Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En kvantitativ Dot Blot analysen for AAV titrering og bruk for funksjonell vurdering av Adeno-assosiert Virus montering-aktivere proteiner

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56766
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

Summary

Dette manuskriptet detaljer en enkel prikk blot analysen for kvantifisering av adeno-assosiert virus (AAV) titers og dens anvendelse å studere rollen til montering-aktivere proteiner (AAPs), en roman klasse av ikke-strukturell virale proteiner i alle AAV serotyper, fremme montering av capsids fra beslektet og heterologous AAV serotyper.

Abstract

Mens adeno-assosiert virus (AAV) er allment akseptert som en attraktiv vektor for genterapi, fungerer den også som en modell virus for å forstå virus biologi. I sistnevnte respekt, har den nylige oppdagelsen av en ikke-strukturell AAV protein, kalt montering-aktivere protein (AAP), kaste nytt lys over prosessene i nasjonalforsamling viral kapsid VP proteiner i en kapsid. Selv om mange AAV serotyper krever AAP for samlingen, vi har nylig rapportert at AAV4, 5, og 11 er unntak til denne regelen. Videre har vi vist at AAPs og samlet capsids av forskjellige serotyper lokalisere til ulike subcellular rom. Dette uventet heterogenitet i biologiske egenskaper og funksjonelle rollene som AAPs blant annet AAV serotyper understreker viktigheten av studier på AAPs avledet fra mangfoldig serotyper. Dette manuskriptet detaljer en enkel prikk blot analysen for AAV kvantifisering og dens anvendelse å vurdere AAP avhengighet og serotype spesifisitet i kapsid samling. For å demonstrere nytten av denne dot blot analysen, satt vi ut for å karakterisere kapsid montering og AAP avhengighet av slange AAV, en tidligere uncharacterized reptil AAV, samt AAV5 og AAV9, som har tidligere vist AAP uavhengig og AAP-avhengig serotyper, henholdsvis. Analysen avdekket at slange AAV kapsid montering krever slange AAP og kan ikke forfremmes av AAPs fra AAV5 og AAV9. Analysen viste at, i motsetning til mange av de vanlige serotype AAPs som fremmer heterologous kapsid montering av kryss-complementation, slange AAP ikke fremme montering av AAV9 capsids. I tillegg viser vi at valget av nuclease påvirker betydelig avlesning av dot blot analysen, og dermed velge en optimal enzymet er avgjørende for vellykket vurdering av AAV titers.

Introduction

Adeno-assosiert virus (AAV) er en liten, ikke-innhyllet, enkelt-strandet DNA virus med et genom omtrent 4,7 kilobases (kb). AAV genomet inneholder åpne-lesing rammer (ORFs) for rep og cap gener. I 2010, ble en tidligere uidentifiserte nonstructural protein kodet av en 1 ramme-forskjøvet ORF innen AAV2 cap genet oppdaget av Sonntag et al. og funnet for å spille en avgjørende rolle i forsamlingen AAV2 kapsid VP monomer proteiner virus kapsid1. Denne roman protein kalles montering-aktivere protein (AAP) etter rollen den spiller i å fremme kapsid montering1.

ORFs for AAP har vært identifisert bioinformatically i genomer av alle parvoviruses i slekten Dependoparvovirus, men ikke i genomer virus av ulike genera parvovirus familie1,2. Funksjonell studier av dette roman protein var utgangspunktet fokusert på the AAP fra prototypen AAV2 (AAP2), som har etablert den viktige rollen AAP2 i målretting umontert VP proteiner til kjerne for akkumulering og formasjon i fullt samlet capsids1,3,4. Manglende evne til AAV2-capsids å montere i fravær av AAP uttrykk har vært uavhengig bekreftet av flere grupper, inkludert vår1,2,3,4,5 . Studier på AAV serotyper 1, 8 og 9 bekreftet den kritiske rollen AAPs i kapsid montering, som VP3 monomer proteiner av AAV1, 8 og 9 klarte ikke å danne en fullstendig montert kapsid i fravær av co uttrykk for AAP2.

Nylig gjennom tilnærminger som omfatter bruk av kvantitative dot blot analyser, vi undersøkt muligheten for AAV1 å 12 VP3 monomerer å samle til capsids i fravær av AAP uttrykk og evne til AAP1 12 å fremme montering av VP3 monomerer fra heterologous serotyper. Denne studien har avdekket at AAV4, 5 og 11 VP3 monomerer kan sette sammen uten AAP. I tillegg ble det funnet at åtte av de tolv AAP serotypene vi (dvs.alle bortsett fra AAP4, 5, 11 og 12) vises en bred evne til å støtte kapsid montering av heterologous AAV serotype capsids, mens AAP4, 5, 11 og 12 vises en vesentlig begrensede evne i denne forbindelse6. Disse fire serotyper er phylogenetically fjernt fra de andre AAP serotyper2,3. Videre har studier avdekket betydelig heterogene i subcellular lokaliseringer forskjellige AAPs6. Videre studier har antydet at tett tilknytningen av AAP samlet capsids og kjerne, kjennetegnet av AAV2 kapsid montering, ikke nødvendigvis bli utvidet til andre serotyper inkludert AAV5, 8 og 9, som viser nucleolar utelukkelse av samlet capsids6. Dermed er opplysningene du får studiet av noen bestemt serotype AAP ikke grovt gjelder alle AAP biologi. Slike forvirrende natur AAP biologi understreker behovet for å undersøke rolle og funksjon av hver AAP fra både kanoniske og ikke-kanoniske AAV serotyper.

Biologiske rollen AAP i kapsid samling kan vurderes ved å bestemme de ferdige versjonen AAV viral partikkel titers produsert i menneskelige embryonale nyre (HEK) 293 celler, mest brukte cellen linjen for AAV vektor produksjon, med eller uten AAP protein uttrykk. Standardmetodene for AAV kvantifisering er kvantitative PCR (qPCR)-baserte analyser7,8 og kvantitative dot blot-basert søk9. Andre metoder for AAV viral partikkel kvantifisering som enzym knyttet immunosorbent analysen10,11 eller optisk densitet måler12 er ikke ideelt for prøver fra mange forskjellige AAV serotyper eller vareprøver forurenset med urenheter (rå lysates eller kultur medier), som ofte eksemplene brukes til AAV forskning. Foreløpig er qPCR mest brukt for AAV kvantifisering; Imidlertid er det nødvendig å erkjenne potensielle advarsler til qPCR-baserte analysen, som analysen kan føre til systemisk feil og betydelig titer variasjoner13,14. PCR-baserte analyser påvirkes av en rekke potensielt confounding faktorer, slik som tilstedeværelsen av covalently lukket terminal hårnåler i PCR-maler som hemmer forsterkning13. Selv en erfaren person kan presentere muligheter forvirrende faktorer inn i en qPCR-basert analysen uvitende13. Kvantitativ dot blot analyser er en klassisk molekylærbiologi teknikk som ikke involverer genomet forsterkning og bruker en mye enklere prinsippet med minimal risiko for feil i forhold til qPCR-baserte analyser. Metoden er mindre teknisk utfordrende; Derfor er analyseresultatene rimelig reproduserbar selv av uerfarne individer.

I denne rapporten beskriver vi metodologiske detaljene for en kvantitativ dot blot analysen vi rutinemessig bruk for AAV vektor kvantifisering og gi et eksempel på hvordan bruke analysen for å studere montering-fremme rollen AAPs felles serotyper (AAV5 og AAV9) og tidligere uncharacterized AAP slange AAV14. I naturen, AAV VP proteiner og AAP proteiner er uttrykt i cis fra ett gen (dvs., VP-AAP cis-complementation), mens i analysen beskrevet her, VP og AAP proteiner leveres i trans fra to separate plasmider (dvs., VP-AAP trans-complementation). Siden hver VP eller AAP protein fra forskjellige serotyper kan uttrykkes fra hver uavhengige plasmider, blir det mulig å teste heterologous VP-AAP kombinasjoner for kapsid montering (dvs., VP-AAP kors-complementation). Kort, AAV VP3 fra ulike serotyper er uttrykt i HEK 293 celler ved plasmider DNA transfection pakke en AAV vektor genomet i tilstedeværelse eller fravær av beslektet serotype AAP, eller i nærvær av en heterologous serotype AAP. Etter produksjon, kultur medier og celle lysates er utsatt for en prikk blot analysen å kvantifisere viral genomet kapsid skallet. Det første trinnet til dot blot analysen er å behandle prøver med en nuclease å fjerne skadelige plasmider DNAs og emballert AAV genomer i prøvene. Gjør det ville øke bakgrunnen signalene spesielt når urenset eksempler er assayed. Dette etterfølges av en protease behandling for å bryte viral capsids og slipp nuclease-resistente virus genomer i utvalg løsninger. Neste, viral genomer denaturert, strøket på en membran og hybridiserte med en viral genomet-spesifikke DNA sonde for kvantifisering. Eksempel analysen rapporterte her, viser vi at slange AAV VP3 krever slange AAP for kapsid montering og at slange AAP ikke fremme montering av AAV9 capsids i motsetning til mange av AAPs fra AAP-avhengige serotyper som kan også fremme nasjonalforsamling heterologous serotype capsids. Til slutt, vi rapporterer en viktig påminnelse til qPCR eller dot blot-baserte AAV kvantifisering søk at valget av nuclease betydelig innvirkning på analyseresultatene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Oppskrifter for løsninger og buffere nødvendig for denne protokollen er gitt i tabell 1. Protokollen beskrevet nedenfor er VP-AAP kors-complementation dot blot analysen å studere roller av AAP proteinene i kapsid montering. Metoden for mer generell kvantitative dot blot analysen for renset AAV vektor titrering er forklart i delen Representant resultater .

1. bygging av VP3, AAP og AAV2 Rep uttrykke plasmider

  1. Bygging av pCMV-AAVx-VP3 (x = serotyper)
    1. PCR-forsterke det hele VP3 ORF (1.6 kb) bruker en Hi-Fi-DNA polymerase og følgende primer paret: VP3 fremover, CTAA-RE1-CACC-N25 (de første 25 nukleotider i VP3 ORF); VP3 bakover, TCTT-RE2-N25 (de siste 25 nukleotider i VP3 ORF).
      Merk: RE1 og RE2 er nettsteder for begrensning enzymer (REs) for kloning. CTAA og TCTT er terminal 5' og 3 tetranucleotides lagt til rette begrensning enzym fordøyelsen nær slutten av double-strandet DNA. CACC er en Kozak konsensus sekvens.
    2. Klone RE-digested PCR produktene mellom de tilhørende RE områder i et pattedyr uttrykk vektoren som bruker menneskelige cytomegalovirus umiddelbart-tidlig (CMV-IE) enhancer-arrangøren for høyt nivå uttrykk.
      Merk: For molekylær kloning, fordøye 5 µg av ryggraden plasmider DNA med en restriction enzyme(s) i en konsentrasjon av 4 U/µg DNA 1t for en optimal temperatur. For PCR fragmenter, forhøye enhetene av enzymer brukes (f.eks10 U/µg 1.6 kb VP3 ORF PCR produktet) og lengre inkubasjon tid (f.eks4 h) skyldes en økning av antall begrensning enzym anerkjennelse områder per enheten lengde. Nyttig informasjon i molekylærbiologi enzymer og kloning prosedyrer inkludert bakteriell transformasjon kan finnes andre steder15,16,17.
  2. Bygging av pCMV-flagg-AAPx (x = serotyper)
    1. PCR-forsterke det hele AAP ORF (0,6 kb) unntatt den første aminosyren bruker en Hi-Fi-DNA polymerase og følgende primer paret: AAP fremover, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (25 nukleotider fra 4 nucleotide i den AAP ORF); AAP bakover, TCTT-RE2-N25 (de siste 25 nukleotider i AAP ORF).
      Merk: GACTACAAGGACGACGATGACAAA koder et flagg-kode, som har blitt vist å ha noen skadelige effekter4,5 , men kan utelates hvis unødvendig.
    2. Klone RE-digested PCR produktene mellom tilsvarende områder av en pattedyr uttrykk vektor med CMV-IE enhancer-arrangøren15,16,17.
  3. Bygging av pHLP-Rep
    1. Digest 5 µg av pAAV-RC2 plasmider (7.3 kb) med 20 enheter hver av Xho jeg og Xcm jeg, og rense DNA ved hjelp av en kommersiell DNA rensing kit eller fenol-kloroform utvinning.
      Merk: Fjerning av 1,8 kb Xho jeg-Xcm jeg fragment fra 7.3 kb pAAV-RC2 plasmider resultatene tap av kapsid VP protein uttrykk samtidig bevare Rep protein uttrykket.
    2. Sløv DNA avsluttes med 6 enheter av T4 DNA Polymerase, agarose gel-rense 5,5 kb DNA fragmentet, og selv ligate renset fragmentet bruker 50-100 ng av DNA og 400 enheter av T4 DNA ligase i henhold til produsentens anbefaling15.
    3. Følger standard bakteriell transformasjon fremgangsmåten i trinn 1.1.2 Merk.
  4. Kontroller plasmider konstruerer begrensning enzym fordøyelsen og sekvensering15,18.
  5. Utføre plasmider minipreps eller maxipreps ved hjelp av kommersielt tilgjengelig kits for å få en tilstrekkelig mengde plasmider DNA for nedstrøms AAV produksjon eksperimenter.

2. produksjon av AAV i HEK 293 cellene ved plasmider DNA Transfection (Cross-complementation analysen)

  1. Kultur HEK 293 celler i Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM)-høy glukose (4.5 g/L) supplert med 10% fosterets bovin serum (FBS), 1% Penicillin & Streptomycin Mix, og 1 mM L-glutamin, i en 37 ° C inkubator med 5% karbondioksid (CO2).
    Merk: AAV titers variere betydelig avhengig av HEK 293 celler.
    Advarsel: Selv om AAV kan håndteres i henhold til nivå 1 (BSL1) inneslutning, BSL2 forvaring anbefales for HEK 293 cell-arbeid.
  2. På dag -1 (24 timer før transfection)plate 6-7 x 105 HEK 293 celler/godt i 2 mL av komplett mediet beskrevet i trinn 2.1 i en 6-og plate(s). Dette oppnår vanligvis ~ 90% confluency neste dag.
  3. Dag 0: Transfection
    1. Forberedelse til DNA transfection
      1. Kontroller at cellene har nådd ~ 90% confluency.
      2. Varm opp DMEM supplert med 1% Penicillin & Streptomycin Mix og 1 mM L-glutamin men uten 10% FBS (dvs., serum-free middels) i et 37 ° C vannbad.
      3. La polyethylenimine (PEI) løsningen til romtemperatur.
    2. Utarbeidelse av plasmider DNA blanding
      1. Bland plasmider i 96 µL fosfat bufret saltoppløsning (PBS) uten CaCl2 eller MgCl2 i bakteriefri 1.5 mL microcentrifuge rør som vist i tabell 2. Den totale mengden DNA er 2 µg/godt.
        Merk: Volumene plasmider DNA løsning kan bli ignorert hvis de er nominell. Volumjustering anbefales hvis det totale volumet av plasmider DNA løsninger er ≥10 µL.
    3. PEI transfection
      1. Legge 4 µL PEI løsning (1 mg/mL) til PBS-plasmider DNA mix (forberedt som ovenfor). Det siste bindet er ca 100 µL (5% volum av kultur medium). Vortex rør kort og Inkuber DNA: PEI blandingen i 15 min ved romtemperatur.
      2. Mens du venter på 15 min incubation å fullføre, erstatte kultur medium med prewarmed serum-free-medium som beskrevet i trinn 2.3.1.2.
      3. En gang den 15 minutter inkubasjonstiden for DNA: PEI blanding er fullført, kort spin rør med en microcentrifuge samle væske på bunnen av rør og legg blandingen DNA: PEI dropwise til kultur medium i hver brønn av HEK 293 kultur plate. Forsiktig agitere platene og returnere dem til en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
      4. Opprettholde cellene i dette hva mediet til harvest på dag 5 (ingen medium endring er nødvendig).
  4. På dag 1 og dag 2, observere celler transfekterte med pCMV-GFP plasmider under en invertert fluorescens mikroskop å vurdere hva effektivitet.
    Merk: For fluorescens mikroskopi, her er en 10 X / 0,25 numeriske blender-målet i kombinasjon med en 10 × okularet ble brukt, og 450-490 nm eksitasjon båndpassfilter og 515-565 nm Båndpassdesign utslipp filter var ansatt. Det over tilstanden gir vanligvis mer enn 70% transfection effektivitet. Cellene kan utvise morfologiske endringer (f.eks celler har blitt slim) på grunn av serum-free tilstanden.
  5. På dager 3 til 5, fortsette å kultur transfekterte cellene i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
  6. På dag 5, samler du både celler og virus inneholder medium i 15 mL polypropylen konisk rør pipettering opp og ned eller ved skraping med en celle skraper.
  7. Lagre prøvene ved-80 ° C før bruk.

3. dot Blot analysen for AAV kvantifisering

  1. Gjenoppretting av virus partikler
    1. Raskt tine frosne rør i et 37 ° C vannbad. Vortex rør godt i 1 min å maksimere utvinningen av AAV fra celler.
    2. Pellets celle rusk av sentrifugering 3700 x g ved 4 ° C i 10 min. Ta 200 µL av nedbryting fra hver rør og overføre den til en merket microcentrifuge rør med skrukork for dot blot analysen.
      Merk: Aliquot gjenstående nedbryting i microcentrifuge rør og lagre dem frosne-80 ° c for fremtidig bruk. Her polypropylen microcentrifuge rør festet med skrulokk og en O-ring ble brukt. Tett forsegling er nødvendig for å hindre søl av AAV og fenol-kloroform.
  2. Behandling med Serratia marcescens endonuclease
    1. Forberede blanding A og blanding B reagenser (tabell 3). Legge til 10 µL av blanding og 10 µL av blanding B i hver retning. Vortex rør for 5 s, kort spin rør for å samle væske til bunnen av rør og ruge rørene på 37 ° C minst 1t.
      Merk: Blanding A inneholder NaOH og optimaliserer pH for behandling med S. marcescens endonuclease. Mix B tilskudd magnesium. Konsentrasjonen av S. marcescens endonuclease i kommersielt tilgjengelig enzym aksjer kan variere. Volumet av S. marcescens endonuclease må justeres deretter for å gjøre 200 U/mL etter blanding A og blanding B i rør i trinn 3.2.1.
      Merk: Lengre inkubasjon tid, opp til 4 h, kan redusere bakgrunnen signaler.
    2. På slutten av inkubering, kort spin rør med en Borstemmaskin sentrifuge å samle kondens og løsning fra toppen og siden av rørene.
      Merk: Protokollen kan pauses her. Eksemplene kan lagres frosset ved 20 ° C eller-80 ° C.
  3. Proteinasen K behandling
    1. Forberede blanding C reagensen (tabell 3). Legg til 180 µL blanding c i hver retning. Vortex rør for 5 s, kort spin rør og Inkuber rør ved 55 ° C i 1 time.
      Merk: EDTA i blanding C reagensen chelates gratis magnesium ioner og deaktiverer S. marcescens endonuclease.
    2. På slutten av inkubering, tillate prøver å nå romtemperatur og kort spin rør med en Borstemmaskin sentrifuge å samle kondens og løsning fra toppen og siden av rørene.
      Merk: Protokollen kan pauses her. Eksemplene kan lagres frosset ved 20 ° C eller-80 ° C. For å gjenoppta protokollen, ruge rør ved 55 ° C i 5 til 10 min å oppløse SDS krystaller finnes i bufferen helt.
  4. Fenol-kloroform utvinning og etanol nedbør
    1. Legge til 200 µL av fenol-kloroform prøver og vortex dem i 1 Spin eksemplene i en microcentrifuge på ≥16, 100 x g i ≥5 min ved romtemperatur.
      FORSIKTIG: Fenol-kloroform skal håndteres i kjemisk avtrekksvifte med riktig personlig verneutstyr (PVU; dvsnitrilhansker, briller eller ansiktsskjerm og Laboratoriefrakk med lange ermer).
    2. Overføre 320 µL av vandig laget (160 µL to ganger med en P200 pipette) til en ny standard microcentrifuge tube (80% av vandig væske volum).
      Merk: Det er viktig å ta samme volum av vandig løsning mellom prøvene, ellers analysen mister kvantitative nøyaktighet.
    3. Forberede blanding D reagensen (tabell 3). Legg 833 µL av blanding D i hver retning. Vortex rør for 5 s, og Inkuber rør ved-80 ° C i ≥20 min.
      Merk: Blanding D er en blanding av etanol og natrium acetate glykogen til praktisk etanol nedbør av DNA. Eksempler kan lagres på-80 ° C på dette trinnet og protokollen kan fortsette senere.
    4. Sentrifuger prøver med en microcentrifuge på ≥16, 100 x g ved 4 ° C i ≥15 min. hell av nedbryting og blot gang på et rent papirhåndkle. Ca 500 µL av 70% etanol inn hver tube, vortex rør for 5 s og sentrifuger rør med en Borstemmaskin microcentrifuge på ≥16, 100 x g på 4 ° C i ≥5 min.
    5. Hell av nedbryting og blot gang på et rent papirhåndkle. Tørr pellets på 65 ° C; pellets kan tørkes helt.
      Merk: Ikke bruk en pipette fjerne overflødig etanol som gjenstår etter blotting rørene. Pellets kan også tørkes ved romtemperatur over natten. Protokollen kan pauses her og tørket DNA pellets kan lagres ved romtemperatur i flere dager med rør lokket stengt.
  5. Rørets viral DNA TE buffer
    1. Oppløse DNA pellets i 120 µL hver TE bufferen ved å riste hver rør i 30 minutter til 1 time i rom temperatur.
  6. Dot blot
    1. Utarbeidelse av plasmider DNA standarder
      1. Fortynne AAV vektor genomet plasmider DNA til 10 ng/µL i vann eller Tris-HCl buffer (10 mM, pH 8.0). Ta 25 µL av denne fortynning og fordøye med et passende begrensning enzym 1t til linearize plasmider DNA, i en reaksjon mengde 50 µL.
        Merk: Vi gjør et duplisert sett fordøyelsen (se trinn 3.6.4.1). Aktuelle enzymet bør være en som kutter plasmider DNA utenfor regionen dot blot probe-binding. For bekvemmelighet, utvannet plasmider DNA kan aliquoted (25 µL/rør) og lagret frosset ved 20 ° C for fremtidig bruk. Fordøye plasmider DNA mens rørene skjelver i trinn 3.5.1. Ikke fordøye plasmider DNA standard over.
      2. Legg 450 µL eller TE til røret som inneholder den fordøyde plasmider DNA standard og bland godt. Overføre 70 µL av denne blandingen til en ny 1,5 mL microcentrifuge rør med 1,330 µL eller TE å lage en utvannet plasmider standard (25 pg/µL).
      3. Følg Tabell 4 for å opprette et sett med todelt føljetong fortynninger (600 µL/rør). Bland fortynninger godt av vortexing for 5 s.
    2. Denaturing standarder og viral DNA-prøver
      1. Legge til 600 µL av 2 x alkalisk løsning hver standard fortynning. Bland godt av vortexing for 5 til 10 s. Incubate ved romtemperatur for 10 min.
      2. Legge til 120 µL av 2 x alkalisk løsning hver viral DNA-prøve. Bland godt av vortexing for 5 til 10 s. Incubate ved romtemperatur for 10 min.
    3. Definere dot blot apparatet
      1. Med saks, kuttet en blotting (f.eks, zeta-sonden) membran til en passende størrelse av prøver og standarder. Nyt membranen med vann i 10 min før du plasserer den på en prikk blot apparater. Dekk ubrukte brønner på membran apparatet.
        Merk: Håndtere ren pinsett membranen. For å dekke tom brønner, kan lys blå beskyttelse arket som følger med membranen brukes. Tillat ikke membranen tørke før bindende prøver og standarder. For mer informasjon på samling og bruk av apparater, henvises til brukeren manuell19.
      2. Tilsett vann til brønnene som prøver lastes. Bruke vakuum og trekker vann gjennom brønnene å se etter feil og retest når fast. Trekk til skruene mens du bruker vakuum å sikre tett forsegling.
        Merk: Ufullstendig tetting kan forårsake eksempel lekkasje mellom brønnene.
      3. Når vannet er helt trukket, slipp vakuum helt (dvs., vakuum manifold skal være åpen for lufttrykk).
    4. Lasting standarder og prøver å dot blot apparatet
      1. Bruk 400 µL av hver utvannet plasmider DNA standard hver brønn og kjøre fire kjørefelt og standard fortynninger. Bruk to separat dele standard sammendraget og laste hver i duplikat. Bruke 200 µL/godt av hver viral DNA-prøve.
        Merk: Bruker den gjenværende ~ 40 µL av denaturert prøver, kan fortynnede prøver forberedt (f.eks10 ganger fortynnede prøver ved 20 µL av prøve pluss 180 µL av 1 x alkalisk løsning) og uten om nødvendig.
      2. Bruke skånsom vakuum å trekke DNA løsninger gjennom brønnen.
        Merk: Vakuum press må justeres ved delvis åpne en tre-veis ventil slik at det tomrommet trykket brukes til punkt blot apparater samt atmosfæren (dvs.med stopcock armene på en ca 45 ° vinkel hvor det gjør en høyere suge støy).
      3. Når alle brønnene har tømt, slipp vakuum ved å justere treveis ventilen. Legge til 400 µL av 1 x alkalisk løsning i hver brønn som inneholdt standarder og eksempler. Vent 5 min før bruke vakuum å tømme brønnene.
      4. Bruk nytt vakuum på samme måte (se trinn 3.6.4.2).
      5. Demontere dot blot apparatet under vakuum, fjerne membranen og skyll den med 2 x SSC. Plasser membranen på et rent papirhåndkle med DNA-bundet siden vendt opp for å fjerne overflødig 2 x SSC.
      6. UV-krysskobling blotted DNA til membranen med en passende UV crosslinker; membranen er nå klar for hybridisering.
        Merk: Våt membraner kan brukes for UV crosslinking. De tørket, UV-krysskoblet membraner kan lagres ved romtemperatur. Ytterligere informasjon kan finnes i Tabell for materiale.
  7. Hybridisering og vask
    1. Varm opp hybridisering bufferen i et vannbad 65 ° C.
    2. Enzymatisk merke en DNA sonde med radioaktive α -32P dCTP og rense den ved hjelp av kommersielt tilgjengelig kits i henhold til produsentens anbefaling.
      Merk: Vi bruker en sonde 0,5-2.0 kb i lengde fra en enhancer-arrangøren region eller en protein-koding sekvens er viral genomet. Selv om denne protokollen benytter 32P-merket radioaktivt sonder for signalgjenkjenning, ikke radioaktiv chemiluminescent eller fluorescerende sonder kan også brukes (se drøftingen ).
    3. Plasser membranen i en hybridisering flaske med DNA-bundet side opp, skyll membranen med 5 mL prewarmed hybridisering Buffer, og forkaste bufferen. Deretter legger 10 mL prewarmed hybridisering bufferen og plassere flasken i en roterende hybridisering ovn satt på 65 ° C. Rotere i ≥5 min.
    4. Varme-denature 20 µL 10 mg/mL skåret sild eller laks sperm DNA løsning og 32P-merket sonden (≥107 cpm) i 5 minutter ved å plassere rør på en varme blokk sett på 100 ° C. Deretter snapin-kjøl dem på is ≥2 min, spin kort, og holde på is til bruk.
      Advarsel: For radioaktivt DNA sonder, 1,5 mL rør med skrukork og O-ring må brukes.
    5. Raskt legge denaturert sperm DNA og radioaktivt sonden å hybridisering bufferen i hybridization flasken og riste flasken for 10 s å blande. Returnere flasken til 65 ° C ovnen og ruge flasken med rotasjon til 65 ° C ≥4 h.
    6. Når hybridisering er fullført, stoppe rotasjonen, fjerne hybridisering flasken og og hell radioaktivt sonde løsningen i en 50 mL konisk rør med en lekkasjesikker plug segl cap. Lagre sonden i en egnet beholder i kjøleskap utpekt for radioaktivt materiale.
      Merk: Brukte hybridisering Buffer med en sonde som er lagret på 4 ° C kan gjenbrukes minst 5 ganger ved å plassere 50 mL konisk røret med en lekkasjesikker plug segl cap som inneholder hybridisering Buffer i et vannbad 100 ° C i 5 min.
    7. Vask membranen med vaskebuffer oppvarmet til 65 ° C. Legge til 20-30 mL vaskebuffer hybridisering flasken og rotere for 5 min. Gjenta dette vask 2 ganger.
      Merk: Måle radioaktivitet vask løsninger og ta det eventuelt av lokale institute.
    8. Mens du vasker membranen, plasserer du en fosfor imaging skjermen på viskelær bildet i 5 min.
    9. Etter tredje vask, fjerne membranen fra hybridisering flasken, fjerne overflødig bufferen på membran med tørkepapir og plassere membranen i en klar plast papir holder. Sjekk radioaktivt signaler på membranen bruker en Geiger-teller. Utsettes for slettet fosfor tenkelig membranen i 10 min å avhengig av signal intensiteten.
    10. Skanne skjermen med et fosfor bilde skanning systemet og skaffe dataene på signalet intensiteten på hvert punkt.
  8. Dataanalyse
    1. Tegne en standard kurve ved hjelp av regneark og data analyseprogramvare (f.eksExcel).
      Merk: Logg-Logg lineær regresjon ble brukt for en standard kurve.
    2. Bestemme nanogram tilsvarende (ng-eq) for hver av viral DNA-prøvene av interpolering. Ng-eq er mengden av plasmider DNA brukes til å tegne en standardkurven som tilsvarer antallet viral DNA molekyler. Når lengden på plasmider DNA er 8000 bp, 1 ng-eq single-strandet AAV viral DNA tilsvarer 2.275 x 108 partikler.
      Merk: Ng-eq kan konverteres til antall virus partikler av følgende formler:
      Equation 1
      Equation 2
      Antall AAV partikler uttrykkes konvensjonelt som "vg" (vektor genomer) eller "DRP" (DNase jeg-resistente partikler).
    3. Beregne AAV konsentrasjonen av start. Fordi blotted viral DNA representerer 66,7% Equation 3 av viral DNA i Start materialet, 1 ng-eq tilsvarer 1,7 x 109 partikler/mL Equation 4 .
      Merk: Denne korreksjonen er ikke nødvendig hvis alle virus-DNA i utgangsmaterialet er strøket på en membran uten tap (se figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En representant resultatet av kvantitative dot blots for kvantifisering av renset AAV vektor aksjer produsert i stor skala er vist i figur 1. Med denne dot blot analysen identifiserte titer av en dobbel-strandet AAV2G9-CMV-GFP vektor aksje. Vektoren var renset av to runder av cesium chloride (CsCl) tetthet-gradert ultracentrifugation etterfulgt av dialyse som beskrevet tidligere20. Generelt for renset AAV vektor aksjer, er tre forskjellige mengder hver AAV vektor aksje (f.eks0,3 µL, 0.1 µL og 0,03 µL) utsatt for dot blot prosedyren beskrevet ovenfor i duplikat med en endring. DNase I enzym A brukes i stedet for S. marcescens endonuclease i trinn 3.2, og en kommersielt tilgjengelig utstyr og rense virus-DNA brukes i trinn 3.4 (se Tabell for materiale). I eksemplet i figur 1, var signalet intensitetsverdiene (vilkårlig enhet) fra hver plasmider DNA standard (figur 1A) plottet mot kjente DNA mengdene tegne en standardkurve (figur 1B), viser en korrelasjon koeffisient av 0.998. Bruker denne standardkurve, ble det bestemt av interpolering at 0,3, 0,1 og 0,03 µL AAV2G9 vektoren dele viste 1.487 og 1.522 ng-eq (0,3 µL), 0.487 og 0.507 ng-eq (0,1 µL) og 0.158 og 0.171 ng-eq (0,03 µL). Dette ga følgende seks verdier: 4.957, 5.073, 4.870, 5.070, 5.267 og 5.700 ng-eq/µL for denne bestemte AAV2G9 vektor lager, fører til et gjennomsnitt på 5,16 ± 0,27 ng-eq/µL (gjennomsnittlig ± SD). Siden lengden på plasmider brukes som standard (pEMBL-CMV-GFP) er 5,848 bp, titer av denne AAV2G9 vektor ble identifisert som 8.0 x 1011 vg/mL ifølge formel 2 i trinn 3.8.2. Denne analysen gjentas minst to ganger for å avgjøre de endelige titers AAV vektor aksjer.

Et representativt resultat av kors-complementation analyser å vurdere AAP avhengigheten i VP3 kapsid montering og muligheten for AAPs å montere VP3 proteiner av heterologous opprinnelse vises i figur 2. In vitro studier av AAV ofte krever ikke virus rensing å gjøre konklusjoner, og eksperimenter ved hjelp av urenset virus preparater som råolje cellen lysates og virus inneholder kultur medier er tilstrekkelig til å gi meningsfulle resultater. I dette eksperimentet, ble AAV viral partikkel produksjon vurdert fra alle mulige AAV VP3-AAP kombinasjoner mellom AAV5, AAV9 og slange AAV inkludert VP3-ingen AAP kombinasjoner av en kvantitativ dot blot analysen. Prøver innhentet i et duplisert et eksperiment ble strøket på 1 x og 10 x fortynninger (satte og angi B i figur 2A, henholdsvis). I diagrammet vises i figur 2B oppsummerer kvantitativ analyse av prikker. Resultatene viser at: (1) AAV5VP3 samler uavhengig av om AAP var forutsatt i trans, (2) AAP5 og AAP9 kan fremme AAV9VP3 kapsid montering selv om AAP5 fungerer mindre enn AAP9, (3) verken AAP5 eller AAP9 har en samling fremme aktivitet Snake AAV VP3, og (4) slange AAP bare fremmer montering av slange AAV VP3. (1) og (2) er i tråd med tidligere observasjoner6, men unikt bestemt AAV VP3-AAP samhandling i slange AAV er en roman funn i dette eksperimentet. En svakhet ved kryss-complementation analysen basert på kvantitativ dot blot er at kontrollen negative alltid viser nevneverdig nivåer av bakgrunnen signaler som ikke kan helt eliminert. Derfor dot blot analysen selv kan ikke utelukke at kapsid samler til et nivå under følsomheten til analysen. I denne forbindelse, bør det bemerkes at vil generere negative kontrollene, en tilstand som brukes under hvilke AAV viral genomer eksponentielt Repliker i fravær av kapsid VP3 protein. Slike negative kontroller kan genereres ved transfecting HEK 293 celler med pAAV-Reporter, pHLP-Rep og pHelper (tabell 2), og brukes til å redusere falske positiver.

DNase jeg har vært mye brukt som en nuclease i dot blot og qPCR-baserte analyser for AAV kvantifisering fjerne gjenværende plasmider DNAs og emballert viral genomer som har forurenset AAV forberedelser. Disse forurensningene ville ellers føre til en overvurdering av titers; Derfor er nuclease fordøyelsen et svært viktig skritt for nøyaktig kvantifisere viral genomet titers. DNase jeg enzymer er tilgjengelig fra forskjellige produsenter og kommersielle leverandører; men betydningen av utvalget av DNase I AAV kvantifisering synes å ha vært underappreciated. For å undersøke hvordan valg av nuclease kan påvirke utfallet av dot blot analysen, ble i følgende tre nucleases sammenlignet for sin evne til å fjerne bakgrunnen signaler fra AAV vektor inneholder kultur media forberedt som beskrevet ovenfor i trinn 2 og 3: DNase jeg enzym A, DNase I enzym B og S. marcescens endonuclease (Tabell for materiale). Publiserte studier har brukt den tidligere to DNase jeg enzymer,13,,21,,22,,23,,24 og vi har brukt S. marcescens endonuclease i forrige og gjeldende studier. Til vår overraskelse, ble det identifisert at DNase I enzym A ikke er et passende valg for dot blot analysen bruke virus som inneholder mediet i ulike forhold testet, noe som resulterer i høye signaler fra kontrollen negative, mens DNase I enzym B og S. marcescens endonuclease effektivt redusert bakgrunn signaler med DNase I enzym B blir ~ 2-fold mer effektivt enn S. marcescens endonuclease (figur 3A, B). DNase I enzym C ble også funnet for å være svært effektiv for å redusere bakgrunnen signaler (data ikke vist). Disse dataene viser at det er betydelige forskjeller i enzym aktiviteter blant kommersielt tilgjengelig nucleases når enzym reaksjonene utføres i urenset AAV forberedelser selv om nuclease fordøyelsen skal gjelde når et lite antall renset viral forutbetalt behandles under en optimalisert tilstand. Dermed markere disse dataene betydningen av riktig valg av nuclease i analysen når urenset AAV forberedelser gjennomgår en kvantitativ dot blot eller qPCR analysen.

Figure 1
Figur 1: en representant dot blot analyse for å fastslå titer av en CsCl-renset AAV vektor. (A) Double-strandet AAV2G9-CMV-GFP vektor ble produsert i HEK 293 celler av en standard adenovirus uten tre plasmider transfection metoden i stor skala, og renset ved to rundene CsCl gradient ultracentrifugation, etterfulgt av dialyse. 0,3, 0,1 og 0,03 µL av renset AAV vektor aksjer (uten på kolonnen lengst til høyre) ble utsatt for kvantitative dot blot analysen i duplikat to sett med duplisert plasmider DNA standarder (Kjønnssykdommer). Blot ble hybridiserte med en 32P-merket GFP sonde (0.77 kb), og bildet ble oppnådd ved hjelp av en fosfor bilde skanning systemet. (B) en standardkurve viser forholdet mellom kjent plasmider DNA mengder (ng-eq, x-aksen) og dot intensiteter (vilkårlig enhet (AU), y-aksen). Tallene på y-aksen ble innhentet med fosfor bildet skanning systemet. R angir Pearsons korrelasjonskoeffisient. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: AAV VP3-AAP kors-complementation dot blot analysen. Double-strandet AAV-CMV-GFP vektor partikkel produksjon ble testet for VP3 proteiner fra AAV5, AAV9 og slange AAV i tilstedeværelse eller fravær av deres beslektet AAPs eller i nærvær av AAPs av heterologous opprinnelse. (A) analysen ble utført i et biologisk duplisert eksperimenter (satte og angi B) med 4 h inkubasjon tid med S. marcescens endonuclease og AAV vektor titer fra hver kombinasjon ble bestemt av en kvantitativ prikk blot metoden beskrevet i delen protokollen. Hvert punkt representerer to tredeler (5 og 6 radene, 66,7%) eller to-thirtieths (7 og 8 radene, 6,7%) av DNA fra hver 200 µL av medium hentes fra prøvene eller kontrollen negative. Topp fire rader (1st å 4th rader) representerer to sett med plasmider DNA standarder (STD 1 og STD 2) tas i duplikat (dvs., lineær pEMBL-CMV-GFP plasmider, som er plasmider brukes for double-strandet AAV-CMV-GFP vektor produksjon). Dot blot membranen undersøkt med en 32P-merket GFP sonde. To punktene angitt med avrundede rektangler er negative kontroller. De øverste to radene (STD 1) har fra bunnen av opprinnelige blot men blitt kuttet og flyttet til toppen uten å endre bildet intensitet vise begge plasmider standarder (STD 1 og STD 2) side ved side. Dette manipulasjon angis med en svart linje i figur. (B) Viral titer var bestemt for kombinasjoner av VP3 og AAP proteiner av dot blot analysen. Grafen representerer en biologisk quadruplicated sett med data, to fra panelet A og to fra en annen dot blot som ikke vises. Feilfelt viser middelverdien +/-SD (n = 4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: en sammenligning av enzymatisk aktivitetene til ulike nucleases i urenset AAV vektor preparater. (A) A kvantitative dot blot viser effekten av hver nuclease behandlingen å fjerne bakgrunnen signaler. En dobbel-strandet AAV9-CMV-GFP vektor inneholder forberedelse ("AAV9 vektor") og en "no-kapsid kontroll" var produsert av HEK 293 celle transfection med plasmider DNAs, og utsatt for analysen. No-kapsid kontrollen inneholder ikke virus partikler, men inneholdt eksponentielt forsterket emballert CMV-GFP vektor genomer. MgCl2 ble supplert ene eller tre ganger anbefalt beløpene (6 mM og 18 mM for DNase jeg enzym A; og 2,5 og 7,5 mM for DNase I enzym B) uten å ta hensyn til 0,8 mM MgSO4 i mediet. For behandling med S. marcescens endonuclease, ble bare én betingelse beskrevet i delen protokollen testet. Alle prøvene ble behandlet med hver nuclease 1t. Dot blot membranen undersøkt med en 32P-merket GFP sonde. Høyre to kolonnene (STD 2) har fra venstre for opprinnelige blot men kuttet og flyttet til høyre uten å endre bildet intensitet vise begge plasmider standarder (STD 1 og STD 2) side ved side. Dette manipulasjon angis med en tynn svart linje i figur. (B) prikker i no-kapsid kontroll eksemplene i panelet A er kvantifisert og vises som gjennomsnittlig ± | hver verdi-at verdien |. Sju av de 12 prøvene behandlet med DNase I enzym A (angitt med en stjerne) viser verdier bare litt høyere enn den høyeste standarden; Derfor er de inkludert i denne grafen for sammenligning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Serratia marcescens Endonuclease Buffer
50 mM Tris-HCl
2 mM MgCl2
Justere pH 8.5 med 4 M NaOH.
10 x proteinasen K Buffer
100 mM Tris-HCl pH 8.0
100 mM EDTA pH 8.0
5% SDS
2 x alkalisk løsning
800 mM NaOH
20 mM EDTA
20 x SSC (1 L)
175.3 g NaCl
88.2 g natriumsitrat tribasic (Na3C6H5O7)
Denhardts løsning 100 x (50 mL)
1 g Bovine serum albumin (brøkdel V) Merk: Filtrering er avgjørende for å fjerne små partikler som de forårsaker bakgrunn hybridisering signaler.
1 g Polysucrose 400
1 g Polyvinylpyrrolidone
Løses i 20 mL vann i et 55 ° C vannbad.
Justere endelige volumet til 50 ml passer.
Filter-sterilisere med filtere 0.22 μm.
Hybridisering Buffer
1% SDS Merk: Store hybridisering Buffer på 4 ° C og varme til 65 ° C i en vann bad før bruk.
6 x SSC
5 x Denhardts løsning
10 mM Tris-HCl pH 8.0
Vaskebuffer
0,1% SDS
0,1 x SSC
Polyethylenimine (PEI) løsning (1 mg/mL, 500 mL)
Legg 500 mg PEI i 450 mL vann og rør. Merk: For lengre lagring,-80 ° C anbefales.
Legge til konsentrert HCl for å bringe pH ned til < 2.0 å oppløse PEI (ca 800 µL av HCl vil være nødvendig).
Legge til 10 M NaOH å bringe pH til 7.0 (ca 500 µL av 10 M NaOH vil være nødvendig).
Juster volumet til 500 mL vann.
Filter-sterilisere med filtere 0.22 μm.
Aliquot og butikk på 20 ° C.
Fenol-kloroform (1:1 blanding) for kvantitative dot blotting
Legge til buffer-mettet fenol (pH 8.0) og kloroform på en 1:1 ratio i et 50 mL polypropylen konisk rør. Merk: Bufferen dekker organisk laget, hvis igjen i røret, kan overføres til eksempel rør gjennom pipettering og kan gjøre analysen unøyaktig.
Vortex tube kraftig å blande.
Tillater trinns separasjon med sentrifugering og deretter fjerne vandig laget helt.
Butikken på 4 ° C.

Tabell 1: løsning og Buffer oppskrifter. Oppskrifter for løsninger og buffere for å fullføre den kvantitative prikken blot protokollen.

Plasmider AAP(+) (μg) AAP(-) (μg) Negativ kontroll (μg) Hva kontroll (μg)
pCMV-AAVx-VP3 0,4 0,4
pCMV-FLAGGET-AAPx 0,4
pAAV-Reporter 0,4 0,4 0,4
pHLP-Rep 0,4 0,4 0,4
pHelper 0,4 0,4 0,4
pCMV (tom) 0,4 0,8
pCMV-GFP 2.0
Totalt 2.0 2.0 2.0 2.0

Tabell 2: plasmider kombinasjoner for AAV VP3-AAP kors-complementation analysen utført i 6-vel plate format. Kombinasjoner av plasmider DNAs skal brukes for HEK 293 celle transfection i hver forsøksgruppen vises. pCMV-AAVx-VP3, en plasmider uttrykke AAV serotype x (x = 1, 2, 3, etc.) VP3 protein under CMV-IE enhancer-selskapet; pCMV-FLAGGET-AAPx, en plasmider uttrykke AAV serotype x (x = 1, 2, 3, etc.) AAP protein under CMV-IE enhancer-selskapet; pAAV-Reporter, en plasmider som har to AAV2 invertert terminal gjentar (ITRs) og er utformet for rekombinant AAV vektor produksjon; pHLP-Rep, en plasmider uttrykke AAV2 Rep protein; pHelper, en adenovirus hjelper plasmider; pCMV (tom), en tom plasmider lagt til kontroll eksperimentelle forhold; pCMV-GFP, en plasmider uttrykke et fluorescens markør gen (f.eksGFP) for å bekrefte vellykket transfection. Transfections gjennomføres i 6-og plater, og bruk totalt 2 µg av plasmider DNAs.

Blanding en For 10 rør (μL)
Serratia marcescens Endonuclease Buffer 91,2
0.1 M NaOH 8.8
Totalt 100
Mix B For 10 rør (μL)
Serratia marcescens Endonuclease Buffer 91,2
1 M MgCl2 7.04
Serratia marcescens Endonuclease (250 enheter/μL) 0.176
Totalt 100
Mix C For 10 rør (μL)
10 x proteinasen K Buffer 400
Proteinasen K (20 mg/mL) 100
H2O 1300
Totalt 1800
Mix D For 10 rør (μL)
100% etanol 8000
3 M natrium acetate (pH 5.2) 320
Østers glykogen (20 mg/mL) 10
Totalt 8,330

Tabell 3: liste over master mix reagenser. Mix A og blanding B brukes for S. marcescens endonuclease behandling i trinn 3.2. Disse to blandingene bør gjøres separat å hindre utfelling av magnesium hydroksid. Mix C brukes for proteinasen K behandling i trinn 3.3. Mix D brukes til etanol nedbør i trinn 3.4.3. Volumene vist i tabellen er for master mix reagensene 10 rør.

Plasmider DNA standard (ng) (µL) mengder 25 pg/µL plasmider DNA standardløsning (µL) mengder vann Totalt volum (µL)
5 600 0 600
2.5 300 300 600
1.25 150 450 600
0.625 75 525 600
0.313 37,5 562.5 600
0.156 18,8 581.2 600
0,078 9.4 590.6 600
0.039 4.7 595.3 600

Tabell 4: kvantitative dot blot plasmider DNA standarder. Nødvendige mengder 25 pg/µL plasmider DNA standardløsning og vann eller TE å forberede plasmider DNA standarder av todelt føljetong fortynninger (600 µL/rør) vises. Tallene i kolonnen plasmider DNA standard (0.039 5 ng) er antallet av DNA i 200 µL av hver plasmider DNA standard løsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nytten av kvantitative dot blot analyser AAV AAPs og deres rolle i kapsid montering er beskrevet i denne rapporten. Kunnskapen fra disse studiene kan gi detaljert innblikk i medfødte forskjellene under AAV kapsid montering og funksjonelle rolle AAPs mellom forskjellige serotyper. I denne forbindelse AAV VP3-AAP kors-complementation dot blot analysen viste at slange AAV VP3 vises en streng avhengighet på co uttrykk for sin beslektet AAP for kapsid montering og at slange AAP ikke fremme kapsid montering av heterologous serotyper . Denne observasjonen er spennende fordi AAP-avhengige AAV serotyper som tidligere ble undersøkt (AAV1, 2, 3, 6, 7, 8, 9 og 12) kan behandle montering i hvert fall til en viss grad ved å utnytte en heterologous AAP6.

Kvantitativ prikk eller spor blot hybridisering er en tradisjonell metode for kvantifisering av nukleinsyrer finnes i flere eksempler på samme tid i en praktisk manner25. Metoden hadde mye brukt til DNA og RNA kvantifisering inntil qPCR ble utbredt i 1990-årene26,27. Selv om qPCR har fordeler over kvantitative dot blot og andre hybridisering-baserte analyser i at qPCR viser en høyere følsomhet og et større dynamisk område, bærer det en iboende risiko for eksponentielt forsterke feil ubevisst, som var tilfelle for titers AAV vektor aksjer bestemmes av qPCR13,23. Kvantitativ dot blot analyser enkelt defineres med en rimelig pris og enkelt gjennomført som forskere har tilgang til en kvantitativ molekylær tenkelig system som kan få signaler fra dot blot membraner hybridiserte med enten en radioaktiv sonde eller en ikke-radioaktivt chemiluminescent eller fluorescerende sonde. Selv om denne protokollen benytter 32P-merket radioaktivt sonder for signalgjenkjenning, bruke andre ikke radioaktiv DNA sonder direkte merket med et kommersielt tilgjengelig thermostable alkalisk fosfatase28. Dot blot analyser bruker et enkelt prinsipp og analysen av seg selv utgjør ikke en teknisk utfordring til utøvere; Derfor er resultatene vanligvis reproduserbar selv av uerfarne individer.

Foruten programmene som er beskrevet her, bruker vi rutinemessig en forenklet og rask versjon av dot blot prosedyren som raskt kan semi kvantifisere AAV partikler. Fordelene med prikk blot analyser i denne sammenheng inkluderer: (1) analysen krever ikke rensing eller enzymatisk forsterkning av viral genomer som tar timer, (2) en kombinasjon av varme og alkaliske denaturering er tilstrekkelig til å bryte AAV partikler i et utvalg løsning og slipp denaturert viral genomer i løsningen som er klar til å binde til en prikk blot membran, og (3) tilstedeværelsen av salt i høy konsentrasjoner i prøver påvirker ikke betydelig analyseresultatene. For eksempel er det mulig å kvantifisere semi AAV partikler i CsCl-rik løsninger (f.eks, brøker ved CsCl tetthet-gradert ultracentrifugation) ved å sette en liten aliquot (≤10 µL) prøver i 100 µL av 1 x alkalisk løsning, oppvarming ved 100 ° C for 10 min og blotting på en membran med eller uten standarder forberedt på forhånd, etterfulgt av en 15 min hybridisering, 3 x 3 min vasker og eksponering for en fosfor imaging skjermen i 15 min (eller lenger når du bruker en sonde med redusert radioaktivitet). Hele prosedyren kan fullføres i 1t når brukeren blir kjent med fremgangsmåten. Vi bruker denne rask metode, som vi vanligvis kaller "kokende dot blot metode", identifisere AAV partikkel-rike CsCl fraksjoner under vektor rensing behandle og avgjøre omtrent titers renset AAV vektor aksjer før du starter den omfattende prosesser for vektor karakterisering. Dermed selv om dot blot analyser kan vises som en utdatert metode å kvantifisere nucleic syrer og har allerede blitt erstattet med ulike PCR-baserte metoder i en rekke vitenskapelige disipliner, er det fortsatt en rekke fordeler til denne metoden bør gjøre forskere vurdere å ansette det i deres laboratorier.

Det viktigste trinnet i protokollen er nuclease behandling av prøver. Hvis dette trinnet ikke utføres i en optimal tilstand, ville det føre til høye signaler. Vi bruker S. marcescens endonuclease mens DNase jeg enzymer av forskjellige kilder er mye brukt i andre laboratorier for viral DNA kvantifisering. DNase I bovin bukspyttkjertelen opprinnelse har vært mest brukt av forskere. Dette er delvis fordi den bovine bukspyttkjertelen DNase jeg ble først identifisert og mest omfattende preget biokjemisk29. DNase jeg enzymer tilgjengelig fra kommersielle leverandører er produsert fra flere ulike biologiske kilder som Pichia pastoris (DNase I enzym A), opprinnelige form renset fra storfe bukspyttkjertelen (f.eksDNase I enzym B), og rekombinant enzymer produsert i enten gjær arter eller Escherichia coli (DNase I enzym C). Vi har funnet at DNase jeg enzymer fra alle tre av disse ulike kilder har blitt brukt i publiserte AAV vektor kvantifisering studier; men til vår kunnskap, har ingen av de tidligere studiene undersøkt om enzymer fra ulike kilder er like effektive i fordøyer forurensende DNA molekyler i AAV vektor preparater. Det bør bemerkes at DNase jeg behandling for AAV vektor analyser er ofte utført under ikke-optimalisert forhold på grunn av tilstedeværelsen av urenheter fra kultur medium og celler. Observasjon som DNase I enzym A er bare delvis aktivt i kultur medium vi har viktige implikasjoner i utformingen analysen for AAV vektor kvantifisering av dot blot og qPCR, og varsler forskere til problemet tidligere uidentifisert. I denne forbindelse, er S. marcescens endonuclease uttrykt i E. colien ideell endonuclease ikke bare for produksjon AAV vektorer, men også for AAV vektor kvantifisering. Dette er fordi den enzymatiske aktiviteten kan beholdes over et bredt spekter av pH-verdier og konsentrasjoner av magnesium ioner og monovalent kasjoner. Av denne grunn og S. marcescens endonuclease er ca 2 ganger billigere enn DNase I enzym B på per enhet basis, vi foretrekker å bruke S. marcescens endonuclease i rutinemessig kvantitative dot blot analyser.

I sammendraget er kvantitativ dot blot analyser en relativt enkel prosedyre som lett kan gi informasjon om evnen til å produsere virus partikler under varierende forhold. Sammenlignet med alternative titering tilnærminger, slik som qPCR, krever denne fremgangsmåten liten, om noen, optimalisering. Den kan også brukes på lett på vektorer av noen serotype å titer både single - og double-strandet vektorer uten å endre protokollen. Etter transfections og høsting av AAV vektor inneholder eksempler (kultur medium og/eller celler), hele protokollen kan være ferdig i en dag, dermed raskt svare spørsmål om evne til å produsere virus partikler fra ulike forhold, herunder ulike kombinasjoner av AAV VP3 og AAP proteiner. Kvantitativ dot blots tilbyr en hensiktsmessig metode for å løse ulike ubesvarte spørsmål som VP-AAP interaksjoner og deres roller i kapsid forsamlingen i en rekke forskjellige AAV serotyper og isolerer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Xiao Xiao ved University of North Carolina i Chapel Hill for å gi oss pEMBL-CMV-GFP plasmider. Vi takker Christopher Cheng og Samuel J. Huang for kritisk lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av helsevesenet gir (NIH R01 NS088399 og T32 EY232113).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase MilliporeSigma 1016970001 Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text.
DNase I Roche 4716728001 Referred to as DNase I Enzyme A in the main text.
DNase I Invitrogen 18047019 Referred to as DNase I Enzyme B in the main text.
DNase I New England Biolabs M0303L Referred to as DNase I Enzyme C in the main text.
1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes Corning 430909
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Polypropylene Conical Tube Corning 352097
3 M Sodium Acetate Teknova S0298
50 mL Polypropylene Conical Tube Corning 430291
AAV-293 Cells Agilent 240073 HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions.
AccuGENE 0.5 M EDTA Solution Lonza 51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 Lonza 51238
AccuGENE 10% SDS Lonza 51213
AccuGENE 1X TE Buffer Lonza 51235
Bio-Dot Apparatus Bio-Rad 1706545
Bovine Serum Albumin MilliporeSigma A3294
Cell Lifter Corning 3008
Chloroform MilliporeSigma 372978
DNA Extractor Kit Wako Pure Chemical Industries 295-50201 This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) Lonza 12-614F
ElectroMAX DH10B Cells Thermo Fisher Scientific 18290015
Ethanol 200 Proof Decon Labs 2716
Fetal Bovine Serum VWR 1500-500
Ficoll 400 Alfa Aesar B22095 Referred to as Polysucrose 400.
Fluorescence Microscope Zeiss Axiovert 40 CFL
Glycogen Roche 10901393001
Herring Sperm DNA Invitrogen 15634-017
Hybridization Tubes Thermo Fisher Scientific 13-247-150
ImageQuant TL GE Healthcare Life Sciences ImageQuant TL
L-glutamine 200 mM Lonza 17-605E
Magnesium Chloride Hexahydrate MilliporeSigma M0250
MicroPulser Electroporator Bio-Rad 1652100
Mini Quick Spin DNA Columns MilliporeSigma 11814419001
pAAV-RC2 Vector Cell Biolabs Inc VPK-422
Penicillin/Streptomycin 10K/10K Lonza 17-602E
Phosphate Buffered Saline Lonza 17-516F
Phosphorimaging Exposure Cassette GE Healthcare Life Sciences Various
Phosphorimaging Screen GE Healthcare Life Sciences Various
Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162
Platinum Pfx DNA Polymerase Invitrogen 11708013
Polyethylenimine Polysciences Inc 23966-2
Polyvinylpyrrolidone MilliporeSigma P5288
Prime-It II Random Primer Labeling Kit Agilent Technologies 300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		 MilliporeSigma Custom Primer
Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Proteinase K Solution Invitrogen 25530-049
Restriction Enzymes New England Biolabs Various
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15632011
Serological Pipettes Thermo Fisher Scientific 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-10
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate MilliporeSigma C8532
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203L
Thermal Cycler Eppendorf 6321000515
Tissue-culture Treated 6-well Plate Corning 353046
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-5
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28955809
UltraPure Buffer-Saturated Phenol Invitrogen 15513-047
UV Crosslinker Spectroline XLE-1000 Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2.
Zeta-Probe Membrane Bio-Rad 162-0165

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
  2. Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
  3. Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
  4. Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
  5. Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211 (2013).
  6. Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
  7. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  8. Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  9. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
  10. Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
  11. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  12. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
  13. Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
  14. Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
  15. NEB, 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , New England Biolabs. 302-368 (2017).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Addgene. Bacterial Transformation. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017).
  18. Addgene. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid. , Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017).
  19. Bio-Rad. Bio-Dot® microfiltration apparatus instruction manual. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf (2017).
  20. Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
  21. Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
  22. Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
  23. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  24. Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
  25. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  26. Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
  27. Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
  28. Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
  29. Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).

Tags

Biologi problemet 136 Adeno-assosiert virus (AAV) aktivering av montering protein (AAP) cross-complementation kvantitativ dot blot analysen viral titer genterapi
En kvantitativ Dot Blot analysen for AAV titrering og bruk for funksjonell vurdering av Adeno-assosiert Virus montering-aktivere proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Powers, J. M., Chang, X. L., Song,… More

Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins. J. Vis. Exp. (136), e56766, doi:10.3791/56766 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter