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Biology

Um ensaio de Blot Dot quantitativa para titulação de AAV e seu uso para avaliação funcional do vírus Adeno-associado Assembly-ativação de proteínas

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/56766
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

Summary

Este manuscrito detalha um ensaio de mancha de ponto simples para quantificação da concentração de vírus adeno-associado (AAV) e sua aplicação para estudar o papel da montagem-ativando proteínas (AAPs), uma classe nova de proteínas virais não estruturais encontrados em todos os vírus adeno-associados sorotipos, em promover a montagem de capsids derivado cognatos e heterólogos serótipos AAV.

Abstract

Enquanto o vírus adeno-associado (AAV) é amplamente aceita como um vetor atraente da terapia genética, serve também como um vírus de modelo para entender a biologia do vírus. A último aspecto, a recente descoberta de uma proteína não-estruturais AAV, denominada Assembleia-ativando proteína (AAP), tem lançar luz sobre os processos envolvidos na montagem das proteínas do capsídeo viral VP em um capsídeo. Embora muitos sorotipos de vírus adeno-associados exigem AAP para montagem, temos recentemente relatado que AAV4, 5, e 11 são exceções a essa regra. Além disso, temos demonstrado que AAPs e capsids montados de diferentes sorotipos localizar para diferentes compartimentos subcellular. Esta heterogeneidade inesperada na propriedades biológicas e funções funcionais da AAPs entre AAV diferente sorotipos sublinhados que a importância dos estudos na PittCon derivada de diversos sorotipos. Este manuscrito detalha um ensaio de mancha de ponto simples para quantificação de AAV e sua aplicação para avaliar a especificidade de dependência e sorotipo AAP no assembly do capsídeo. Para demonstrar a utilidade deste teste do borrão de ponto, partimos para caracterizar o conjunto de capsídeo e AAP dependência de AAV cobra, um réptil anteriormente descaracterizado AAV, bem como AAV5 e AAV9, que anteriormente foram mostrados para ser independente de AAP e dependente da AAP sorotipos, respectivamente. O ensaio revelou que o conjunto de capsídeo cobra AAV requer cobra AAP e não pode ser promovido por AAPs de AAV5 e AAV9. O ensaio também mostrou que, ao contrário de muitos o sorotipo comum PittCon que promovem Assembleia capsídeo heteróloga por Cruz-complementação, cobra AAP não promove Assembleia de AAV9 capsids. Além disso, mostramos que a escolha de nuclease afeta significativamente a leitura do ensaio de mancha do ponto, e assim, escolher uma enzima ideal é fundamental para o sucesso avaliação de títulos AAV.

Introduction

Vírus adeno-associado (AAV) é um pequeno, não-envelopado, single-stranded DNA vírus com um genoma de aproximadamente 4,7 kilobases (kb). O genoma do vírus adeno-associados contém quadros de leitura aberta (ORFs) para os genes rep e cap . Em 2010, uma proteína não-estruturais inédita codificada por um + 1 quadro-deslocados ORF dentro do gene do tampão de AAV2 foi descoberta por Sonntag et al e verificou-se que desempenham um papel fundamental na montagem de AAV2 proteínas do capsídeo VP monômero em um viral capsídeo1. Esta proteína romance foi nomeada assembly-ativando proteína (AAP) após o papel que desempenha na promoção do capsídeo conjunto1.

As ORFs para AAP foram identificado bioinformatically nos genomas dos parvovírus todos do género Dependoparvovirus, mas não dentro os genomas dos vírus de diferentes gêneros dos parvovírus família1,2. Estudos funcionais desta proteína romance foram inicialmente focados no AAP do protótipo AAV2 (AAP2), que estabeleceu o papel essencial da AAP2 no direcionamento de proteínas de VP desmontadas para o nucléolo para sua acumulação e formação em totalmente montados capsids1,3,4. A incapacidade dos capsids AAV2 a montar na ausência de expressão de AAP tem sido independentemente confirmada por vários grupos, incluindo a nossa,1,2,3,4,5 . Estudos posteriores em serótipos AAV 1, 8 e 9 corroborou o papel crítico da AAPs no assembly do capsídeo, como proteínas de monômero VP3 de AAV1, 8, e 9 foram incapazes de formar um capsídeo totalmente montado na ausência de expressão co da AAP2.

Recentemente, através de abordagens que incluem o uso de ponto quantitativo borrão ensaios, investigamos a capacidade de AAV1 de 12 VP3 monômeros para montar em capsids na ausência de expressão de AAP e a capacidade de AAP1 a 12 para promover a montagem de VP3 monômeros de heterólogos serótipos. Este estudo revelou que AAV4, 5 e 11 VP3 monómeros podem montar sem AAP. Além disso, verificou-se que oito dos serótipos AAP doze nós examinamos (isto é, todos, mas AAP4, 5, 11 e 12) exibida uma ampla capacidade de suporte conjunto capsídeo de capsids de sorotipo heterólogos da AAV, enquanto AAP4, 5, 11 e 12 exibido um substancialmente capacidade limitada nesta consideração6. Estes quatro sorotipos são filogeneticamente distantes do outro AAP serótipos2,3. Além disso, o estudo revelou significativa heterogeneidade em suas localizações subcellular de diferentes PittCon6. Além disso, o estudo tem sugerido que a associação apertada da AAP com capsids montados e o nucléolo, a marca da montagem do capsídeo AAV2, necessariamente não pode ser estendida para outros sorotipos incluindo AAV5, 8 e 9, que exibem nucleolar exclusão de capsids montados6. Assim, a informação adquirida com o estudo de qualquer sorotipo específico AAP não é amplamente aplicável para todos biologia AAP. Natureza tão intrigante da biologia AAP enfatiza a necessidade de investigar o papel e a função de cada AAP de canônicos e não-canônicos serótipos AAV.

O papel biológico da AAP no assembly do capsídeo pode ser avaliado, determinando que os títulos de partícula viral de AAV totalmente embalados produziram no rim embrionário humano (HEK) 293 células, a linha de celular mais comumente usados para produção de vetor de vírus adeno-associados, com ou sem proteína AAP expressão. Os métodos padrão para quantificação de AAV são PCR quantitativo (qPCR)-ensaios com base7,8 e dot quantitativo baseado em blot ensaios9. Outros métodos para quantificação de partícula viral AAV como de10,de ensaio enzima-lig da imunoabsorção11 ou de medição de densidade óptica12 não são ideais para amostras provenientes de muitos diferentes sorotipos de vírus adeno-associados ou amostras contaminado com impurezas (lysates bruto ou meios de cultura), que muitas vezes são as amostras utilizadas para pesquisa AAV. Atualmente, qPCR é mais amplamente utilizado para quantificação de vírus adeno-associados; no entanto, é necessário reconhecer potenciais advertências do ensaio qPCR-baseado, como o ensaio podem resultar em erros sistêmicos e título significativas variações13,14. Ensaios baseados em PCR são afetados por uma série de confusão potencialmente fatores, tais como a presença de grampos de cabelo terminais fechados covalentemente em modelos PCR que inibem a amplificação13. Até mesmo um indivíduo experiente pode apresentar potencial fatores de confundimento em uma base qPCR inconscientemente ensaio13. Em contraste, os ensaios de mancha ponto quantitativos são uma técnica clássica de biologia molecular que não envolve a amplificação do genoma e usa um princípio muito mais simples com um risco mínimo de erros em comparação com ensaios baseados em qPCR. O método é menos tecnicamente desafiador; Portanto, os resultados do ensaio são razoavelmente reproduzíveis mesmo por pessoas inexperientes.

Neste relatório, descrevemos os detalhes metodológicos de um ensaio de mancha de ponto quantitativa rotineiramente usamos para quantificação de vetor de vírus adeno-associados e fornecer um exemplo de como aplicar o ensaio para estudar o papel de montagem-promoção da AAPs em comum sorotipos (AAV5 e AAV9) e uma anteriormente descaracterizada AAP de AAV cobra14. Na natureza, AAV VP proteínas e proteínas AAP são expressos em cis de um único gene (ou seja, VP-AAP cis-complementação), enquanto no ensaio descrito aqui, proteínas de VP e AAP são fornecidas em trans de dois plasmídeos separados (ou seja, VP-AAP trans-complementação). Desde que cada proteína VP ou AAP de sorotipos diferentes pode ser expressa de cada independente do plasmídeo, torna-se possível testar combinações de VP-AAP heterólogos para montagem do capsídeo (ou seja, VP-AAP Cruz-complementação). Brevemente, VP3 AAV de vários serótipos é expresso em células HEK 293 transfeccao de Plasmideo DNA de um genoma de vetor de vírus adeno-associados do pacote na presença ou ausência do sorotipo cognato AAP, ou na presença de um sorotipo heterólogo AAP. Após a produção, meios de cultura e lisados celulares são submetidos a um ensaio de mancha de ponto para quantificar o genoma viral dentro do shell do capsídeo. O primeiro passo do ensaio de mancha do ponto é tratar as amostras com uma nuclease para remover contaminantes DNAs plasmideo e genomas AAV não acondicionadas em amostras. A não observância aumentaria os sinais de fundo, em particular quando impuro amostras são doseadas. Esta é seguida por um tratamento de protease para quebrar capsids virais e liberam nuclease resistente genomas virais em soluções de amostra. Genomas virais, próximo são desnaturadas, destruídas em uma membrana e hibridizadas com uma sonda de DNA específico do genoma viral para quantificação. No ensaio exemplo relatado aqui, demonstramos que cobra AAV VP3 exige cobra AAP para montagem do capsídeo e que cobra AAP não promove a montagem de AAV9 capsids ao contrário de muitos as AAPs derivados de serótipos AAP-dependente que podem também promover a montagem de capsids do sorotipo heterólogo. Por último, relatamos uma ressalva importante para qPCR ou quantificação de AAV ponto baseado em blot ensaios que a escolha de nuclease afeta significativamente os resultados do ensaio.

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Protocol

Nota: Receitas para as soluções e buffers necessários para este protocolo são fornecidas na tabela 1. O protocolo descrito abaixo é para o ensaio de mancha de ponto de cruz-complementação VP-AAP estudar as funções das proteínas no assembly do capsídeo AAP. O método para o ensaio de mancha ponto quantitativos mais genérico para titulação de vetor AAV purificada é explicado na seção de Resultados de representante .

1. construção de VP3, AAP e AAV2 Rep expressando plasmídeos

  1. Construção de pCMV-AAVx-VP3 (x = sorotipos)
    1. PCR-amplificar o inteiro VP3 ORF (1,6 kb) usando um polymerase do DNA de alta fidelidade e o seguinte par de primer: VP3 avanço, CTAA-RE1-CACC-N25 (os primeiros 25 nucleotídeos de ORF VP3); VP3 reversa, TCTT-RE2-N25 (os última 25 nucleotídeos de ORF VP3).
      Nota: RE1 e RE2 são locais para enzimas de restrição (REs) para clonagem. CTAA e TCTT são o terminal 5' e 3' tetranucleotides adicionadas para facilitar a digestão da enzima de restrição perto do final do DNA dupla-hélice. CACC é uma sequência de consenso Kozak.
    2. Clone os produtos de PCR RE-digested entre o correspondente RE sites de um vetor de expressão dos mamíferos que usa o citomegalovírus humano imediatamente-início (CMV-IE) potenciador-promotor para expressão de alto nível.
      Nota: Para clonagem molecular, digeri a 5 µ g de DNA do plasmídeo espinha dorsal com uma restriction enzyme(s) em uma concentração de 4 U / µ g DNA para 1 h com uma temperatura ideal. Para fragmentos PCR, aumente as unidades de enzimas utilizadas (por exemplo, 10 U / µ g do produto do PCR de ORF VP3 1,6 kb) e um tempo de incubação (por exemplo, 4 h) devido ao aumento do número de sites de reconhecimento da enzima de restrição por unidade de comprimento. Informações úteis em biologia molecular enzimas e clonagem procedimentos, incluindo a transformação bacteriana podem ser encontradas em outro lugar15,16,17.
  2. Construção de pCMV-bandeira-AAPx (x = sorotipos)
    1. PCR-amplificar o inteiro AAP ORF (0,6 kb) exceto para o primeiro aminoácido usando um polymerase do DNA de alta fidelidade e o seguinte par de primer: AAP avanço, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (25 nucleotídeos dos 4 nucleotídeos na AAP ORF); AAP reversa, TCTT-RE2-N25 (os última 25 nucleotídeos da AAP ORF).
      Nota: GACTACAAGGACGACGATGACAAA códigos de uma marca de bandeira, que tem sido mostrada para ter nenhum efeito nocivo4,5 , mas pode ser omitida se desnecessários.
    2. Clone os produtos de PCR RE-digested entre os sites correspondentes de um vetor de expressão mamíferos com o CMV-IE potenciador-promotor15,16,17.
  3. Construção de pHLP-Rep
    1. Digest 5 µ g do plasmídeo pAAV-RC2 (7,3 kb) com 20 unidades cada de Xho I e Xcm e purificar o DNA usando um kit de purificação de DNA comercial ou por extração de fenol-clorofórmio.
      Nota: Remoção de 1,8 kb Xho eu-Xcm que eu fragmento de 7,3 kb pAAV-RC2 plasmídeo resultados em perda da expressão de proteínas do capsídeo VP preservando a expressão da proteína Rep.
    2. Contundente o DNA termina com 6 unidades de T4 DNA Polymerase, agarose gel-purificar o fragmento de DNA de 5,5 kb e self ligate o fragmento purificado usando 50 a 100 ng de DNA e 400 unidades de T4 DNA ligase de acordo com recomendação15 as indicações do fabricante.
    3. Siga o procedimento de transformação bacteriana padrão referenciado na etapa 1.1.2 nota.
  4. Verifique se que o plasmídeo constrói por digestão enzimática de restrição e sequenciamento de15,18.
  5. Execute minipreps plasmídeo ou maxipreps usando kits comercialmente disponíveis para obter uma quantidade suficiente de plasmídeo para os experimentos de produção de vírus adeno-associados a jusante.

2. produção de AAV no HEK 293 células por transfecção de DNA do plasmídeo (Cross-complementação do ensaio)

  1. Cultura de células HEK 293 em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM)-glicose alta (4,5 g/L) suplementado com 10% soro bovino fetal (FBS), 1%, penicilina e estreptomicina Mix e 1 mM L-glutamina, uma incubadora de 37 ° C com 5% de dióxido de carbono (CO2).
    Nota: Títulos AAV variam significativamente dependendo da fonte de células HEK 293.
    Atenção: Embora o AAV pode ser manipulado em Biossegurança nível 1 (BSL1) contenção, BSL2 contenção é recomendada para trabalhos de células HEK 293.
  2. Dia -1 (24 h antes do transfection), placa 6 – 7 x 105 HEK 293 células/poço em 2 mL do meio de completo descrito no passo 2.1 em um s 6-poços. Este geralmente alcança a confluência do ~ 90% no dia seguinte.
  3. Dia 0: Transfection
    1. Preparação para transfeccao de DNA
      1. Certifique-se que as células chegaram a confluência ~ 90%.
      2. Aquecer DMEM suplementado com 1% penicilina e estreptomicina Mix e 1 mM L-glutamina mas sem 10% FBS (isto é, livre de soro médio) em banho maria a 37 ° C.
      3. Permitir que a solução o polyethylenimine (PEI) para atingir a temperatura.
    2. Preparação da mistura de DNA plasmídeo
      1. Misture os plasmideos em 96 µ l de solução salina tampão fosfato (PBS) sem CaCl2 ou MgCl2 em tubos de microcentrifuga estéril 1,5 mL conforme indicado na tabela 2. A quantidade total de DNA é de 2 µ g/bem.
        Nota: Os volumes de solução de DNA de plasmídeo podem ser desconsiderados, se eles são nominais. Ajuste do volume é recomendado se o volume total das soluções de DNA de plasmídeo é ≥ 10 µ l.
    3. Transfecção de PEI
      1. Adicione 4 µ l da solução de PEI (1 mg/mL) para a mistura de PBS-Plasmídeo (preparada como acima). O volume final é aproximadamente 100 µ l (5% de volume de meio de cultura). Vórtice brevemente os tubos e incube a mistura de DNA: PEI durante 15 minutos à temperatura ambiente.
      2. Enquanto espera para a incubação de 15 min completar, substitua o meio de cultura com meio livre de soro escaldado, descrito na etapa 2.3.1.2.
      3. Uma vez a 15min a incubação do DNA: mistura de PEI está completa, brevemente girar os tubos com microcentrifuga para coletar o líquido para o fundo dos tubos e adicione a mistura de DNA: PEI gota de meio de cultura em cada poço da placa de cultura de HEK 293. Suavemente agitar as placas e devolvê-los para uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2.
      4. Manter as células neste meio de transfeccao até a colheita no dia 5 (nenhuma mudança média é necessária).
  4. No dia 1 e dia 2, observe células transfectadas com plasmídeo pCMV-GFP sob um microscópio de fluorescência invertido para avaliar a eficiência do transfection.
    Nota: para a microscopia de fluorescência, aqui um 10x / 0.25 objectivo de abertura numérica em combinação com uma ocular de 10 × foi usado, e 450-490 nm excitação bandpass filtro e filtro de emissão 515 – 565 nm bandpass foram empregados. A condição acima normalmente rende mais do que a eficiência de 70% do transfection. As células podem apresentar algumas alterações morfológicas (por exemplo, células tornaram magro), devido à condição livre de soro.
  5. Nos dias 3-5, continue a cultura de células transfectadas em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2.
  6. No dia 5, colete células e médio contendo vírus em polipropileno tubos cônico de 15 mL pipetando para cima e para baixo ou por raspagem com uma espátula de célula.
  7. Armazene as amostras a-80 ° C até o uso.

3. dot Blot ensaio para quantificação de AAV

  1. Recuperação de partículas virais
    1. Descongele rapidamente os tubos congelados em banho maria a 37 ° C. Vórtice os tubos vigorosamente durante 1 minuto maximizar a recuperação de AAV de células.
    2. Granule os detritos de células por centrifugação a 3.700 x g a 4 ° C por 10 min. Tome 200 µ l do sobrenadante de cada tubo e transferi-lo para um tubo de microcentrifuga rotulado com uma tampa de rosca para o ensaio de mancha de ponto.
      Nota: Alíquota do sobrenadante restante em microcentrifuga tubos e armazená-los congelados a-80 ° C para uso futuro. Aqui, os tubos de polipropileno microcentrifuga anexado com tampas de rosca e um-Ring foram usados. Vedação é necessária para evitar derramamentos de AAV e fenol-clorofórmio.
  2. Tratamento com endonucleases de Serratia marcescens
    1. Prepare a mistura A e B de mistura reagentes (tabela 3). Adicione 10 µ l da mistura A e 10 µ l da mistura B em cada tubo. Vórtice os tubos por 5 s, brevemente, girar os tubos para coletar o líquido para o fundo do tubo e incubar os tubos a 37 ° C pelo menos durante 1 h.
      Nota: Mix A contém NaOH e otimiza o pH para tratamento com S. marcescens endonuclease. B Mix suplementos de magnésio. Concentração de endonuclease S. marcescens em estoques de enzima comercialmente disponíveis pode variar. O volume de S. marcescens endonuclease precisa ser ajustada para fazer 200 U/mL após a adição de mistura A e B de Mix para tubos em passo 3.2.1.
      Nota: Um tempo de incubação, acima de 4h, pode diminuir sinais de fundo.
    2. No final da incubação, gire rapidamente os tubos com uma centrífuga de bancada para coletar condensação e solução da parte superior e os lados dos tubos.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. As amostras podem ser armazenadas congeladas a-20 ° C ou -80 ° C.
  3. Tratamento de proteinase K
    1. Prepare o reagente C Mix (tabela 3). Adicione 180 µ l do Mix C em cada tubo. Vórtice os tubos por 5 s, brevemente, gire os tubos e incubar os tubos a 55 ° C, durante 1 h.
      Nota: O EDTA no Mix C reagente quelatos íons de magnésio livre e inactivates S. marcescens endonuclease.
    2. No final da incubação, permitir que as amostras atingirem a temperatura e brevemente, girar os tubos com uma centrífuga de bancada para coletar condensação e solução da parte superior e os lados dos tubos.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. As amostras podem ser armazenadas congeladas a-20 ° C ou -80 ° C. Para retomar o protocolo, incube os tubos a 55 ° C, durante 5 a 10 min dissolver os cristais de SDS contidos no buffer completamente.
  4. Precipitação de extração e etanol de fenol-clorofórmio
    1. Adicione 200 µ l de fenol-clorofórmio para as amostras e o vórtice-los por 1 min. giram as amostras em um microcentrifuge no ≥16, 100 g de x para ≥ 5 min à temperatura ambiente.
      Atenção: O fenol-clorofórmio deve ser tratada em uma coifa química com equipamento de protecção adequado (EPI; ou seja, luvas de nitrila, óculos ou protetor facial e jaleco com mangas compridas).
    2. Transferência de 320 µ l da camada aquosa (160 µ l duas vezes com uma pipeta P200) para um novo tubo de microcentrifuga padrão (80% do volume de fluido aquoso).
      Nota: É extremamente importante levar o mesmo volume de solução aquosa entre amostras, caso contrário o ensaio perde precisão quantitativa.
    3. Prepare o reagente de mistura D (tabela 3). Adicione 833 µ l do Mix D em cada tubo. Vórtice os tubos por 5 s e incubar os tubos a-80 ° C para ≥ 20 min.
      Nota: Mix D é uma mistura de etanol, acetato de sódio e glicogênio para precipitação do álcool etílico conveniente do DNA. As amostras podem ser armazenadas a-80 ° C a esta etapa e o protocolo pode ser retomado mais tarde.
    4. Amostras de centrífuga com microcentrifuga no ≥16, 100 x g a 4 ° C ≥ 15 min. decantar o sobrenadante e borre uma vez em uma toalha de papel limpo. Coloque aproximadamente 500 µ l de etanol a 70% em cada tubo, vórtice os tubos durante 5 s e centrifugar os tubos com microcentrifuga bancada no ≥16, 100 x g a 4 ° C para ≥ 5 min.
    5. Decantar o sobrenadante e borre-se uma vez em uma toalha de papel limpo. Pelotas secas a 65 ° C; pelotas podem ser secadas completamente.
      Nota: Não use uma pipeta para retirar o excesso etanol que permanece após a mancha os tubos. Pelotas também podem ser secadas em temperatura ambiente durante a noite. O protocolo pode ser pausado aqui e pelotas secas de DNA podem ser armazenadas à temperatura ambiente durante vários dias com a tampa do tubo fechada.
  5. Ressuspensão de DNA viral em tampão TE
    1. Dissolva as pelotas de DNA em µ l 120 cada debuffer TE sacudindo cada tubo por 30 min a 1 h à temperatura ambiente.
  6. Borrão de ponto
    1. Preparação de padrões de DNA do plasmídeo
      1. Dilua a AAV vector genoma ADN do plasmídeo para 10 ng / µ l em água ou em tampão Tris-HCl (10 mM, pH 8.0). Pegue 25 µ l desta diluição e digerir com uma enzima de restrição apropriada por 1h linearizar o plasmídeo de DNA, num volume de reação de 50 µ l.
        Nota: Nós fazemos um conjunto duplicado de digestão (consulte a etapa 3.6.4.1). A enzima apropriada deve ser aquele que corta o DNA do plasmídeo fora da região de sonda-vinculação do ponto do borrão. Para sua conveniência, o Plasmídeo diluído pode ser aliquotadas (25 µ l/tubo) e armazenado congelado a-20 ° C para uso futuro. Digeri o ADN do plasmídeo, enquanto os tubos estão tremendo na etapa 3.5.1. Não digeri excesso o plasmídeo de DNA padrão.
      2. Adicione 450 µ l de água ou TE ao tubo contendo o plasmídeo digerido DNA padrão e misture bem. Transfira 70 µ l desta mistura para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL com 1.330 µ l de água ou TE tornar um plasmídeo diluído padrão (25 pg / µ l).
      3. Siga a tabela 4 para criar um conjunto de diluições em série dupla (600 µ l/tubo). Homogeneizar as diluições vortexing por 5 s.
    2. Desnaturação dos padrões e amostras de ADN virais
      1. Adicione 600 µ l de solução alcalina de 2x para cada diluição padrão. Misture bem por num Vortex para 5 a 10 s. Incubar à temperatura ambiente por 10 min.
      2. Adicione 120 µ l de solução alcalina de 2x para cada amostra de DNA viral. Misture bem por num Vortex para 5 a 10 s. Incubar à temperatura ambiente por 10 min.
    3. Configurando o aparelho de borrão do ponto
      1. Usando a tesoura, corte uma membrana mancha (por exemplo, zeta-sonda) para um tamanho adequado para o número de amostras e padrões. Embeba a membrana com água durante 10 minutos antes de colocá-lo em um aparelho de borrão do ponto. Cobrir os poços não utilizados em cima do aparelho de membrana.
        Nota: Lidar com a membrana com uma pinça limpa. Para cobrir os poços vazios, a folha de proteção azul luz que vem com a membrana pode ser usada. Não permita que a membrana secar antes da ligação de amostras e padrões. Para mais detalhes sobre a montagem e utilização do aparelho, por favor consulte o manual do utilizador19.
      2. Adicione água aos poços para o qual as amostras serão carregadas. Aplica vácuo e puxe a água através dos poços para verificar se há erros e reteste quando fixo. Voltar a apertar os parafusos durante a aplicação de vácuo para garantir a vedação.
        Nota: Selagem incompleta pode causar vazamento de amostra entre os poços.
      3. Uma vez que a água é completamente puxada através de, liberar o vácuo completamente (ou seja, o distribuidor de vácuo deve ser aberto a pressão do ar).
    4. Carregar padrões e amostras ao aparelho de borrão de ponto
      1. Aplicar 400 µ l de cada padrão de ADN do plasmídeo diluído a cada poço e executar quatro pistas de diluições padrão. Use duas alíquotas distintas de digerir o padrão e carregar cada uma em duplicado. Aplicam-se 200 µ l/poço de cada amostra de DNA viral.
        Nota: Usando o restante µ l ~ 40 amostras desnaturado, amostras diluídas podem ser preparadas (por exemplo, 10 vezes amostras diluídas usando 20 µ l de amostra mais 180 µ l de solução alcalina de 1x) e destruídas se necessário.
      2. Aplica o vácuo suave para puxar as soluções de DNA através do poço.
        Nota: Vácuo pressão precisa ser ajustado abrindo parcialmente uma válvula de três vias, para que a pressão do vácuo é aplicado para o dot blot aparelhos, bem como a atmosfera (ou seja, com os braços de torneira posicionado em um ângulo de aproximadamente 45 ° onde ele faz um ruído mais alto de aspiração).
      3. Uma vez que todos os poços de tem esvaziado, libere o vácuo, ajustando a válvula de três vias. Adicione 400 µ l de solução alcalina de 1x a cada poço que continha normas e amostras. Espere por 5 min antes de re-aplicar vácuo para esvaziar os poços.
      4. Re-aplicar o vácuo da mesma forma (consulte a etapa 3.6.4.2).
      5. Desmontar o aparelho de borrão ponto sob vácuo, remover a membrana e enxaguá-lo com 2 x SSC. Coloque uma toalha de papel limpa com o lado de DNA-limite para cima, para remover o excesso 2 a membrana x SSC.
      6. UV-crosslink o borrado DNA para a membrana com um apropriado agente reticulante UV; a membrana está agora pronta para a hibridação.
        Nota: As membranas molhadas podem ser usadas para reticulação de UV. O UV-quitosana membranas secas, podem ser armazenadas à temperatura ambiente. Mais informações podem ser encontradas na Tabela de materiais.
  7. Hibridação e lavagem
    1. Aquecer o tampão de hibridização em um banho de água de 65 ° C.
    2. Enzimaticamente rotular uma sonda de DNA com radioativo α -32P dCTP e purificá-la usando kits comercialmente disponíveis de acordo com a recomendação do fabricante.
      Nota: Utilizamos uma sonda de 0.5-2.0 kb em tamanho de uma região de potenciador-promotora ou uma sequência de proteínas no genoma viral. Embora este protocolo utiliza 32P-rotulado sondas radioactivas para detecção do sinal, não-radioativo sondas quimioluminescente ou fluorescentes também podem ser usadas (por favor, consulte a seção de discussão ).
    3. Coloque a membrana em uma garrafa de hibridação com o lado de DNA-limite, enxágue a membrana com 5 mL pré-aquecido tampão de hibridização e descartar o buffer. Em seguida, adicionar 10 mL de tampão de hibridização escaldadas e coloque a garrafa em um forno de hibridização rotativo definido a 65 ° C. Gire para ≥ 5 min.
    4. Calor-desnaturar 20 µ l de arenque de 10 mg/mL distorcido ou solução de DNA de esperma de salmão e a sonda 32P-rotulado (≥ 107 cpm) por 5 min, colocando os tubos em um conjunto de bloco térmico a 100 ° C. Então snap-chill-los no gelo para ≥2 min, rotação brevemente e manter no gelo até o uso.
      Cuidado: Para sondas de DNA radioativas, tubos de 1,5 mL com tampa de rosca e o-Ring devem ser usados.
    5. Adicione rapidamente o DNA de esperma desnaturado e sonda radioativa para o Buffer de hibridação em hibridação da frasco e agite bem o frasco para 10 s para misturar. Retornar o frasco para o forno de 65 ° C e incubar a garrafa com rotação a 65 ° C para ≥4 h.
    6. Uma vez que a hibridização é completa, parar a rotação, retire a garrafa de hibridação e então despeje a solução sonda radioativa em um tubo cónico de 50 mL com um tampão de selo plug estanques. Loja da sonda em um recipiente apropriado colocado no frigorífico designado para materiais radioactivos.
      Nota: Usado tampão de hibridização com uma sonda que é armazenada em 4 ° C pode ser re-usado pelo menos 5 vezes, colocando o tubo cónico de 50 mL com um tampão de selo plug estanques que contém o tampão de hibridização em um banho de água de 100 ° C por 5 min.
    7. Lavar a membrana com amortecedor da lavagem aquecida a 65 ° C. Adicionar 20 a 30 mL de tampão de lavagem para a garrafa de hibridação e rodar por 5 min. Repita este lavar 2 vezes mais.
      Nota: Medir a radioactividade das soluções de lavagem e gravá-la se necessário pelo Instituto local.
    8. Enquanto lavava a membrana, coloque um fósforo de imagem tela em uma borracha de imagem por 5 min.
    9. Após a terceira lavagem, remover a membrana da garrafa de hibridação, remover excesso tampão na membrana com toalhas de papel e colocar a membrana em um suporte de papel plástico transparente. Verifica sinais radioativos na membrana usando um contador Geiger. Expor a tela de fósforo apagados de imagem para a membrana durante 10 minutos durante a noite, dependendo da intensidade do sinal.
    10. Varredura de tela usando uma imagem de fósforo sistema de digitalização e obter os dados sobre a intensidade do sinal de cada ponto.
  8. Análise de dados
    1. Desenhe uma curva de calibração usando software de análise dados e planilha (por exemplo, Excel).
      Nota: Regressão linear Log-log era usado para desenhar uma curva padrão.
    2. Determine o equivalente nanograma (ng-eq) para cada uma das amostras de DNA virais por interpolação. O ng-eq é a quantidade do plasmídeo de DNA usado para desenhar uma curva padrão que é equivalente ao número de moléculas de DNA virais. Quando o comprimento do ADN do plasmídeo é 8.000 bp, 1 ng-eq do ADN viral, single-stranded AAV corresponde a 2.275 x 108 partículas.
      Nota: O ng-eq pode ser convertido para o número de partículas virais pelas seguintes equações:
      Equation 1
      Equation 2
      O número de partículas AAV convencionalmente é expressos como "vg" (vetor genomas) ou "DRP" (partículas de DNase eu-resistente).
    3. Calcule as concentrações de AAV das matérias-primas. Porque o DNA viral tricaína representa 66,7% Equation 3 do DNA viral nas matérias-primas, 1 ng-eq corresponde a 1,7 x 109 partículas/mL Equation 4 .
      Nota: Esta correção não é necessária se todo o DNA viral contido em matérias-primas é borrado em uma membrana sem perda (ver Figura 1).

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Representative Results

Um resultado representativo de borrões ponto quantitativa para quantificação das existências de vetor AAV purificadas produzido em larga escala é mostrado na Figura 1. Com este ensaio de mancha de ponto, determinou-se o título de um estoque de vetor de AAV2G9-CMV-GFP de dupla-hélice. O vetor foi purificado por duas rodadas de cloreto de césio (CsCl) gradiente de densidade ultracentrifugação seguida de diálise como descrito anteriormente,20. Em geral, para as unidades populacionais vetor AAV purificadas, três volumes diferentes de cada unidade populacional vetor de vírus adeno-associados (por exemplo, 0,3 µ l, 0,1 µ l e 0,03 µ l) estão sujeitos ao procedimento de borrão ponto descrito acima, em duplicado, com uma modificação. DNase I enzima A é usada no lugar de S. marcescens endonuclease no passo 3.2, e um kit disponível comercialmente para extrair e purificar DNA viral é usado no passo 3.4 (ver Tabela de materiais). No exemplo mostrado na Figura 1, os valores de intensidade de sinal (unidade arbitrária) obtidos de cada plasmídeo padrão (figura 1A) foram plotados contra as quantidades conhecidas de DNA para desenhar uma curva padrão (figura 1B), mostrando uma correlação coeficiente de 0.998. Usando esta curva padrão, foi determinado por interpolação que alíquotas de 0,3, 0.1 e 0,03 µ l do vetor AAV2G9 mostraram 1.487 e 1.522 ng-eq (0,3 µ l), 0.487 e 0.507 ng-eq (0,1 µ l) e 0.158 e 0.171 ng-eq (0,03 µ l). Isto deu os seguintes seis valores: 4.957, 5.073, 4.870, 5.070, 5.267 e 5.700 ng-eq / µ l para este particular AAV2G9 vector ações, levando a uma média de 5,16 ± 0,27 ng-eq / µ l (média ± DP). Desde que o comprimento do plasmídeo usado como o padrão (pEMBL-CMV-GFP) é 5.848 bp, o título deste vetor AAV2G9 estava determinado a ser 8,0 x 1011 vg/mL de acordo com a equação 2 na etapa 3.8.2. Este ensaio é repetido pelo menos duas vezes para determinar uma concentração final de estoques de vetor de vírus adeno-associados.

Um resultado representativo da Cruz-complementação de ensaios para avaliar a dependência da AAP em VP3 capsídeo conjunto e a capacidade para AAPs para montar VP3 proteínas de origem heteróloga é exibido na Figura 2. Em vitro estudos de AAV, muitas vezes não necessitam de purificação de vírus para fazer conclusões e experiências utilizando preparações de vírus impuro como lisados celulares bruto e meios de cultura contendo vírus são suficientes para produzir resultados significativos. Neste experimento, produção de partículas virais de AAV foi avaliada de todas as combinações possíveis de AAV VP3-AAP entre AAV5, AAV9 e cobra AAV, incluindo combinações de AAP VP3-não por um ensaio de mancha de ponto quantitativa. As amostras obtidas em um conjunto duplicado de um experimento foram destruídas em 1x e 10 x de diluições (conjunto A e conjunto B na Figura 2A, respectivamente). O gráfico mostrado na Figura 2B resume a análise quantitativa dos pontos. Os resultados mostram que: (1) AAV5VP3 monta independentemente se AAP foi fornecido em trans, (2) AAP5 e AAP9 podem promover Assembleia de capsídeo AAV9VP3 apesar de AAP5 funções menos eficaz do que AAP9, (3) nem AAP5 nem AAP9 exibe um assembly promoção da actividade na cobra AAV VP3 e (4) cobra AAP só promove Assembleia da cobra AAV VP3. (1) e (2) estão em consonância com os anteriores observações6, mas o AAV VP3-AAP excepcionalmente específico interação em cobra AAV é uma descoberta romance neste experimento. Uma fraqueza do Cruz-complementação ensaio baseado no blot quantitativa ponto é que o controlo negativo sempre mostra níveis apreciáveis de sinais de fundo que não podem ser totalmente eliminados. Portanto, o ensaio de mancha de ponto por si só não pode excluir a possibilidade do capsídeo monta a um nível inferior a sensibilidade do ensaio. A este respeito, deve notar-se que, para gerar os controles negativos, uma condição é usada sob quais genomas virais de AAV exponencialmente replicar na ausência do capsídeo proteína VP3. Esses controles negativos podem ser gerados por transfecting células HEK 293 com pAAV-repórter, pHLP-Rep e pHelper (tabela 2) e são usados para reduzir falsos positivos.

DNase eu tem sido amplamente utilizada como uma nuclease no borrão de ponto e ensaios baseados em qPCR para quantificação de AAV para remover DNAs plasmideo residual e não embaladas genomas virais que contaminou os preparativos de AAV. Estes contaminantes outra forma levariam a uma sobreavaliação de títulos; Portanto, a digestão de nuclease é um passo muito importante para quantificar com precisão a concentração do genoma viral. DNase eu enzimas estão disponíveis a partir de vários fabricantes e fornecedores comerciais; no entanto, a importância da seleção de DNase eu na quantificação da AAV aparenta ter sido subestimado. Para investigar como a escolha de nuclease pode afetar os resultados do ensaio de mancha do ponto, as seguintes três nucleases foram comparadas por sua capacidade de remover sinais de fundo do AAV vetor contendo meios de cultura preparados como descrito nos passos 2 e 3: DNase I A enzima, DNase I enzima B e S. marcescens endonuclease (Tabela de materiais). Estudos publicados utilizaram o antigo DNase dois eu enzimas13,21,22,23,24 e tenho vindo a utilizar endonuclease s. marcescens em anterior e atual estudos. Para nossa surpresa, foi identificado que DNase I enzima A não é de todo uma escolha apropriada para o ensaio de mancha de ponto usando a mídia contendo vírus nas várias condições testadas, resultando em sinais de fundo elevado do controle negativo, enquanto DNase I enzima B e S. marcescens endonuclease reduzido eficazmente os sinais de fundo com DNase I enzima B sendo ~ 2 dobras mais eficaz do que a S. marcescens endonuclease (Figura 3A, B). C de enzima DNase I também foi encontrado para ser muito eficaz para reduzir os sinais de fundo (dados não mostrados). Estes dados demonstram que existem diferenças significativas em actividades enzimáticas entre nucleases comercialmente disponíveis quando as reacções enzimáticas são realizadas em preparações de AAV impuro embora nuclease digestão deve ser eficaz quando um pequeno quantidade de preparações purificadas de virais é tratada sob uma condição otimizada. Assim, estes dados destacam a importância da correta seleção da nuclease no ensaio quando submetidos a um ensaio quantitativo ponto de borrão ou qPCR impuro preparações de AAV.

Figure 1
Figura 1: uma análise de borrão ponto representativo para determinar o título de um vetor de CsCl-purificado AAV. (A) Double-stranded vector AAV2G9-CMV-GFP foi produzido em células HEK 293 por um padrão livre de adenovírus três método de transfeccao Plasmideo em grande escala e purificado por duas rodadas de ultracentrifugação gradiente de CsCl, seguido de diálise. 0.3, 0.1 e 0,03 µ l da unidade populacional de vetor AAV purificado (apagado na coluna mais à direita) foram submetidos a ensaio quantitativo ponto borrão em duplicado com dois conjuntos de padrões de DNA do plasmídeo duplicadas (DST). O Borrão foi hibridizado com uma sonda GFP P-etiquetada 32(0,77 kb), e a imagem foi obtida utilizando uma imagem de fósforo sistema de digitalização. (B) uma curva padrão mostrando a relação entre as quantidades de DNA de plasmídeo conhecido (ng-eq, eixo x) e intensidades dot (arbitrária unidade (UA), eixo y). Os números no eixo y foram obtidos com a imagem de fósforo sistema de digitalização. R indica o coeficiente de correlação de Pearson. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: ensaio de mancha de ponto de cruz-complementação de AAV VP3-AAP. Produção de partículas Double-stranded vírus adeno-associados-CMV-GFP vector foi testada para as proteínas VP3 da AAV cobra, AAV9 e AAV5 na presença ou ausência de sua cognata PittCon ou na presença de AAPs de origem heteróloga. (A), o ensaio foi realizado em um conjunto biologicamente duplicado de experimentos (conjunto A e conjunto B) com o tempo de incubação de 4 h com endonuclease s. marcescens , e o título de vetor AAV obtido de cada combinação foi determinado por um ponto quantitativo borre o método descrito na seção de protocolo. Cada ponto representa dois terços (5 e 6 linhas, 66,7%) ou dois-trigésimos (dias 7 e 8 linhas, 6,7%) de DNA recuperado de cada 200 µ l de meio colhidas as amostras ou o controle negativo. As quatro principais linhas (linhas de 1ª a 4ª) representam dois conjuntos de padrões de DNA do plasmídeo (STD 1 e 2 STD) apagados em duplicata (ou seja, linear pEMBL-CMV-GFP plasmídeo, que é o plasmídeo utilizado para produção de vetor double-stranded vírus adeno-associados-CMV-GFP). A membrana de borrão ponto foi sondada com uma sonda GFP P-rotulado de 32. O par de pontos indicados com retângulos arredondados é controles negativos. As duas linhas superiores (STD 1) são do fundo do blot original mas foram cortadas e movidas para o topo, sem alterar a intensidade da imagem para exibir ambos os padrões de plasmídeo (STD 1 e 2 STD) lado a lado. Esta manipulação é indicada com uma linha preta na figura. (B) título Viral foi determinado para as combinações de VP3 e proteínas AAP pelo dot blot ensaio. O gráfico representa um biologicamente quadruplicated conjunto de dados, dois de painel A e dois do outro borrão de ponto que não é mostrado. Barras de erro indica a média + /-SD (n = 4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: uma comparação das actividades enzimáticas de nucleases diferentes em preparações de vetor AAV impuro. (A), A mancha de quantitativos ponto mostrando a eficácia de cada tratamento de nuclease na eliminação de sinais de fundo. Uma preparação AAV9-CMV-GFP double-stranded vetor contendo ("vetor AAV9") e um "controle de não-capsídeo" foram produzidos por transfecção de células HEK 293 com plasmídeo DNAs e submetidos ao ensaio. O controle de não-capsídeo não continha partículas virais, mas continha exponencialmente amplificadas genomas de vetor de CMV-GFP não embaladas. MgCl2 foi completado em uma ou três vezes as quantidades recomendadas (6 mM e 18 mM para DNase I A enzima; e 2,5 mM e 7.5 mM para DNase I enzima B) sem levar em consideração a 0,8 mM MgSO4 presente no meio. Para o tratamento com endonuclease S. marcescens , apenas uma condição descrita na seção de protocolo foi testada. Todas as amostras foram tratadas com cada nuclease por 1h. A membrana de borrão ponto foi sondada com uma sonda GFP P-rotulado de 32. Bem duas colunas (STD 2) estão do lado esquerdo do blot original mas foram cortadas e mudou-se para a direita sem alterar a intensidade da imagem para exibir ambos os padrões de plasmídeo (STD 1 e 2 STD) lado a lado. Esta manipulação é indicada com uma linha preta fina na figura. (B) pontos nas amostras não-capsídeo controle no painel A são quantificados e exibidos como média ± | cada valor — valor |. Sete dos 12 amostras tratadas com DNase I enzima A (indicada com um asterisco) mostram valores apenas ligeiramente superiores ao padrão o mais elevado; Portanto, estão incluídos neste gráfico para comparação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Serratia marcescens Endonuclease Buffer
50 mM Tris-HCl
2 mM MgCl2
Ajuste o pH 8,5, com 4 M de NaOH.
10x Buffer Proteinase K
pH 100 mM Tris-HCl 8.0
pH de 100 mM EDTA 8.0
5% SDS
2 x solução alcalina
NaOH de 800 mM
20 mM de EDTA
20 x SSC (1L)
175,3 g NaCl
88,2 g de citrato de sódio tribásico (at3C6H5O7)
Solução do Denhardt 100 x (50 mL)
albumina de soro bovino de 1 g (fração V) Nota: Filtragem é essencial para remover pequenas partículas que causam sinais de hibridação de fundo.
1G Polysucrose 400
1G de polivinilpirrolidona
Dissolva em 20 mL de água em um banho de água de 55 ° C.
Ajuste volume final de 50 mL.
Filtro-esterilizar com um filtro de 0,22 μm.
Tampão de hibridização
1% SDS Nota: Tampão de hibridização da loja a 4 ° C e calor a 65 ° C, em um antes do banho de água de usar.
6 x SSC
5 x solução de Denhardt
pH 10 mM Tris-HCl 8.0
Tampão de lavagem
0,1% SDS
0,1 x SSC
O polyethylenimine (PEI) solução (1 mg/mL, 500 mL)
Adicione 500 mg PEI em 450 mL de água e mexa. Nota: Para o armazenamento mais longo, é recomendável-80 ° C.
Adicionar HCl concentrado para trazer o pH baixo para < 2.0 para dissolver PEI (aproximadamente 800 µ l de HCl será necessário).
Adicionar 10 M NaOH para trazer o pH até 7.0 (aproximadamente 500 µ l de 10 M NaOH será necessário).
Ajuste o volume para 500 mL de água.
Filtro-esterilizar com um filtro de 0,22 μm.
Alíquota e loja a-20 ° C.
Fenol-clorofórmio (mistura 1:1) para a mancha do ponto quantitativo
Adicionar saturada com buffer de fenol (pH 8.0) e clorofórmio na proporção de 1:1 em um tubo cônico polipropileno de 50 mL. Nota: O buffer cobrindo a camada orgânica, se deixado no tubo, pode transitar em tubos de amostra a pipetagem e pode fazer o ensaio imprecisas.
O tubo vigorosamente a mistura de vórtice.
Permitir a separação de fases por centrifugação e em seguida, retire a camada aquosa completamente.
Loja a 4 ° C.

Tabela 1: solução e receitas Buffer. Receitas para soluções e buffers necessários para completar o ponto quantitativo borre protocolo.

Plasmídeo AAP(+) (μg) AAP(-) (μg) Controle negativo (μg) Controle de transfeccao (μg)
pCMV-AAVx-VP3 0.4 0.4
pCMV-bandeira-AAPx 0.4
pAAV-repórter 0.4 0.4 0.4
pHLP-Rep 0.4 0.4 0.4
pHelper 0.4 0.4 0.4
pCMV (vazio) 0.4 0.8
pCMV-GFP 2.0
Total 2.0 2.0 2.0 2.0

Tabela 2: combinações de plasmídeo para ensaio de cruz-complementação de AAV VP3-AAP realizado em um formato de placa 6. Combinações do plasmídeo DNAs deve ser usado para transfecção de células HEK 293 em cada grupo experimental são mostradas. pCMV-AAVx-VP3, um plasmídeo expressando serótipo AAV x (x = 1, 2, 3, etc.) proteína VP3 sob o realçador de CMV-IE-promotor; pCMV-bandeira-AAPx, um plasmídeo expressando serótipo AAV x (x = 1, 2, 3, etc.) proteína AAP sob o realçador de CMV-IE-promotor; pAAV-repórter, um plasmídeo que tem duas repetições terminais de AAV2 invertido (ITRs) e destina-se a produção de vetor AAV recombinante; pHLP-Rep, um plasmídeo expressando a proteína AAV2 Rep; pHelper, um plasmídeo ajudante de adenovírus; pCMV (vazio), um plasmídeo vazio adicionado para controlar as condições experimentais; pCMV-GFP, um plasmídeo expressando um gene marcador de fluorescência (por exemplo, as boas práticas agrícolas) para verificar o sucesso do transfection. Transfections são realizados em placas de 6-bem e usam um total de 2 µ g do plasmídeo DNAs.

Mistura A Para 10 tubos (μL)
Serratia marcescens Endonuclease Buffer 91,2
0,1 NaOH M 8.8
Total 100
Mistura B Para 10 tubos (μL)
Serratia marcescens Endonuclease Buffer 91,2
1 M MgCl2 7.04
Serratia marcescens Endonuclease (250 unidades/μL) 0.176
Total 100
Mix C Para 10 tubos (μL)
10x Buffer Proteinase K 400
Proteinase K (20 mg/mL) 100
H2O 1.300
Total 1.800
Mistura D Para 10 tubos (μL)
100% etanol 8.000
Acetato de sódio 3M (pH 5.2) 320
Glicogênio ostra (20 mg/mL) 10
Total 8.330

Tabela 3: lista de mestre mistura reagentes. Mistura A e B de mistura são usados para o tratamento de endonuclease S. marcescens em passo 3.2. Estas duas misturas devem ser feitas separadamente para evitar a precipitação do hidróxido de magnésio. C Mix é usado para tratamento de Proteinase K na etapa 3.3. Mistura D é usado para precipitação do álcool etílico na etapa 3.4.3. Os volumes indicados na tabela são para mestre de mistura reagentes para 10 tubos.

Padrão de DNA de plasmídeo (ng) Volume (µ l) de 25 pg / µ l plasmídeo DNA solução-padrão Volumes (µ l) de água Volume total (µ l)
5 600 0 600
2.5 300 300 600
1.25 150 450 600
0.625 75 525 600
0,313 37.5 562.5 600
0.156 18,8 581.2 600
0.078 9.4 590.6 600
0.039 4.7 595.3 600

Tabela 4: padrões de DNA do ponto quantitativa borrão plasmídeo. Volumes necessários da solução-padrão de DNA do plasmídeo pg / µ l 25 e água ou TE preparar plasmídeo padrões de DNA por diluições em série dupla (600 µ l/tubo) são mostrados. Os números na coluna padrão de DNA de plasmídeo (0.039 a 5 ng) são a quantidade de DNA em 200 µ l de cada solução-padrão de DNA do plasmídeo.

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Discussion

Neste relatório, a utilidade dos ensaios de borrão ponto quantitativa para estudar AAV AAPs e seu papel na montagem do capsídeo é descrita. Conhecimentos adquiridos com estes estudos podem fornecer insights detalhadas sobre as diferenças inatas no processo de montagem de capsídeo do vírus adeno-associados e o papel funcional da AAPs entre diferentes sorotipos. A este respeito, o ponto de cruz-complementação de AAV VP3-AAP blot revelou que cobra AAV VP3 exibido uma dependência estrita a expressão co seu cognato AAP para montagem do capsídeo e que cobra AAP não promove Assembleia de capsídeo de serótipos heterólogos de ensaio . Esta observação é intrigante porque o AAV AAP-dependente sorotipos que anteriormente foram investigados (AAV1, 2, 3, 6, 7, 8, 9 e 12) são todos capazes de processar montagem pelo menos em algum grau, utilizando um heterólogo AAP6.

Quantitativa dot ou slot blot hibridização é um método tradicional para quantificação de ácidos nucleicos contidos em amostras múltiplas ao mesmo tempo em uma maneira conveniente de25. O método tinha sido amplamente utilizado para quantificação de DNA e RNA até qPCR tornou-se predominante na década de 199026,27. Embora qPCR tem vantagens sobre o borrão ponto quantitativa e outros ensaios baseados em hibridização em que qPCR apresenta uma maior sensibilidade e uma gama dinâmica maior, ele também carrega um risco inerente de exponencialmente aumentando erros inconscientemente, que foi o caso para uma concentração de estoques de vetor AAV determinados pelo qPCR13,23. Quantitativa dot blot ensaios são facilmente configurar com um custo barato e facilmente realizados enquanto pesquisadores têm acesso a um sistema de imageamento molecular quantitativo que pode adquirir sinais de dot blot membranas hibridizados com uma sonda ou radioactiva ou uma sonda fluorescente ou quimioluminescente não-radioativo. Embora este protocolo utiliza 32P-rotulado sondas radioactivas para detecção do sinal, outros com sucesso usam sondas de DNA não-radioativo diretamente rotuladas com uma fosfatase alcalina termoestável comercialmente disponível28. Os ensaios de mancha de ponto usam um princípio simples e o ensaio por si só não representa um desafio técnico para artistas; Portanto, os resultados são geralmente pode ser reproduzidos nem por pessoas inexperientes.

Além das aplicações descritas aqui, usamos rotineiramente uma versão simplificada e acelerada do procedimento ponto borrão que pode quantificar semi partículas AAV rapidamente. Vantagens dos ensaios de borrão ponto neste contexto incluem: (1) o ensaio não requer purificação ou amplificação enzimática de genomas virais que leva horas, (2) uma combinação de calor e desnaturação alcalina é suficiente para quebrar as partículas de vírus adeno-associados em uma amostra solução e lançamento desnaturado genomas virais na solução que estão prontos para vincular a uma membrana de borrão de ponto e (3) a presença de sal em alta concentração em amostras não afeta significativamente os resultados do ensaio. Por exemplo, é possíveis quantificar semi partículas AAV em soluções de CsCl-ricos (por exemplo, frações obtidas por ultracentrifugação de densidade-gradiente de CsCl), colocando uma pequena alíquota (≤ 10 µ l) de amostras em 100 µ l de solução alcalina, aquecimento a 100 ° de 1x C por 10 min e mancha em uma membrana com ou sem normas preparadas antecipadamente, seguidas por uma hibridização de 15 min, 3 x 3 min lavagens e exposição para um fósforo de imagem a tela por 15 min (ou mais quando usando uma sonda com diminuição da radioactividade). Todo o processo pode ser concluído em 1 h, uma vez que o usuário torna-se familiarizado com o procedimento. Usamos este método acelerado, o que habitualmente chamamos de "método de borrão de ponto ebulição", para identificar a AAV fracções de CsCl rico em partículas durante a purificação de vetor processam e determinar aproximadamente uma concentração de estoques de vetor AAV purificados antes de iniciar a extensa processos para a caracterização do vetor. Assim, embora os ensaios de mancha de ponto podem ser vistos como um método obsoleto para quantificar os ácidos nucleicos e já foram substituídos por vários métodos baseados em PCR, em uma ampla gama de disciplinas científicas, há ainda uma série de vantagens para este método deve fazer pesquisadores consideram emprega em seus laboratórios.

O passo mais crítico no protocolo é o tratamento de nuclease das amostras. Se esta etapa não é realizada em uma condição ideal, causaria sinais de fundo elevado. Nós usamos S. marcescens endonuclease enquanto DNase eu enzimas de diferentes fontes são amplamente utilizadas em outros laboratórios para quantificação de DNA viral. A DNase I da origem de pâncreas bovino tem sido mais amplamente utilizada pelos pesquisadores. Isto é, em parte porque o DNase pancreática bovina, fui o primeiro identificado e mais extensivamente caracterizados bioquimicamente29. A DNase eu enzimas disponíveis atualmente de fornecedores comerciais são produzidas a partir de várias fontes biológicas diferentes tais como Pichia pastoris (DNase I enzima A), a forma nativa purificada a partir do pâncreas bovino (por exemplo, B de enzima DNase I), e as enzimas recombinantes produziram em uma espécie de levedura ou Escherichia coli (DNase I enzima C). Achamos que o DNase eu enzimas de todos os três destas fontes diferentes têm sido usadas em estudos de quantificação de vetor de vírus adeno-associados publicados; no entanto, a nosso conhecimento, nenhum dos estudos anteriores investigaram se as enzimas de diferentes fontes são igualmente eficazes na digestão de moléculas de DNA contaminantes em preparações de vetor de vírus adeno-associados. Note-se que DNase eu tratamento para ensaios de vetor de vírus adeno-associados geralmente é realizado sob condições não-otimizados devido à presença de impurezas derivadas de células e o meio de cultura. A observação de que DNase I enzima A só é parcialmente ativa em meio de cultura que usamos tem implicações significativas na concepção do ensaio para quantificação de vetor AAV por qPCR e borrão de ponto e alerta pesquisadores a esta questão anteriormente não identificada. A este respeito, S. marcescens endonuclease expresso em Escherichia coli, é uma endonuclease ideal não só para fins de fabricação vetores AAV, mas também para quantificação de vetor de vírus adeno-associados. Isto é porque sua atividade enzimática pode ser mantida ao longo de uma vasta gama de valores de pH e concentrações de íons de magnésio e cátions monovalentes. Por esta razão, e porque S. marcescens endonuclease é aproximadamente 2 vezes mais barato que DNase I B da enzima em uma base por unidade, nós preferimos usar endonuclease S. marcescens em análises de rotina ponto quantitativa do borrão.

Em resumo, ponto quantitativa borrão ensaios são um procedimento relativamente simples que pode facilmente fornecer informações sobre a capacidade de produzir partículas virais sob condições variáveis. Em comparação com abordagens de Titulagem alternativos, tais como qPCR, essa abordagem requer pouca ou nenhuma, otimização. Ele também pode ser facilmente aplicado a vetores de qualquer sorotipo e pode ser usado para título ambos single - e double-stranded vetores sem modificar o protocolo. Após transfections e colheita de amostras contendo vetor AAV (meio de cultura e/ou células), o protocolo pode ser concluído em um dia, assim, rapidamente, responder às perguntas sobre a capacidade de produzir partículas virais de diversas condições, incluindo várias combinações de proteínas AAV VP3 e AAP. Borrões de quantitativos ponto oferecem um método conveniente para resolver várias perguntas sem resposta sobre interações de VP-AAP e suas funções no assembly do capsídeo em uma grande variedade de diferentes sorotipos de vírus adeno-associados e isolados.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Agradecemos Xiao Xiao na Universidade de North Carolina em Chapel Hill, por nos oferecer o plasmídeo pEMBL-CMV-GFP. Agradecemos a Christopher Cheng e Samuel J. Huang pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo serviço de saúde pública concede (NIH R01 NS088399 e EY232113 T32).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase MilliporeSigma 1016970001 Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text.
DNase I Roche 4716728001 Referred to as DNase I Enzyme A in the main text.
DNase I Invitrogen 18047019 Referred to as DNase I Enzyme B in the main text.
DNase I New England Biolabs M0303L Referred to as DNase I Enzyme C in the main text.
1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes Corning 430909
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 05-408-129
15 mL Polypropylene Conical Tube Corning 352097
3 M Sodium Acetate Teknova S0298
50 mL Polypropylene Conical Tube Corning 430291
AAV-293 Cells Agilent 240073 HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions.
AccuGENE 0.5 M EDTA Solution Lonza 51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 Lonza 51238
AccuGENE 10% SDS Lonza 51213
AccuGENE 1X TE Buffer Lonza 51235
Bio-Dot Apparatus Bio-Rad 1706545
Bovine Serum Albumin MilliporeSigma A3294
Cell Lifter Corning 3008
Chloroform MilliporeSigma 372978
DNA Extractor Kit Wako Pure Chemical Industries 295-50201 This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) Lonza 12-614F
ElectroMAX DH10B Cells Thermo Fisher Scientific 18290015
Ethanol 200 Proof Decon Labs 2716
Fetal Bovine Serum VWR 1500-500
Ficoll 400 Alfa Aesar B22095 Referred to as Polysucrose 400.
Fluorescence Microscope Zeiss Axiovert 40 CFL
Glycogen Roche 10901393001
Herring Sperm DNA Invitrogen 15634-017
Hybridization Tubes Thermo Fisher Scientific 13-247-150
ImageQuant TL GE Healthcare Life Sciences ImageQuant TL
L-glutamine 200 mM Lonza 17-605E
Magnesium Chloride Hexahydrate MilliporeSigma M0250
MicroPulser Electroporator Bio-Rad 1652100
Mini Quick Spin DNA Columns MilliporeSigma 11814419001
pAAV-RC2 Vector Cell Biolabs Inc VPK-422
Penicillin/Streptomycin 10K/10K Lonza 17-602E
Phosphate Buffered Saline Lonza 17-516F
Phosphorimaging Exposure Cassette GE Healthcare Life Sciences Various
Phosphorimaging Screen GE Healthcare Life Sciences Various
Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162
Platinum Pfx DNA Polymerase Invitrogen 11708013
Polyethylenimine Polysciences Inc 23966-2
Polyvinylpyrrolidone MilliporeSigma P5288
Prime-It II Random Primer Labeling Kit Agilent Technologies 300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		 MilliporeSigma Custom Primer
Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 MilliporeSigma Custom Primer
Proteinase K Solution Invitrogen 25530-049
Restriction Enzymes New England Biolabs Various
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15632011
Serological Pipettes Thermo Fisher Scientific 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-10
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate MilliporeSigma C8532
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203L
Thermal Cycler Eppendorf 6321000515
Tissue-culture Treated 6-well Plate Corning 353046
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-5
Typhoon FLA 7000 GE Healthcare Life Sciences 28955809
UltraPure Buffer-Saturated Phenol Invitrogen 15513-047
UV Crosslinker Spectroline XLE-1000 Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2.
Zeta-Probe Membrane Bio-Rad 162-0165

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References

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Biologia questão 136 vírus Adeno-associado (AAV) montagem-ativando proteína (AAP) ensaio de mancha de ponto cruz-complementação quantitativos titulação viral terapia gênica
Um ensaio de Blot Dot quantitativa para titulação de AAV e seu uso para avaliação funcional do vírus Adeno-associado Assembly-ativação de proteínas
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Powers, J. M., Chang, X. L., Song,… More

Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins. J. Vis. Exp. (136), e56766, doi:10.3791/56766 (2018).

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