तो । डॉट ब्लाटर परख के पहले कदम के नमूनों में दूषित प्लाज्मिड DNAs और unपैकेज्ड AAV जीनोम को दूर करने के लिए एक nuclease के साथ नमूनों का इलाज है । ऐसा करने में विफलता विशेष रूप से जब शुद्ध नमूनों परख रहे है पृष्ठभूमि संकेतों में वृद्धि होगी । यह तो नमूना समाधान में वायरल capsids और रिलीज nuclease-प्रतिरोधी वायरल जीनोम को तोड़ने के लिए एक चिढ़ा उपचार के बाद है । अगले, वायरल जीनोम विकृत कर रहे हैं, एक झिल्ली पर blotted, और quantitation के लिए एक वायरल जीनोम विशेष डीएनए जांच के साथ संकर । उदाहरण के लिए यहां रिपोर्ट में परख, हम प्रदर्शित करते है कि सांप AAV VP3 कैप्सिड विधानसभा के लिए सांप aap की आवश्यकता है और वह सांप aap से निकाले गए capsids के कई विपरीत AAV9 AAPs के विधानसभा को बढ़ावा नहीं देता है-serotypes पर निर्भर है कि भी विधानसभा का प्रचार कर सकते है heterologous सीरोटाइप capsids. अंत में, हम qPCR या डॉट दाग को एक महत्वपूर्ण चेतावनी-AAV quantitation परख आधारित है कि nuclease के चुनाव काफी परख परिणामों को प्रभावित करता है की रिपोर्ट ।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक समाधानों और बफ़र्स के लिए व्यंजन तालिका 1में प्रदान किए गए हैं । नीचे वर्णित प्रोटोकॉल उपाध्यक्ष के लिए है-aap पार पूरकता डॉट ब्लाटर परख के लिए कैप्सिड विधानसभा में aap प्रोटीन की भूमिकाओं का अध्ययन. शुद्ध AAV वेक्टर अनुमापन के लिए और अधिक सामांय मात्रात्मक डॉट दाग परख के लिए विधि प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में समझाया गया है ।

1. VP3, AAP, और AAV2 प्रतिनिधि Plasmids का निर्माण

  1. pCMV-AAVx-VP3 (x = serotypes) का निर्माण
    1. पीसीआर-बढ़ाना पूरे VP3 ओआरएफ (१.६ kb) एक उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ और निंनलिखित प्राइमर जोड़ी का उपयोग: VP3 फॉरवर्ड, CTAA-RE1-CACC-N25 (न्यूक्लियोटाइड ओआरएफ के पहले 25 VP3); VP3 रिवर्स, TCTT-RE2-एन25 (पिछले 25 न्यूक्लियोटाइड के VP3 ओआरएफ) ।
      नोट: RE1 और RE2 प्रतिबंध एंजाइमों (REs) के लिए क्लोनिंग के लिए साइटों रहे हैं । CTAA और TCTT टर्मिनल 5 ' और 3 ' tetranucleotides डबल-कतरा डीएनए के अंत के पास प्रतिबंध एंजाइम पाचन की सुविधा के लिए जोड़ा गया है । CACC एक श्मिट आम सहमति अनुक्रम है ।
    2. क्लोन एक स्तनधारी अभिव्यक्ति की इसी पुनः साइटों के बीच पुनः पचा पीसीआर उत्पादों वेक्टर कि मानव cytomegalovirus तुरंत का उपयोग करता है जल्दी (सीएमवी-IE) बढ़ाने-उच्च स्तर की अभिव्यक्ति के लिए प्रमोटर ।
      नोट: आणविक क्लोनिंग के लिए, एक इष्टतम तापमान पर 1 ज के लिए 4 U/µ जी डीएनए की एकाग्रता में एक प्रतिबंध एंजाइम (एस) के साथ रीढ़ प्लाज्मिड डीएनए के 5 µ जी पचा । पीसीआर टुकड़े के लिए, इस्तेमाल किया एंजाइमों की इकाइयों में वृद्धि (उदा., १.६ kb VP3 ओआरएफ पीसीआर उत्पाद के 10 U/µ जी) और एक लंबी मशीन समय (जैसे, 4 ज) प्रति इकाई लंबाई प्रतिबंध एंजाइम मांयता साइटों की संख्या की वृद्धि के कारण । आणविक जीव विज्ञान एंजाइमों में उपयोगी जानकारी और जीवाणु परिवर्तन सहित क्लोनिंग प्रक्रियाओं कहीं पाया जा सकता है15,16,17.
  2. pCMV का निर्माण-झंडा-AAPx (x = serotypes)
    1. पीसीआर-एक उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ और निंनलिखित प्राइमरी जोड़ी का उपयोग कर पहले एमिनो एसिड के अलावा पूरे aap ओआरएफ (०.६ kb) बढ़ाना: aap आगे, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (the 25 न्यूक्लियोटाइड से 4 न्यूक्लियोटाइड में AAP ओआरएफ); aap रिवर्स, TCTT-RE2-एन25 (aap के पिछले 25 न्यूक्लियोटाइड ओआरएफ).
      नोट: GACTACAAGGACGACGATGACAAA कोड एक झंडा टैग, जो कोई हानिकारक प्रभाव4,5 है दिखाया गया है, लेकिन अगर अनावश्यक लोप किया जा सकता है ।
    2. क्लोन एक स्तनधारी अभिव्यक्ति की इसी साइटों के बीच पुनः पचा पीसीआर उत्पादों सीएमवी के साथ वेक्टर-IE बढ़ाने-प्रमोटर15,16,17
  3. pHLP का निर्माण-प्रतिनिधि
    1. डाइजेस्ट 5 pAAV के µ जी-RC2 प्लाज्मिड (७.३ kb) 20 इकाइयों के साथ Xho मैं और Xcm मैं, और एक वाणिज्यिक डीएनए शोधन किट का उपयोग कर डीएनए शुद्ध या phenol-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण द्वारा ।
      नोट: १.८ kb से Xho i-Xcm मैं अंश से ७.३ kb pAAV-RC2 प्लाज्मिड प्रतिनिधि प्रोटीन अभिव्यक्ति का संरक्षण करते हुए कैप्सिड उपाध्यक्ष प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक नुकसान में परिणाम ।
    2. कुंद-टी-4 डीएनए पोलीमरेज़ की 6 इकाइयों के साथ डीएनए समाप्त होता है, agarose जेल-५.५ kb डीएनए टुकड़ा शुद्ध, और आत्म ligate शुद्ध टुकड़ा ५० का उपयोग करने के लिए १०० डीएनए के एनजी और टी-4 डीएनए ligase के ४०० इकाइयों के अनुसार निर्माता की सिफारिश15.
    3. मानक बैक्टीरियल रूपांतरण प्रक्रिया में संदर्भित कदम 1.1.2 नोट का पालन करें ।
  4. प्लाज्मिड का निर्माण प्रतिबंध एंजाइम पाचन और sequencing द्वारा15,18
  5. प्लाज्मिड minipreps या maxipreps बहाव AAV उत्पादन प्रयोगों के लिए प्लाज्मिड डीएनए की एक पर्याप्त राशि प्राप्त करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर प्रदर्शन करते हैं ।

2. प्लाज्मिड डीएनए अभिकर्मक द्वारा HEK २९३ कोशिकाओं में AAV का उत्पादन (परस्पर पूरक परख)

  1. संस्कृति HEK २९३ Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में कोशिकाओं-उच्च ग्लूकोज (४.५ जी/एल) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक, 1% पेनिसिलिन & Streptomycin मिश्रण, और 1 मिमी एल-glutamine, एक ३७ ° c मशीन में 5% कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) के साथ ।
    नोट: AAV titers HEK २९३ कक्षों के स्रोत के आधार पर काफी भिंनता है ।
    चेतावनी: हालांकि AAV सुरक्षा स्तर 1 (BSL1) में नियंत्रित किया जा सकता है, BSL2 रोकथाम HEK २९३ सेल काम के लिए सिफारिश की है ।
  2. दिन पर-1 (24 ज अभिकर्मक से पहले), 6 प्लेट-7 x 105 HEK २९३ कोशिकाओं/अच्छी तरह से एक 6-वेल प्लेट (ओं) में चरण २.१ में वर्णित पूर्ण माध्यम के 2 मिलीलीटर में । यह आम तौर पर प्राप्त ~ ९०% अगले दिन को प्रभावित ।
  3. दिन 0: अभिकर्मक
    1. डीएनए अभिकर्मक के लिए तैयारी
      1. सुनिश्चित करें कि कक्ष ~ ९०% तक पहुंच चुके हैं ।
      2. 1% पेनिसिलिन और Streptomycin मिश्रण और 1 मिमी L-glutamine के साथ पूरक DMEM गर्म, लेकिन एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में 10% FBS (यानी, सीरम मुक्त माध्यम) के बिना ।
      3. polyethylenimine (पी) समाधान कमरे के तापमान तक पहुंचने के लिए अनुमति दें ।
    2. प्लाज्मिड डीएनए मिश्रण की तैयारी
      1. CaCl2 या MgCl2 में बाँझ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के बिना फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के ९६ µ एल में plasmids मिश्रण तालिका 2में संकेत के रूप में । डीएनए की कुल राशि 2 µ g/
        नोट: प्लाज्मिड डीएनए समाधान के लिए मात्रा यदि वे नाममात्र की अवहेलना कर सकते हैं । प्लाज्मिड डीएनए समाधानों की कुल मात्रा ≥ 10 µ है, तो वॉल्यूम समायोजन अनुशंसित है l
    3. पी अभिकर्मक
      1. पंजाब-प्लाज्मिड डीएनए मिश्रण करने के लिए पी समाधान (1 मिलीग्राम/एमएल) के 4 µ एल जोड़ें (ऊपर के रूप में तैयार) । अंतिम मात्रा लगभग १०० µ एल (5% संस्कृति माध्यम की मात्रा) है । भंवर ट्यूबों संक्षेप में और डीएनए गर्मी: कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पी मिश्रण ।
      2. जबकि 15 मिनट की गर्मी के लिए पूरा करने के लिए इंतजार कर, गर्म सीरम मुक्त माध्यम के साथ संस्कृति माध्यम की जगह कदम 2.3.1.2 में वर्णित है ।
      3. एक बार 15-डीएनए के मिन मशीन: पी मिश्रण पूरा हो गया है, संक्षेप में ट्यूबों के नीचे करने के लिए तरल इकट्ठा करने के लिए एक microcentrifuge के साथ ट्यूबों स्पिन, और डीएनए जोड़ने: पी मिश्रण HEK २९३ संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुआं में संस्कृति माध्यम को dropwise । धीरे प्लेटें आंदोलन और उंहें 5% CO2के साथ एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन के लिए वापस ।
      4. इस अभिकर्मक मध्यम में जब तक फसल दिन 5 (कोई मध्यम परिवर्तन की आवश्यकता है) में कोशिकाओं को बनाए रखने ।
  4. 1 दिन और दिन 2पर, एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत pCMV-GFP प्लाज्मिड के साथ transfected कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए अभिकर्मक दक्षता का आकलन करें ।
    नोट: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए, एक 10 × ऐपिस के साथ संयोजन में एक 10x/0.25 संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य का इस्तेमाल किया गया था, और 450 – 490 एनएम उत्तेजना bandpass फिल्टर और 515 – 565 एनएम bandpass उत्सर्जन फिल्टर कार्यरत थे । इसके बाद के संस्करण की हालत सामांय रूप से अधिक से अधिक ७०% अभिकर्मक दक्षता पैदावार । सीरम मुक्त स्थिति के कारण कोशिकाओं कुछ सुघड़ परिवर्तन (जैसे कोशिकाओं स्लिम हो गए हैं) प्रदर्शित कर सकते हैं ।
  5. 3 दिनों-5पर, संस्कृति के लिए जारी रखें transfected कोशिकाओं को एक ३७ डिग्री सेल्सियस में 5% CO2के साथ मशीन ।
  6. 5 दिनपर, दोनों कोशिकाओं और वायरस युक्त मध्यम 15 मिलीलीटर के शंकु ट्यूबों में ऊपर और नीचे pipetting द्वारा या एक सेल खुरचनी के साथ परिमार्जन द्वारा इकट्ठा ।
  7. नमूने पर-८० ° c उपयोग तक संग्रहीत करें ।

3. AAV Quantitation के लिए डॉट ब्लाटर परख

  1. वायरल कणों की वसूली
    1. जल्दी से एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में जमे हुए ट्यूबों गल । भंवर ट्यूबों जोरदार 1 मिनट के लिए कोशिकाओं से AAV की वसूली को अधिकतम करने के लिए ।
    2. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ३,७०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा सेल मलबे गोली । प्रत्येक ट्यूब से supernatant के २०० µ एल लो और डॉट दाग परख के लिए एक पेंच टोपी के साथ एक लेबल microcentrifuge ट्यूब में यह हस्तांतरण ।
      नोट: microcentrifuge ट्यूबों में शेष supernatant Aliquot और उंहें भविष्य में उपयोग के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए की दुकान । यहां, microcentrifuge पेंच टोपियां और एक O-अंगूठी के साथ संलग्न ट्यूबों का इस्तेमाल किया गया । तंग सील AAV और phenol-क्लोरोफॉर्म के फैल को रोकने के लिए आवश्यक है ।
  2. Serratia marcescens endonuclease के साथ उपचार
    1. मिश्रण एक और मिश्रण बी रिएजेंट (तालिका 3) तैयार करते हैं । मिश्रण के 10 µ एल जोड़ें एक और प्रत्येक ट्यूब में मिक्स बी के 10 µ एल । भंवर 5 एस के लिए ट्यूबों, संक्षेप ट्यूबों स्पिन ट्यूबों के नीचे करने के लिए तरल इकट्ठा करने के लिए और ३७ डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों मशीन कम से 1 के लिए एच ।
      नोट: मिश्रण एक NaOH शामिल है और एस marcescens endonuclease के साथ उपचार के लिए पीएच का अनुकूलन । मिक्स बी की खुराक मैग्नीशियम । वाणिज्यिक उपलब्ध एंजाइम शेयरों में एस marcescens endonuclease की एकाग्रता भिंन हो सकते हैं । एस marcescens endonuclease की मात्रा के अनुरूप करने के लिए तदनुसार समायोजित करने के लिए २०० U/एमएल मिश्रण जोड़ने के बाद एक और ट्यूब में कदम 3.2.1 में मिश्रण बी की जरूरत है ।
      नोट: एक लंबी गर्मी समय, 4 घंटे तक, पृष्ठभूमि संकेतों को कम कर सकते हैं ।
    2. मशीन के अंत में, संक्षेप में एक benchtop के साथ ट्यूबों स्पिन करने के लिए ऊपर और ट्यूबों के पक्षों से संघनित्र और समाधान इकट्ठा ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । नमूने-20 डिग्री सेल्सियस या-८० डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है ।
  3. Proteinase K उपचार
    1. मिक्स सी रिएजेंट (Table 3) तैयार करें । प्रत्येक ट्यूब में मिश्रण सी की १८० µ एल जोड़ें । भंवर 5 एस के लिए ट्यूबों, संक्षेप ट्यूबों स्पिन और ५५ ° c पर ट्यूबों के लिए 1 एच मशीन ।
      नोट: मिश्रण सी रिएजेंट में EDTA chelates मुक्त मैग्नीशियम आयनों और निष्क्रिय एस marcescens endonuclease ।
    2. मशीन के अंत में, नमूने कमरे के तापमान तक पहुंचने के लिए अनुमति देते हैं, और संक्षेप में एक benchtop के साथ ट्यूबों स्पिन करने के लिए ऊपर और ट्यूबों के पक्षों से संघनित्र और समाधान इकट्ठा ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । नमूने-20 डिग्री सेल्सियस या-८० डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है । प्रोटोकॉल को फिर से शुरू करने के लिए, 5 से 10 मिनट के लिए ५५ ° c पर ट्यूबों मशीन बफर में निहित एसडीएस क्रिस्टल को भंग करने के लिए पूरी तरह से ।
  4. Phenol-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और इथेनॉल वर्षण
    1. नमूने के लिए phenol-क्लोरोफॉर्म के २०० µ एल जोड़ें और उन्हें 1 मिनट के लिए भंवर । ≥ १६,१०० x g के लिए ≥ 5 मिनट पर कमरे के तापमान पर एक microcentrifuge में नमूने स्पिन ।
      चेतावनी: Phenol-क्लोरोफॉर्म उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई के साथ एक रासायनिक धुएं डाकू में नियंत्रित किया जाना चाहिए; यानी, nitrile दस्ताने, काले चश्मे या चेहरा ढाल, और लंबी आस्तीन के साथ प्रयोगशाला कोट) ।
    2. ३२० जलीय परत के µ एल स्थानांतरण (१६० µ l दो बार एक P200 पिपेट के साथ) एक नए मानक microcentrifuge ट्यूब के लिए (८०% जलीय द्रव की मात्रा का).
      नोट: यह महत्वपूर्ण है के लिए नमूनों के बीच जलीय समाधान की एक ही मात्रा लेने के लिए, अंयथा परख मात्रात्मक सटीकता खो देता है ।
    3. मिक्स डी रिएजेंट (तालिका 3) तैयार करें । प्रत्येक ट्यूब में मिश्रण डी के ८३३ µ एल जोड़ें । भंवर 5 एस के लिए ट्यूबों, और ≥ 20 मिनट के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों गर्मी ।
      नोट: मिश्रण डी इथेनॉल का एक मिश्रण है, सोडियम एसीटेट, और डीएनए की सुविधाजनक इथेनॉल वर्षण के लिए ग्लाइकोजन. नमूने इस कदम पर-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और प्रोटोकॉल बाद में फिर से शुरू किया जा सकता है ।
    4. ≥ 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ≥ १६,१०० एक्स जी में एक microcentrifuge के साथ नमूने केंद्रापसारक । एक साफ कागज तौलिया पर एक बार बंद supernatant और दाग डालो । प्रत्येक ट्यूब में ७०% इथेनॉल के लगभग ५०० µ एल रखो, भंवर 5 एस के लिए ट्यूबों, और ≥ १६,१०० x पर एक benchtop microcentrifuge के साथ ट्यूबों केंद्रापसारक 4 ° c पर ≥ 5 मिनट के लिए ।
    5. supernatant और दाग एक बार एक साफ कागज तौलिया पर डालो । ६५ डिग्री सेल्सियस पर सूखी छर्रों; छर्रों पूरी तरह से सूख सकता है ।
      नोट: अतिरिक्त इथेनॉल है कि ट्यूबों सोख्ता के बाद रहता है को दूर करने के लिए एक पिपेट का उपयोग न करें । छर्रों भी कमरे के तापमान पर रातोंरात सूख जा सकता है । प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है और सूखे डीएनए छर्रों ट्यूब ढक्कन बंद के साथ कई दिनों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
  5. ते में वायरल डीएनए का पुनर्निलंबन बफर
    1. १२० µ में डीएनए छर्रों को भंग एल कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 30 मिनट के लिए प्रत्येक ट्यूब मिलाते हुए ते ।
  6. डॉट ब्लाट
    1. प्लाज्मिड डीएनए मानकों की तैयारी
      1. पानी या Tris-एचसीएल बफर (10 मिमी, पीएच ८.०) में AAV वेक्टर जीनोम प्लाज्मिड डीएनए को 10 एनजी/µ एल को पतला करना । इस कमजोर पड़ने के 25 µ एल लो और 1 ज के लिए एक उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइम के साथ डाइजेस्ट प्लाज्मिड डीएनए linearize करने के लिए, एक प्रतिक्रिया मात्रा में ५० µ l
        नोट: हम पाचन का एक डुप्लिकेट सेट (चरण 3.6.4.1 देखें) बनाते हैं । उपयुक्त एंजाइम एक कि डॉट ब्लाट जांच बाध्यकारी क्षेत्र के बाहर प्लाज्मिड डीएनए में कटौती होनी चाहिए । सुविधा के लिए, पतला प्लाज्मिड डीएनए aliquoted (25 µ एल/ट्यूब) और भविष्य के उपयोग के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है । प्लाज्मिड डीएनए पचा जबकि ट्यूबों कदम 3.5.1 में मिलाते हैं । प्लाज्मिड डीएनए मानक को पचा नहीं है ।
      2. पच प्लाज्मिड डीएनए मानक युक्त ट्यूब करने के लिए पानी या ते के ४५० µ एल जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण । स्थानांतरण ७० µ l को इस मिश्रण के १,३३० µ l के साथ एक नया १.५ एमएल microcentrifuge ट्यूब के लिए पानी या ते एक पतला प्लाज्मिड मानक (25 pg/µ l) बनाने के लिए ।
      3. दो गुना सीरियल कमजोर पड़ने का एक सेट बनाने के लिए तालिका 4 का पालन करें (६०० µ एल/ 5 एस के लिए भंवर द्वारा अच्छी तरह से कमजोर पड़ने मिश्रण ।
    2. मानकों और वायरल डीएनए नमूनों का Denaturing
      1. प्रत्येक मानक कमजोर पड़ने के लिए 2x alkaline समाधान के ६०० µ एल जोड़ें । 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 5 से 10 एस की मशीन के लिए भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं ।
      2. प्रत्येक वायरल डीएनए नमूने के लिए 2x alkaline समाधान के १२० µ एल जोड़ें । 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 5 से 10 एस की मशीन के लिए भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं ।
    3. डॉट दाग उपकरण की स्थापना
      1. कैंची का प्रयोग, एक सोख्ता (जैसे, जीटा जांच) झिल्ली नमूनों और मानकों की संख्या के लिए एक उचित आकार में कटौती । एक डॉट दाग उपकरण पर रखने से पहले 10 मिनट के लिए पानी के साथ झिल्ली सोख । झिल्ली तंत्र पर अप्रयुक्त कुओं को कवर ।
        नोट: साफ चिमटी के साथ झिल्ली संभाल । खाली कुओं को कवर करने के लिए, झिल्ली के साथ आने वाले हल्के नीले रंग की सुरक्षा शीट का इस्तेमाल किया जा सकता है । झिल्ली बाध्यकारी नमूनों और मानकों से पहले शुष्क करने की अनुमति नहीं है । विधानसभा और तंत्र के उपयोग के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया उपयोगकर्ता मैनुअल19को देखें ।
      2. कुओं में पानी डालें जिससे नमूने भरे जा सकेंगे । वैक्यूम लागू करें और कुओं के माध्यम से पानी खींच त्रुटियों के लिए जांच करने के लिए और जब तय पुनर्परीक्षण । फिर से शिकंजा कसने जबकि तंग सील सुनिश्चित करने के लिए वैक्यूम लागू ।
        नोट: अपूर्ण सीलिंग के कारण कुओं के बीच नमूना रिसाव हो सकता है.
      3. एक बार पानी पूरी तरह से के माध्यम से खींचा है, निर्वात पूरी तरह से जारी (यानी, निर्वात कई गुना हवा के दबाव के लिए खुला होना चाहिए).
    4. मानक और नमूने डॉट दाग उपकरण के लिए लोड हो रहा है
      1. प्रत्येक अच्छी तरह से प्रत्येक पतला प्लाज्मिड डीएनए मानक के ४०० µ एल लागू करें, और मानक कमजोर पड़ने के चार लेन चलाते हैं । दो अलग aliquots मानक डाइजेस्ट का उपयोग करें और प्रत्येक डुप्लिकेट में लोड । प्रत्येक वायरल डीएनए नमूने के २०० µ l/
        नोट: विकृत नमूनों की शेष ~ ४० µ एल का उपयोग करना, पतला नमूने तैयार किया जा सकता है (उदा., 10-पतला नमूना प्लस १८० µ के 20 µ l का उपयोग कर के नमूनों 1x alkaline समाधान के) और blotted यदि आवश्यक हो तो ।
      2. कोमल वैक्यूम लागू करने के माध्यम से अच्छी तरह से डीएनए समाधान खींच ।
        नोट: वैक्यूम दबाव को आंशिक रूप से एक तीन तरह से वाल्व खोलने के द्वारा समायोजित करने की जरूरत है ताकि वैक्यूम दबाव डॉट दाग उपकरण के रूप में अच्छी तरह के रूप में वातावरण के लिए लागू किया जाता है (यानी, टोंटी हथियारों के साथ एक लगभग ४५ डिग्री कोण पर तैनात जहां यह एक जोर से चूषण शोर करता है) ।
      3. एक बार सभी कुओं को खाली कर दिया है, तीन तरह से वाल्व का समायोजन करके वैक्यूम जारी । प्रत्येक अच्छी तरह से है कि मानकों और नमूनों निहित करने के लिए 1x alkaline समाधान के ४०० µ एल जोड़ें । फिर से पहले 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए कुओं खाली वैक्यूम लागू ।
      4. पुन: उसी तरह वैक्यूम लागू करें (चरण 3.6.4.2 देखें).
      5. वैक्यूम के तहत डॉट दाग उपकरण जुदा, झिल्ली को हटाने, और 2x एसएससी के साथ कुल्ला । एक साफ कागज तौलिया पर डीएनए के साथ जगह-बंधे पक्ष ऊपर का सामना करना पड़ अतिरिक्त 2x एसएससी को हटाने के लिए ।
      6. यूवी-crosslink एक उपयुक्त यूवी crosslinker के साथ झिल्ली को blotted डीएनए; झिल्ली अब संकरण के लिए तैयार है ।
        नोट: गीली झिल्ली यूवी crosslinking के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सूखे, यूवी crosslinked झिल्ली कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है । अधिक जानकारी सामग्री की तालिकामें पाया जा सकता है ।
  7. संकरण और धुलाई
    1. एक ६५ ° c पानी स्नान में संकरण बफर गर्म ।
    2. Enzymatically रेडियोधर्मी α-३२पी dCTP के साथ एक डीएनए जांच लेबल और यह निर्माता की सिफारिश के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर शुद्ध ।
      नोट: हम एक बढ़ाने-प्रमोटर क्षेत्र या वायरल जीनोम में एक प्रोटीन कोडिंग अनुक्रम से लंबाई में 0.5-2.0 केबी की जांच का उपयोग करें । हालांकि इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल ३२पी-संकेत का पता लगाने के लिए रेडियोधर्मी जांच लेबल, गैर रेडियोधर्मी chemiluminescent या फ्लोरोसेंट जांच भी इस्तेमाल किया जा सकता है ( चर्चा अनुभाग को देखें) ।
    3. झिल्ली के साथ एक संकरण बोतल में जगह डीएनए-बंधे पक्ष ऊपर, 5 मिलीलीटर गर्म संकरण बफर के साथ झिल्ली कुल्ला, और बफर छोड़ दें । फिर गरम संकरण बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें और एक घूर्णन संकरण ओवन में ६५ डिग्री सेल्सियस सेट में बोतल जगह है । ≥ 5 मिनट के लिए घुमाएँ ।
    4. गर्मी-प्रकृति 20 µ एल के 10 मिलीग्राम/एमएल कतरनी मछली या सामन शुक्राणु डीएनए समाधान और ३२पी-लेबल जांच (≥ 107 सीपीएम) 5 मिनट के लिए एक गर्मी १०० डिग्री सेल्सियस पर सेट पर ट्यूबों रखकर । फिर स्नैप-≥ 2 मिनट के लिए बर्फ पर उन्हें ठंडा, संक्षेप में स्पिन, और उपयोग तक बर्फ पर रखने.
      चेतावनी: रेडियोधर्मी डीएनए जांच के लिए, पेंच टोपी और O-अंगूठी के साथ १.५ मिलीलीटर ट्यूबों इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
    5. जल्दी संकरण बोतल में संकरण बफर के लिए विकृत शुक्राणु डीएनए और रेडियोधर्मी जांच जोड़ने और मिश्रण करने के लिए 10 एस के लिए बोतल हिला । ६५ ° c ओवन के लिए बोतल लौटें और ≥ 4 एच के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर रोटेशन के साथ बोतल गर्मी ।
    6. एक बार संकरण पूरा हो गया है, रोटेशन बंद करो, संकरण बोतल को हटा दें, और फिर एक रिसाव प्रूफ प्लग सील टोपी के साथ एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में रेडियोधर्मी जांच समाधान डालना । एक उपयुक्त एक रेडियोधर्मी सामग्री के लिए नामित फ्रिज में रखा कंटेनर में जांच की दुकान ।
      नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाता है कि एक जांच के साथ प्रयुक्त संकरण बफर ५० एमएल शंकु ट्यूब एक लीक प्रूफ प्लग सील टोपी है कि एक १०० ° c पानी स्नान के लिए 5 मिनट में शामिल संकरण बफर के साथ रखने के द्वारा कम 5 बार फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    7. धोने के साथ झिल्ली धो ६५ ° c करने के लिए गरम बफर । संकरण बोतल के लिए धोने बफर के 20 से 30 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए घुमाएगी इस धोने 2 अधिक बार दोहराएं ।
      नोट: धोने समाधान के रेडियोधर्मिता उपाय और स्थानीय संस्थान द्वारा यदि आवश्यक हो तो इसे रिकॉर्ड.
    8. जबकि झिल्ली धोने, 5 मिनट के लिए एक छवि रबड़ पर एक फॉस्फोरस इमेजिंग स्क्रीन जगह है ।
    9. तीसरे धोने के बाद, संकरण बोतल से झिल्ली को हटा दें, कागज तौलिए के साथ झिल्ली पर अतिरिक्त बफर निकालें, और एक स्पष्ट प्लास्टिक पेपर धारक में झिल्ली जगह है । एक Geiger काउंटर का उपयोग झिल्ली पर रेडियोधर्मी संकेतों की जाँच करें. संकेत तीव्रता पर निर्भर करता है रात भर के लिए 10 मिनट के लिए झिल्ली को मिट फास्फोरस इमेजिंग स्क्रीन बेनकाब ।
    10. एक फॉस्फोरस छवि स्कैनिंग प्रणाली का उपयोग कर स्क्रीन स्कैन और प्रत्येक डॉट के संकेत तीव्रता पर डेटा प्राप्त करते हैं ।
  8. डेटा विश्लेषण
    1. स्प्रेडशीट और डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (उदा., Excel) का उपयोग करके मानक वक्र आरेखित करें ।
      नोट: लॉग-लॉग रेखीय प्रतीपगमन एक मानक वक्र आरेखित करने के लिए उपयोग किया गया था ।
    2. प्रक्षेपित द्वारा वायरल डीएनए नमूनों में से प्रत्येक के लिए नैनोग्राम-समकक्ष (एनजी-eq) का निर्धारण । एनजी-eq वायरल डीएनए अणुओं की संख्या के बराबर है कि एक मानक वक्र आकर्षित करने के लिए इस्तेमाल किया प्लाज्मिड डीएनए की राशि है । जब प्लाज्मिड डीएनए की लंबाई ८,००० bp, 1-असहाय AAV वायरल डीएनए के एनजी-eq २.२७५ x 108 कणों के अनुरूप है ।
      नोट: एनजी eq निम्नलिखित समीकरणों के द्वारा वायरल कणों की संख्या में परिवर्तित किया जा सकता है:
      Equation 1
      Equation 2
      AAV कणों की संख्या परंपरागत रूप से "वी. आर." (वेक्टर जीनोम) या "DRP" (DNase मैं प्रतिरोधी कणों) के रूप में व्यक्त कर रहे हैं ।
    3. शुरू सामग्री की AAV सांद्रता की गणना । क्योंकि blotted वायरल डीएनए शुरू सामग्री में वायरल डीएनए के Equation 3 ६६.७% का प्रतिनिधित्व करता है, 1 एनजी-eq १.७ x 109 कणों/एमएल Equation 4 से मेल खाती है ।
      नोट: यह सुधार की जरूरत नहीं है अगर सभी वायरल शुरू सामग्री में निहित डीएनए हानि के बिना एक झिल्ली पर blotted है ( चित्रा 1देखें) ।

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Representative Results

एक बड़े पैमाने पर उत्पादित शुद्ध AAV वेक्टर स्टॉक्स के quantitation के लिए मात्रात्मक डॉट दाग का एक प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1में दिखाया गया है । इस डॉट ब्लाटर की परख के साथ-साथ एक डबल कतरा titer के AAV2G9-सीएमवी-GFP वेक्टर स्टॉक का निर्धारण किया गया । वेक्टर सीज़ियम क्लोराइड (CsCl) घनत्व के दो दौर से शुद्ध किया गया-ढाल डायलिसिस के बाद ultracentrifugation के रूप में पहले20वर्णित है । सामांय में, शुद्ध AAV वेक्टर स्टॉक के लिए, तीन प्रत्येक AAV वेक्टर स्टॉक के विभिंन संस्करणों (जैसे, ०.३ µ एल, ०.१ µ एल, और ०.०३ µ एल) डॉट दाग एक संशोधन के साथ नकल में ऊपर वर्णित प्रक्रिया के अधीन हैं । DNase मैं एंजाइम एक ३.२ कदम में एस marcescens endonuclease के स्थान पर प्रयोग किया जाता है, और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट को निकालने और वायरल डीएनए शुद्ध करने के लिए कदम ३.४ में प्रयोग किया जाता है ( सामग्री की तालिकादेखें) । चित्र 1में दिखाए गए उदाहरण में, प्रत्येक प्लाज्मिड डीएनए मानक (चित्र 1a) से प्राप्त सिग्नल तीव्रता मान (एक मानक वक्र) एक सहसंबंध दिखाने के लिए ज्ञात डीएनए मात्रा के विरुद्ध प्लॉट किए गएथे ०.९९८ के गुणांक । इस मानक वक्र का उपयोग कर, यह इंटरपोल द्वारा निर्धारित किया गया था कि ०.३, ०.१ और ०.०३ µ एल aliquots AAV2G9 वेक्टर दिखाया १.४८७ और १.५२२ एनजी-eq (०.३ µ एल), ०.४८७ और ०.५०७ एनजी-eq (०.१ µ एल), और ०.१५८ और ०.१७१ एनजी-eq (०.०३ µ एल) । यह निंनलिखित छह मूल्यों: ४.९५७, ५.०७३, ४.८७०, ५.०७०, ५.२६७, और ५.७०० एनजी-eq/µ एल इस विशेष AAV2G9 वेक्टर स्टॉक के लिए, ५.१६ ± ०.२७ के एक औसत करने के लिए अग्रणी दिया एनजी-eq/µ एल (± एसडी मतलब) । मानक के रूप में इस्तेमाल किया प्लाज्मिड की लंबाई के बाद से (pEMBL-सीएमवी-GFP) ५,८४८ बीपी है, इस titer वेक्टर के AAV2G9 चरण 3.8.2 में समीकरण 2 के अनुसार ८.० x 1011 वी. एम./ यह परख कम से AAV वेक्टर स्टॉक्स के अंतिम titers निर्धारित करने के लिए दो बार दोहराया है ।

पार के एक प्रतिनिधि परिणाम-पूरक परख VP3 कैप्सिड विधानसभा में AAP निर्भरता का आकलन करने के लिए और heterologous मूल के VP3 प्रोटीन को इकट्ठा करने के लिए AAPs की क्षमता चित्रा 2में प्रदर्शित होता है. इन विट्रो AAV के अध्ययनों में अक्सर वायरस शुद्धिकरण करने के लिए निष्कर्ष बनाने की आवश्यकता नहीं है, और ऐसे क्रूड सेल lysates और वायरस युक्त संस्कृति मीडिया के रूप में पतित वायरस की तैयारी का उपयोग प्रयोगों सार्थक परिणाम उपज के लिए पर्याप्त हैं । इस प्रयोग में, AAV वायरल कण उत्पादन AAV5, AAV9, और AAV सहित नाग VP3 के बीच सभी संभव AAV VP3-aap युग्म से आकलन किया गया था-कोई AAP युग्म एक मात्रात्मक डॉट दाग परख द्वारा. एक प्रयोग के डुप्लिकेट सेट में प्राप्त नमूनों 1x और 10x कमजोर पड़ने पर blotted थे (एक सेट और चित्र 2aमें बी सेट, क्रमशः) । चित्रा बी में दिखाया गया ग्राफ डॉट्स के मात्रात्मक विश्लेषण संक्षेप । परिणाम बताते है कि: (1) AAV5VP3 इक्ट्ठा चाहे AAP ट्रांस में प्रदान किया गया था, (2) AAP5 और AAP9 AAV9VP3 कैप्सिड विधानसभा को बढ़ावा देने के हालांकि AAP5 से कम प्रभावी ढंग से AAP9 कार्य कर सकते हैं, (3) न तो AAP5 और न ही AAP9 प्रदर्शन एक गतिविधि को बढ़ावा देने के विधानसभा साँप AAV VP3 पर, और (४) साँप AAP ही साँप AAV VP3 की एसेंबली को बढ़ावा देता है. (1) और (2) पिछले टिप्पणियों के साथ कतार में हैं6, लेकिन विशिष्ट विशेष AAV VP3-AAP संपर्क सर्प AAV में इस प्रयोग में एक उपंयास खोज है । पार की एक कमजोरी-मात्रात्मक डॉट दाग के आधार पर परख पूरक है कि नकारात्मक नियंत्रण हमेशा पृष्ठभूमि संकेतों के प्रशंसनीय स्तर है कि पूरी तरह से समाप्त नहीं किया जा सकता से पता चलता है । इसलिए, खुद द्वारा डॉट दाग परख संभावना है कि कैप्सिड परख की संवेदनशीलता के नीचे एक स्तर के लिए इकट्ठे नहीं कर सकते हैं । इस संबंध में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, नकारात्मक नियंत्रण उत्पंन करने के लिए, एक शर्त है जिसके तहत AAV वायरल जीनोम तेजी से कैप्सिड VP3 प्रोटीन के अभाव में दोहराने का प्रयोग किया जाता है । इस तरह के नकारात्मक नियंत्रण pAAV-रिपोर्टर, pHLP-प्रतिनिधि, और pHelper (तालिका 2) के साथ transfecting HEK २९३ कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है, और झूठी सकारात्मक को कम करने के लिए उपयोग किया जाता है ।

DNase मैं व्यापक रूप से डॉट दाग और qPCR में एक nuclease के रूप में इस्तेमाल किया गया है AAV quantitation के लिए परख पर आधारित अवशिष्ट प्लाज्मिड DNAs और unपैकेज्ड वायरल जीनोम है कि दूषित AAV तैयारियां दूर है । इन संदूषणों अंयथा titers के एक अनुमान के लिए नेतृत्व करेंगे; इसलिए, nuclease पाचन सही वायरल जीनोम titers बढ़ाता के लिए एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है । DNase मैं एंजाइमों विभिंन निर्माताओं और वाणिज्यिक विक्रेताओं से उपलब्ध हैं; हालांकि, AAV quantitation में DNase के चयन के महत्व को सराहा गया है । कैसे nuclease की पसंद डॉट दाग परख के परिणामों को प्रभावित कर सकता है की जांच करने के लिए, निंनलिखित तीन nucleases उनके लिए AAV वेक्टर से पृष्ठभूमि संकेतों को दूर करने की क्षमता के लिए तुलना कर रहे थे-संस्कृति मीडिया तैयार युक्त के रूप में 2 कदम में ऊपर वर्णित और 3: DNase मैं एक एंजाइम, DNase मैं बी एंजाइम, और एस marcescens endonuclease (सामग्री की मेज) । प्रकाशित अध्ययन के पूर्व दो DNase मैं13,21,22,23,24 एंजाइमों का इस्तेमाल किया है और हम पिछले और वर्तमान में एस marcescens endonuclease का उपयोग किया गया है अध्ययन. हमारे आश्चर्य करने के लिए, यह है कि DNase मैं एंजाइम की पहचान की थी डॉट दाग परख के लिए सभी एक उपयुक्त विकल्प पर वायरस का उपयोग विभिंन स्थितियों में मीडिया युक्त परीक्षण, नकारात्मक नियंत्रण से उच्च पृष्ठभूमि संकेतों में जिसके परिणामस्वरूप, जबकि DNase मैं एंजाइम बी और एस marcescens endonuclease प्रभावी ढंग से DNase मैं एंजाइम बी जा रहा है ~ 2 गुना से अधिक प्रभावी एस marcescens endonuclease (3ए, बी) की तुलना में पृष्ठभूमि संकेतों को कम कर दिया । DNase मैं एंजाइम सी भी पृष्ठभूमि संकेतों को कम करने के लिए बहुत प्रभावी होना पाया गया था (डेटा नहीं दिखाया गया है). इन आंकड़ों को प्रदर्शित करता है कि वाणिज्यिक उपलब्ध nucleases के बीच एंजाइम गतिविधियों में महत्वपूर्ण अंतर है जब एंजाइम प्रतिक्रियाओं पतित AAV तैयारी में प्रदर्शन कर रहे हैं, हालांकि nuclease पाचन प्रभावी होना चाहिए जब एक छोटे शुद्ध वायरल प्रस्तुतीकरण की मात्रा एक अनुकूलित शर्त के तहत इलाज किया जाता है । इस प्रकार, इन आंकड़ों परख जब पतित AAV तैयारी एक मात्रात्मक डॉट दाग या qPCR परख से गुजरना में nuclease के सही चयन के महत्व पर प्रकाश डाला ।

Figure 1
चित्रा 1: एक प्रतिनिधि डॉट दाग विश्लेषण एक CsCl-शुद्ध AAV वेक्टर के titer निर्धारित करने के लिए । () डबल कतरा AAV2G9-सीएमवी-GFP वेक्टर एक मानक एडीनोवायरस द्वारा HEK २९३ कोशिकाओं में उत्पादन किया गया था एक बड़े पैमाने पर तीन प्लाज्मिड अभिकर्मक विधि, और CsCl ढाल ultracentrifugation के दो दौर से शुद्ध, डायलिसिस के बाद । ०.३, ०.१ और ०.०३ शुद्ध AAV वेक्टर स्टॉक (rightmost कॉलम पर blotted) के µ एल मात्रात्मक प्लाज्मिड डीएनए मानक (एसटीडी) के दो सेट के साथ डुप्लिकेट में परिमाण डॉट दाग परख के अधीन थे । ब्लाट एक ३२पी के साथ संकर-GFP जांच (०.७७ kb) लेबल था, और छवि एक फॉस्फोरस छवि स्कैनिंग प्रणाली का उपयोग कर प्राप्त किया गया था । () एक मानक वक्र ज्ञात प्लाज्मिड डीएनए मात्रा के बीच संबंध दिखा (एनजी-eq, एक्स-अक्ष) और डॉट तीव्रता (मनमाना इकाई (AU), Y-अक्ष) । Y-अक्ष पर संख्या फास्फोरस छवि स्कैनिंग प्रणाली के साथ प्राप्त किया गया । R पियरसन के सहसंबंध गुणांक को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: AAV VP3-AAP पार-पूरकता डॉट ब्लाटर परख. डबल-कतरा AAV-सीएमवी-GFP वेक्टर कण उत्पादन AAV5, AAV9, और सांप AAV उपस्थिति या उनके cognate AAPs की अनुपस्थिति में या AAPs मूल के heterologous की उपस्थिति में से VP3 प्रोटीन के लिए परीक्षण किया गया था । (एक) परख एक जैविक प्रयोगों का सेट दोहराया में प्रदर्शन किया गया था (सेट एक और सेट बी) 4 एस marcescens endonuclease के साथ ज मशीन समय के साथ, और AAV वेक्टर प्रत्येक संयोजन से प्राप्त titer एक मात्रात्मक डॉट द्वारा निर्धारित किया गया था दाग विधि प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है । प्रत्येक डॉट दो तिहाई का प्रतिनिधित्व करता है (5 और 6 पंक्तियों, ६६.७%) या दो-thirtieths (7 वीं और 8 पंक्तियों, डीएनए के ६.७%) माध्यम नमूने या नकारात्मक नियंत्रण से एकत्र की प्रत्येक २०० µ एल से बरामद किया । शीर्ष चार पंक्तियों (1 से 4 पंक्तियों) प्लाज्मिड डीएनए मानकों के दो सेट का प्रतिनिधित्व (एसटीडी 1 और एसटीडी 2) डुप्लिकेट में blotted (यानी, रैखिक pEMBL-सीएमवी-GFP प्लाज्मिड, जो डबल-कतरा प्लाज्मिड-AAV-सीएमवी वेक्टर उत्पादन के लिए इस्तेमाल GFP है) । ३२पी-लेबल GFP जांच के साथ डॉट ब्लाटर झिल्ली की जांच की गई । गोल आयतों के साथ संकेत डॉट्स की जोड़ी नकारात्मक नियंत्रण कर रहे हैं । शीर्ष दो पंक्तियों (एसटीडी 1) मूल दाग के नीचे से कर रहे हैं, लेकिन काट दिया गया है और छवि तीव्रता फेरबदल के लिए दोनों प्लाज्मिड मानकों (एसटीडी 1 और एसटीडी 2) पक्ष की ओर से प्रदर्शित किए बिना शीर्ष पर ले जाया गया । इस हेरफेर आंकड़ा में एक काली लाइन के साथ संकेत दिया है । () डॉट ब्लाटर परख द्वारा VP3 और AAP प्रोटीन के संयोजनों के लिए वायरल titer निर्धारित किया गया था । ग्राफ एक जैविक डेटा के सेट quadruplicated का प्रतिनिधित्व करता है, दो पैनल से एक और दो से दूसरे डॉट दाग है कि नहीं दिखाया गया है । त्रुटि पट्टियों का अर्थ +/-SD (n = 4) इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: शुद्ध AAV वेक्टर तैयारी में विभिन्न nucleases की एंजाइमी गतिविधियों की तुलना. () एक मात्रात्मक डॉट दाग पृष्ठभूमि संकेतों को नष्ट करने में प्रत्येक nuclease उपचार की प्रभावकारिता दिखा. एक डबल-कतरा AAV9-सीएमवी-GFP वेक्टर-तैयारी युक्त ("AAV9 वेक्टर") और एक "नहीं-कैप्सिड नियंत्रण" HEK अभिकर्मक के साथ २९३ सेल प्लाज्मिड द्वारा उत्पादित किया गया, और परख के अधीन । no-कैप्सिड नियंत्रण वायरल कणों को शामिल नहीं किया था, लेकिन तेजी से परिवर्धित unपैकेज्ड सीएमवी-GFP वेक्टर जीनोम निहित । MgCl2 एक या तीन बार सिफारिश की मात्रा (6 मिमी और 18 मिमी DNase मैं एंजाइम के लिए एक; और २.५ मिमी और DNase मैं एंजाइम बी के लिए ७.५ मिमी) खाते में ०.८ मिमी MgSO4 माध्यम में मौजूद लेने के बिना पूरक था । एस marcescens endonuclease के साथ इलाज के लिए, केवल एक ही शर्त प्रोटोकॉल खंड में वर्णित परीक्षण किया गया था । सभी नमूनों 1 एच के लिए प्रत्येक nuclease के साथ इलाज किया गया । ३२पी-लेबल GFP जांच के साथ डॉट ब्लाटर झिल्ली की जांच की गई । सही दो कॉलम (एसटीडी 2) मूल दाग के बाएं से हैं, लेकिन काट दिया गया है और छवि तीव्रता फेरबदल के लिए दोनों प्लाज्मिड मानकों को प्रदर्शित करने के बिना सही करने के लिए ले जाया गया (एसटीडी 1 और एसटीडी 2) पक्ष की ओर से । इस हेरफेर आंकड़ा में एक पतली काली रेखा के साथ संकेत दिया है । () पैनल में कोई कैप्सिड नियंत्रण नमूनों में डॉट्स एक quantified और के रूप में प्रदर्शित कर रहे है मतलब ± । प्रत्येक मान — माध्य मान | । DNase के साथ इलाज किया 12 नमूनों में से सात मैं एंजाइम एक (एक तारांकन के साथ संकेत) मूल्यों केवल थोड़ा उच्चतम मानक से अधिक दिखाने; इसलिए, वे तुलना के लिए इस ग्राफ में शामिल हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Serratia marcescens Endonuclease बफर
५० mM Tris-एचसीएल
2 मिमी MgCl2
4 मीटर NaOH के साथ पीएच ८.५ को समायोजित करें ।
10x Proteinase K बफर
१०० mM Tris-एचसीएल नं० ८.०
१०० मिमी EDTA पीएच ८.०
5% एसडीएस
2x alkaline समाधान
८०० मिमी NaOH
20 एमएम EDTA
20x एसएससी (1L)
१७५.३ g NaCl
८८.२ g सोडियम साइट्रेट tribasic (Na3C65O7)
Denhardt का समाधान 100x (५० मिलि)
1 जी गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (अंश V) नोट: फ़िल्टरिंग क्रम में वे पृष्ठभूमि संकरण संकेतों के कारण छोटे कणों को निकालने के लिए महत्वपूर्ण है ।
1 जी Polysucrose ४००
1 छ Polyvinylpyrrolidone
एक ५५ ° c पानी स्नान में 20 मिलीलीटर पानी में भंग ।
अंतिम वॉल्यूम को ५० mL पर समायोजित करें ।
फ़िल्टर-एक ०.२२ माइक्रोन फिल्टर के साथ बंध्याकरण ।
संकरण बफर
1% एसडीएस नोट: का उपयोग करने से पहले एक पानी स्नान में 4 डिग्री सेल्सियस और ६५ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी में संकरण बफर स्टोर ।
6x एसएससी
5x Denhardt का समाधान
10 एमएम Tris-एचसीएल नं० ८.०
बफर धो
०.१% एसडीएस
0.1 x एसएससी
Polyethylenimine (पी) समाधान (1 मिलीग्राम/एमएल, ५०० एमएल)
जोड़ें ५०० पानी की ४५० मिलीलीटर में मिलीग्राम बेई और हलचल । नोट: लंबे समय तक भंडारण के लिए,-८० ° c अनुशंसित है ।
बेई को भंग करने के लिए < 2.0 में pH को नीचे लाने के लिए केंद्रित एचसीएल जोड़ें (एचसीएल के लगभग ८०० µ एल की आवश्यकता होगी) ।
७.० तक नं० लाने के लिए 10 मीटर NaOH जोड़ें (10 मीटर NaOH के लगभग ५०० µ l की आवश्यकता होगी) ।
मात्रा को पानी के ५०० मिलीलीटर में समायोजित करें ।
फ़िल्टर-एक ०.२२ माइक्रोन फिल्टर के साथ बंध्याकरण ।
Aliquot और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
मात्रात्मक डॉट सोख्ता के लिए Phenol-क्लोरोफॉर्म (1:1 mix)
बफर संतृप्त phenol (पीएच ८.०) जोड़ें और एक ५० मिलीलीटर के क्लोरोफॉर्म शंकु ट्यूब में 1:1 अनुपात में । नोट: बफर कार्बनिक परत को कवर, अगर ट्यूब में छोड़ दिया, pipetting के माध्यम से नमूना ट्यूबों में किया जा सकता है और परख गलत कर सकते हैं ।
भंवर ट्यूब जोरदार मिश्रण करने के लिए ।
केंद्रापसारक द्वारा चरण जुदाई के लिए अनुमति दें और फिर जलीय परत को पूरी तरह से हटा दें ।
4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।

तालिका 1: समाधान और बफर व्यंजनों । समाधान और मात्रात्मक डॉट दाग प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए आवश्यक बफ़र्स के लिए व्यंजनों ।

प्लाज्मिड AAP (+) (μg) AAP (-) (μg) नकारात्मक नियंत्रण (μg) अभिकर्मक कंट्रोल (μg)
pCMV-AAVx-VP3 ०.४ ०.४
pCMV-झंडा-AAPx ०.४
pAAV-रिपोर्टर ०.४ ०.४ ०.४
pHLP-प्रतिनिधि ०.४ ०.४ ०.४
pHelper ०.४ ०.४ ०.४
pCMV (खाली) ०.४ ०.८
pCMV-GFP २.०
कुल २.० २.० २.० २.०

तालिका 2: AAV VP3 के लिए प्लाज्मिड युग्म-AAP cross-पूरक परख एक 6-खैर प्लेट प्रारूप में प्रदर्शन किया । प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह में HEK २९३ सेल अभिकर्मक के लिए इस्तेमाल की जाने प्लाज्मिड DNAs के युग्म दिखाए जाते हैं । pCMV-AAVx-VP3, एक प्लाज्मिड व्यक्त AAV सीरोटाइप x (x = 1, 2, 3, आदि) VP3 के तहत प्रोटीन-IE बढ़ाने-प्रवर्तक; pCMV-वज-AAPx, एक प्लाज्मिड व्यक्त AAV सीरोटाइप x (x = 1, 2, 3, आदि) AAP प्रोटीन के तहत सीएमवी-IE बढ़ाने-प्रमोटर; pAAV-रिपोर्टर, एक प्लाज्मिड है कि दो AAV2 उल्टे टर्मिनल दोहराता है (ITRs) और रिकॉमबिनेंट AAV वेक्टर उत्पादन के लिए डिज़ाइन किया गया है; pHLP प्रतिनिधि, एक प्लाज्मिड AAV2 प्रतिनिधि प्रोटीन व्यक्त; pHelper, आण एडीनोवायरस हेल्पर प्लाज्मिड; pCMV (खाली), एक खाली प्लाज्मिड प्रयोगात्मक शर्तों को नियंत्रित करने के लिए जोड़ा; pCMV-GFP, एक प्लाज्मिड व्यक्त एक प्रतिदीप्ति मार्कर जीन (जैसे, GFP) सफल अभिकर्मक सत्यापित करने के लिए । Transfections 6-अच्छी तरह से प्लेटों में आयोजित की जाती हैं, और प्लाज्मिड DNAs के 2 µ जी का कुल उपयोग करें ।

मिश्रण एक के लिए 10 ट्यूबों (μL)
Serratia marcescens Endonuclease बफर ९१.२
०.१ एम NaOH ८.८
कुल १००
मिक्स बी के लिए 10 ट्यूबों (μL)
Serratia marcescens Endonuclease बफर ९१.२
1 M MgCl2 ७.०४
Serratia marcescens Endonuclease (२५० इकाइयां/μL) ०.१७६
कुल १००
Mix ग के लिए 10 ट्यूबों (μL)
10x Proteinase K बफर ४००
Proteinase K (20 mg/ १००
एच १,३००
कुल १,८००
Mix D के लिए 10 ट्यूबों (μL)
१००% इथेनॉल ८,०००
3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच ५.२) ३२०
कस्तूरा ग्लाइकोजन (20 मिलीग्राम/ 10
कुल ८,३३०

तालिका 3: मास्टर मिक्स रिएजेंट की सूची । मिक्स ए और मिक्स बी स्टेप ३.२ में एस. marcescens endonuclease ट्रीटमेंट के लिए इस्तेमाल किया जाता है । इन दोनों मिश्रण मैग्नीशियम हीड्राकसीड की वर्षा को रोकने के लिए अलग से किया जाना चाहिए । Mix C चरण ३.३ में Proteinase K उपचार के लिए प्रयोग किया जाता है । मिश्रण डी चरण 3.4.3 में इथेनॉल वर्षण के लिए प्रयोग किया जाता है । तालिका में इंगित मात्रा 10 ट्यूबों के लिए मास्टर मिक्स एजेंट के लिए कर रहे हैं ।

प्लाज्मिड डीएनए मानक (एनजी) खंड (µ एल) के 25 स्नातकोत्तर/µ एल प्लाज्मिड डीएनए मानक समाधान वॉल्यूम (µ l) of water कुल मात्रा (µ l)
5 ६०० 0 ६००
२.५ ३०० ३०० ६००
१.२५ १५० ४५० ६००
०.६२५ ७५ ५२५ ६००
०.३१३ ३७.५ ५६२.५ ६००
०.१५६ १८.८ ५८१.२ ६००
०.०७८ ९.४ ५९०.६ ६००
०.०३९ ४.७ ५९५.३ ६००

तालिका 4: मात्रात्मक डॉट दाग प्लाज्मिड डीएनए मानकों । आवश्यक खंड के 25 स्नातकोत्तर/µ l प्लाज्मिड डीएनए मानक समाधान और पानी या ते दो गुना सीरियल कमजोर पड़ने वालों द्वारा प्लाज्मिड डीएनए मानकों को तैयार करने के लिए (६०० µ एल ट्यूब) दिखाया जाता है । प्लाज्मिड डीएनए मानक कॉलम में संख्या (०.०३९ से 5 एनजी) प्रत्येक प्लाज्मिड डीएनए मानक समाधान के २०० µ एल में डीएनए की मात्रा कर रहे हैं ।

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Discussion

इस रिपोर्ट में AAV AAPs का अध्ययन करने के लिए मात्रात्मक डॉट ब्लाट परख की उपयोगिता और कैप्सिड असेंबली में उनकी भूमिका का वर्णन किया गया है । इन अध्ययनों से प्राप्त ज्ञान AAV कैप्सिड विधानसभा की प्रक्रिया और विभिंन serotypes के बीच AAPs की कार्यात्मक भूमिका में सहज अंतर में विस्तृत अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । इस संबंध में AAV VP3-aap पार-पूरित डॉट ब्लाटर की परख से पता चला कि सर्प AAV VP3 ने cognate विधानसभा के लिए अपनी कैप्सिड aap की सह-अभिव्यक्ति पर सख्त निर्भरता दिखायी है और वह साँप aap कैप्सिड की heterologous विधानसभा को बढ़ावा नहीं देता serotypes . इस निरीक्षण पेचीदा है क्योंकि aap-निर्भर AAV serotypes कि पहले (AAV1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, और 12) की जांच कर रहे थे सब कुछ एक heterologous AAP6का उपयोग करके कुछ हद तक विधानसभा की प्रक्रिया कर रहे हैं ।

मात्रात्मक डॉट या स्लॉट दाग संकरण एक पारंपरिक विधि है न्यूक्लिक एसिड के quantitation एक सुविधाजनक तरीके से एक ही समय में कई नमूनों में निहित25. विधि व्यापक रूप से डीएनए और आरएनए quantitation के लिए इस्तेमाल किया गया था जब तक qPCR 1990 के दशक में प्रचलित बन गया26,27. हालांकि qPCR मात्रा से अधिक लाभ डॉट दाग और अंय संकरण आधारित है कि qPCR में परख एक उच्च संवेदनशीलता और एक व्यापक गतिशील रेंज प्रदर्शित करता है, यह भी तेजी से त्रुटियों को अनजाने में वृद्धि का एक अंतर्निहित जोखिम वहन करती है, जो मामला था qPCR13,23द्वारा निर्धारित AAV वेक्टर स्टॉक्स के titers के लिए । मात्रात्मक डॉट दाग परख आसानी से एक सस्ती लागत के साथ स्थापित कर रहे है और आसानी से के रूप में लंबे समय के रूप में शोधकर्ताओं ने एक मात्रात्मक आणविक इमेजिंग प्रणाली है कि डॉट दाग झिल्ली से संकेत प्राप्त कर सकते है के लिए उपयोग किया है या तो एक रेडियोधर्मी जांच के साथ संकर या एक गैर रेडियोधर्मी chemiluminescent या फ्लोरोसेंट जांच । हालांकि इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल ३२पी-संकेत का पता लगाने के लिए रेडियोधर्मी जांच लेबल, दूसरों को सफलतापूर्वक गैर रेडियोधर्मी डीएनए जांच का उपयोग सीधे एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध thermostable alkaline फॉस्फेट28के साथ लेबल । डॉट दाग परख एक सीधा सिद्धांत का उपयोग करें और परख अपने आप में कलाकारों के लिए एक तकनीकी चुनौती पैदा नहीं करता है; इसलिए, परिणाम आम तौर पर भी अनुभवहीन व्यक्तियों द्वारा reproducible हैं ।

अनुप्रयोगों के अलावा यहां वर्णित है, हम नियमित रूप से डॉट ब्लाट प्रक्रिया है कि अर्द्ध AAV कणों जल्दी कर सकते है की एक सरलीकृत और शीघ्र संस्करण का उपयोग करें । इस संदर्भ में डॉट दाग परख के लाभ में शामिल हैं: (1) परख शुद्धि या वायरल जीनोम के एंजाइमी प्रवर्धन जो घंटे लगते है की आवश्यकता नहीं है, (2) गर्मी और alkaline विकार का एक संयोजन एक नमूना में AAV कणों को तोड़ने के लिए पर्याप्त है समाधान और रिहाई के समाधान में विकृत वायरल जीनोम है कि एक डॉट दाग झिल्ली को बांधने के लिए तैयार हैं, और (3) नमूनों में उच्च सांद्रता में नमक की उपस्थिति काफी परख परिणामों को प्रभावित नहीं करता है । उदाहरण के लिए, CsCl-रिच समाधानों में अर्द्ध-AAV कणों के लिए संभव है (उदा., CsCl घनत्व-ग्रैडिएंट ultracentrifugation द्वारा प्राप्त अंशों) एक छोटा aliquot (≤ 10 µ l) को नमूनों के १०० µ l में डाल कर, १०० ° पर ताप 10 मिनट के लिए सी, और के साथ या अग्रिम में तैयार मानकों के बिना एक झिल्ली पर सोख्ता, एक 15 मिनट संकरण, 3 x 3 मिनट धोने और 15 मिनट के लिए एक फास्फोरस इमेजिंग स्क्रीन के लिए जोखिम के बाद (या अब जब कम रेडियोधर्मिता के साथ एक जांच का उपयोग कर) । पूरी प्रक्रिया 1 घंटे में पूरा किया जा सकता है एक बार उपयोगकर्ता प्रक्रिया से परिचित हो जाता है । हम इस शीघ्र विधि का उपयोग करें, जो हम customarily कॉल "उबलते डॉट दाग विधि", वेक्टर शुद्धि प्रक्रिया के दौरान AAV कण अमीर CsCl भागों की पहचान करने के लिए और मोटे तौर पर व्यापक शुरुआत से पहले शुद्ध AAV वेक्टर शेयरों के titers निर्धारित वेक्टर लक्षण वर्णन के लिए प्रक्रियाओं । इस प्रकार, हालांकि डॉट दाग परख एक विधाई विधि के रूप में देखा जा सकता है न्यूक्लिक एसिड यों तो और पहले से ही विभिंन पीसीआर के साथ प्रतिस्थापित किया गया है वैज्ञानिक विषयों की एक विस्तृत श्रृंखला में तरीकों पर आधारित है, वहां अभी भी इस विधि के लिए लाभ की एक संख्या है कि चाहिए शोधकर्ताओं ने इसे अपनी प्रयोगशालाओं में रोजगार पर विचार करें ।

प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम नमूनों का nuclease उपचार है । यदि यह चरण एक इष्टतम स्थिति में नहीं किया जाता है, यह उच्च पृष्ठभूमि संकेतों का कारण होगा । हम एस marcescens endonuclease का उपयोग करते हुए DNase मैं विभिंन स्रोतों के एंजाइमों वायरल डीएनए ठहराव के लिए अंय प्रयोगशालाओं में व्यापक रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं । DNase मैं गोजातीय अग्ंयाशय मूल के सबसे व्यापक रूप से शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है । यह भाग में है क्योंकि गोजातीय अग्नाशय DNase मैं पहले की पहचान की थी और सबसे बड़े पैमाने पर जैव रासायनिक29विशेषता । DNase मैं वाणिज्यिक विक्रेताओं से वर्तमान में उपलब्ध एंजाइमों ऐसे पिच्या pastoris के रूप में कई विभिंन जैविक स्रोतों से उत्पादित कर रहे है (DNase मैं एक एंजाइम), देशी गोजातीय अग्ंयाशय से शुद्ध रूप (जैसे, DNase मैं एंजाइम बी), और रिकॉमबिनेंट या तो एक खमीर प्रजातियों या ई कोलाई (DNase मैं एंजाइम सी) में उत्पादित एंजाइमों । हमने पाया है कि DNase मैं इन विभिंन स्रोतों के तीन से एंजाइमों प्रकाशित AAV वेक्टर quantitation अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है; हालांकि, हमारे ज्ञान के लिए, पिछले अध्ययनों से कोई भी जांच की है कि विभिंन स्रोतों से एंजाइमों AAV वेक्टर तैयारी में दूषित डीएनए अणुओं को पचाने में समान रूप से प्रभावी रहे हैं । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि DNase मैं AAV के लिए उपचार वेक्टर परख अक्सर गैर के तहत किया जाता है, संस्कृति माध्यम और कोशिकाओं से व्युत्पंन अशुद्धियों की उपस्थिति के कारण शर्तों अनुकूलित । अवलोकन कि DNase मैं एक एंजाइम केवल आंशिक रूप से संस्कृति के माध्यम से हम इस्तेमाल किया AAV वेक्टर quantitation के लिए परख डॉट दाग और qPCR द्वारा डिजाइन करने में महत्वपूर्ण निहितार्थ है में सक्रिय है, और यह पहले से अज्ञात मुद्दे पर शोधकर्ताओं को चेतावनी । इस संबंध में, एस marcescens endonuclease ई. कोलाईमें व्यक्त, एक आदर्श endonuclease न केवल विनिर्माण AAV वैक्टर के प्रयोजन के लिए है, लेकिन यह भी AAV वेक्टर quantitation के लिए । इसका कारण यह है कि अपनी एंजाइमी गतिविधि पीएच मूल्यों और मैग्नीशियम आयनों और monovalent cations की सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला पर बनाए रखा जा सकता है । इस कारण से, और क्योंकि एस marcescens endonuclease लगभग 2 बार कम DNase मैं एक प्रति इकाई के आधार पर एंजाइम बी से महंगा है, हम दिनचर्या मात्रात्मक डॉट दाग विश्लेषण में एस marcescens endonuclease का उपयोग करना पसंद करते हैं ।

सारांश में, मात्रात्मक डॉट दाग परख एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया है कि आसानी से बदलती शर्तों के तहत वायरल कणों का उत्पादन करने की क्षमता के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं । इस तरह के qPCR के रूप में वैकल्पिक titering दृष्टिकोण, की तुलना में, इस दृष्टिकोण, अगर कोई अनुकूलन, थोड़ा की आवश्यकता है । यह भी आसानी से किसी भी सीरोटाइप के वैक्टर करने के लिए लागू किया जा सकता है और प्रोटोकॉल को संशोधित करने के बिना दोनों एकल और डबल फंसे वैक्टर titer के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । निम्नलिखित transfections और AAV वेक्टर-नमूनों (संस्कृति मध्यम और/या कोशिकाओं) की फसल, पूरे प्रोटोकॉल एक दिन में पूरा किया जा सकता है, इस प्रकार तेजी से सहित विविध स्थितियों से वायरल कणों का उत्पादन करने की क्षमता के बारे में सवालों का जवाब AAV VP3 और AAP प्रोटीन के विभिन्न संयोजन. मात्रात्मक डॉट दाग विभिन्न AAV serotypes की एक विस्तृत विविधता में कैप्सिड विधानसभा में उपाध्यक्ष-AAP बातचीत और उनकी भूमिकाओं के रूप में विभिंन अनुत्तरित प्रश्नों का पता करने के लिए एक समीचीन विधि की पेशकश और अलग ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम हम pEMBL-सीएमवी-GFP प्लाज्मिड के साथ प्रदान करने के लिए चैपल हिल पर उत्तरी केरोलिना विश्वविद्यालय में जिओ जिओ धंयवाद । हम क्रिस्टोफर चेंग और शमूएल जे हुआंग पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए धंयवाद । इस कार्य को जन स्वास्थ्य सेवा अनुदान (NIH R01 NS088399 एण्ड T32 EY232113) द्वारा समर्थन दिया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase MilliporeSigma 1016970001 Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text.
DNase I Roche 4716728001 Referred to as DNase I Enzyme A in the main text.
DNase I Invitrogen 18047019 Referred to as DNase I Enzyme B in the main text.
DNase I New England Biolabs M0303L Referred to as DNase I Enzyme C in the main text.
1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes Corning 430909
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Polypropylene Conical Tube Corning 352097
3 M Sodium Acetate Teknova S0298
50 mL Polypropylene Conical Tube Corning 430291
AAV-293 Cells Agilent 240073 HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions.
AccuGENE 0.5 M EDTA Solution Lonza 51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 Lonza 51238
AccuGENE 10% SDS Lonza 51213
AccuGENE 1X TE Buffer Lonza 51235
Bio-Dot Apparatus Bio-Rad 1706545
Bovine Serum Albumin MilliporeSigma A3294
Cell Lifter Corning 3008
Chloroform MilliporeSigma 372978
DNA Extractor Kit Wako Pure Chemical Industries 295-50201 This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) Lonza 12-614F
ElectroMAX DH10B Cells Thermo Fisher Scientific 18290015
Ethanol 200 Proof Decon Labs 2716
Fetal Bovine Serum VWR 1500-500
Ficoll 400 Alfa Aesar B22095 Referred to as Polysucrose 400.
Fluorescence Microscope Zeiss Axiovert 40 CFL
Glycogen Roche 10901393001
Herring Sperm DNA Invitrogen 15634-017
Hybridization Tubes Thermo Fisher Scientific 13-247-150
ImageQuant TL GE Healthcare Life Sciences ImageQuant TL
L-glutamine 200 mM Lonza 17-605E
Magnesium Chloride Hexahydrate MilliporeSigma M0250
MicroPulser Electroporator Bio-Rad 1652100
Mini Quick Spin DNA Columns MilliporeSigma 11814419001
pAAV-RC2 Vector Cell Biolabs Inc VPK-422
Penicillin/Streptomycin 10K/10K Lonza 17-602E
Phosphate Buffered Saline Lonza 17-516F
Phosphorimaging Exposure Cassette GE Healthcare Life Sciences Various
Phosphorimaging Screen GE Healthcare Life Sciences Various
Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162
Platinum Pfx DNA Polymerase Invitrogen 11708013
Polyethylenimine Polysciences Inc 23966-2
Polyvinylpyrrolidone MilliporeSigma P5288
Prime-It II Random Primer Labeling Kit Agilent Technologies 300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25
MilliporeSigma Custom Primer
Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Proteinase K Solution Invitrogen 25530-049
Restriction Enzymes New England Biolabs Various
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15632011
Serological Pipettes Thermo Fisher Scientific 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-10
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate MilliporeSigma C8532
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203L
Thermal Cycler Eppendorf 6321000515
Tissue-culture Treated 6-well Plate Corning 353046
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-5
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28955809
UltraPure Buffer-Saturated Phenol Invitrogen 15513-047
UV Crosslinker Spectroline XLE-1000 Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2.
Zeta-Probe Membrane Bio-Rad 162-0165

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References

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जीव विज्ञान अंक १३६ Adeno-एसोसिएटेड वायरस (AAV) विधानसभा सक्रिय प्रोटीन (AAP) पार पूरकता मात्रात्मक डॉट दाग परख वायरल titer जीन थेरेपी
AAV अनुमापन और Adeno के कार्यात्मक आकलन के लिए इसके उपयोग के लिए एक मात्रात्मक डॉट दाग परख-संबंधित वायरस विधानसभा-सक्रिय प्रोटीन
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Powers, J. M., Chang, X. L., Song,More

Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins. J. Vis. Exp. (136), e56766, doi:10.3791/56766 (2018).

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