Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

إنشاء ثقافة الأولية المستمدة من المريض الأنسجة اللينة كابوزي

doi: 10.3791/56767 Published: April 11, 2018

Summary

ويركز البروتوكول التالي على إنشاء ثقافة الأولية المستمدة من المريض الأنسجة اللينة كابوزي (STS). هذا النموذج يمكن أن تساعدنا على فهم أفضل لخلفية الجزيئية والشخصية الدوائية لهذه الأورام الخبيثة النادرة، ويمكن أن تمثل نقطة انطلاق لإجراء مزيد من البحوث التي تهدف إلى تحسين إدارة STS.

Abstract

الأنسجة اللينة الطويلا (STS) تمثل طائفة من الأورام الخبيثة غير متجانسة مع صعوبة التشخيص والتصنيف، والإدارة. حتى الآن، تم التعرف على أنواع فرعية غذائها أكثر من 50 من هذه الأورام الصلبة نادرة. وهكذا، نظراً لتنوع استثنائي وانخفاض معدل الإصابة، فهمنا لعلم الأحياء من هذه الأورام لا يزال محدودا. وتمثل الثقافات المستمدة من المريض منصة مثالية لدراسة STS الفيزيولوجيا المرضية والصيدلة. وهكذا وضعنا نموذجا الإكلينيكية بشرية من STS بدءاً من عينات الورم حصادها من المرضى الذين يخضعون للاستئصال الجراحي. التي تم الحصول عليها من العينات الجراحية بالهضم كولاجيناز الثقافات الخلية STS المستمدة من المريض ومعزولة عن طريق الترشيح. كانت عد الخلايا والمصنف، وترك لمدة 14 يوما في ثقافات أحادي الطبقة القياسية وثم معالجتها بواسطة تحليل المتلقين للمعلومات. قبل القيام بالتحليلات الجزيئية أو الصيدلانية، أكد إنشاء ثقافات STS الأولية عن طريق تقييم ميزات سيتومورفولوجيك، وعندما تكون متاحة، علامات المناعي. ويمثل هذا الأسلوب أداة مفيدة 1) لدراسة التاريخ الطبيعي لهذه الأورام الخبيثة استكشفت سيئة و 2) لاختبار تأثيرات العقاقير المختلفة في محاولة لمعرفة المزيد عن تلك آليات العمل.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الطويلا الأنسجة الرخوة (STS) وتشمل طائفة آفات غير متجانسة من أصل الوسيطة في حساب 1% من جميع الأورام الصلبة1،2، وتصنيف "منظمة الصحة العالمية" الجديدة تقر بوجود أكثر من 50 3من أنواع فرعية مختلفة. ومن بين هذه هيستوتيبيس الأكثر شيوعاً هي ساركومه adipocyte أو ليبوساركوما و leiomyosarcoma، تستأثر ب 15 في المائة و 11 في المائة من جميع البالغين STS، على التوالي4،5. على الرغم من أن يمكن تطوير STS في أجزاء مختلفة من الجسم، بالحدود القصوى و retroperitoneum هي المواقع الأكثر شيوعاً، والتي تحدث في 60% و 20% من الحالات، على التوالي6.

هو حجر الزاوية في علاج المرض المترجمة الاستئصال الجراحي على نطاق واسع، بينما فوائد العلاج الكيميائي adjuvant ونيوادجوفانت لا تزال غير واضحة، وتعتبر فقط في حالات مختارة7. في إعداد المنتشر، العلاج الكيميائي هو معيار العناية، لكن يظهر نتائج محدودة8. فهم أفضل للبيولوجيا الجزيئية من STS سيساعد على تحسين التشخيص التفضيلية الحالية وتحسين العلاجات المتاحة، وتحديد أهداف جديدة للعلاج.

وقد أجريت بحوث السرطان داخل هذا السياق، لسنوات عديدة باستخدام خلية مخلدة خطوط9. هي عادة مثقف في أحادي الطبقة قياسي يدعم هذه النماذج التجريبية أو مزروع في القوارض العوز إلى إنشاء نماذج في فيفو إكسينوجرافت10. تمثل الخطوط خلية مخلدة يمكن التحكم فيها وسهلة لتخزين مواد التي يمكن أن يؤديها على عدد كاف من تجارب بحثية. هي، في الواقع، الأقل كلفة والأكثر استخداماً أداة في الدراسات الإكلينيكية11.

ومع ذلك، نماذج سرطان الخلية-خط أساس لها أيضا بعض القيود والثقافة مثلاً لفترات طويلة في ظل نظام أحادي الطبقة جنبا إلى جنب مع عدد متزايد من الممرات يستحث المظهرية والانجراف الجينية، صنع خلايا أقل احتمالاً أن الخص الورم الرئيسية ميزات. وعلاوة على ذلك، تفشل الثقافات خط الخلية لإنتاج خلية إلى التفاعل والحديث المتبادل جزيء مما يشير إلى أن تقليد السلوك البيولوجي للأورام وتميز وورم المكروية. هذه القضايا تشكل الأساس للفجوة القائمة بين النتائج السريرية والاكلينيكية12.

وفي ضوء ما ورد أعلاه، ازداد الاهتمام بالثقافات الأولية المستمدة من المريض13. في الواقع، ختان الأنسجة الخبيثة والعادي يقلل من خطر فقدان سرطان الخلية النمط الظاهري وعدم التجانس، مما يتيح انطلاق المواد التي أكثر تمثيلاً لورم المكروية. وعلاوة على ذلك، استخدام عينات الورم الطازجة المحصودة من المرضى الذين يخضعون للعمليات الجراحية استئصال يتيح لنا للتحقيق في واحد من الأورام ومقارنة آفات مختلفة من نفس الجزء من جسم المريض14. للأسباب المذكورة أعلاه، تقدم الثقافات الخلية المستمدة من الأنسجة مادة قيمة لدراسة الأورام الفيزيولوجيا المرضية والصيدلة15،16،17، لا سيما في STS في خطوط الخلايا ساركومه المتاحة تجارياً التي هي محدودة18. وبالتالي نحن الأمثل طريقة لإنشاء ثقافة خلية الابتدائية STS المستمدة من المريض بدءاً من الورم جراحيا قصت الأنسجة13،،من1920. لدينا أسلوب يتكون من تصنيف الورم العينة إلى أجزاء صغيرة من أنسجة متبوعاً بتفكك النسيج الانزيمية بين عشية وضحاها الحصول على تعليق خلية مفردة. في اليوم التالي، توقفت عملية الهضم الأنزيمي بإضافة وسائل الإعلام ثقافة جديدة وتعليق التي تم الحصول عليها تم تصفيته لإزالة شظايا الأنسجة والخلية-المجاميع، والمواد الزائدة المصفوفة أو الحطام. وأخيراً، جزء خلايا السرطانية المعزولة سيتوسبينيد على الشرائح الزجاجية، ثابتة وتخزينها لتحليل المتلقين للمعلومات الرامية إلى تأكيد إنشاء ثقافة STS الأولية سيتومورفولوجيكال والمناعي والتقييم الخلوية الوراثية الجزيئية (مثل السمك في تحليل التضخيم MDM2 يمثل تشخيص التفاضلية القياسية ليبوساركوما جيدا متمايزة وليبوساركوما ديديفيرينتياتيد) 4-الخلايا المتبقية هي المصنفة إلى ثقافة أحادي الطبقة قياسية للدراسات التنميط والدوائي التعبير الجيني. جميع التجارب التي تتم باستخدام منخفض ممر الثقافات الأولية لتجنب اختيار سوبكلونيس السرطان محددة، وتحليلها من قبل الطبيب الشرعي ساركومه ذوي خبرة. وهكذا أنشأنا بشرية الكامل STS السابقين فيفو نموذج13،،من1920. هذا تنوعاً عاليا، وسهلة للتعامل مع نموذج يمكن أن يمثل أداة مفيدة لأنواع مختلفة من البحوث الإكلينيكية، مثل تحديد واسمات جزيئية جديدة للتشخيص والتشخيص أو للحصول على فهم أعمق لنشاط وآليات عمل موحدة وجديدة من العقاقير المستخدمة في إدارة STS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

خلايا STS يتم عزل من ورم قداس جراحيا اقتطعت من المرضى مع STS. البروتوكول وافقت عليه "اللجنة المحلية للأخلاقيات" وتتم وفقا للمبادئ التوجيهية "الممارسة السريرية الجيدة" و "إعلان هلسنكي". وأعطى جميع المرضى الموافقة الخطية على المشاركة في الدراسة. تحليلها من قبل الطبيب الشرعي ساركومه ذوي خبرة العينات الجراحية ومعالجة في غضون 3 ساعات جراحة.

1-الورم جمع العينات وتجهيزها:

  1. جمع عينات الورم بمساعدة أخصائي ساركومه في حاوية بول معقم 100 مل مع 50 مل من دميم الجلوكوز منخفضة متوسطة مختومة مع فيلم بارافين.
  2. تخزين العينات في 4 درجات مئوية لمدة أقصاها 3 ح بعد استئصال الورم.
  3. تنفيذ كافة الخطوات التالية تحت غطاء زراعة الأنسجة عقيمة.
    1. تعقيم هود مع الإيثانول 70% وارتداء قفازات معقمة.
    2. تعقيم الملقط اينوكس الصلب مع 70% إيثانول (استخدم شاش معقم).
    3. إزالة الفيلم البارافين من الحاوية البول وتجاهل.
    4. أغسل الخارجي للحاوية البول مع الإيثانول 70%.
    5. افتح طبق بتري مربعة.
    6. فتح حاوية البول ونقل العينات ورم في طبق بتري مربعة استخدام الملقط المعقم اينوكس الصلب.
  4. تغسل العينات الورم مع برنامج تلفزيوني مرتين.
  5. فتح مشرط جراحة معقمة.
    1. ناعما اجاد عينات الورم أربا3 1-2 مم.
    2. جمع ربع مجموع العينة في أنبوب 2 مل.
    3. أضف 1 مل كاشف تريزول (شراء) للأنبوب وتجمد فورا في-80 درجة مئوية (سيتم استخدام العينة في تحليل المتلقين للمعلومات لتقييم التعبير الجيني STS).
  6. جمع بقية المواد تمزيقه ناعما ورم في أنبوب 15 مل.
    1. إضافة 4 مل كولاجيناز النوع الأول من الحل (نوع كولاجيناز أنا يتم حله في برنامج تلفزيوني، بتركيز 4 ميكروغرام/مل).
    2. تمييع كولاجيناز النوع الأول من الحل مع 4 مل وسائط الثقافة العالية دميم (التركيز النهائي من نوع كولاجيناز 2 ميكروغرام/مل).
    3. أغلق أنبوب 15 مل وختم مع الفيلم البارافين.
    4. وضع أنبوب 15 مل شاكر متداول في حاضنة في 37 درجة مئوية في ظروف التحريك لمدة 15 دقيقة لتنشيط الهضم.
    5. وبعد 15 دقيقة تخزين الأنبوب في شاكر المتداول تحت إثارة الأوضاع في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
  7. وفي اليوم التالي وضع أنبوب 15 مل تحت غطاء محرك السيارة العقيمة.
  8. تصفية تعليق خلية بلطف من خلال عامل تصفية عقيمة 100 ميكرومتر تعلق على الجزء العلوي من أنبوب 50 مل.
  9. يجب غسل الفلتر مع دميم وسائل الإعلام ثقافة عالية وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين والجلوتامين 1% و 1% البنسلين/ستربتوميسين.
  10. تجاهل عامل التصفية عقيمة 100 ميكرومتر، إغلاق أنبوب 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 225 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  11. تجاهل المادة طافية بعكس الأنبوب.
  12. إعادة تعليق الخلايا مع 1-2 مل دميم عالية الثقافة الإعلامية تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين والجلوتامين 1% و 1% البنسلين/ستربتوميسين.
    ملاحظة: الحجم يعتمد على حجم الورم العينة المجهزة.
  13. عد الخلايا بدائرة نويباور.
    1. تمييع عينة 1:2 في تريبان الأزرق واستخدم 10 ميليلتر من إضعاف لعد الخلايا.
    2. الاعتماد على الأقل مرتين وحساب متوسط replicates معرفة متوسط إجمالي عدد الخلايا التي تم جمعها.
  14. لوحة الخلايا في ثقافة أحادي الطبقة قياسية في كثافة 80,000 الخلايا/سم2.
    ملاحظة: تتضمن عناصر التحكم دائماً في التجارب. أداء replicates التقنية على الأقل 3 لكل شرط. أداء replicates البيولوجي 2 على الأقل. للصيدلة السريرية والتعبير الجيني وبروتين تعبير تحاليل، تجارب ينبغي أن يتم مع عدد قليل من الممرات الثقافة في غضون 30-45 يوما من الخلية البذر لتجنب فقدان السرطان تعمل الخلية.
  15. إعداد عينة الخلوية.
    1. جمع الخلايا 100,000 في 200 ميليلتر من دميم وسائل الإعلام ثقافة عالية وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين والجلوتامين 1% و 1% البنسلين/ستربتوميسين.
    2. ماصة الحل (200 ميليلتر ماصة) إلى قمع المتاح مجهزة بمرشح ومزودة بشريحة زجاجية.
    3. فتح في سيتوسينتريفوجي وتدرج العينات.
    4. تشغيل في سيتوسينتريفوجي في 18.6 g x لمدة 20 دقيقة.
    5. تجاهل القمع مزودة بعامل التصفية.
    6. تحديد الشرائح في الأسيتون لمدة 10 دقائق تليها كلوروفورم لمدة 5 دقائق.
    7. تخزين الشرائح عند-20 درجة مئوية.
      ملاحظة: ذوبان الجليد وهيدرات العينات قبل التلوين وأداء تلطيخ اتباع إرشادات الشركة المصنعة. إعداد replicates التقنية 3 على الأقل.

2-STS خلية الثقافات:

  1. تغيير الوسائط مرة واحدة في أسبوع (دميم عالية الثقافة الإعلامية تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين، الجلوتامين 1% و 1% البنسلين/ستربتوميسين).
    1. تجاهل المتوسطة الثقافة باستخدام ماصة ميليلتر 200 1,000.
    2. إضافة جديدة متوسطة جديدة باستخدام ماصة ميليلتر 200 1,000.
    3. مرور الخلية:
      1. فصل الخلايا عند الالتقاء هو حوالي 90%:
        ملاحظة: ينبغي أن يقوم STS خلية ثقافة التضخيم مرة واحدة في أسبوع على أساس شروط الثقافة.
      2. تجاهل المتوسطة وتغسل ببرنامج تلفزيوني وإضافة 2-3 مل التربسين 1 x في برنامج تلفزيوني
        ملاحظة: حجم التربسين المستخدمة يعتمد على كمية الخلايا المزروعة التي تم الحصول عليها.
      3. احتضان خلايا لمدة 3-5 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      4. جمع الخلايا المنفصلة من لوحة باستخدام ماصة ميليلتر 200 1,000.
      5. "الماصة؛" الخلايا المنفصلة في أنبوب 15 مل وإضافة 4 مل من دميم وسائل الإعلام ثقافة عالية وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين والجلوتامين 1% 1% البنسلين/ستربتوميسين لوقف رد الفعل الأنزيمي.
      6. الطرد المركزي في 225 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      7. تجاهل المادة طافية.
      8. إعادة تعليق بيليه الخلية بإضافة 1 مل من دميم وسائل الإعلام ثقافة عالية وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين والجلوتامين 1% و 1% البنسلين/ستربتوميسين.
      9. بذور الخلايا الموجودة في لوحة ثقافة جديدة أو قارورة مع وحدة تخزين نهائي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
        ملاحظة: عدم انقسام خلايا أكثر من 1:3.

3-المصب التحليلات:

ملاحظة: مجموعة متنوعة من تجارب مختلفة يمكن أن يتم استخدام هذا النموذج (انظر أدناه). ولذلك، من المهم أن تقرر خلال مرحلة التصميم للدراسة التحليلات التي سيتم تنفيذ ذلك يمكن إعداد عدد كاف من العينات و replicates.

  1. فحوصات الانتشار مثل بروميد 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium MTT
  2. نك أبوبتوتيك فحوصات مثل المحطة الطرفية ديوكسينوكليوتيديل ترانسفيراز (TdT) نهاية الوسم المقايسة (TUNEL)
  3. التحليل المناعي
  4. تحليل التعبير الجيني
  5. تحليل لطخة غربية
  6. تحليل أليسا
  7. خلية تنشيط fluorescence الفرز التحليل (نظام مراقبة الأصول الميدانية)
  8. نموذج إكسينوجرافت في فيفو

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لقد قمنا بتصميم طريقة بسيطة للحصول على إنشاء ثقافة الأولية المستمدة من المريض الأنسجة اللينة كابوزي وتقرير هنا مثالاً على النتائج التي تم الحصول عليها في أحد هيستوتيبي STS محددة13. البروتوكول كان يستخدم لإنشاء ثقافات الأولية من هيستوتيبيس STS مختلفة بما في ذلك ليبوساركوما جيدا متمايزة، ديديفيرينتياتيد ليبوساركوما، ليبوساركوما ميكسويد، ليبوساركوما بليومورفيك، ميكسوفيبروساركوما، متمايز بليومورفيك الليفي السرقوم ورم خبيث، وفريق دعم المعلومات الجغرافية، ورباطي.

كان معدل النجاح لإنشاء ثقافات الابتدائي 54% (الثقافات الابتدائي 13 من 24 العينات الجراحية STS) للعينات الجراحية المستمدة من المرضى تعامل مع العلاج الكيميائي، العلاج الإشعاعي، أو لم تعالج. على العكس من ذلك، كان 72% (الثقافات الابتدائي 13 من 18 من العينات الجراحية STS) للعينات الجراحية مستمدة فقط من المرضى دون علاج.

ورم الخلايا بمعزل عن جيدا ديفيرينتياتيد/ديديفيرينتياتيد ليبوساركوما (ALT/دلبس) جراحيا من مريض عمره 54 سنة. حاليا تحليل التضخيم MDM2، أداء لتشخيص تفاضلية القياسية ALT/دلبس واستعرضها الطبيب الشرعي ساركومه ذوي خبرة، كانت إيجابية، ويؤكد وجود الآفة ALT/دلبس (الشكل 1أ). وأكد تحليل الخلوية MDM2 التضخيم في الخلايا السرطانية معزولة إنشاء المستمدة من المريض ALT/دلبس الابتدائي ثقافة (94.6% خلايا المزروعة كانت إيجابية بالنسبة للتضخيم MDM2) (الشكل 1ب). الثقافة الأولية وتواصل تتكاثر بعد الممرات في ثقافات أحادي الطبقة القياسية وبقاء الخلية كان يرصدها MTT و Tunel المقايسة.

هذا النموذج مكنتنا من اختبار حساسية الثقافة ALT/دلبس الأولية للعقاقير المختلفة المستخدمة حاليا أو قيد التقييم اﻻكلينيكي لعلاج ALT/دلبس مثل ifosfamide (مالت)، ابيروبيسين (EPI)، والجمع بين مالت + برنامج التحصين الموسع، ترابيكتالدين (طرابه)، واريبولين (ERI)، يقوم باستخدام مقايسة MTT. وأكدت النتائج حساسية الثقافات للعلاج الكيميائي (الشكل 2أ). وكانت معاملة الأكثر نشاطا مالت + برنامج التحصين الموسع، الخط الأول علاج المستخدمة في ALT/دلبس المتقدم أو المنتشر. وعلاوة على ذلك، جرت دراسة مورفولوجيا الخلايا بعد التعرض للمخدرات، النتائج في إيغلايتينج التغييرات الشكلية في الثقافة الأولية فيما يتعلق بمراقبة ونتائج الفحص السامة للخلايا (الشكل 2ب). كما ورد في البروتوكول، يمكن تنفيذ عدة تحليلات منجرفة مع هذا النموذج. الشكل 3 تنص تمثيل تخطيطي للأسلوب، ويتضمن المخطط زمني الذي ينبغي إجراء التجارب للحصول على نتائج متعدية الجنسيات.

Figure 1
الشكل 1 . إنشاء ثقافة الأولية المستمدة من المريض ALT/دلبس. A) في الموقع التهجين (الأسماك) إجراء للكشف عن التضخيم MDM2 في عينة أنسجة مريض (100 X صورة). ب) في الموقع التهجين (الأسماك) إجراء للكشف عن التضخيم MDM2 في ثقافة الأولية (100 X التكبير). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . العلاج الكيميائي في ثقافة ALT/دلبس الأولية. A) الخلايا تعامل مع: ifosfamide (مالت)، ابيروبيسين (EPI)، مالت + برنامج التحصين الموسع، ترابيكتالدين (طرابه)، واريبولين (إيري). وأجريت ثلاثة replicates مستقلة لكل تجربة. ترد البيانات يعني ± الخطأ المعياري (SE)، كما ورد، مع الإشارة إلى عدد replicates ن. تم تقييم الفروق بين مجموعات من-التائي t-اختبار، * p < 0.05. ب) الصور ALT/دلبس الثقافة الأولية بعد التعرض للمخدرات (2 X التكبير). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : نموذج الثقافة الأولية STS. التمثيل التخطيطي للنموذج السريري STS الثقافة الأولية بما في ذلك الجدول الزمني والتحليلات المتلقين للمعلومات الممكنة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

نماذج محددة تحديداً جيدا السريرية ضرورية لتوضيح الخلفية الجزيئية للأورام، والتنبؤ بسوء التشخيص، وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة لمرضى السرطان. هذا مهم بشكل خاص لاورام نادرة مثل STS التي تغاير عالية من حيث التشكل، والسلوك العدواني المحتملة، والسريرية التحديات فهمنا للبيولوجيا STS وإدارة المريض21. وعلاوة على ذلك، يحد من خطوط الخلايا ساركومه التجارية القليلة المتوفرة التحقيقات الإكلينيكية في هذه المجموعة من الأورام الوسيطة18. وهكذا تمثل السابقين فيفو نماذج موردا قيماً لبحث عن STS. قمنا بتطوير نموذج الإنسان الكامل في المختبر من STS بدءاً من أنسجة الورم جراحيا مستأصل (الشكل 3). خلال الاستفادة المثلى الأسلوب، تناول العديد من القضايا الحرجة وحلها. المشكلة الأولى تتعلق بالفاصل الزمني بين العلاج الجراحي وتجهيز العينات. في البداية، عندما وصلت عينات الورم لدينا مختبر العلوم البيولوجية بعد فترة معينة من الزمن، كانت مخزنة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ومعالجتها في اليوم التالي. الخلايا STS معزولة من هذه العينات أظهرت النشاط انتشار منخفضة وبقاء الفقراء في ثقافة أحادي الطبقة القياسية. يمكن أن يحدث هذا، في جزء منه، أن يعزى إلى الحقيقة أن عينة الورم كله يتم الاحتفاظ بها لفترة طويلة من الزمن في الحاوية البول قبل أن يتم معالجتها. وهكذا قمنا بتعديل وقت بدء العينة المعالجة لمدة أقصاها 3 ح بعد الجراحة لضمان استمرار الثقافة الأولية تنتشر في الثقافة القياسية أحادي الطبقة ويحمل صلاحية جيدة. ونحن أيضا الأمثل في عملية تصنيف الخلية: شظايا صغيرة من أنسجة متجانسة ضرورية لتسهيل عملية الهضم الأنزيمي، وقد تحقق ذلك باستخدام مشرط. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن البروتوكول يعمل مع عينات ذات أحجام مختلفة، إنشاء ثقافة الابتدائي بدءاً من عينات من محدودة الحجم (< سم 2) هو أصعب تحقيقا. وكان تركيز كولاجيناز مسألة هامة أخرى لتركيز أنينزيمي مرتفعة جداً يمكن أن يسبب الإجهاد الخلوية، مما يؤدي إلى التغيرات المظهرية في ثقافة STS الأولية أو نقصانا في ورم الخلايا البقاء على قيد الحياة. مطلوب جيد الهضم الأنزيمي لفصل الخلايا من المواد المصفوفة والحطام. وأخيراً نحن الأمثل تركيز الإنزيم استخدامها في مرحلة الهضم. وعلاوة على ذلك، الحد من الإجهاد الخلوي، وتوفير المواد الغذائية للخلايا STS أثناء مرحلة العزلة إعادة علقنا الإنزيم في ثقافة وسائل الإعلام بدلاً من الكواشف الأخرى مثل برنامج تلفزيوني. وأخيراً، كشفت عدة تجارب أجريت على مختلف الثقافات الأولية STS مثل ليبوساركوما وميكسوفيبروساركوما التغييرات في التعبير الجيني مع مرور الوقت وزيادة الحساسية للعلاج الكيميائي13،20. هذه النتائج تعزى إلى ثقافة طويلة من الخلايا STS المستمدة من المريض في نظام أحادي الطبقة جنبا إلى جنب مع عدد متزايد من الممرات، التي تحفز المظهرية والجينية الانجراف على حد سواء. موثوقية نظام الثقافة هذا التناقص مع مرور الوقت أن الخص أنسجة الورم، مثلما هو مبين، يمثل واحداً من أهم القيود المفروضة على السابقين فيفو نماذج22،23. وبالتالي نحن الأمثل البروتوكول عن طريق الحد من الوقت للقيام بتجارب (خلال 30-45 يوما خلية الورم البذر) واستخدام الثقافات مرور منخفضة للحصول على النتائج استنساخه ومتعدية الجنسيات. علاوة على ذلك، يمكن أن تجمد الثقافات الأولية، ولكن صلاحيتها اللاحقة تعتمد على عدة عوامل، بما في ذلك موقع الورم، هيستوتيبي STS، كمية العينة الجراحية وعدد من الممرات ثقافة أداء.

لدينا نظام يحتوي على عدد من المزايا، أي أنها نموذج الإكلينيكية بشرية الكامل، على عكس الأخرى المستندة إلى الفاري ساركومه الخلية خط نماذج24،25،26،27. وعلاوة على ذلك، بينما حققت تأكيد إنشاء STS الثقافات الأولية، سيتومورفولوجيكال والمناعي والتقييم الخلوية الوراثية الجزيئية، بالدعم من ساركومه ذوي الخبرة الطبيب الشرعي، إلزامي في لدينا بروتوكول ، هذا ليس هو الحال بالنسبة لنماذج الثقافة الأولية STS أخرى دائماً. في بعض الصحف، تم إجراء تحليل المصب الخلايا المستردة من العينات الجراحية دون تأكيد النسبة المئوية الخلية التشخيص المنبوذة في الثقافات الأساسية28. نظامنا هو أيضا تنوعاً، واستنساخه، ويمكن استخدامها لأداء مجموعة متنوعة من التجارب. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل الخلية بذر، والمؤثرات الخارجية لدراسة السمات المحددة والردود. وضع هذا النموذج مكنتنا من التحقيق في حساسية خلايا STS المستمدة من المريض للعقاقير المختلفة المستخدمة حاليا أو قيد التقييم اﻻكلينيكي لعلاج STS. هذا النموذج، ولذلك، يمثل أداة هامة الإكلينيكية للتنبؤ باستجابة للعلاج وإذا كان كذلك الأمثل، يمكن استخدامها لتحسين العلاج شخصية. يمكن استخدامه أيضا لتحديد التشخيص أو تشخيصية الواسمات الجزيئية، أهمية خاصة في STS التي تتوفر فيها عدد قليل من المؤشرات الحيوية المحددة. واحدة من القيود المفروضة على البروتوكول هو الوقت المتاح لإجراء تحليل المصب بعد إنشاء ثقافة الأولية قصيرة نسبيا. ويمكن تحسين البروتوكول عن طريق إجراء التنميط التعبير الجيني وتجميع تحليل للورم والثقافات الأولية المستمدة من نفس المريض مع مرور الوقت لتقييم قدرة الثقافة الأولية لتقليد عدم تجانس الأنسجة السرطانية، خاصة بالنسبة لتلك التي لا يتوفر علامة تشخيصية هيستوتيبيس STS. تحليلات من هذا القبيل سيساعد أيضا على مواصلة تميز كيف تختلف الخلايا في الثقافة التي تم الحصول عليها من تلك المستمدة مباشرة من عينات الورم.

وفي الختام، إنشاء نماذج قوية السريري ضروري لتعزيز فهمنا للأمراض السرطانية. ونحن نعتقد أن لدينا نموذج يساعد على الكشف عن الآليات الجزيئية التي هي مسؤولة عن سوء التشخيص من STS وستسهم في تحديد استراتيجيات علاجية جديدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

Acknowledgments

المؤلف يود أن يشكر تيرني Gráinne للمساعدة التحريرية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM High Glucose EuroClone ECB7501L
Fetal bovine serum EuroClone ECS0180D
Glutamine Gibco 25030-024
Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 157-4-100
Penicillin streptomycin Gibco 15140122
Triazol reagent Ambion Life-Technologies 15596018
Trypsin EuroClone ECB3052D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66, (1), 7-30 (2016).
  2. Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11, (4), 187-202 (2014).
  3. Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours - an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64, (1), 2-11 (2014).
  4. De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9, (12), 6233-6246 (2016).
  5. Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
  6. Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6, (8), 20294 (2011).
  7. Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17, (7), 966-975 (2016).
  8. The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, Suppl 3 102-112 (2014).
  9. Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
  10. Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2, (2), 247-250 (2007).
  11. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10, (8), 483-487 (2013).
  12. Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8, (3), 159-166 (2015).
  13. De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3, (12), 1662 (2016).
  14. Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95, (3), 343-347 (2009).
  15. Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
  16. Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
  17. Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313 (2008).
  18. Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13, (2), 227-240 (2016).
  19. Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15, (2), 309 (2017).
  20. De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9, (12), 755-767 (2017).
  21. Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14, (2), 78-80 (2017).
  22. Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55, (12), 2516-2519 (1995).
  23. Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12, (2), 1050-1055 (2016).
  24. Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21, (6), 848-855 (2012).
  25. Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16, (6), 625-638 (2011).
  26. Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37, (4), 1711-1722 (2017).
  27. Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2, (3), 407-412 (2011).
  28. Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, (8), 313 (2008).
إنشاء ثقافة الأولية المستمدة من المريض الأنسجة اللينة كابوزي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

De Vita, A., Mercatali, L., Miserocchi, G., Liverani, C., Spadazzi, C., Recine, F., Bongiovanni, A., Pieri, F., Cavaliere, D., Fausti, V., Amadori, D., Ibrahim, T. Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma. J. Vis. Exp. (134), e56767, doi:10.3791/56767 (2018).More

De Vita, A., Mercatali, L., Miserocchi, G., Liverani, C., Spadazzi, C., Recine, F., Bongiovanni, A., Pieri, F., Cavaliere, D., Fausti, V., Amadori, D., Ibrahim, T. Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma. J. Vis. Exp. (134), e56767, doi:10.3791/56767 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter