Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

Etablering af en primær kultur af Patient-afledte bløddelssarkom

doi: 10.3791/56767 Published: April 11, 2018

Summary

Følgende protokol fokuserer på oprettelsen af en primær kultur af patient-afledte bløddelssarkom (STS). Denne model kan hjælpe os til bedre at forstå de molekylære baggrund og farmakologisk profil af disse sjældne maligne sygdomme og kunne udgøre et udgangspunkt for yderligere forskning med henblik på forbedring af forvaltningen af STS.

Abstract

Bløddelssarkomer (STS) repræsenterer et spektrum af heterogene maligniteter med en vanskelig diagnose, klassificering og ledelse. Til dato, er blevet identificeret mere end 50 histologiske undertyper af disse sjældne solide tumorer. Således, på grund af deres ekstraordinære mangfoldighed og lav forekomst, vores forståelse af biologi af disse tumorer er stadig begrænset. Patient-afledte kulturer repræsenterer den ideelle platform til at studere STS Patofysiologi og farmakologi. Vi har således udviklet en menneskelig prækliniske model af STS startende fra tumor prøver høstet fra patienter, som gennemgår kirurgisk resektion. Patient-afledte STS cellekulturer hidrører fra de kirurgiske enheder af collagenase fordøjelse og isoleret ved filtrering. Celler var tælles, seedet, og forlod i 14 dage i standard éncellelag kulturer og derefter behandles af downstream analyse. Før du udfører molekylære eller farmaceutiske analyser, etablering af STS primære kulturer var bekræftet gennem evalueringen af cytomorphologic funktioner, og når de er tilgængelige, immunhistokemiske markører. Denne metode repræsenterer en nyttig værktøj 1) til at studere disse dårligt udforskede maligniteter naturhistorie og 2) at afprøve virkningerne af forskellige stoffer i et forsøg på at lære mere om deres virkningsmekanismer.

Introduction

Bløddelssarkomer (STS) omfatter et spektrum af heterogene læsioner af mesenchymale oprindelse udgør 1% af alle solide tumorer1,2, og den nye World Health Organization klassificering anerkender tilstedeværelsen af mere end 50 forskellige undertyper3. Blandt disse er de mest almindelige histotypes adipocyt sarkom eller liposarcoma og leiomyosarcoma, tegner sig for 15% og 11% af alle voksne STS, henholdsvis4,5. Selv om STS kan udvikle sig i forskellige dele af kroppen, er ekstremiteter og retroperitoneum de mest almindelige steder, forekommer hos 60% og 20% af tilfældene, henholdsvis6.

Hjørnestenen i behandling af lokaliseret sygdom er bredt kirurgisk resektion, hvorimod fordelene ved adjuvans og neoadjuverende kemoterapi er stadig uklart og betragtes kun i udvalgte tilfælde7. I indstillingen metastatisk kemoterapi er standard for pleje men viser begrænsede resultater8. En bedre forståelse af Molekylærbiologi af STS ville bidrage til at forbedre den nuværende differentialdiagnosticering, optimere de tilgængelige behandlinger, og identificere nye mål for terapi.

I denne sammenhæng, er blevet udført forskning i kræft i mange år ved hjælp af udødeliggjort celle linjer9. Disse eksperimentelle modeller er normalt dyrkes i standard éncellelag understøtter eller implanteres i immundefekte rotter at etablere i vivo xenograft modeller10. Udødeliggjort cellelinjer repræsenterer en overskuelig og let-at-store materiale som en rigelig række forskning eksperimenter kan udføres. De er faktisk den billigste og udbredte mest værktøj i prækliniske studier11.

Dog cellelinie baseret kræftmodeller har også nogle begrænsninger, fx langvarig kultur i et éncellelag system sammen med et stigende antal passager inducerer fænotypisk og genetisk drift, making celler mindre tilbøjelige til at sammenfatte vigtige tumor funktioner. Derudover undlader linje cellekulturer at gengive celle til celle interaktion og signalfunktion molekyle krydstale, der efterligner den biologiske opførsel af tumorer og karakterisere tumor mikromiljø. Spørgsmålene danner grundlag for kløften mellem prækliniske og kliniske resultater12.

I betragtning af ovenstående er interesse i patienten-afledte primære kulturer steget13. Faktisk reducerer excision af ondartede og normale væv risikoen for at miste kræft celle fænotype og heterogenitet, dermed tilbyder råvare, der er mere repræsentativ for tumor mikromiljø. Desuden brug af friske tumor prøver høstet fra patienter, som gennemgår kirurgisk resektion giver os mulighed for at undersøge enkelt tumorer og sammenligne forskellige læsioner fra den samme del af en patients krop14. Af ovennævnte grunde giver væv-afledte cellekulturer et værdifuldt materiale for at studere tumor Patofysiologi og farmakologi15,16,17, især i STS i hvilke kommercielt tilgængelige sarkom cellelinjer er begrænset18. Vi optimeret således en metode til at etablere en patient-afledte STS primære cellekultur fra kirurgisk skåret tumor væv13,19,20. Vores metode består af disaggregating tumor modellen i lille væv fragmenter efterfulgt af overnight enzymatisk væv dissociation at opnå en enkelt cellesuspension. Den følgende dag, den enzymatiske fordøjelsen stoppes ved at tilføje friske dyrkningsmedier og opnåede suspensionen er filtreret for at fjerne væv fragmenter, celle-aggregater, og overskydende matrix materiale eller snavs. Endelig, en brøkdel af isolerede tumorceller er cytospinned på glas dias, fast og gemt for downstream analyse sigter bekræfter oprettelsen af STS primære kultur af cytomorphological, immunhistokemisk og molekylær cytogenetisk evaluering (fx fisk analyse af MDM2 forstærkning repræsenterer den standard differentialdiagnosticering for et godt differentieret liposarcoma og den dedifferentiated liposarcoma) 4. de resterende celler er seedet til en standard éncellelag kultur for gen expression profilering og farmakologiske undersøgelser. Alle eksperimenterne, der udføres ved hjælp af lav passage primære kulturer at undgå udvalg af specifikke kræft subclones, og analyseret af en erfaren sarkom patolog. Vi har således skabt et fuldt humane STS ex-vivo model13,19,20. Denne meget alsidigt, let at håndtere model kunne udgøre et nyttigt værktøj til forskellige typer af prækliniske forskning, fx til at identificere nye molekylære markører for diagnose og prognose eller at få en dybere forståelse af aktiviteten og mekanismer for handling af standard og nye lægemidler, der anvendes i forvaltningen af STS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

STS celler er isoleret fra en tumor masse kirurgisk skåret ud fra patienter med STS. Protokollen er blevet godkendt af de lokale etiske udvalg og udføres efter retningslinjer for god klinisk praksis og Helsinki-erklæringen. Alle patienter gav skriftlig informeret samtykke til at deltage i undersøgelsen. De kirurgiske prøver er analyseret af en erfaren sarkom patolog og forarbejdes senest 3 timer efter operationen.

1. tumor prøvetagning og forarbejdning:

  1. Indsamle tumor prøver ved hjælp af et sarkom patolog i en 100 mL steril urin beholder med 50 mL af DMEM lav glucose medium forseglet med en paraffin film.
  2. Opbevare prøver ved 4 ° C i højst 3 h efter tumor resektion.
  3. Udføre alle de følgende trin under en steril vævskultur hætte.
    1. Sterilisere hætte med 70% ethanol og bære sterile handsker.
    2. Sterilisere stål inox pincet med 70% ethanol (brug en steril gaze).
    3. Fjern paraffinen film fra urinen container og kassér.
    4. Vaskes udvendig i urinen container med 70% ethanol.
    5. Åbne en firkantet petriskål.
    6. Åbn urinen container og overføre tumor enheder i de firkantede petriskål ved hjælp af steriliseret stål inox pincet.
  4. Vask tumor prøver med PBS to gange.
  5. Åbne en steril kirurgisk skalpel.
    1. Sønderdele fint tumor enheder i 1-2 mm3 stykker.
    2. Indsamle en fjerdedel af den samlede prøve i et 2-mL-rør.
    3. Der tilsættes 1 mL trizol reagens (købt) til røret og straks fryse ved-80 ° C (prøven vil blive brugt i den efterfølgende analyse for STS gen expression evaluering).
  6. Indsamle resten af fint strimlet tumor materiale i en 15 mL tube.
    1. Der tilsættes 4 mL af collagenase type I-løsning (collagenase type jeg er opløst i PBS, i en koncentration på 4 µg/mL).
    2. Fortyndes collagenase type I-løsning med 4 mL af DMEM høje kultur medier (endelig koncentration af collagenase type jeg er 2 µg/mL).
    3. Luk 15 mL tube og forsegle med paraffin film.
    4. Sætte 15-mL-rør i en rullende shaker i en inkubator ved 37 ° C i omrøring betingelser for 15 min at aktivere fordøjelsen.
    5. Efter 15 min gemme røret i rullende shaker under omrøring betingelser ved rumtemperatur natten over.
  7. Den følgende dag sætte 15 mL tube under sterile kølerhjelmen.
  8. Forsigtigt filtreres cellesuspension gennem en 100 µm sterile filter vedhæftet til toppen af en 50 mL tube.
  9. Vask filteret med DMEM høje kultur medier suppleret med 10% føtal bovint serum, 1% glutamin og 1% penicillin/streptomycin.
  10. Kassér den 100 µm sterile filter, lukke 50 mL tube og centrifugeres ved 225 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
  11. Supernatanten ved at vende røret.
  12. Cellerne genopslæmmes med 1-2 mL DMEM høj kultur medier suppleret med 10% føtal bovint serum, 1% glutamin og 1% penicillin/streptomycin.
    Bemærk: Omfanget afhænger af størrelsen af tumor prøven behandles.
  13. Tælle celler med en Neubauer kammer.
    1. Fortynd prøven 1:2 i trypan blå og bruge 10 µL af fortynding tælle celler.
    2. Regne mindst to gange og beregne middelværdien af flergangsbestemmelser at kende det samlede gennemsnitlige antal celler indsamlet.
  14. Plade celler i en standard éncellelag kultur med en tæthed på 80.000 celler/cm2.
    Bemærk: Altid medtage kontrolelementer i eksperimenter. Udføre mindst 3 tekniske flergangsbestemmelser for hver betingelse. Udføre mindst 2 biologiske replikater. Til prækliniske farmakologi, genekspression og protein udtryk analyser, bør der udføres eksperimenter med et lavt antal kultur passager inden 30-45 dage efter celle seeding for at undgå at miste kræft celle fænotyper.
  15. Forberedelse af cytologiske prøver.
    1. Indsamle 100.000 celler i 200 µL af DMEM høje kultur medier suppleret med 10% føtal bovint serum, 1% glutamin og 1% penicillin/streptomycin.
    2. Pipette løsning (200 µL pipette) i en engangs tragt udstyret med et filter og monteret med et glas dias.
    3. Åbn cytocentrifuge og Indsæt prøverne.
    4. Køre cytocentrifuge ved 18.6 x g i 20 min.
    5. Kassér tragten udstyret med filteret.
    6. Fix dias i acetone i 10 min efterfulgt af chloroform i 5 min.
    7. Gemme dias ved-20 ° C.
      Bemærk: Tø og fugte prøverne før farvning og udføre farvning efter fabrikantens anvisninger. Forbered mindst 3 tekniske replikater.

2. STS cellekulturer:

  1. Ændre media en gang om ugen (DMEM høj kultur medier suppleret med 10% føtal bovint serum, 1% glutamin og 1% penicillin/streptomycin).
    1. Kassér dyrkningsmediet ved hjælp af en 200-1.000 µL pipette.
    2. Tilføje nye friske medium ved hjælp af en 200-1.000 µL pipette.
    3. Celle passage:
      1. Frigør celler, når sammenløbet er omkring 90%:
        Bemærk: STS celle kultur forstærkning skal udføres en gang om ugen på grundlag af dyrkningsbetingelserne.
      2. Kassér medium, vask med PBS og tilføje 2-3 mL trypsin 1 x i PBS
        Bemærk: Mængden af trypsin anvendes, afhænger af mængden af dyrkede celler fremstillet.
      3. Inkuber celler for 3-5 min ved 37 ° C.
      4. Indsamle fritliggende celler fra pladen ved hjælp af en 200-1.000 µL pipette.
      5. Der afpipetteres fritliggende cellerne i en 15 mL tube og tilsættes 4 mL af DMEM høje kultur medier suppleret med 10% føtal bovint serum, 1% glutamin og 1% penicillin/streptomycin at stoppe den enzymatiske reaktion.
      6. Der centrifugeres ved 225 x g i 5 min ved stuetemperatur.
      7. Supernatanten.
      8. Genopslæmmes celle pellet ved tilsætning af 1 mL af DMEM høje kultur medier suppleret med 10% føtal bovint serum, 1% glutamin og 1% penicillin/streptomycin.
      9. Seed celler i en ny kultur plade eller en kolbe med en endelige mængden efter fabrikantens anvisninger.
        Bemærk: Ikke opdele celler mere end 1:3.

3. downstream analyser:

Bemærk: En række forskellige eksperimenter kan udføres ved hjælp af denne model (se nedenfor). Det er derfor afgørende at beslutte under designfasen af undersøgelsen som analyser udføres således at et tilstrækkeligt antal prøver og replikater kan forberedes.

  1. Spredning assays såsom MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid
  2. Apoptotiske assays som terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) nick ende mærkning (TUNEL) assay
  3. Immunhistokemisk analyse
  4. Gen expression analyse
  5. Western blot analyse
  6. ELISA assay
  7. Fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) analyse
  8. In vivo xenograft model

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har udviklet en enkel metode til at opnå oprettelsen af en primær kultur af patient-afledte bløddelssarkom og rapportere her et eksempel på resultaterne på én bestemt STS histotype13. Protokollen blev brugt til oprettelse af primære kulturer af forskellige STS histotypes herunder godt differentieret liposarcoma, dedifferentiated liposarcoma, myxoid liposarcoma, polymorfe liposarcoma, myxofibrosarcoma, udifferentierede polymorfe sarkom, GIST og desmoid fibromatosis.

Succesraten for etablering af primære kulturer var 54% (13 primære kulturer fra 24 STS kirurgisk prøver) for kirurgiske enheder afledt af patienter behandlet med kemoterapi, strålebehandling eller ikke behandlet. Omvendt, det var 72% (13 primære kulturer fra 18 STS kirurgisk prøver) for kirurgisk prøver afledt fra ubehandlede patienter.

Tumorceller blev isoleret fra en godt-differentiated/dedifferentiated liposarcoma (ALT/DDLPS) bortopereret fra en 54-årig patient. MDM2 forstærkning analyse, i øjeblikket udføres til den standard differentialdiagnosticering af ALT/DDLPS og gennemgået af en erfaren sarkom patolog, var positive, bekræfter tilstedeværelsen af en ALT/DDLPS læsion (fig. 1A). Cytologiske analyse af MDM2 forstærkning i isolerede tumorceller bekræftet oprettelsen af en patient-afledte ALT/DDLPS primære kultur (94,6% af dyrkede celler var positive for MDM2 forstærkning) (figur 1B). Den primære kultur fortsatte med at formere sig efter passager i standard éncellelag kulturer og cellernes levedygtighed blev overvåget af MTT og Tunel assay.

Denne model gjort det muligt at teste følsomheden af ALT/DDLPS primære kultur til forskellige lægemidler, der i øjeblikket anvendes eller under klinisk evaluering til behandling af ALT/DDLPS ifosfamid (IFO), epirubicin (EPI), kombination IFO + EPI, trabectedin (TRABE), og eribulin (ERI), udføres ved hjælp af MTT assay. Resultaterne bekræftede følsomheden af kulturer til kemoterapi (fig. 2A). Den mest aktive behandling var IFO + EPI, en første-line terapi bruges i fremskreden eller metastatisk ALT/DDLPS. Derudover blev celle morfologi undersøgt efter stof eksponering, resultater i ighlighting morfologiske ændringer i den primære kultur med hensyn til kontrol og resultaterne af den cytotoksiske assay (figur 2B). Som nævnt i protokollen, kan flere downstream analyser udføres med denne model. Figur 3 giver en skematisk gengivelse af metoden og omfatter en tidslinje, inden for hvilken eksperimenterne, der skal udføres for at opnå translationel resultater.

Figure 1
Figur 1 . Etablering af patient-afledte primære kultur af ALT/DDLPS. A) In situ hybridisering (FISH) udført for at opdage MDM2 forstærkning i patient væv prøvemateriale (100 X image). B) In situ hybridisering (FISH) udført for at opdage MDM2 forstærkning i en primær kultur (100 X forstørrelse). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Kemoterapi i en ALT/DDLPS primære kultur. A) cellerne blev behandlet med: ifosfamid (IFO), epirubicin (EPI), IFO + EPI, trabectedin (TRABE), og eribulin (ERI). Tre uafhængige replikater blev udført for hvert forsøg. Data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse (SE), som anført, hvor n angiver antallet af gentagelser. Forskelle mellem grupper blev vurderet af en tosidede Student's t-test, * p < 0,05. B) billeder af ALT/DDLPS primære kultur efter stof eksponering (2 X forstørrelse). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : STS primære kultur model. Skematisk fremstilling af den prækliniske model af STS primære kultur herunder tidslinjen og de mulige downstream analyser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Veldefinerede prækliniske modeller er nødvendige for at belyse de molekylære baggrund af tumorer, forudsige dårlig prognose og udvikle nye terapeutiske strategier for kræftpatienter. Dette er især vigtigt for sjældne tumorer såsom STS hvis høje heterogenitet i morfologi, aggressive potentielle og klinisk adfærd udfordrer vores forståelse af STS biologi og patienthåndtering21. Desuden begrænser de par kommercielle sarkom cellelinier til rådighed prækliniske undersøgelser af denne gruppe af mesenkymale tumorer18. Ex vivo modeller repræsenterer dermed en værdifuld forskning ressource for STS. Vi udviklede en fuldt humane i vitro model af STS startende fra kirurgisk resektion tumor væv (figur 3). Under optimering af metoden, var flere kritiske spørgsmål behandles og løses. Det første problem angår tidsintervallet mellem kirurgisk behandling og prøve behandling. I første omgang, når tumor prøver ankom vores biosciences laboratory efter en vis tid, var de gemt natten over ved 4 ° C og behandlet næste dag. STS celler isoleret fra disse prøver udstillet lav spredning aktivitet og fattige levedygtighed i standard éncellelag kultur. Dette kan delvis tilskrives faktum hele tumor modellen er holdt i en langvarig periode i urinen container før der behandles. Vi har dermed ændret starttidspunktet for eksemplet forarbejdning til et maksimum på 3 h efter operation for at sikre, at den primære kultur fortsatte med at formere sig i standard éncellelag kultur og udviser god levedygtighed. Vi også optimeret celle opdeling proces: lille homogent væv fragmenter er nødvendig for at lette den enzymatiske fordøjelsen, og dette blev opnået ved hjælp af en skalpel. Desuden, selv om protokollen arbejdede med prøver af forskellige størrelser, etablering af en primær kultur start fra prøver af begrænset størrelse (< 2 cm) er mere vanskeligt at opnå. Collagenase koncentrationen var et andet vigtigt emne, fordi for høje anenzyme koncentration kan forårsage cellulært stress, fører til fænotypiske forandringer i STS primære kultur eller et fald i tumor celle overlevelse. God enzymatisk fordøjelse er forpligtet til at adskille celler fra matrix materiale og debris. Vi endelig optimeret enzym koncentration til brug i fasen for fordøjelsen. Desuden, for at begrænse cellulært stress og levere næringsstoffer til STS celler under isolation fase vi igen suspenderet enzymet i kultur medier i stedet for andre reagenser som PBS. Endelig afsløret flere eksperimenter udført på forskellige STS primære kulturer såsom liposarcoma og myxofibrosarcoma ændringer i genekspression over tid og øget følsomhed for kemoterapi13,20. Disse resultater kan henføres til den langvarige kultur af patient-afledte STS celler i et éncellelag system sammen med et stigende antal passager, både som fremkalde fænotypisk og genetisk drift. Faldende pålideligheden af denne kultur system med tiden at sammenfatte tumor væv, som tidligere vist, repræsenterer en af de vigtigste begrænsninger af ex vivo modeller22,23. Vi optimeret således protokollen ved at reducere den tid til at udføre eksperimenter (inden 30-45 dage efter tumor celle såning) og ved hjælp af lav passage kulturer for at opnå reproducerbare og translationel resultater. Desuden, de primære kulturer kan fryses, men deres efterfølgende levedygtighed er afhængig af flere faktorer, herunder tumor placering, STS histotype, af kirurgisk enhed og antal kultur passager udføres.

Vores system har en række fordele, dvs det er en fuldt humane prækliniske model, i modsætning til andre murine-baserede sarkom celle linje modeller24,25,26,27. Endvidere, mens bekræftelse af etableringen af STS primære kulturer, opnået ved cytomorphological, immunhistokemisk og molekylær cytogenetisk evaluering, med støtte fra en erfaren sarkom patolog, er obligatorisk i vores protokol , det er ikke altid tilfældet for andre STS primære kultur modeller. I nogle papirer, blev downstream analyse af celler inddrives fra kirurgiske enheder udført uden bekræfter diagnosen af STS celle procentdel i de primære kulturer28. Vores system er også alsidige, reproducerbare og kan bruges til at udføre en lang række eksperimenter. Derudover kan celle såning og eksterne stimuli ændres for at studere specifikke funktioner og svar. Udvikling af denne model muliggjort at undersøge følsomheden af patient-afledte STS celler til forskellige lægemidler, der i øjeblikket anvendes eller under klinisk evaluering til behandling af STS. Denne model, derfor, repræsenterer en vigtig prækliniske værktøj til at forudsige svar til terapi, og hvis yderligere optimeret, kan potentielt bruges til at forbedre personlig terapi. Det kunne også bruges til at identificere diagnostiske eller prognostiske molekylære markører, især vigtigt i STS hvor få specifikke biomarkører er tilgængelige. En af begrænsningerne i protokollen er den relativt korte tid til rådighed til at udføre downstream analyse efter oprettelsen af den primære kultur. Protokollen kunne forbedres ved at udføre gen expression profilering og klyngedannelse analyse for både tumor og primære kulturer stammer fra den samme patient over tid at vurdere de primære kultur evne til at efterligne heterogenitet af tumor væv, især for de STS histotypes som en diagnostisk markør ikke er tilgængelig. Sådanne analyser medvirke til yderligere karakterisere, hvordan cellerne i den fremkomne kultur adskiller sig fra hidroerer direkte fra tumor prøver.

Afslutningsvis, er oprettelse af robust prækliniske modeller afgørende for at fremme vores forståelse af tumor patologi. Vi mener, at vores model vil bidrage til at afdække de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for den dårlige prognose af STS og vil bidrage til identifikationen af nye terapeutiske strategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Gráinne Tierney for redaktionelle bistand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM High Glucose EuroClone ECB7501L
Fetal bovine serum EuroClone ECS0180D
Glutamine Gibco 25030-024
Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 157-4-100
Penicillin streptomycin Gibco 15140122
Triazol reagent Ambion Life-Technologies 15596018
Trypsin EuroClone ECB3052D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66, (1), 7-30 (2016).
  2. Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11, (4), 187-202 (2014).
  3. Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours - an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64, (1), 2-11 (2014).
  4. De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9, (12), 6233-6246 (2016).
  5. Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
  6. Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6, (8), 20294 (2011).
  7. Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17, (7), 966-975 (2016).
  8. The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, Suppl 3 102-112 (2014).
  9. Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
  10. Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2, (2), 247-250 (2007).
  11. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10, (8), 483-487 (2013).
  12. Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8, (3), 159-166 (2015).
  13. De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3, (12), 1662 (2016).
  14. Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95, (3), 343-347 (2009).
  15. Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
  16. Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
  17. Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313 (2008).
  18. Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13, (2), 227-240 (2016).
  19. Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15, (2), 309 (2017).
  20. De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9, (12), 755-767 (2017).
  21. Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14, (2), 78-80 (2017).
  22. Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55, (12), 2516-2519 (1995).
  23. Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12, (2), 1050-1055 (2016).
  24. Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21, (6), 848-855 (2012).
  25. Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16, (6), 625-638 (2011).
  26. Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37, (4), 1711-1722 (2017).
  27. Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2, (3), 407-412 (2011).
  28. Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, (8), 313 (2008).
Etablering af en primær kultur af Patient-afledte bløddelssarkom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

De Vita, A., Mercatali, L., Miserocchi, G., Liverani, C., Spadazzi, C., Recine, F., Bongiovanni, A., Pieri, F., Cavaliere, D., Fausti, V., Amadori, D., Ibrahim, T. Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma. J. Vis. Exp. (134), e56767, doi:10.3791/56767 (2018).More

De Vita, A., Mercatali, L., Miserocchi, G., Liverani, C., Spadazzi, C., Recine, F., Bongiovanni, A., Pieri, F., Cavaliere, D., Fausti, V., Amadori, D., Ibrahim, T. Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma. J. Vis. Exp. (134), e56767, doi:10.3791/56767 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter