Summary
Aşağıdaki iletişim kuralı hasta elde edilen yumuşak doku sarkomu (STS) birincil kültürünün kurulması üzerinde duruluyor. Bu model bize moleküler arka plan ve bu nadir maligniteler farmakolojik profil daha iyi anlamak için yardımcı ve daha fazla STS yönetimi iyileştirme amaçlı araştırma için bir başlangıç noktası temsil edebilir.
Abstract
Yumuşak doku sarkomları (STS) heterojen maligniteler zor tanı, sınıflandırma ve yönetimi ile bir spektrum temsil eder. Bugüne kadar 50'den fazla histolojik alt türlerinden bu nadir solid tümör tespit edilmiştir. Böylece, onların olağanüstü çeşitlilik ve düşük insidansı nedeniyle, bu tümörlerin biyoloji anlayışımız hala sınırlıdır. Hasta kaynaklı kültürler STS patofizyolojisi ve Farmakoloji eğitim için ideal bir platform temsil eder. Böylece tümör numuneler cerrahi rezeksiyon uygulanan hastalardan hasat itibaren STS insan preklinik modeli geliştirdik. STS hücre kültürleri hasta türetilmiş cerrahi numuneler collagenase sindirim tarafından elde edilen ve filtrasyon tarafından izole. Hücreleri sayılır, tohumlari ve 14 gün içinde standart monolayer kültürler için yaptı ve ardından aşağı akım analizi ile. Moleküler veya ilaç analizleri gerçekleştirmeden önce STS birincil kültürler kurulması ile cytomorphologic özellikleri ve, ne zaman elde edilebilir, değerlendirme doğrulandı immunohistokimyasal işaretleri. Bu yöntem 1) bu kötü keşfedilmeyi maligniteler Doğal Tarih çalışmaya ve 2) bir çaba daha fazla eylem mekanizmaları hakkında bilgi edinmek için farklı ilaçlar etkilerini sınamak için yararlı bir araç temsil eder.
Introduction
Yumuşak doku sarkomları (STS) bir spektrum Mezenkimal kökenli muhasebe bütün solid tümör1,%21'için türdeş olmayan lezyonların içerir ve Yeni Dünya Sağlık Örgütü sınıflandırma 50'den fazla varlığı tanır farklı alt türlerinden3. Bunlar arasında en yaygın histotypes adipocyte sarkomu veya Liposarkom ve Leyomiyosarkom, % 15 ve tüm yetişkin STS, sırasıyla4,%511'i için muhasebe vardır. STS-ebilmek gelişmek vücudun farklı bölgelerinde de, ekstremitelerde ve retroperitoneum % 60 ve % 20 olgunun, sırasıyla6meydana gelen en yaygın siteleri vardır.
Adjuvan ve neoadjuvan kemoterapi faydaları hala pek açık değildir ve yalnızca seçili durumda7' olarak kabul edilir ise lokalize hastalığın tedavisinin geniş cerrahi rezeksiyon, temel taşıdır. Metastatik ortamda kemoterapi standart tedavi ama sınırlı sonuçlar8gösterir. STS moleküler biyoloji daha iyi bir anlayış geçerli ayırıcı tanı geliştirmek, mevcut uygulamaları en iyi duruma getirmek ve tedavisi için yeni hedefler belirlemek için yardımcı olacaktır.
Bu bağlamda, kanser araştırması ölümsüzleştirdi hücre hatları9kullanarak uzun yıllar sahne aldı. Bu deneysel modeller normalde standart monolayer destekler kültürlü veya10 in vivo xenograft modeller kurmak için immünyetmezligi kemirgen implante. Ölümsüzleştirdi hücre hatları ile araştırma deneyler yeterli sayıda gerçekleştirileceği bir yönetilebilir ve mağaza kolay malzeme temsil eder. Onlar, aslında, en ucuz ve en çok kullanılan aracı preklinik çalışmalar11'.
Ancak, hücre bulundurarak kanser modelleri de bazı sınırlamalar var, uzun süreli örneğin pasajlar sayısının artmasıyla birlikte monolayer sistem kültüründe fenotipik indükler ve genetik sürüklenme, hücreleri yapımı daha az muhtemel anahtar tümör özetlemek için özellikleri. Ayrıca, hücre satırı kültürleri hücre hücre etkileşim ve tümörlerin biyolojik davranışını taklit ve tümör microenvironment karakterize sinyal molekülü crosstalk çoğaltmak başarısız. Bu sorunlar preklinik ve klinik sonuçları12arasında varolan boşluğu oluşturmaktadır.
Yukarıda bahsedildiği, birincil kültürler hasta kaynaklı ilgi13artmıştır. Nitekim, kötü huylu ve normal doku eksizyon kanser hücre fenotip ve heterojenlik, böylece daha fazla temsilcisi tümör microenvironment, başlangıç materyali sunan kaybetme riskini azaltır. Ayrıca, cerrahi rezeksiyon uygulanan hastalardan hasat taze tümör örnekler kullanımı tek tümörler araştırmak ve bir hastanın vücut14aynı kısmından farklı lezyonlar karşılaştırmak için bize sağlar. Yukarıdaki nedenlerden dolayı doku kaynaklı hücre kültürleri tümör patofizyolojisi ve Farmakoloji15,16,17, özellikle'STS hangi ticari olarak mevcut sarkomu hücre hatlarında çalışmaya değerli bir malzeme sağlar. sınırlı18' dir. Biz böylece en iyi duruma getirilmiş hasta kaynaklı STS birincil hücre kültürü cerrahi olarak eksize tümör doku13,19,20ila başlayan bir yöntem. Bizim yöntem bir tek hücre süspansiyon elde etmek için gece enzimatik doku ayrılma tarafından takip küçük doku parçaları içine tümör numune disaggregating oluşur. Ertesi gün, Enzimatik sindirim taze kültür medya ekleyerek durdurulur ve elde edilen süspansiyon doku parçaları, hücre-toplamları ve aşırı matris malzeme veya enkaz kaldırmak için filtre uygulanır. Son olarak, bir izole tümör hücreleri cytospinned cam slayda, sabit ve STS birincil kültür kurulması onaylayan cytomorphological, immunohistokimyasal ve Moleküler Sitogenetik değerlendirme amaçlı aşağı akım analizi için depolanan bölümüdür (örneğin balık analizi ile MDM2 amplifikasyon temsil eden standart ayırıcı tanı için iyi farklılaşmış Liposarkom ve dediferansiye Liposarkom) 4. kalan hücrelerin gen ifade profil oluşturma ve farmakolojik çalışmalar için bir standart monolayer kültür içine tohumlari. Tüm deneyler düşük kullanarak gerçekleştirilen belirli kanser subclones seçim önlemek için birincil kültürlerin geçiş ve deneyimli sarkomu patolog tarafından analiz. Biz böylece tamamen insan STS ex vivo modeli13,19,20oluşturduk. Bu çok yönlü, kolay kolu modeli preklinik araştırma, örneğin tanı ve teşhis için yeni moleküler işaretleri veya faaliyet daha derin bir anlayış ve mekanizmaları kazanmak için farklı türleri için yararlı bir araç temsil eder eylem STS yönetiminde kullanılan standart ve yeni ilaçların.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
STS hücreler tümör kütlesini cerrahi hastaların STS ile eksize etkilenmezsiniz. İletişim kuralı yerel Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve iyi klinik uygulama yönergeleri ve Helsinki Deklarasyonu göre gerçekleştirilir. Tüm hastalar yazılı çalışmaya katılmak için onay verdi. Cerrahi örnek bir deneyimli sarkomu patolog tarafından analiz ve cerrahi 3 saat içinde işlenir.
1. tümör numune toplama ve işleme:
- DMEM düşük glikoz orta parafin film ile kapalı 50 mL 100 mL steril idrar kapsayıcısında bir sarkomu patolog yardımıyla ile tümör örnekler toplamak.
- En fazla 3 h 4 ° C'de örnekleri tümör rezeksiyonundan sonra saklamak.
- Steril doku kültürü başlık altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- % 70 etanol ile örtünün sterilize ve steril eldiven giymek.
- Çelik Inox cımbız % 70 etanol (kullanım steril bir gazlı bez) ile sterilize.
- Parafin film idrar kapsayıcıdan kaldır ve atın.
- Dış idrar kabı % 70 etanol ile yıkayın.
- Kare bir petri açın.
- İdrar kabı açın ve tümör örnekler steril çelik Inox cımbız kullanarak kare petri kabına aktarın.
- Tümör numuneler PBS ile iki kez yıkayın.
- Steril cerrahi neşter açın.
- İnce tümör örnekler 1-2 mm3 parçalar halinde bile olmamalı.
- Dörtte birini 2 mL tüp içinde toplam örnek toplamak.
- 1 mL trizol reaktif (tüp satın) ekleyin ve hemen-80 ° c (örnek aşağı akım analizde STS gen ifade değerlendirme için kullanılacak) dondurma.
- İnce rendelenmiş tümör malzeme 15 mL tüp içinde kalan toplamak.
- Collagenase 4 mL ekleyin çözüm (4 µg/mL konsantrasyonu PBS içinde çözünmüş collagenase tip) yazın.
- Collagenase seyreltik çözüm DMEM yüksek kültür ortamının 4 mL ile yazın (son konsantrasyonu collagenase ben türüdür 2 µg/mL).
- 15 mL tüp kapatın ve tutkal ile parafin film.
- Çalışırken bir shaker bir kuluçka 15dk sindirimi harekete geçirmek için karıştırma koşullarında 37 ° C'de 15 mL tüp koy.
- 15 dakika sonra koşullar gecede oda sıcaklığında karıştırma altında çalışırken shaker tüp depolamak.
- Ertesi gün 15 mL tüp steril başlık altında koymak.
- Yavaşça hücre süspansiyon 50 mL tüp tepesine bağlı 100 µm steril filtre ile filtre.
- Filtre DMEM yüksek kültür medya % 10 fetal sığır serum, % 1 glutamin ve % 1 penisilin/streptomisin ile yıkayın.
- 100 µm steril filtre atmak, oda sıcaklığında 5 dakika 50 mL tüp ve santrifüj 225 x g de yakın.
- Süpernatant tüp ters çevirme tarafından atmak.
- Hücreleri 1-2 mL DMEM yüksek kültür % 10 fetal sığır serum, % 1 glutamin ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenen medya ile yeniden askıya alma.
Not: Birimin işlenen tümör örnek miktarına bağlıdır. - Neubauer odası içeren hücreleri saymak.
- Örnek 1:2 trypan mavi'sulandırmak ve seyreltme 10 µL hücreleri saymak için kullanın.
- En az iki kez saymak ve hücreleri toplanan toplam ortalama sayısını çoğaltır ortalamasını hesaplamak.
- 80.000 hücreler/cm2yoğunluğu bir standart monolayer kültür plaka hücrelerde.
Not: Her zaman deneylerde denetimleri içerir. En az 3 teknik çoğaltır her koşul için gerçekleştirin. En az 2 biyolojik çoğaltır gerçekleştirin. Preklinik Farmakoloji, gen ekspresyonu ve protein ifade analizleri için deneyler kültür pasajlar düşük bir sayı ile hücre kanser hücre fenotipleri kaybetmemek için tohum, 30-45 gün içinde yapılmalıdır. - Saytolojik numune hazırlama.
- DMEM yüksek kültür medya % 10 fetal sığır serum, % 1 glutamin ve % 1 penisilin/streptomisin ile takıma 200 µL 100.000 hücreleri toplamak.
- Pipet çözüm (200 µL pipet) tek kullanımlık bir huni içine bir filtre ile donatılmış ve bir cam slayt ile monte.
- Cytocentrifuge açın ve örnekleri yerleştirin.
- 18,6 x g 20 dk için cytocentrifuge çalıştırın.
- Filtre ile donatılmış huni atmak.
- Slaytları aseton 10 dk 5 min için kloroform ardından fix.
- -20 ° C'de slaytları depolama
Not: Çözülme ve örnekleri boyama önce hidrat ve üreticinin yönergeleri izleyerek boyama gerçekleştirmek. En az 3 teknik çoğaltır hazırlayın.
2. STS hücre kültürleri:
- Medya haftada (DMEM yüksek kültür % 10 fetal sığır serum, % 1 glutamin ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenen medya) değiştirin.
- Kültür bir 200-1000 µL pipet kullanarak orta atın.
- Yeni taze orta 200-1000 µL pipet kullanarak ekleyin.
- Hücre geçiş:
- Ne zaman % 90 civarında görkemlidir hücre bağlantısını kesin:
Not: STS hücre kültür amplifikasyon haftada bir kültür koşullara göre yapılmalıdır. - Orta atmak, PBS ile yıkayın ve tripsin 1 2-3 mL ekleyin PBS x
Not: Kullanılan tripsin hacmi kültürlü hücreleri elde edilen miktarına bağlıdır. - 3-5 dk 37 ° C'de hücreler kuluçkaya
- Müstakil hücreleri 200-1000 µL pipet kullanarak plaka toplamak.
- 15 mL tüp içine müstakil hücreleri pipette ve DMEM yüksek kültür medya % 10 fetal sığır serum, % 1 glutamin ve enzimatik reaksiyon durdurmak için penisilin/streptomisin % 1 ile 4 mL ekleyin.
- 225 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant atmak.
- Hücre Pelet 1 mL DMEM yüksek kültür % 10 fetal sığır serum, % 1 glutamin ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenen medya ekleyerek yeniden askıya alma.
- Yeni bir kültür plaka veya üreticinin yönergelerine göre son bir hacim ile bir şişesi hücrelerde tohum.
Not: Hücreleri 1:3 daha fazla bölünmüş değil.
- Ne zaman % 90 civarında görkemlidir hücre bağlantısını kesin:
3. aşağı akım analizleri:
Not: Farklı deneyler çeşitli bu model (aşağıya bakın) kullanarak yürütülen olabilir. Bu, bu nedenle, yeterli sayıda örnekleri ve çoğaltır hazırlıklı hangi analizleri gerçekleştirilen çalışmanın tasarım aşamasında karar vermek önemlidir.
- MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromür gibi proliferasyon deneyleri
- Apoptotik deneyleri terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) gibi (tünel) tahlil etiketleme sonunda nick
- İmmunohistokimyasal analizi
- Gen ifade analizi
- Western blot analizi
- ELISA tahlil
- Floresans aktif hücre (FACS) analiz sıralama
- Vivo xenograft modeli
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz hasta elde edilen yumuşak doku sarkomu birincil kültürünün kurulması elde edilir ve burada bir örnek bir belirli STS histotype13tarihinde elde edilen sonuçları raporu için basit bir yöntem tasarlanmıştır. Protokol farklı STS histotypes iyi farklılaşmış Liposarkom dahil olmak üzere birincil kültürleri kurulması için kullanılan Liposarkom, myxoid Liposarkom, Pleomorfik Liposarkom farklılaşmamış myxofibrosarcoma, dediferansiye Pleomorfik sarkomu, özü ve desmoid Fibromatoz.
Birincil kültürler kurulması için başarı oranı % 54 (13 24 STS cerrahi örnekleri birincil kültürler) Kemoterapi, radyoterapi ile tedavi ya da tedavi hastalardan elde edilen cerrahi numuneler için oldu. Diğer taraftan, cerrahi örnekleri yalnızca işlenmemiş hastalardan elde edilen % 72 (13 18 STS cerrahi örnekleri birincil kültürler) içindi.
Tümör hücreleri bir 54 yaşındaki hastanın ameliyatla iyi-differentiated/dediferansiye Liposarkom (ALT/DDLPS) dan izole edildi. MDM2 güçlendirme analizi, şu anda ALT/DDLPS standart ayırıcı tanı için gerçekleştirilen ve bir deneyimli sarkomu patolog tarafından gözden olumlu, bir ALT/DDLPS lezyon (şekil 1A) varlığı teyit. Saytolojik analizi ile izole tümör hücreleri MDM2 amplifikasyon doğruladı (%94.6 kültürlü hücre MDM2 güçlendirme için pozitif) bir hasta elde edilen ALT/DDLPS birincil kültür kurulması (şekil 1B). Birincil kültür devam etti sonra pasajlar standart monolayer kültürlerde çoğalırlar ve hücre canlılığı MTT ve tünel tarafından izlenen tahlil.
Bu model bize şu anda kullanılan farklı ilaçlar veya ifosfamide (IFO), epirubicin (EPI), kasanın IFO + EPI, trabectedin (TREYB), ALT/DDLPS tedavisi için klinik değerlendirme altında ALT/DDLPS birincil kültür duyarlılığını test etmek etkin ve eribulin (erg), ÇMT tahlil kullanılarak gerçekleştirilir. Sonuçları kemoterapi (Şekil 2A) kültürler duyarlılığını doğruladı. En etkin tedavi IFO + EPI, Gelişmiş veya metastatik ALT/DDLPS kullanılan bir ilk basamak tedavi oldu. Ayrıca, hücre morfolojisi uyuşturucu pozlama, vurgulama morfolojik değişiklikler denetim ve sitotoksik tahlil (Şekil 2B) bulguları ile ilgili birincil kültüründe sonuçlarında sonra incelenmiştir. İletişim kuralında belirtildiği gibi birkaç aşağı akım analizleri bu model ile gerçekleştirilebilir. Şekil 3 yönteminin şematik bir gösterimini sağlar ve içinde deneyler translasyonel sonuçları elde etmek için gerçekleştirilmesi gereken bir zaman çizelgesi içerir.
Resim 1 . Hasta elde edilen ALT/DDLPS birincil kültürünü kurulması. A) In situ hibridizasyon (balık) gerçekleştirilen MDM2 amplifikasyon bir hasta doku örneği (100 X görüntü) algılamak için. B) In situ hibridizasyon (balık) gerçekleştirilen MDM2 amplifikasyon birincil bir kültürde (100 X büyütme) algılamak için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Bir ALT/DDLPS birincil kültür kemoterapi. A) hücreleri ile tedavi edildi: ifosfamide (IFO), epirubicin (EPI), IFO + EPI, trabectedin (TREYB) ve eribulin (erg). Üç bağımsız çoğaltır her deneme için yapıldı. Verileri ortalama ± standart hata (SE), belirtildiği gibi çoğaltır sayısını gösteren n ile sunulmaktadır. Gruplar arasındaki farklar değerlendirildi iki kuyruklu Öğrenci t-testi, * p < 0,05. B) görüntüleri ALT/DDLPS birincil kültür uyuşturucu pozlama (2 X büyütme) sonra. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : STS birincil kültür modeli. Zaman çizelgesi ve olası aşağı akım analizleri de dahil olmak üzere STS birincil kültür preklinik modeli şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İyi tanımlanmış preklinik modelleri Tümörlerinin moleküler arka plan aydınlatmak, kötü prognoz tahmin ve kanser hastaları için yeni tedavi stratejileri geliştirmek için ihtiyaç vardır. Bu yüksek olan heterojen Morfoloji açısından özellikle STS gibi nadir tümörler için önemlidir, saldırgan potansiyel ve klinik davranış STS Biyoloji ve hasta yönetimi21anlayışımızı meydan okuyor. Ayrıca, kullanılabilir birkaç ticari sarkomu hücre hatları bu grup Mezenkimal tümörler18preklinik soruşturmalar sınırlar. Ex vivo modelleri böylece değerli araştırma Kaynak STS için temsil eder. Cerrahi olarak rezeke tümör doku (şekil 3) başlayan STS tamamen insan vitro modeli geliştirdik. Yöntem en iyileştirme sırasında birkaç kritik konuları ele ve giderilir. İlk sorun cerrahi tedavi ve örnek işleme arasındaki zaman aralığını ilgili. Başlangıçta, tümör numuneler bizim biosciences laboratuvar belirli bir süre sonra geldiğinde, onlar gecede 4 ° C'de depolanan ve ertesi gün işlenen. Bu örnekleri izole STS hücreleri düşük nükleer silahların yayılmasına karşı etkinlik ve standart monolayer kültür zavallı canlılığı sergiledi. Bu olabilir, kısmen, aslında atfedilen o bütün tümör numune idrar kapsayıcısında işlenmeden önce uzun bir süre için tutulur. Böylece birincil kültür standart monolayer kültüründe çoğalırlar ve iyi canlılığı sergi devam emin olmak için ameliyattan sonra en fazla 3 h için işleme örnek başlangıç saatini değiştiren. Biz de hücre yükünün süreci optimize: küçük homojen doku parçaları enzimatik sindirimi kolaylaştırmak için gereklidir ve bu bir neşter kullanarak sağlanır. Ayrıca, protokol farklı boyutlarda örnekleri ile çalışabiliyordu, kurulması örnekleri başlayan bir birincil kültür boyutu sınırlı (< 2 cm) elde etmek daha zordur. Collagenase toplama bir başka önemli konu olduğu için çok yüksek anenzyme konsantrasyon hücresel stres, STS birincil kültür fenotipik değişiklikler veya tümör hücre survival azalmasına yol açan neden olabilir. İyi Enzimatik sindirim hücreleri matris malzeme ve enkaz ayırt etmek gerekir. Biz son olarak en iyi duruma getirilmiş sindirim aşamasında kullanılacak enzim konsantrasyon. Ayrıca, hücresel stres sınırlamak ve besin STS hücreler için yalıtım aşamasında sağlamak için biz enzim kültür medya PBS gibi diğer Kimyasalları yerine yeniden askıya aldı. Son olarak, çeşitli deneyler Liposarkom ve myxofibrosarcoma gibi farklı STS birincil kültürler üzerinde gerçekleştirilen gen ekspresyonu zaman ve artan duyarlılık kemoterapi13,20üzerinde değişiklikler ortaya koydu. Bu bulgular ile birlikte giderek artan sayıda pasajlar, hem hangi neden fenotipik ve genetik sürüklenme monolayer sistemi için hasta kaynaklı STS hücre kültür uzun süreli atfedilebilecek. Tümör dokusu, daha önce gösterilen, özetlemek için zaman içinde bu kültür sisteminin güvenilirliği azalan bir ex vivo modelleri22,23en önemli sınırlamaları temsil eder. Böylece Protokolü (30-45 gün içinde tohum tümör hücresinin) deneyler gerçekleştirileceği zamanı azaltarak ve tekrarlanabilir ve çevirim sonuçları elde etmek için düşük geçiş kültürler kullanarak optimize. Ayrıca, birincil kültürler donmuş olabilir, ama sonraki canlılığı tümör konumu, STS histotype, cerrahi numune miktarı ve gerçekleştirilen kültür pasajlar sayısı da dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır.
Sistemimiz bir çok avantaj, diğer antikorundan tabanlı sarkomu hücre satırı modelleri24,25,26,27aksine tamamen insan preklinik manken mi Yani vardır. Ayrıca, STS birincil kültürler, kurulması onayı elde ederken cytomorphological, immunohistokimyasal ve Moleküler Sitogenetik değerlendirme, deneyimli bir sarkomu desteği ile patolog, bizim iletişim kuralında zorunlu , diğer STS birincil kültür modelleri için durum her zaman böyle değildir. Bazı gazetelerde, cerrahi numuneler kurtarılan hücre aşağı akım analizi tanı STS hücre yüzde28birincil kültürler olarak teyit olmadan gerçekleştirildi. Sistemimiz da çok yönlü, tekrarlanabilir ve çok çeşitli deneyler gerçekleştirmek için kullanılabilir. Ayrıca, tohum hücre ve dış uyaranlara belirli özellikleri ve yanıt-e doğru çalışmaya değiştirilebilir. Bu model geliştirilmesi bize hasta kaynaklı STS hücreleri için şu anda kullanılan farklı ilaçlar veya STS tedavisi için klinik değerlendirme altında duyarlılığını araştırmak için etkin. Bu model, bu nedenle, tedaviye yanıt tahmin için önemli bir preklinik araç temsil eder ve daha fazla optimize edilmiş ise, potansiyel olarak kişiselleştirilmiş tedavi geliştirmek için kullanılabilir. Tanılama ya da prognostik moleküler işaretleyiciler, burada birkaç belirli biyolojik kullanılabilir STS özellikle önemli tanımlamak için de kullanılabilir. Protokol sınırlamaları biri nispeten kısa zaman birincil kültür kurulması sonra aşağı akım çözümlemesi için kullanılabilir. Protokol gen ifade profil oluşturma ve kümeleme analizi için tümör ve birincil kültürler aynı hastadan tümör doku heterojen taklit etmek için birincil kültür kapasitesini değerlendirmek için zaman içinde elde gerçekleştirerek geliştirilebilir, özellikle bu STS tanılama bir işaretleyici kullanılabilir değil histotypes için. Bu tür analizleri da daha fazla nasıl elde edilen kültür hücreleri doğrudan tümör örneklerinden elde edilen farklı karakterize etmek için yardımcı olacaktır.
Sonuç olarak, kuruluş sağlam Preklinik modellerin tümör patoloji bizim anlayışı ilerletmek için esastır. Biz bizim model STS kötü prognoz için sorumludur ve yeni tedavi stratejileri tanımlaması için katkıda bulunacak moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak için yardımcı olacaktır inanıyorum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Yazarlar Gráinne Tierney Editör Yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM High Glucose | EuroClone | ECB7501L | |
| Fetal bovine serum | EuroClone | ECS0180D | |
| Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Triazol reagent | Ambion Life-Technologies | 15596018 | |
| Trypsin | EuroClone | ECB3052D |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).
- Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours - an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64 (1), 2-11 (2014).
- De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9 (12), 6233-6246 (2016).
- Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
- Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6 (8), 20294 (2011).
- Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17 (7), 966-975 (2016).
- The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, Suppl 3 102-112 (2014).
- Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2 (2), 247-250 (2007).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).
- Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (3), 159-166 (2015).
- De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3 (12), 1662 (2016).
- Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95 (3), 343-347 (2009).
- Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
- Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
- Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313 (2008).
- Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13 (2), 227-240 (2016).
- Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15 (2), 309 (2017).
- De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9 (12), 755-767 (2017).
- Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14 (2), 78-80 (2017).
- Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55 (12), 2516-2519 (1995).
- Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12 (2), 1050-1055 (2016).
- Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21 (6), 848-855 (2012).
- Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16 (6), 625-638 (2011).
- Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37 (4), 1711-1722 (2017).
- Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2 (3), 407-412 (2011).
- Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29 (8), 313 (2008).
